WO2005079994A1 - 分離・回収装置および分離・回収方法 - Google Patents

分離・回収装置および分離・回収方法 Download PDF

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WO2005079994A1
WO2005079994A1 PCT/JP2005/002369 JP2005002369W WO2005079994A1 WO 2005079994 A1 WO2005079994 A1 WO 2005079994A1 JP 2005002369 W JP2005002369 W JP 2005002369W WO 2005079994 A1 WO2005079994 A1 WO 2005079994A1
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WO
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separation
gel
sol
temperature
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/002369
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuichi Mori
Hiroshi Yoshioka
Yuko Sato
Satoru Yoshida
Shinya Ohtsubo
Original Assignee
Waseda University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present invention provides a separation / collection that can easily separate / collect various samples (for example, a sample derived from an organism such as a cell and / or an organism) according to the characteristics of each component contained in the sample. Equipment and separation and recovery methods. Background art
  • the applicable range of the separation / collection apparatus and the separation / collection method of the present invention is not particularly limited, here, for convenience of explanation, separation / recovery of biologically related samples (particularly, separation / recovery under delicate conditions. (Recovery is highly preferred).
  • a separation / analysis device includes a chromatography device such as gas chromatography and liquid chromatography; an analysis device utilizing an agglutination reaction of particles such as blood cells or artificial particles (for example, lattetus particles); A typical example is an analyzer such as an amino acid analyzer.
  • chromatography device such as gas chromatography and liquid chromatography
  • analysis device utilizing an agglutination reaction of particles such as blood cells or artificial particles (for example, lattetus particles)
  • a typical example is an analyzer such as an amino acid analyzer.
  • at least some of their operations may be automated collection or dilution equipment (eg, automated fraction collectors to be combined with chromatographic equipment).
  • An object of the present invention is to provide a separation / collection apparatus and a separation / collection method that can solve the above-mentioned drawbacks of the prior art.
  • Another object of the present invention is to provide a separation / collection device and a separation / recovery system which enable quick and easy recovery of separated components after performing delicate separation, which was difficult with conventional devices. Recovery method.
  • a separation target supply means for supplying the separation target in a fluid state to the separation medium, a separation medium container for storing the separation medium, and a separated substance recovered from the separation medium It has been found that it is extremely effective to achieve the above-mentioned object by combining not only a collecting means for recovery but also a temperature control means for controlling the temperature of the separation medium container.
  • the separation / recovery device of the present invention is based on the above findings, and more specifically, means for supplying an object to be separated for supplying the object to be separated to a separation medium in a fluidized state,
  • a temperature control unit for controlling the temperature of the separation medium container, and a collection unit for collecting the separated material from the separation medium. Is also included.
  • an aqueous solution of a polymer having a mouth-opening gel-forming polymer exhibiting a thermoreversible sol-gel transition, which exhibits a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature is used.
  • a separation / recovery method characterized by including at least a step of recovering an object to be separated into a first recovery container while maintaining a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • the present invention includes, for example, the following embodiments.
  • a separation object supply means for supplying the separation object in a flowing state to the separation medium
  • a separation / collection device comprising at least temperature control means for controlling the temperature of the separation medium container and collection means for collecting a separated substance from the separation medium.
  • the change according to the temperature change is at least one change selected from the group consisting of a phase change, a change in viscosity, a change in separation ability, a change in hydrophobicity, and a change in crosslink density. 4) Separation / recovery device.
  • a fluid containing the object to be separated maintained at a temperature higher than the transition temperature is supplied to the separation medium container. At least a step of bringing a fluid into contact with the gel; and (4) a step of collecting an object to be separated into a first collection container while maintaining a temperature higher than the sol-gel transition temperature. Separation and recovery methods.
  • the separation medium container is cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to convert the hydrogel into a sol state, and the aqueous polymer solution containing the object to be separated is transferred to the second recovery container.
  • the aqueous polymer solution further contains a chemotactic factor [14] to
  • FIG. 1 is a schematic perspective view for explaining one embodiment of the separation method using the apparatus of the present invention (the step of supplying a separation medium to a container).
  • FIG. 2 is a schematic perspective view for explaining one embodiment of the separation method using the apparatus of the present invention (the step of supplying an object to be separated to a container).
  • FIG. 3 is a schematic perspective view for explaining one embodiment of the separation method using the apparatus of the present invention (the step of recovering an object to be separated).
  • FIG. 4 is a schematic plan view showing one embodiment of the device of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic perspective view showing one embodiment of the device of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic perspective view of a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic perspective view of another preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows that a suspension of cells and organisms is brought into contact with a gel of the present invention containing a chemotactic factor (FIG. 7 (a));
  • the hydrogel of the present invention is selectively incorporated into the hydrogel of the present invention (FIG. 7 (b)); the hydrogel of the present invention containing the fractionated cells is separated from the cell suspension (FIG. 7 (c)), and the gel is cooled.
  • the separation / recovery device of the present invention includes: a separation object supply means for supplying the separation object in a flowing state to the separation medium; a separation medium container for containing the separation medium; and a temperature of the separation medium container.
  • a temperature control means for controlling; and a collecting means for collecting a separated substance from the separation medium.
  • FIGS. 1 to 3 are schematic perspective views for explaining an example of a method of using a preferred embodiment of the separation / collection device of the present invention.
  • a hydrogel exhibiting a thermoreversible sol-gel transition phenomenon of gelling at a high temperature and a sol state at a low temperature is used as a separation medium.
  • thermoreversible gel liquid aqueous solution held at a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the thermoreversible gel liquid aqueous solution as described above separatation medium supply means 1
  • thermoreversible aqueous hydrogel solution containing a chemotactic factor in the low-temperature sol state From a thermoreversible aqueous hydrogel solution containing a chemotactic factor in the low-temperature sol state.
  • a fixed amount is collected, and a predetermined amount is supplied (or dispensed) to the separation medium container (fractionation container) maintained at the low temperature.
  • the separation medium container 2 is heated to a temperature higher than the sol-gel transition temperature by a temperature control means (for example, a Peltier element) 3, and the heat containing the chemotactic factor is obtained.
  • a temperature control means for example, a Peltier element
  • the temperature of the separation medium container 2 is controlled by a temperature control means.
  • a Peltier element for replacement (Rule 26 ) (For example, a Peltier element) 3, a separation target supply means (cell dispersion storage container) which is maintained at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the thermoreversible gel solution at the mouth of the mouth and is maintained at a temperature higher than the transition temperature. ) From Step 4, take a predetermined amount of the cell dispersion and dispense a predetermined amount into the separation medium container 2 maintained at the high temperature. Next, as shown in FIG. 2 (b), the hydrogel is brought into contact with the cell dispersion in the high-temperature separation medium container 2 for a predetermined time. In the state shown in FIG. 2 (b), the cells to be separated are separated from the inside of the hydrogel according to the concentration of the chemotactic factor contained in the hydrogel (separation medium) based on the chemotaxis. Move to
  • the cell dispersion is collected from the separation medium container 2 at the high temperature and dispensed to the first collection container 5. Further, the temperature of the separation medium container 2 is cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the aqueous thermoreversible gel solution, and the hydrogel is brought into a sol state. Can be dispensed into the collection container 6.
  • each part of the separation / recovery apparatus of the present invention or other elements (for example, separation medium, separation target) to be used for this will be described.
  • the components other than the separation medium and the separation medium container are described in well-known configurations (for example, the aforementioned “Analytical Chemistry Handbook” (Asakura Shoten) and Hiroshi Nakamura, “ Processing Handbook ", as described in Maruzen, 2003) can be used.
  • separation target that can be used in the present invention, as long as separation can be performed by a separation medium described below.
  • Examples of the separation target that can be used in the present invention are listed below.
  • lipids and related compounds (cholesterol, triglycerides, phosphorus Lipids, free fatty acids, lipid peroxides, etc.); 'nucleic acids and related compounds; catecholamines and metabolites; serotonin and tributophane metabolites; histamine and histidine metabolites; Mineral and vitamin-like substances; Carbonyl compounds; Thiols and related compounds; Phenols and related compounds; In vivo pigments (hemoglobin, pyrilrubin, perobulin, etc.); Cations; Anions; Chemical substance; dioxin; urine sample; organ; Muscle; skin; adipose tissue; saliva; gastric juice; cerebrospinal fluid; sweat; milk; hair; body hair; nails, teeth, bones; vomiting;
  • Food samples major components (water; protein; lipids; carbohydrates; dietary fiber); inorganic components (ash, minerals); trace components (vitamins (water-soluble; fat-soluble; amino acids; amino acids; fatty acids; organic acids; Nucleic acids; sterols)
  • the above-mentioned biological samples include cells of living organisms (humans, animals, plants, etc.) (cancer cells, embryonic stem cells, somatic stem cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, osteoblasts, chondrocytes, Nerve cells, fibroblasts, hematopoietic stem cells, knee island cells, leukocytes, lymphocytes, etc.).
  • cancer cells embryonic stem cells, somatic stem cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, osteoblasts, chondrocytes, Nerve cells, fibroblasts, hematopoietic stem cells, knee island cells, leukocytes, lymphocytes, etc.
  • the use for biologically relevant samples is particularly advantageous in that it is suitable for delicate separation by the apparatus of the present invention.
  • the object to be separated is in a fluid state when supplied to the separation medium by the object to be separated supply means. That is, it is not essential that the material to be separated be in a fluid state when stored or stored.
  • the separation object supply means has a function of supplying the separation object to the separation medium in a flowing state.
  • the configuration of the means for supplying the separation target is no particular limitation on the configuration of the means for supplying the separation target, as long as it can perform such a function.
  • the separation object supply means includes a storage container for storing or storing the separation object, a liquid sending means (for example, a pump) for sending the separation object in a flowing state, and a separation state in a flowing state. It may include a flow path for guiding the object to the separation media container.
  • the apparatus of the present invention may further have a separation medium supply means as needed.
  • This separation medium supply means has a function of supplying the separation medium to the separation medium container.
  • the configuration of the separation medium supply means is not particularly limited as long as such a function can be exhibited.
  • the separation medium supply means includes a storage container for storing or storing the separation medium, a liquid sending means (for example, a pump) for sending the fluidized separation medium, and a fluidized separation medium.
  • a channel for guiding to the container may be included.
  • the separation medium container has a function of storing the separation medium.
  • the configuration (eg, material, shape, number, size, etc.) of the separation medium container is not particularly limited as long as such a function can be exhibited.
  • the material, shape, number, and size of the separation medium container suitable for the present invention are as follows.
  • Shape cylindrical, rectangular parallelepiped, spherical
  • a so-called multi-well plate which is frequently used in biochemical measurement or clinical test, is separated.
  • Such a multi-well plate for example, has a number of wells, each corresponding to a separation media container,
  • a container having a small groove such as a microreactor, a microchannel, or a microplant that provides a microreaction space, which can be suitably used in so-called combinatorial chemistry, can also be used in the present invention.
  • the separation medium has a function of providing a field for separating an object to be separated.
  • the separation medium may contain one or more additives (for example, the above-described cell chemotactic factor).
  • the course of the separation does not matter as long as the separation of the separation target can be realized as a result (for example, the separation may be accompanied by one or more reactions of the separation target). .
  • the type, chemical composition, amount, and the like of the separation medium are not particularly limited as long as the separation medium can exert the above functions.
  • a solid, a fluid having a relatively high viscosity, a gel, and the like can be suitably used.
  • separation media examples will be listed.
  • Solids calcium carbonate, ion exchange resin, celluloses, silica gel, etc.
  • Hide mouth gel acrylamide gel, agarose gel, agar gel, etc.
  • the separation medium can be favorably transferred, recovered, and separated by the phase change based on the temperature change
  • the high-temperature-reversible sol-gel change described later is considered. It is preferable to use drogel.
  • the temperature control means has a function of controlling the temperature of the separation medium container.
  • the species, configuration, number, etc. there are no particular restrictions on the species, configuration, number, etc., as long as such functions can be exerted.
  • examples of temperature control means that can be used in the present invention will be listed.
  • the heating means for example, is it necessary to directly heat the separation medium container with a material that generates heat when energized (such as chromium, tin oxide, indium oxide, and carbon)?
  • a method of indirectly heating the separation medium container via a heat medium such as air or water can be selected.
  • the chilling P means includes, for example, a so-called heat pump that utilizes the heat of vaporization of a liquid, the heat of fusion of a solid (eg, ice), or the indirect use of a refrigerant.
  • a cooling method or the like can be selected.
  • the temperature control element for example, the temperature can be detected by a sensor such as a thermocouple and a thermistor, and ONZOFF of the heating means and / or the cooling means can be selected.
  • an electric or electronic element for example, a Peltier element
  • heating and cooling are possible, and a medium such as a refrigerant is unnecessary (the device can be simplified).
  • the recovering means has a function of recovering a separated material (along with the separation medium, if necessary) from the separation medium.
  • the type, configuration, number, and the like are not particularly limited as long as such functions can be exhibited.
  • the collecting means includes a collecting container for collecting or storing the separation medium, a liquid sending means (for example, a pump) for sending the separated material, and a flow path for guiding the separated material to the collecting container. be able to.
  • the device of this effort may have more than one collection means as needed. As described above, when the apparatus of the present invention has two or more recovery means, it becomes easy to recover (and further recycle) different separated components related to separation in each recovery means. .
  • FIG. 4 is a schematic plan view showing one embodiment of the separation / collection device of the present invention
  • FIG. 5 is a schematic perspective view thereof.
  • reference symbols indicate parts having the following relationships, respectively.
  • Separation medium container 24 4-well plate 50
  • Temperature control means Peltier unit 44, cable 42, 43, heater temperature control unit 45, water cooling unit 46,
  • Separation target supply / recovery means Dispensing pump 41, dispensing pump movement rail 49, 100 ⁇ m ⁇ 6 chips X 9 4 7, Chip disposal box 4 8
  • the separation / recovery apparatus and the separation / recovery method of the present invention have the above-described configuration, materials such as a separation medium (gel) that can be suitably used in such an apparatus or method, and those apparatuses, etc.
  • a separation medium gel
  • Various methods that can be used in combination in accordance with the present invention are described below (for convenience of explanation, a description will be given mainly of an embodiment in which the present invention is applied to separation of cells and the like related to chemotaxis).
  • the present invention relates to, for example, the ability to move cells and Z or organisms (hereinafter referred to as “cells / organisms”) according to the chemotactic or field properties (electrotaxis, magnetotaxis, phototaxis, Hydrogels for separating cells, microorganisms, etc. using thermotaxis, viscometer, etc.), and cell / biological separation methods using such hydrogels. it can.
  • the chemotactic or field properties electrotaxaxis, magnetotaxis, phototaxis, Hydrogels for separating cells, microorganisms, etc. using thermotaxis, viscometer, etc.
  • the present invention utilizes the property of migrating according to the concentration of a physiologically active substance inherent in many organisms (chemotaxis), or the property of migrating according to the strength of a field.
  • chemotaxis concentration of a physiologically active substance inherent in many organisms
  • the present invention utilizes the property of migrating according to the strength of a field.
  • cells are separated (differentiated, fractionated, or fractionated) by differences in chemotactic performance for factors related to immune diseases such as atopic dermatitis, allergy and rheumatism. Etc.).
  • cells are separated (differentiated, sorted, or separated) by using the apparatus or the like of the present invention, for example, based on the difference in chemotactic performance with respect to factors related to cancer treatment and metastasis of cancer cells. Sorting etc.).
  • cells are differentiated due to differences in chemotactic performance with respect to factors related to the induction, formation, regeneration, etc. of tissues and organs such as blood vessels and nerves in the field of regenerative medicine. Separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) becomes possible.
  • cells can be separated (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) utilizing the difference in chemotaxis (eg, electrophoretic mobility) with respect to an electric field using the apparatus of the present invention. It becomes possible. '
  • chemotaxis In general, when a living organism (or a part thereof) that has the ability to move causes a movement in response to an external stimulus and has a certain direction in the movement, the property of the living thing is regarded as a chemotaxis. It is a well-known property. If the stimulus is a substance, its properties are called chemotaxis. On the other hand, when the stimulus is a physical stimulus, it is called electrotaxis, magnetotaxis, phototaxis, thermotaxis, viscotaxis, etc. according to the physical stimulus.
  • Organisms having the above-mentioned motility include lower animals, plants, microorganisms, cells and organisms, and most organisms on the earth are considered to have running performance.
  • chemotaxis of living organisms particularly the chemotaxis of cells, plays an important role in living organisms.
  • the induction and regeneration of blood vessels require the proliferation of vascular endothelial cells, and the induction and regeneration of blood vessels in response to a gradient of vascular endothelial cell growth factor concentration, ie, the chemotactic activity of vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cell growth factor concentration ie, the chemotactic activity of vascular endothelial cells.
  • auxotrophic cancer cells secrete vascular endothelial cell growth factor to induce blood vessels from host blood vessels to cancer tissues and tissues.
  • the vascular system is induced and regenerated by the gradient of oxygen concentration. Since the important function of the vascular system is to supply oxygen to tissues and organs, it is considered to be a function for inducing and regenerating the vascular system in hypoxic regions and controlling oxygen concentration. That is, vascular endothelial cells
  • the induction and regeneration of a neural network is also performed in vivo by imparting a concentration gradient of a nerve cell growth factor to a field.
  • chemotactic properties of immune-related cells such as leukocytes are exerted in response to an allergen that causes an allergic reaction, and leukocytes and the like are not accumulated at the reaction site.
  • the possibility of cancer metastasis caused by cancer cells with high chemotactic performance is increasing.
  • chemotaxis due to physical stimulation is also well known.
  • the growth of plants in the light direction is well known as phototaxis.
  • cells that exhibit various electrophoretic performances in cell electrophoresis are known.
  • cells with high torsional activity, such as sperm have a high correlation between their motility and function.
  • lymphocytes include B lymphocytes and T lymphocytes, and B lymphocytes differentiate into many plasma cells upon external stimuli.
  • T lymphocytes are classified into various T cell subpopulations such as killer T cells, helper T cells, and sublesser T cells according to their functions. It is also becoming clear that macrophages have various subpopulations.
  • cancer cells in cancer tissues are also diverse, and it has been found that there is a large distribution of drug or radiation resistance, proliferation ability, metastasis, and the like. Further, it is well known that stem cells existing in bone marrow are differentiated into various cells depending on the environment.
  • each of these diverse cell groups has its own migration performance, and cells can be fractionated for each migration performance. Being able to sort will be a major step forward in elucidating cell functions.
  • a gel for cell / biological separation and the like in order to solve the above-mentioned disadvantages of the prior art, it can be used in combination with a gel for cell / biological separation and the like.
  • a gel such as a hide-mouth gel to enable the separation (fractionation, fractionation or fractionation, etc.) of cells and organisms with various running performances that could not be achieved with the conventional technology. it can.
  • the hydrogel can be used in combination with a hydrogel or the like so as to separate cells and organisms according to their running performance.
  • the separation of cells and organisms is performed by using a hydrogel having a specific structure or a gel having a specific opening, which can realize a concentration difference of a specific substance in a gel or inside or outside a gel.
  • the hydrogel for cell / biological separation used in this embodiment is a gel for cell / biological separation that enables selective migration of cells according to the concentration difference of the physiologically active substance.
  • the above-mentioned cell / bioseparation which exhibits a thermoreversible sol-gel transition phenomenon in which a sol state occurs at a low temperature and gels at a high temperature, and the gel is substantially water-insoluble at a temperature higher than the sol-gel transition temperature Hide mouth gel can be used.
  • the present invention further provides a gel-forming composition containing at least water and a hydrogel-forming polymer; and a reversibly sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Higher than transition temperature
  • An aqueous solution containing a physiologically active substance is brought into contact with one side of the gel-state composition at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the gel-forming composition; and Contacting a suspension of cells and organisms with the other surface,
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • the present invention further provides a gel-forming composition containing at least water and a hydrogel-forming polymer; and a reversibly sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures higher than the sol-gel transition temperature;
  • the composition in the gel state is
  • the physiologically active substance is transferred into the composition in the gel state to form a concentration gradient of the physiologically active substance in the composition, and the cells and organisms in the composition are transformed according to the concentration gradient.
  • a cell comprising at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than its sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering cells and organisms from the composition in the sol state.
  • ⁇ Biological separation methods can be used.
  • the present invention further provides a gel-forming composition containing at least water and a polymer having a mouth-opening gel-forming property; at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, the composition reversibly enters a sol state; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures higher than the sol-gel transition temperature;
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures above the transition temperature;
  • the composition in a gel state is brought into contact with a suspension of cells and an organism, and the chemotaxis caused by the gradient of each property causes the cells in the composition in a gel state from the suspension of the cells and the organism to form a gel. Transferring the organism, separating at least a portion of the gel-state composition into which the cells and the organism have been transferred from other parts of the composition, and
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • the present invention further provides a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; and a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at higher temperatures;
  • the gel-forming composition is brought into a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and cells and organisms are added to the sol to suspend the cells and organisms.
  • composition in the gel state in a field where the physical properties change continuously to form a gradient of each physical property in the composition; Relocating cells and organisms that have been substantially uniformly distributed in the composition in the composition in a gel state due to the difference in migration performance for each physical property,
  • the separated portion of the composition in the gel state is cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and at least a step of recovering the cells and the organism from the composition in the sol state is performed. Separation methods can be used.
  • the present invention can be suitably used in combination with the following gels or methods.
  • a hydrogel for cell / biological separation that enables selective migration of cells according to differences in the concentration of bioactive substances.
  • the hydrogel exhibits a thermoreversible sol-gel transition phenomenon in which it forms a sol state at a low temperature and gels at a high temperature, and the gel is substantially water-insoluble at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • the physical property of the field has a gradient, and cells and organisms are separated by a difference in chemotaxis based on the gradient of the physical property.
  • Any of [1] to [7] A cell for biological separation according to the above.
  • the hydrogel includes water, and a hydrogel-forming polymer obtained by combining a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block [1] to [9].
  • the hydrogel for biological separation of cells according to any one of the above.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, the composition reversibly enters a sol state; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at high temperature; one side of the gel-state composition at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the gel-forming composition Contacting an aqueous solution containing a physiologically active substance with the composition, and contacting a suspension of cells and organisms with the other surface of the composition in a gel state.
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • a gel-forming composition containing at least water and a gel-forming polymer having a mouth opening; and a reversible sol at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel state at a temperature higher than the gel transition temperature; add a cell to the gel-forming composition in a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • composition in a gel state with an aqueous solution containing a physiologically active substance at a temperature higher than the sol-gel transition temperature;
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • a gel-forming composition containing at least water and a gel-forming polymer at a mouth; at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, the composition reversibly enters a sol state, and the sol-gel transition A gel-forming composition which is substantially insoluble in water at a temperature higher than the temperature; a gel-forming composition which is in a sol state at a temperature lower than its solu-genicy transition temperature; Mixing the physiologically active substance in the sol-state composition substantially uniformly;
  • composition in the genole state with a suspension of cells and organisms at a temperature higher than the sol-gel transition temperature to transfer the cells and organisms from the suspension into the composition in the gel state;
  • At least the step of converting the separated gel-state composition into a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature and recovering the cells and organisms transferred into the composition from the sol-state composition is included.
  • composition for forming a mouth-opening gel has a sol-gel transition temperature higher than 0 ° C and 45 ° C or less.
  • sol-gel transition temperature higher than 0 ° C and 45 ° C or less.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a gel-forming polymer having a mouth opening; a sol-gel transition, which reversibly enters a sol state at a temperature lower than ⁇ ° C.
  • a gel-forming composition that is substantially water-insoluble at a temperature higher than the sol-gel transition temperature; and the gel-forming composition in a gel state has a continuous physical property. Forming a gradient of the physical property in the hydrogel,
  • the gel-state composition is brought into contact with a suspension of cells and organisms, and the chemotaxis induced by the gradient of each property causes the suspension of the cells and organisms to enter the gel-state composition. Transferring the cells and organisms; separating at least a portion of the gel-state composition into which the cells and organisms have been transferred from other parts of the composition; and
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a polymer having a mouth-opening gel-forming property; at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, the composition reversibly enters a sol state. At temperatures higher than the sol-gel transition temperature
  • the physical property is one or more physical properties selected from electric field strength, magnetic field strength, luminous intensity, temperature, and viscosity [18] or
  • [2 1] A plurality of parts containing cells and organisms having different chemotactic performances or migration distances are respectively separated from the gel-like composition to which the cells and organisms are transferred or rearranged, and the plurality of parts are separated.
  • composition for forming a mouth-opening gel has a temperature higher than 0 ° C.
  • a gel having a mouth opening for example, a sol-gel transition phenomenon of gelling at a high temperature and a sol state at a low temperature is exhibited, and the sol-gel transition is thermoreversible, and It is possible to separate cells and organisms (fractionation, fractionation or fractionation, etc.) according to their running performance using hydrogels, which are substantially water-insoluble at temperatures higher than the transition temperature.
  • hydrogels which are substantially water-insoluble at temperatures higher than the transition temperature.
  • the cells / organisms are differentiated in their chemotaxis to the respective properties. (Fractionation, fractionation or preparative separation).
  • a suspension of an aqueous solution containing a physiologically active substance and a cell / organism for separation is used at a temperature higher than the sol-gel transition temperature using the above-mentioned hydrogel.
  • a concentration gradient of the physiologically active substance is created in the hydrogel, and the cells and organisms are transferred from the cell and organism suspension into the hydrogel by the chemotaxis induced by the concentration gradient. Can be migrated.
  • the migration or migration distance of various cells and organisms into the hydrogel differs depending on the difference in the chemotactic performance of the cells for sorting and the organism. Of different or transition distances
  • a sol state containing cells and organisms can be produced by cutting out the gel at the portion of the mouth containing different cells and organisms and cooling the gel to a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the gel at the mouth. it can. Next, a large amount of cells and a biological culture solution or a preservation solution are added to the sol, and the polymer solution is diluted so as not to gel even at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, followed by ordinary separation such as centrifugation or membrane separation. It is possible to separate cells (organisms, fractionation or sorting) by the method.
  • the hydrogel is brought into a sol state by lowering the temperature to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a cell / biological suspension can be prepared by adding cells / organisms for separation. .
  • the suspension of cells and organisms is heated to a temperature higher than the above-mentioned sol-gel transition temperature to gel, thereby producing a hydrogel in which cells for sorting and organisms are substantially uniformly dispersed.
  • the hydrogel is brought into contact with an aqueous solution containing a physiologically active substance (chemotaxis factor) to transfer the physiologically active substance into the hydrogel, whereby a concentration gradient of the physiologically active substance in the hydrogel is obtained.
  • a physiologically active substance chemotaxis factor
  • Cells that have been substantially uniformly distributed in the gel at the concentration according to the concentration gradient are re-arranged at each site in the gel due to differences in chemotactic performance.
  • each site of the above hydrogel is cut out, and cells and organisms can be separated (fractionation, fractionation or fractionation, etc.) by differences in chemotactic performance by the same method as described above. .
  • the above hydrogel is brought to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol-state solution, and a physiologically active substance is substantially added to the sol-state aqueous solution.
  • Uniformly filtering raising the mixture in the sol state to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to form a hydrogel having a predetermined shape, and converting the hydrogel of a predetermined shape from the sol-gel transition temperature. Fine at high temperature
  • the hydrogel is placed in a field where physical properties selected from electric field strength, magnetic field strength, luminous intensity, temperature, viscosity, etc. are continuously changed, and the gradient of the property is set in the field.
  • the hydrogel is prepared in a gel with a closed mouth, and then the hydrogel is brought into contact with a suspension of the cells for separation and the suspension of the organism.
  • cells and organisms can be transferred into the gel at the hide opening.
  • the migration or migration distance of the various cells and organisms into the gel at the hide mouth is different.
  • the hydrogel to which the cells / organisms have migrated or the hydrogels with different running performance that is, the hydrogels containing the cells / organisms with different migration distances are cut out and cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the hydrogels.
  • a large amount of cell or biological culture solution or preservation solution is added to the solution, and the polymer solution is diluted so as not to gel even at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then subjected to a usual method such as centrifugation or membrane separation. Cells and organisms can be separated (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) by the fractionation method.
  • the hydrogel is brought into a sol state by lowering the temperature from the sol-gel transition temperature, and cells / organisms for separation are added to prepare a cell / organic suspension. be able to .
  • the cell / biological suspension is then heated above the sol-gel transition temperature.
  • the gel is formed by raising the temperature to produce a hydrogel in which cells and organisms for sorting are dispersed substantially uniformly inside.
  • the hydrogel is placed in a field where properties selected from electric field strength, magnetic field strength, luminous intensity, temperature, and viscosity change continuously, and gradients of the properties are produced in the gel at the mouth.
  • the cells / organisms which have been substantially uniformly distributed in the hydrogel according to the gradient are rearranged to each site in the hydrogel due to the difference in the migration performance for each property.
  • the hydrogel for cell / biological separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) of the present invention utilizes hydrophobic bonds at least partially for crosslinking. Presumed. Hydrophobic bonds are the only physical bonds among various physical bonds that become stronger as the temperature rises. When this hydrophobic bond is used for cross-linking, it is possible to synthesize a hydrogel suitably used in the present invention, which gels at a high temperature in a solution state (sol) at a low temperature. Further, the sol-gel transition temperature of the hydrogel can be changed by changing the hydrophobic bonding force of the cross-linking point.
  • the sol-gel transition temperature of the hydrogel that can be used in the present invention is preferably higher than o ° C and 45 ° C or less.
  • the physical properties of the above-mentioned gel for the mouth opening are such that the process of embedding cells, organisms, microorganisms, tissues, organs and the like in the hydrogel and recovering the same from the hydrogel is caused by thermal damage or enzyme. To be carried out without substantial damage.
  • the temperature to be transferred is about 99 55 ° C, which is within the physiological and physiological temperature range ⁇ Normally 00 °° (( ⁇ ⁇ 44 00 °° CC)) Tissue cell vesicles that were remarkably high and were higher than thighs ⁇ Living organisms, microscopic living organisms, tissue tissues ⁇ The burial, insertion, and recovery of the material were impossible. .
  • gegerul aaluginate of which the positive temperature and temperature are shown to change by dissolution and dissolution
  • the cross-linking force is Due to the binding formed by the binding, the binding force is strong, and gegell can be removed under physiological and physiological conditions.
  • the conventional coco lagergengen, zegeratichintingegeruru (Either way, the positive temperature and temperature and the dissolution degree change In the case of), the bridge is formed by the crystallized structure, or by the ionic bonding.
  • enzymatic enzymes such as coco lagerage genase, zelaratichinanase, etc. in order to convert gegerl into zozolulate in order to make it available. I do. .
  • one of the most important properties of Hahaiidodroglogegerl used in the embodiment of the present invention is a fine cell in Vesicles, living organisms, microscopic organisms, tissue tissues, organ organs, etc., move (with a certain degree of degree). Here and there as much as possible. .
  • the bridge bridge point of the three-dimensional three-dimensional original network structure of Hahaiid Dodrologegerl described above must be obtained. It is indispensable that the bond is not too strong.
  • the connection of the bridge point of the bridge of the third dimensional three-dimensional network of Gehiel of Hahaidodo mouth and mouth is assumed to be AA FF.
  • the life span ((te)) at the bridge bridge point is expressed by the following equation. .
  • the crosslinking points of the hydrogel are bonded to the operation having a ⁇ frequency higher than l / ⁇ (sec " 1 ").
  • the crosslinking point of the hydrogel is in the non-bonded state, that is, the liquid having no crosslinked structure This is because the gel at the mouth is very
  • the bonding energy of the cross-linking points that form the three-dimensional network structure having the above properties should be equivalent to the thermal energy (RT) in the physiological temperature range (0 ° C to 40 ° C).
  • a three-dimensional network formed by a covalent bond having a high binding energy of several tens to several hundreds of kcal Z mo 1, a crystallized structure, and a cross-linked structure formed by ionic bonds is a high-mouth gel usable in the present invention.
  • a three-dimensional network structure by dispersive force, hydrogen bond or hydrophobic bond having a binding energy of several kca 1 / mo 1 can be suitably used as a hydrogel usable in the present invention. It is.
  • the three-dimensional network structure formed by the hydrophobic bonds has a property that the hydrophobic bonds become stronger as the temperature rises, so that the sol is gelled at a low temperature and gelled at a high temperature. . Therefore, the temperature dependence of the sol-gel transition is opposite to that of a high-opening gel using other bonds, for example, bonds by hydrogen bonding, dispersing force, and the like.
  • the physical properties of hydrogels using hydrophobic bonds are higher than those of conventional gels in that they can embed cells and organisms in a low-temperature sol, avoiding thermal damage during embedding. Hide-mouth gel for cell / biological fractionation of the present invention
  • the gel When removing the gel from living organisms, the gel can be dissolved at a low temperature, and cells and organisms can be easily recovered from the gel without causing thermal damage. '
  • a hydrogel capable of separating (fractionating, fractionating or sorting, etc.) cells and organisms having various running performances.
  • the hydrogel for cell / biological separation includes a hydrogel-forming polymer whose aqueous solution has a sol-gel transition temperature, and is used at a lower temperature.
  • the state shows a thermoreversible sol-gel transition that gels at higher temperatures.
  • “cells / organisms” means “cells and / or organisms”, and organisms containing one or more cells (plants and animals) as long as they show some chemotaxis to any physiologically active substance. ) Includes or refers to any cell or cell aggregate derived from.
  • the forms of the cells and cell aggregates are not particularly limited, and include, for example, single cells, multicellular organisms or organs thereof, microorganisms, sperm, eggs, and the like.
  • “separation” refers to an object to be separated (in the present embodiment, the above-described cell / organism), and any feature of the object. ⁇ ⁇ ⁇ To make a difference in their spatial position based on the difference (eg, running). In the present invention, this “differential spatial position” form is not particularly limited.
  • “separation” is based on the property of the object to be separated (in this embodiment, the chemotaxis or the chemotaxis corresponding to the chemotaxis or physical property of the above-described cell and Z or organism).
  • the “separation” in the present invention includes, for example, fractionation, fractionation, or fractionation.
  • the definition and measurement of “sol state”, “gel state” and “sol-gel transition temperature” are described in the literature (H. Yoshioka et al., Journal of Macromolecular Science, A3 A, 1), 113, 1994. Based on the definition and method described in)), the dynamic elastic modulus of the sample at the observation frequency of 1 Hz is measured by gradually changing the temperature from the low temperature side to the high temperature side (1 ° C / 1 minute). The temperature at the point where the storage modulus (G-elastic term) of the sample exceeds the loss modulus (G ", viscous term) is defined as the sol-gel transition temperature. Generally, the state of G "> G 'is defined as a sol, and the state of G" ⁇ G "is defined as a gel. In measuring the sol-gel transition temperature, the following measurement conditions can be suitably used. .
  • Measuring equipment (trade name): Stress control rheometer CSL700, manufactured by Carri-Med
  • Measurement frequency 1 ⁇ ⁇ Applicable stress: Within the linear region.
  • the above Zolgel transition temperature is higher than 0 ° C, preferably 45 ° C or lower, and more preferably 0 ° C or lower. It is preferably 42 ° C or lower (especially 4 ° C or higher and 40 ° C or lower).
  • the hydrogel having such a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds described below according to the above-mentioned screening method (sol-gel transition temperature measurement method). Separation of cells and organisms by using a gel with a mouth opening that can be used in the present invention
  • the above sol-gel transition temperature (a ° C) is fractionated as the temperature for cell / biological fractionation and fractionation (b ° C). It is preferable to set it between the temperature at the time of cooling (c ° C) and the temperature. That is, it is preferable that the above three temperatures a ° C., b ° C., and c ° C. have a relationship of b> a> c. More specifically, (b_a) is preferably 1 to 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C, and (a-c) is 1 to 40 ° C, more preferably The temperature is preferably 2 to 30 ° C.
  • the hydrogel preferably used in the present invention has a cell selectivity RnR measured by the following measurement method from the viewpoint of exhibiting a suitable cell selectivity. Is preferably 2 or more, more preferably 5 or more, and still more preferably 10 or more. Cell selectivity RZR. Is measured as follows.
  • the gel with a mouth opening that can be used in the present invention exhibits a solid behavior at higher frequencies, since cells, organisms, microorganisms, and the like can move freely therein. It is preferable to exhibit liquid behavior at lower frequencies. More specifically, the mobility of cells, organisms and the like in the gel for a mouth can be suitably measured by the following method.
  • the hydrogel (1 mL as the hydrogel) usable in the present invention is placed in a sol state (a temperature lower than the sol-gel transition temperature) into a test tube having an inner diameter of lcm, and the hydrogel is prepared.
  • the test tube is kept for 12 hours in an aqueous solution at a temperature sufficiently higher than the sol-gel transition temperature (for example, about 10 ° C. higher than the sol-gel transition temperature) to gel the hydrogel.
  • T time until the solution / air interface (meniscus) is deformed by the weight of the solution when the test tube is turned upside down is measured.
  • the hide gel behaves as a liquid, and for the operation at a frequency higher than 1 / T (sec" 1 ).
  • the hide-mouth gel behaves as a solid.
  • T is 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 10 hours.
  • the gel-like properties of the hydrogel usable in the present invention can be suitably measured by measuring the steady-state flow viscosity.
  • Steady flow viscosity 77 (Theta)
  • steady flow viscosity 77 This steady flow viscosity is sometimes referred to as Newtonian viscosity. However, the steady-state flow viscosity here must be determined within a linear region that hardly depends on shear stress. '
  • a stress control type viscoelasticity measuring device CSL type rheometer (CSL500, manufactured by Carrymed USA) was used as a measuring device, and an acrylic disk was used as a measuring device. (Diameter: 4 cm), and observe the creep behavior (delay curve) for a measurement time of at least 5 minutes or more with a sample thickness of 600 ⁇ m. The sampling time is once every second for the first 100 seconds and once every 100 seconds thereafter.
  • It is preferably 6 Pa ⁇ sec or less.
  • the gel-like properties of the hydrogel usable in the present invention can be suitably measured also by the dynamic elastic modulus. Amplitude 0 / in the gel. ', The frequency of /
  • the hide-mouth gel usable in the present invention has the following properties (for details of such elastic modulus measurement, see, for example, Reference: Ryohei Oda, edited by Modern Industrial Chemistry 19, p. 359, Asakura Shoten, 1989).
  • L (tan S) L is one or more ( More preferably 1.5 or more, and particularly preferably 2 or more).
  • the ratio ((tan ⁇ ) s / (tan ⁇ ) L ⁇ of (tan S) s and (tan S) L is preferably less than 1 (more preferably 0.8 or less, particularly preferably 0 5 or less) .
  • Temperature A temperature about 10 ° C higher than the sol-gel transition temperature of the gel at the mouth opening.
  • Measuring equipment Stress-controlled rheometer (Model name: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • the hydrogel-forming polymer that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it exhibits a thermoreversible sol-gel transition as described above (ie, has a sol-gel transition temperature). From the viewpoint that it is easy to show a suitable sol-gel change at a physiological temperature (about 0 to 42 ° C), for example, a plurality of blocks having a cloud point in the hydrogel-forming polymer can be used. It is preferably achieved by adjusting the cloud point of the hydrophilic and hydrophilic blocks, the composition of both blocks, and the hydrophobicity, hydrophilicity, and Z or molecular weight of both blocks, respectively. .
  • polystyrene resin whose aqueous solution has a sol-gel transition temperature and exhibits a reversible sol state at a temperature lower than the transition temperature
  • polypropylene oxide and polyethylene oxide examples include, for example, polypropylene oxide and polyethylene oxide.
  • Pluronic F-127 (trade name, BASF Wyandotte Chemica Is), in which polypropylene oxide is bonded at both ends to polyethylene oxide Co.) Gel is being developed. It is known that the high-concentration aqueous solution of the pull-mouth nick F-127 forms a gel at a hide-mouth gel at about 20 ° C or higher, and becomes an aqueous solution at a lower temperature. However, in the case of this material, it becomes a gel state only at a high concentration of about 20% by mass or more.
  • Pluronic F-127 has a relatively small molecular weight, exhibits not only a very high osmotic pressure in a high gel state of about 20% by mass or more, but also easily penetrates cell membranes. However, it may not adversely affect biological tissues.
  • the sol-gel transition temperature is usually high and is about 45 ° C or higher (N. Sarkar, J. Appl. Polym. Science, 24, 1073, 1979).
  • the etherified cellulose is in a sol state, and the etherified cellulose is used. With the method, fractionation and separation of cells and organisms are practically difficult.
  • the problems of a conventional polymer that has a sol-gel transition point in its aqueous solution and reversibly forms a sol at a temperature lower than the transition temperature are as follows: 1) The temperature is higher than the sol-gel transition temperature. However, even if the gel is formed, the gel is dissolved when water is further added. 2) The sol-gel transition temperature is lower than the cell / organic fractionation and fractionation temperature (around 37 ° C or lower). It is high and it is in a sol state at the fractionation and fractionation temperature. 3) It is necessary to make the aqueous polymer concentration very high in order to gel.
  • a hydrogel-forming polymer whose ice solution preferably has a sol-gel transition temperature of higher than 0 ° C. and not higher than 42 ° C.
  • An aqueous solution has a sol-gel transition temperature and is reversible at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • the hydrogel-forming polymer utilizing a hydrophobic bond which can be suitably used as a base for separation (fractionation, fractionation, or fractionation) of cells and organisms of the present invention, has a cloud point.
  • a plurality of blocks and a hydrophilic block are combined.
  • the hydrophilic block is preferably present in order to make the hide-port gel water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a plurality of blocks having a cloud point are preferably used.
  • the hydrogel exists because it changes into a gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • a block having a cloud point dissolves in water below the cloud point and becomes insoluble in water above the cloud point, so that at a temperature above the cloud point,
  • the block serves as a cross-linking point composed of hydrophobic bonds for forming a gel. That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond corresponds to the sol-gel transition temperature of the above-mentioned hide-mouth gel.
  • the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily have to match. This is because the cloud point of the above-mentioned “block having a cloud point” is generally affected by the bond between the block and the hydrophilic block.
  • the hydrogel used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond not only becomes stronger with an increase in temperature, but that the change is reversible with respect to temperature. Multiple crosslinking points are formed in one molecule
  • the hydrogel-forming polymer has a plurality of “blocks having a cloud point” in the molecule.
  • the hydrophilic block in the above-mentioned hydrogel-forming polymer is such that the hydrogel-forming polymer is a sol.
  • the block having a cloud point is preferably a block of a polymer having a solubility in water and a negative temperature coefficient, and more specifically, propylene oxide and propylene oxide.
  • Copolymers with other alkylene oxides, poly N-substituted acrylamide derivatives, poly N-substituted methacrylamide derivatives, copolymers of N-substituted acryloleamide derivatives and N-substituted metaacrylamide derivatives A polymer selected from the group consisting of coalesced, polyvinyl methyl ether and partially acetylated polyvinyl alcohol can be preferably used.
  • the sol-gel transition temperature of the compound having a hydrophilic block bonded thereto is set to be higher than 4 ° C and 40 ° C or lower.
  • the cloud point is measured by, for example, cooling an aqueous solution of about 1% by weight of the above polymer (block having a cloud point) into a transparent homogeneous solution, and then gradually increasing the temperature (at a rate of temperature increase of about 1%). This can be performed by setting the point at which the solution becomes cloudy for the first time at 1 ° C / in) as the cloud point.
  • poly N-substituted acrylamide derivatives and poly N monosubstituted methacrylamide derivatives that can be used in the present invention are listed below.
  • the polymer may be a homopolymer (a homopolymer) or a copolymer of a monomer constituting the polymer and another monomer.
  • a homopolymer a homopolymer
  • a copolymer of a monomer constituting the polymer and another monomer As the other monomer constituting such a copolymer, any of a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer can be used.
  • copolymerization with a hydrophilic monomer raises the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, even by selecting these monomers to be copolymerized, it is possible to obtain a polymer having a desired cloud point (for example, a cloud point higher than 4 ° C and 45 ° C or lower). Can be.
  • hydrophilic monomer examples include N-bulpyrrolidone, bulpyridine, acrylamide, metaacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxylethyl methacrylate, and hydracrylic acid.
  • the present invention is not limited to these.
  • the hydrophobic monomer includes acrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate, and glycidyl methacrylate, and methacrylate.
  • acrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate, and glycidyl methacrylate, and methacrylate.
  • N-substituted alkyl methacrylamide derivatives such as N_n_butyl methacrylamide, butyl chloride
  • the hydrophilic block to be bound to the block having the above cloud point includes, specifically, methylcellulose, dextran, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, and poly N-bulpy. Mouth lidone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, polyacrylamide, polyN-methylacrylamide, polyhydroxymethyl acrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl sulfonic acid , Polystyrenesulfonic acid and salts thereof; poly N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-ethylamino.noethyl methacrylate, poly N, N-dimethylaminopropylacrylamide and their salts, etc. Is mentioned.
  • the method for bonding the block having a cloud point and the hydrophilic block is not particularly limited.
  • a polymerizable functional group for example, an atalyloyl group
  • a monomer that gives the other block for example, an atalyloyl group
  • the conjugate of the block having a cloud point and the above-mentioned hydrophilic block is a combination of a monomer that provides a block having a cloud point and a monomer that provides a hydrophilic block. It can also be obtained by block copolymerization.
  • a bond between the block having a cloud point and the hydrophilic block is formed by introducing a reactive group (for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxy group, an isocyanate group, etc.) into both of them in advance.
  • a reactive group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxy group, an isocyanate group, etc.
  • both can be performed by bonding the both by a chemical reaction.
  • a plurality of reactive functional groups are introduced into the hydrophilic block.
  • the bond between the polypropylene oxide having a cloud point and the hydrophilic block can be formed, for example, by anionic polymerization or cationic polymerization.
  • Polypropylene oxide and “hydrophilic block” are obtained by repeatedly and sequentially polymerizing pyrene oxide and a monomer (eg, ethylene oxide) that constitutes “another hydrophilic block”.
  • a block copolymer such as this can be obtained by introducing a polymerizable group (for example, an acryloyl group) into the end of polypropylene propylene oxide. It can also be obtained by copolymerizing a monomer constituting a hydrophilic block.
  • a functional group capable of binding and reacting with a functional group for example, a hydroxyl group
  • a functional group for example, a hydroxyl group
  • the polymer of the present invention is characterized in that at a temperature lower than the cloud point, the above-mentioned “block having a cloud point” existing in the molecule is a hydrophilic block. Since it is water-soluble together with ⁇ , it completely dissolves in water and shows a sol state. However, when the temperature of the aqueous solution of the polymer is heated to a temperature higher than the above cloud point, the “block having a cloud point” existing in the molecule becomes hydrophobic, and a separate molecule is formed by the hydrophobic interaction. Meet between.
  • the polymer of the present invention can be used in water to prevent hydrophobicity between blocks having a cloud point in water. Generates a mouth-opening gel with a three-dimensional network structure with the sex association part as a crosslinking point. The temperature of the hydrogel is again increased by the “cloud point
  • the block having the cloud point When the block having the cloud point is cooled to a temperature lower than the cloud point of the block, the block having the cloud point becomes water-soluble, the cross-linking points due to hydrophobic association are released, and the hydrogel structure disappears.
  • the molecule is again a complete aqueous solution.
  • the sol-gel transition of the polymer of the present invention in a preferred embodiment is based on a reversible change in hydrophilicity and hydrophobicity at a cloud point of a block having a cloud point present in the molecule. Therefore, it is completely reversible in response to temperature changes.
  • the hydrogel usable in the present invention whose aqueous solution contains at least a polymer having a sol-gel transition temperature exhibits substantially water insolubility at a temperature (d ° C) higher than the sol-gel transition temperature. It exhibits water solubility reversibly at a temperature (e ° C) lower than the sol-gel transition temperature.
  • the above-mentioned high temperature (d ° C) is preferably 1 ° C or more, more preferably 2 ° C or more (particularly 5 ° C or more) higher than the sol-gel transition temperature.
  • the “substantially water-insoluble” means that the amount of the polymer dissolved in 100 mL of water at the temperature (d ° C.) is 5.0 g or less (furthermore, 0.5 g Hereinafter, it is particularly preferable to be 0.1 lg or less.
  • the above-mentioned low temperature (e ° C) is preferably 1 ° C or more (in absolute value) lower than the sol-gel transition temperature, and more preferably 2 ° C or more (particularly 5 ° C or more). More preferably, the temperature is low.
  • water-soluble means that the amount of the polymer soluble in 100 mL of water at the temperature (e ° C) is 0.5 g or more (more preferably 1.0 g or more). Preferably, there is.
  • reversibly water-soluble means that the aqueous solution of the above-mentioned hydrogel-forming polymer is once gelled (at a temperature higher than the sol-gel transition temperature), but the sol-gel transition temperature is high. At lower temperatures, it indicates the above water solubility.
  • the above polymer has a viscosity of 10 to 30000 centiboise (more preferably 50 to 10000 centiboise) at 10 ° C. in a 10% aqueous solution. Such a viscosity is preferably measured, for example, under the following measurement conditions.
  • Viscometer Stress-controlled rheometer (Model name: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer usable in the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature and then immersed in a large amount of water, the gel is not substantially dissolved.
  • the above characteristics of the substrate for separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) of the above-mentioned cells and organisms can be confirmed, for example, as follows. That is, 0.115 g of a polymer having a mouth-opening gel that can be used in the present invention is dissolved in 1.35 g of distilled water at a temperature lower than the above-mentioned sol-gel transition temperature (for example, under water cooling).
  • aqueous solution To prepare a 10 W% aqueous solution, inject the aqueous solution into a plastic Petri dish with a diameter of 35 mm, and heat it to 37 ° C to form a gel with a thickness of about 1.5 mm. After being formed in the petri dish, the weight (f gram) of the whole petri dish including the gel is measured. Next, the whole petri dish containing the gel was allowed to stand at 37 ° C. for 10 hours in water in 25 OmL, and then the weight (g gram) of the whole petri dish containing the gel was measured to determine the gel surface. The presence or absence of dissolution of the gel from is evaluated.
  • the weight loss rate of the above gel that is, (f-1g) Z ⁇ is preferably 5.0% or less, and more preferably 1% or less. It is preferably at most 0% (particularly at most 0.1%).
  • Hydrogel-forming polymeric water usable in the present invention is preferably 5.0% or less, and more preferably 1% or less. It is preferably at most 0% (particularly at most 0.1%).
  • the solution After the solution is gelled at a temperature higher than the above-mentioned sol-gel transition temperature, even if it is immersed in a large amount of water (0.1 to 100 times the volume of the gel by volume ratio), the solution remains for a long time.
  • the gel does not dissolve.
  • Such properties of the polymer used in the present invention can be achieved, for example, by the presence of two or more (plural) blocks having a cloud point in the polymer.
  • a similar gel was prepared using the above-mentioned pull-mouth nick F-127 in which polyethylene oxide was bonded to both ends of polypropylene oxide, it took several hours. The present inventors have found that the gel completely dissolves in ice upon standing.
  • the concentration in water that is, ⁇ (polymer) Z (polymer + water) ⁇ XI 00 (%) is less than 20% (more Is preferably 15% or less, particularly 10% or less).
  • the physiologically active substance in the present invention refers to a substance that binds, reacts, or attracts cells or organisms.
  • chemotactic factors chemotaxis factors
  • antibodies cytokins and their receptors
  • cell adhesion factors cell adhesion factors and the like
  • Chemotaxis is a property in which a cell or microorganism accumulates or escapes according to the concentration difference of a certain chemical substance (chemotaxis factor) as a stimulus.
  • Chemotaxis is a property of many cells such as microorganisms, leukocytes, cancer cells, and sperm, and microorganisms, cells, and organisms each have the ability to recognize specific chemotactic factors.
  • typical chemotactic factors include neutrophils, immunoglobulin-derived factors that act on macrophages, and other complement-derived factors that act on neutrophils, such as C3a, C5a, and N-forminole.
  • Macro such as Met-Leu-Phe (fMLP)
  • Lymphokine which is a lymphocyte-derived factor that acts on phage, peptidic factors that act on eosinophils, ekalectin, and the like. These are chemotactic factors for immunocompetent cells involved in the allergic response.
  • various cell growth factors such as vascular endothelial cell growth factor associated with blood vessel induction and regeneration, and neural cell growth factor associated with neural network induction and regeneration are also considered chemotactic factors. I have.
  • the vascular system is also induced and regenerated by the gradient of oxygen concentration, and oxygen is known to be a negative chemotactic factor.
  • Chemotactic factors have also been implicated in the metastasis of cancer cells. As described above, immune-related and cancer-related drugs that act directly on cells can be considered to have chemotaxis in many cases.
  • Physical chemotaxis is a property in which cells or microorganisms gather or escape according to the difference in intensity when a difference in intensity of a certain physical factor serves as a stimulus.
  • Physotaxis is a property of many microbial cells, each of which has the ability to recognize specific motility factors.
  • typical physical chemotaxis factors are electric field, magnetic field, gravitational field, luminous intensity, temperature, viscosity and the like.
  • the chemotactic factor is the cell attracting ability N / N measured for the target cell by the following measurement method. Is more preferably 1.2 or more, more preferably 2 or more, even more preferably 10 or more.
  • the cell attraction ability can be measured, for example, as follows.
  • aqueous solution with a concentration of 10 wt%.
  • concentration of chemoattractant high Dorogeru forming high molecular aqueous solution it is necessary to set the range that can attract cells of interest, typically a range of 1 0- 6 M ⁇ l 0- 5 M And 1 g of this aqueous solution is heated to 37 ° C. to form a hydrogel having a surface area of 10 to 15 cm 2 (SZV ratio: 10 to 15).
  • the aqueous solution is filled into a 23 mL 1-mL syringe equipped with a syringe needle, cooled to 4 ° C, and placed in 100 mL of 37 ° C physiological saline.
  • the diameter of the obtained hydrogel in the form of a string is about 3 mm and the length is about 14 cm, so that a hydrogel having a surface area of about 13 cm 2 can be obtained.
  • Additional chemotactic factor 1 0 - 6 M to l 0- 5 and Hyde port gel 1 g of S ⁇ V ratio 1 0-1 5 containing M, a suspension of cells of interest (cell count: 1 0 6 pieces of Zml) are brought into contact in a 14 mL disposable centrifuge tube, and gently stirred at 37 ° C for 4 hours.
  • the cell suspension is removed by decantation while leaving the hydrogel, and 10 mL of physiological saline at 37 ° C is newly added to wash and remove the cells adhered to the surface of the hydrogel. After repeating this washing operation three times, the mixture is cooled to 4 ° C to dissolve the hydrogel, and the number N of cells migrated into the hydrogel is measured. On the other hand, the same measurement as described above was performed on a hydrogel usable for the present invention which does not contain a chemotactic factor, and the number N of cells migrated into the hydrogel was determined. Measure the cell-attracting ability of the migration factor NZN. Ask for.
  • Apparatus and method for separating cells and organisms by chemotactic performance Apparatus and method for separating cells and organisms by chemotactic performance
  • the methods and methods are broadly classified into the following three types, depending on the means used to migrate cells and organisms in the gel. 1) An aqueous solution containing a physiologically active substance and a suspension of cells and organisms for separation are separated by a hydrogel, and a concentration gradient of the physiologically active substance is formed in the hydrogel, and the gradient is induced by the concentration gradient.
  • a method for transferring cells and organisms from the cell / organism suspension into the hydrogel by chemotaxis 2) producing a gel with a mouth opening in which the cells / organisms are substantially uniformly dispersed inside, Then, the gel is brought into contact with an aqueous solution containing a physiologically active substance at a temperature higher than the sol-gel transition temperature to transfer the physiologically active substance into the gel.
  • a concentration gradient of the physiologically active substance is formed in the hydrogel, and the cells and organisms which have been substantially uniformly distributed in the hydrogel according to the concentration gradient have a difference in the chemotactic performance (due to the difference in the height of the hydrogel).
  • FIG. 6 schematically shows an embodiment of the present invention according to the above methods 1) and 2)
  • FIG. 7 schematically shows an embodiment according to the above method 3).
  • Which of the above methods is adopted may be appropriately selected depending on the type of the target cell and the organism.
  • the shape of the hydrogel may be appropriately selected according to the purpose, and may be any shape such as a column, a disk, a rectangular parallelepiped, a sphere, a thin string, a fiber, a flake, a plate, a film, and an irregular shape. can do.
  • the hydrogel containing the physiologically active substance is used to increase the frequency of contact with the cells in the cell suspension placed around the hydrogel. It is advantageous to increase the surface area per unit volume of the prescribed shape given to the sphere, and it can be any one of a spherical shape, a thin string shape, a fiber shape, a flake shape, a plate shape, a film shape, and an irregular shape. desirable.
  • That predetermined ⁇ shape, surface area (S) is preferably Z volume (V) ratio is in the form of the 1 0 (cm- 1) or more, particularly 3 0 (cm- 1) or more, and further 6 0 (cm — 1 ) More preferably
  • the method 3 it is preferable to carry out the cell suspension in a stirring or circulating manner in order to increase the frequency of contact between the hydrogel and the cells in the cell suspension arranged around the hydrogel. .
  • a number of sets of the hydrogel and the cell suspension arranged around it can be processed in parallel. At this time, by changing the concentration of the chemotactic factor in the gel of the hydrogel in each set, or by changing the contact time between the hydrogel of each set and the cell suspension, the target cells and organisms can be obtained. It can be fractionated and collected.
  • Chemotactic peptides, LPS (Lipopolysacch aride), etc. are known as chemotactic factors for leukocytes (neutrophils). ing. When a concentration gradient of these chemotactic factors is formed in a hydrogel usable in the present invention and brought into contact with a cell group containing leukocytes (for example, peripheral blood), the chemotaxis induced by these chemotactic factors is caused. High and low chemotactic cells are separated in the hydrogel according to the concentration of the chemoattractant in the hydrogel. After that, the portion of the gel at the mouth where the target cells are present is cut out, cooled [3 to form the hydrogel into a sol, diluted with physiological saline, etc., and centrifuged to separate the target cells. Only can be recovered.
  • the gel in the form of a droplet is gelled, and the micronized mouth-opening gel containing the chemotactic factor which can be used in the present invention is kept at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and recovered from physiological saline. This is dispersed in the blood.
  • the mixture is stirred at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, f
  • the microgel-shaped hydrogel usable in the present invention Only cells having an affinity for MLP and LPS are incorporated into the microgel-shaped hydrogel usable in the present invention.
  • the high-mouth gel usable in the present invention that has taken up the cells while maintaining the temperature higher than the sol-gel transition temperature is collected by centrifugation, and washed. Thereafter, the hydrogel that can be used in the present invention, in which cells have been taken up at a temperature lower than the transfer temperature, is turned into a sol, diluted with physiological saline, etc., and further washed to be used in the present invention. Remove the possible hide gel and collect the desired cells.
  • the feature of this method is that not only the cells in the cell suspension but also the hydrogel which can be used in the present invention containing a chemotactic factor can freely move, and the hydrogel which can be used in the present invention can be freely moved. Since a very high surface area per unit amount is generated from the size and shape, high frequency contact between the cells and the hydrogel usable in the present invention can be expected. Also, by encapsulating various chemotactic factors in the hydrogel usable in the present invention, or by changing the conditions such as time and temperature, functional recovery in a small multiplex type can be expected.
  • pluripotent hematopoietic stem cells are contained in CD34 positive cells in hematopoietic cells, and CD34 positive in hematopoietic cells of transplant donors.
  • the rate has been used as one of the evaluations of hematopoietic stem cell transplantation.
  • CD34-positive cells cells that exhibit chemokine activity for chemokines such as the chemokine receptor CXCR-4 ligand Stromel cell der derived factory-1 (SDF-1) Is homing to the bone marrow of the transplant recipient
  • a hydrogel containing SDF-1 and usable in the present invention is used.
  • CD34-positive cells were separated from hematopoietic cells collected from bone marrow fluid, peripheral blood, or cord blood of a transplant donor by the magnetic bead method, and SDF-1 was contained in the CD34-positive cell suspension.
  • the gel of the present invention can be co-suspended, and cultured with stirring for a certain period of time.
  • the CD3-positive cells that have reacted with SDF-1 and entered the hydrogel usable in the present invention are separated and collected.
  • the recovery rate indicates the percentage of SDF-1 reactive cells, and it can be expected that the homing activity of donor cells can be evaluated.
  • the isolated cells can be directly transplanted as synthetic I & L stem cells having high-homing activity.
  • Sperm is a cell specialized for fertilization. It is the only cell in the life of an organism that has flagella and exhibits a sophisticated motor function, chemotaxis. This chemotaxis enables fertilization.
  • the hydrogel that can be used in the present invention is used to utilize only sperm having a high migration ability based on chemotaxis for fertilization with an egg cell. After washing the collected clarified liquid, the spermatozoa are suspended in a small amount of a hydrogel usable in the present invention in a sol state, and gelled as it is at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • the periphery of the hydrogel usable in the present invention in the form of a microgel containing the spermatozoa is covered with a hydrogel that can be used in the present invention in an appropriate amount prepared separately and at an appropriate concentration.
  • the amount and concentration of the outer hydrogel that can be used in the present invention is such that only spermatozoa having high migration ability can move in the gel of the mouth, and within a certain period of time.
  • a hydrogel containing sperm that can be used in the present invention is suspended at a temperature higher than its sol-gel transition temperature in a plastic petri dish in which egg cells are placed in a culture solution. Only sperm with high motor function shows high chemotaxis in the hydrogel usable in the present invention ', and sperm showing high chemotaxis functionally selected in the hydrogel used in the present invention Only springs into the culture. Therefore, the egg can fertilize only with highly chemotactic sperm.
  • Polypropylene oxide polyethylene oxide copolymer (Propylene oxide / ethylene oxide average degree of polymerization: approx. 60/180, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd .: Pull mouth nick F—127) 10 g was dissolved in 3 mL of dry chloroform in form of O 3, and 0.13 g of hexanemethylenediocyanate was added in the presence of phosphorus pentoxide, and the mixture was reacted at the boiling point of reflux for 6 hours.
  • the residue was dissolved in distilled water, and subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane (Amicon PM-30) having a molecular weight cut off of 30,000 to obtain a high molecular weight polymer and a low molecular weight polymer.
  • the coalescence was fractionated.
  • the obtained aqueous solution was frozen to obtain an F-127 high polymer and an F-127 low polymer.
  • the F-127 high polymer (TGP-1) which was obtained as described above was dissolved in distilled water at a concentration of 8% by mass under cooling with water. . When this aqueous solution is slowly heated, the viscosity gradually increases from 21 ° C, solidifies at about 27 ° C, and forms
  • Trimethylol prono 1 mole of ethylene oxide
  • polyethylene oxide triol having an average molecular weight of about 700,000.
  • a hydrogel-forming polymer (TGP-2) usable in the present invention was obtained. This was dissolved in distilled water at a concentration of 5% by mass under ice cooling, and its sol-gel transition temperature was measured to be about 16 ° C.
  • poly (N-isopropylamine) is added to the poly (N-isopropylacrylamide doco-N-atalyloxys succinimide), and excess polyisopropylamine is added to the poly (N-isopropylamine).
  • Sopropyl acrylamide (n-butyl methacrylate) was obtained.
  • the cloud point of the aqueous solution of this poly (N-isopropionylacrylamide amide n-butyl methacrylate) was 19 ° C.
  • the TGP-3 thus obtained was distilled at a concentration of 5% by mass under ice-cooling.
  • sol-gel transition temperature of the polymer did not change by this sterilization operation.
  • the precipitate was dissolved again in 6 L of distilled water to obtain a hollow-foiler type molecular weight cutoff of 100,000.
  • the solution was concentrated to 2 L at 10 ° C using an external filtration membrane (H1P100-43, manufactured by Amicon).
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of distilled water, and the dilution operation was repeated. Repeat the above dilution and ultrafiltration concentration operations 5 more times.
  • the hydrogel-forming polymer (TG which can be used in the present invention of Production Example 3)
  • the agar was dissolved in distilled water at a concentration of 2% by mass at 90 ° C, gelled at 10 ° C for 1 hour, and 77 was measured at 37 ° C. measurement limit (1 X 1 0 7 P a - sec) was over.
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the substance not filtered by the ultrafiltration (the substance remaining in the ultrafiltration membrane) is recovered, freeze-dried, and formed into a hydrogel-forming polymer having a molecular weight of 100,000 or more and usable in the present invention ( TGP-5) 72 g was obtained.
  • reaction solution was diluted by adding 5 L of cold distilled water at 5 ° C and concentrated to 2 L at 5 ° C using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 100,000. .
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less. Filtration by this ultrafiltration
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated 5 times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the polymer not filtered by the ultrafiltration (the one remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, freeze-dried, and used as a hydrogel-forming polymer having a molecular weight of 100,000 or more and usable in the present invention ( TGP-7) 22 g was obtained.
  • hydrogel-forming polymer that can be used in the present invention obtained as described above (
  • Cooling 2 Apply 4 ice-cold TGP aqueous solutions (4 x 15 mL centrifuge tubes) containing chemotactic factors (4 types of or4 concentrations) to each 4-well plate.
  • MLPN -formyl-methionyl - leucyl- phenylalanine Molecular weight 4 3 7. 6, chemotactic peptides, SI GMA Co.) 0 M, 1 0 - 6 M , 1 0- 7 M, 1 0- 8 M Soft comprising respectively Dissolved in agar medium (Dalbecco's Modification Eagle's Medium, GIBC0, containing 10% FCS (Fetal Calf Serum)) so that the concentration of soft agar powder from Nacalai Tesque is 0.6% Was prepared at 42 ° C, and each lmL (about 1 mm thick) was placed in a 35 mm diameter polystyrene dish (manufactured by SUMIL0N) and gelled at room temperature.
  • agar medium Dalbecco's Modification Eagle's Medium, GIBC0, containing 10% FCS (Fetal Calf Serum)
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-5) which can be used in the present invention obtained in Production Example 8 was sterilized by EOG in the same manner as in Production Example 4, and 1 g of the polymer was placed in 9 0 'MEM medium at 4 ° C. C. The mixture was dissolved in C, and each 0.5 mL (about 0.5 mm thick) was poured on the above soft agar gel and gelled at room temperature. The sol-gel transition temperature of this hydrogel / re was 18 ° C.
  • a tissue culture insert (manufactured by NUNC) with a pore size of 8. ⁇ is placed on the gel layer of the edible hide-mouth gel used in the present invention, and the human peripheral blood is placed therein.
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-5) obtained in Production Example 8 and usable in the present invention was sterilized by EOG in the same manner as in Production Example 4, and its lg was changed to 9 g of D'MEM medium (Dulbecco '). s Modification Eagle's Medium, GIBCO, containing 1% Fetal Calf Serum) under ice-cooling. When the sol-gel transition temperature of this aqueous solution was measured, the sol-gel transition temperature was 18 ° C.
  • the f ML P was dissolved in 4 ° C D of the high Dorogeru forming polymer (TGP- 5), in MEM medium (concentration: 1 0- 6 M).
  • the fMLP-containing high-mouth gel-forming polymer (TGP-5) D, MEM medium was placed in a 23 mL 1 mL syringe with a needle and cooled to 4 ° C.
  • One mL of this 4 ° C aqueous solution was extruded into 10 mL of phosphate buffered saline (PBS) at 37 ° C in a disposable centrifuge tube (14 mL, manufactured by Falcon), which was then thinned. String-like hydrogel was formed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the separation target is supplied to the separation medium in a fluidized state, and the necessary separation is performed by the temperature control means when performing the necessary separation with the separation medium. Since the temperature can be controlled, even after delicate separation, the separated components can be quickly and easily recovered.

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Abstract

分離対象物を流動状態で供給するための分離対象物供給手段と、分離媒体を収容するための分離媒体容器と、前記分離媒体容器の温度を制御するための温度制御手段と、前記分離媒体から分離物を回収するための回収手段とを少なくとも含む分離・回収装置。デリケートな分離を行った後に、分離された成分の速やか且つ容易な回収を可能とする分離・回収装置および分離・回収方法が提供される。

Description

明 細 書 分離 · 回収装置および分離 · 回収方法 技術分野 '
本発明は、 種々の試料 （例えば、 細胞および 又は生物等の生物 由来の試料） を、 該試料中に含まれる各成分の特性に応じて、 簡便 に分離 · 回収することが可能な分離 · 回収装置、 および分離 ' 回収 方法に関する。 背景技術
本発明の分離 · 回収装置および分離 · 回収方法の適用可能な範囲 は特に制限されないが、 ここでは説明の便宜のために、 生物関連試 料の分離 · 回収 （特に、 デリケートな条件下における分離 · 回収が 極めて好ましい） に関する背景技術について述べる。
従来よ り、 医療関連分野等においては、 臨床検査装置等の生物関 連試料 （例えば、 生化学的試料） の分離および Z又は分析装置が頻 繁に使用されて来た。 このよ うな分離 · 分析装置としては、 一般に 、 ガスクロマ トグラフィー、 液体ク ロマ トグラフィ一等のクロマ ト グラフィ一装置 ； 血球ないしは人工粒子 （例えばラテッタス粒子） 等の粒子の凝集反応を利用する分析装置 ； ァミ ノ酸分析装置等の分 析装置が典型的な例として挙げられる。 このよ うな分離および Z又 は分析装置においては、 必要に応じて、 それらの操作の少なく とも 一部が自動化された回収ないし希釈装置 （例えば、 クロマトグラフ ィー装置と組み合わせられるべき自動化フラクショ ンコレクター、 または凝集反応装置と組み合わせられるべき自動化希釈装置） が併 用されて来た （これら従来の分離およびノ又は分析装置の詳細に関 しては、 例えば、 分析化学ハン ドブック編集委員会編 「分析化学ハ ン ドブック」 朝倉書店、 1 9 9 2年を参照することができる） 。
しかしながら、 上記した従来の分離 · 分析装置を用いた際には、 例えば、 デリ ケートな条件下における分離 （例えば、 比較的微量な 成分の分離、 分解 · 変質し易い生物関連試料の分離） を'行った後に 、 分離された成分を速やかに且つ容易に回収することが、 必ずしも 容易ではなかった。 発明の開示
本発明の目的は、 上記した従来技術の欠点を解消できる分離 · 回 収装置および分離 · 回収方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、 従来の装置では困難であったような、 デリ ケートな分離を行った後に、 分離された成分の速やか且つ容易な回 収を可能とする分離 · 回収装置および分離 · 回収方法を提供するこ とにある。
本発明者は鋭意研究の結果、 分離対象物を流体状態で、 分離媒体 に供給するための分離対象物供給手段、 分離媒体を収容するための 分離媒体容器、 および分離媒体から分離物を回収するための回収手 段を組み合わせるのみならず、 更に分離媒体容器の温度を制御する ための温度制御手段をも組み合わせることが、 上記目的の達成のた めに極めて効果的なことを見出した。
本発明の分離 · 回収装置は上記知見に基づく ものであり、 よ り詳 しく は、 分離対象物を流動状態で、 分離媒体に供給するための分離 対象物供給手段と、
分離媒体を収容するための分離媒体容器と、
前記分離媒体容器の温度を制御するための温度制御手段と、 前記分離媒体から分離物を回収するための回収手段とを少なく と も含むことを特徴とするものである。
本発明によれば、 更に、 低温でゾル状態、 高温でゲル状態を呈す る熱可逆的なゾルーゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性高分子の水 溶液を用い、
( 1 ) 該ゾルーゲル転移温度よ り低温に保持した前記高分子の水 溶液を、 分離媒体容器に供給する工程、
( 2 ) 分離媒体容器を加温して、 高分子の水溶液をゲル化させる 工程、
( 3 ) 分離媒体容器の温度を高分子水溶液のゾルーゲル転移温度 より高温に維持しつつ、 該転移温度よ り高い温度に保持した分離対 象物を含む流体を、 分離媒体容器に供給して、 該流体を前記ゲルと 接触ざせる工程、 および
( 4 ) 前記ゾルーゲル転移温度よ り高温を保持しつつ、 分離対象 物を第 1の回収容器へ回収する工程、 を少なく とも含むことを特徴 とする分離 · 回収方法が提供される。
本発明は、 例えば、 以下の,態様を含む。
[ 1 ] 分離対象物を流動状態で、 分離媒体に供給するための分 離対象物供給手段と、
分離媒体を収容するための分離媒体容器と、
前記分離媒体容器の温度を制御するための温度制御手段と、 前記分離媒体から分離物を回収するための回収手段とを少なく と も含むことを特徴とする分離 · 回収装置。
[ 2 ] 分離媒体を流動状態で、 前記分離媒体容器に供給するた めの分離媒体供給手段を更に有する [ 1 ] に記載の分離 · 回収装置
[ 3 ] 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際に固体状態 である [ 1 ] または 「 2 ] に記載の分離 · 回収装置。 [ 4 ] 前記分離媒体が、 温度変化に応じた変化を生ずる媒体で ある [ 1 ] 〜 [ 3 ] のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
[ 5 ] 前記温度変化に応じた変化が、 相変化、 粘度の変化、 分 離能の変化、 疎水性の変化、 および架橋密度の変化からなる群から 選ばれる少なく とも 1種の変化である [ 4] に記載の分離 · 回収装 置。
[ 6 ] 前記相変化が、 ゾルーゲル転移である [ 5 ] に記載の分 離 · 回収装置。
[ 7 ] 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際にゲル状態 である [ 1 ] 〜 [ 6 ] のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
[ 8 ] 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際にゲル状態 であり、 且つ分離物を回収する際にゾル状態である [ 7 ] に記載の 分離 · 回収装置。
[ 9 ] 前記ゾル状態が、 3 7 °C以下の低温におけるゾル状態で ある [ 8 ] に記載の分離 · 回収装置。
[ 1 0 ] 前記分離対象物が生体関連物質である [ 1 ] 〜 [ 9 ] のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
[ 1 1 ] 前記生体関連物質が細胞分散体である [ 1 0 ] に記载 の分離 · 回収装置。
[ 1 2 ] 前記温度制御手段がペルチェ素子を含む [ 1 ] 〜 [ 1 1 ] のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
[ 1 3 ] 前記分離媒体容器がマルチウエルプレー トである [ 1 ] 〜 [ 1 2 ] のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
[ 1 4 ] 低温でゾル状態、 高温でゲル状態を呈する熱可逆的な ゾル—ゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性高分子の水溶液を用い、
( 1 ) 該ゾルーゲル転移温度よ り低温に保持した前記高分子の水 溶液を、 分離媒体容器に供給する工程、 ( 2 ) 分離媒体容器を加温して、 高分子の水溶液をゲル化させる 工程、
( 3 ) 分離媒体容器の温度を高分子水溶液のゾルーゲル転移温度 より高温に維持しつつ、 該転移温度より高い温度に保持した分離対 象物を含む流体を、 分離媒体容器に供給して、 該流体を'前記ゲルと 接触させる工程、 および （ 4 ) 前記ゾルーゲル転移温度よ り高温 を保持しつつ、 分離対象物を第 1の回収容器へ回収する工程、 を少 なく とも含むことを特徴とする分離 · 回収方法。
[ 1 5 ] 前記工程 （ 4) の後に、 分離媒体容器を前記ゾルーゲ ル転移温度よ り低温に冷却してハイ ドロゲルをゾル状態とし、 分離 対象物を含む高分子水溶液を第 2の回収容器へ回収する工程を更に 含む [ 1 4 ] に記載の分離 '· 回収方法。
[ 1 6 ] 前記分離対象物が、 細胞分散液である [ 1 4] または 「 1 5 ] に記載の分離 · 回収方法。
[ 1 7 ] 前記高分子水溶液が、 更に走化因子を含む [ 1 4 ] 〜
[ 1 6 ] のいずれかに記載の分離 · 回収方法。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の装置を用いる分離方法の一態様 （分離媒体を容 器に供給する工程） を説明するための模式斜視図である。
図 2は、 本発明の装置を用いる分離方法の一態様 （分離対象物を 容器に供給する工程） を説明するための模式斜視図である。
図 3は、 本発明の装置を用いる分離方法の一態様 （分離対象物を 回収する工程） を説明するための模式斜視図である。
図 4は、 本発明の装置の一態様を示す模式平面図である。
図 5は、 本発明の装置の一態様を示す模式斜視図である。
図 6は、 本発明の好適な態様の模式斜視図である。 図 7は、 本発明の他の好適な態様の模式斜視図である。 この図 7 は、 細胞 · 生物の懸濁液と、 走化因子を含有する本発明のハイ ド口 ゲルとを接触させ （図 7 ( a ) ) ； 走化因子に親和性を有する細胞 を、 選択的に本発明のハイ ドロゲルに取り込ませ （図 7 ( b ) ) ； 分画細胞を含む本発明のハイ ドロゲルを細胞懸濁液と分離し （図 7 ( c ) ) 、 冷却によ りゲルをゾル化させ、 分画細胞を回収する （図 7 ( d ) ) 態様を示している。 発明を実施するための最良の形態
以下、 必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明 する。 以下の記载において量比を表す 「部」 および 「％」 は、 特に 断らない限り質量基準とする。
(分離 · 回収装置）
本発明の分離 · 回収装置は、 分離対象物を流動状態で、 分離媒体 に供給するための分離対象物供給手段と ； 分離媒体を収容するため の分離媒体容器と ； 前記分離媒体容器の温度を制御するための温度 制御手段と ； 前記分離媒体から分離物を回収するための回収手段と を少なく とも含む。
(好適な一態様）
図 1〜図 3は、 本発明の分離 · 回収装置の好適な一態様の使用方 法の一例を説明するための模式斜視図である。 この態様例において は、 低温でゾル状態、 高温でゲル化する熱可逆的なゾルーゲル転移 現象を示すハイ ドロゲルを、 分離媒体として用いている。
図 1 ( a ) を参照して、 上記したような熱可逆ハイ ド口ゲル水溶 液のゾルーゲル転移温度よ り低温に保持した熱可逆ハイ ド口ゲル水 溶液の保管容器 （分離媒体供給手段） 1から、 低温ゾル状態の走化 因子 （chemotactic factor) を含む熱可逆ハイ ドロゲル水溶液を所
6
差替え用紙 (¾126) 2005/002369
定量採取し、 該低温に保持した分離媒体容器 （分画容器） へ所定量 を供給 （ないし分注） する。 次いで、 図 1 ( b ) に示すように、 温 度制御手段 （例えば、 ペルチェ素子） 3によ り、 分離媒体容器 2を 加温してゾルーゲル転移温度よ り高温とし、 走化因子を含む熱可逆 ハイ ドロゲル水溶液をゲル化させる。
図 2 ( a ) を参照して、 分離媒体容器 2の温度を、 温度制御手段
6/1
差替え用弒（規則26) (例えば、 ペルチェ素子） 3によ り、 熱可逆ハイ ド口ゲル水溶液の ゾルーゲル転移温度よ り高温に維持して、 該転移温度より高い温度 に保持した分離対象物供給手段 （細胞分散液保管容器） 4から、 細 胞分散液を所定量採取し、 該高温に保持した分離媒体容器 2へ所定 量を分注する。 次いで、 図 2 ( b ) に示すように、 該高温の分離媒 体容器 2内で所定時間、 該ハイ ドロゲルと該細胞分散液を接触させ る。 この図 2 ( b ) の状態において、 分離対象物たる細胞は、 その 走化性に基づき、 ハイ ド口ゲル （分離媒体） 中に含まれる走化因子 の濃度に応じて、 該ハイ .ドロゲル内部に移行する。
更に、 図 3 ( a ) を参照して、 該高温のまま細胞分散液を分離媒 体容器 2から採取して第 1の回収容器 5へ分注する。 更に、 分離媒 体容器 2の温度を熱可逆ハイ ド口ゲル水溶液のゾルーゲル転移温度 よ り低温に冷却して該ハイ ドロゲルをゾル状態と し、 細胞を含む熱 可逆ハイ ド口ゲル水溶液を第 2の回収容器 6へ分注することができ る。
(各部の構成）
以下、 本発明の分離 · 回収装置の各部ないしこれに使用すべき他 の要素 （例えば、 分離媒体、 分離対象物） の構成について述べる。 なお、 下記の構成要素のう ち、 分離媒体および分離媒体容器以外の 要素の構成については、 公知の構成 （例えば、 前述した 「分析化学 ハンドブック」 (朝倉書店） 、 および中村洋監修 「分析試料前処理 ハンドブック」 丸善、 2 0 0 3年に記載されているよ うなもの） を 用いることができる。
(分離対象物）
後述する分離媒体によ り分離が可能である限り、 本発明において 使用可能な分離対象物は特に制限されない。 本発明において使用可 能な分離対象物の例を、 以下に列挙する。
7 ( 1 ) 生体試料 （血液試料 （血清、 血しょ う、 血球）
(アミ ノ酸、 ペプチド、 タンパク質 ； 糖、 糖アルコールおよび関連 化合物 ； カルポン酸 ； ステロイ ド、 胆汁酸 ； プロスタグランジンお よび関連化合物 ； 脂質および関連化合物 （コ レステロール、 ト リ グ リセリ ド、 リ ン脂質、 遊離脂肪酸、 過酸化脂質など） ； '核酸および 関連化合物 ； 力テコールァミ ンおよび代謝物 ； セロ トニンおよびト リ ブ トファン代謝物 ； ヒスタ ミ ンおよびヒスチジン代謝物 ； ジアミ ンおよびポリ アミ ン ； ビタ ミ ンおよびビタ ミ ン様作用物質 ； カルボ ニル化合物 ； チオールおよび関連化合物 ； フエノールおよび関連化 合物 ； 生体内色素 (へモグロ ビン、 ピリルビン、 ゥロブリ ン体など ) ； 陽イオン ； 陰イオン ； 内分泌攪乱化学物質 ； ダイォキシン ； 尿 試料 ；.臓器 ； 筋肉 ； 皮膚 ； 脂肪組織 ； 唾液 ； 胃液 ； 髄液 ； 汗 ； 乳汁 ； 毛髪 · 体毛 ； 爪 · 歯 · 骨 ； 吐瀉 ； その他）
( 2 ) 医薬品試料 （剤型別の前処理 （錠剤 ； 散剤、 顆粒剤 ； カプセ ル剤 ； シロ ップ剤 ； エキス剤 ； トローチ剤、 舌下錠 ； 吸入薬 ； 注射 薬 ； 点眼薬 ； 軟膏、 ク リーム ； 座薬 ； 貼付薬） ； 生体試料中の医薬 品 （血液 ； 尿 ； 唾液 ； 乳 ； 毛髪） ； 生薬 （根 · 根茎など ； 葉類 ； 花 類 ； 果実 · 種子類 ； 茎枝類 ； 皮類 ； 木類 ； 草類）
( 3 ) 香粧品試料
( 4 ) 食品試料 （主要成分 （水分 ； タンパク質 ； 脂質 ； 炭水化物 ； 食物繊維 ； 無機成分 （灰分、 ミネラル） ； 微量成分 （ビタ ミ ン （水 溶性 ； 脂溶性 ； アミ ノ酸 ； 脂肪酸 ； 有機酸 ； 核酸 ； ステロール類）
； その他 （ダイォキシン、 PCB；食品に残留する動物用医薬品 ； 食 品に残留する農薬 ； 食品添加物 ； 有害金属 ； 魚介独毒 ； 遺伝子組換 ロロ
( 5 ) 水試料 （無機 ； 有機）
( 6 ) 大気試料 （無機 ； 有機）
8 ( 7 ) 自動車 · 排ガス
( 8 ) 土壌 · 底質試料 （無機 ； 有機）
( 9 ) 岩石試料 （無機 ； 有機）
( 1 0 ) 香料
( 1 1 ) 高分子試料 '
( 1 2 ) 有機合成高分子試料
( 1 3 ) 電子材料 （有機 · 無機）
( 1 4 ) 半導体 · プロセス材料 ぐ無機 ； 有機）
( 1 5 ) 鉄鋼材料
( 1 6 ) 非鉄金属材料
( 1 7 ) セラ ミ ツクス試料
( 1 8 ) ガラス試料 .
( 1 9 ) セメ ン ト · 無機試料
特に、 上記した生体関連試料と しては、 生物 （ヒ ト、 動物、 植物 等） の細胞 （癌細胞、 胚性幹細胞、 体性幹細胞、 血管内皮細胞、 肝 細胞、 骨芽細胞、 軟骨細胞、 神経細胞、 繊維芽細胞、 造血幹細胞、 膝島細胞、 白血球、 リ ンパ球等） が挙げられる。
上記した中でも、 本発明の装置によるデリケー トな分離に適した 点からは、 生物関連試料に対する使用が、 特に有利である。
本発明において、 分離対象物は、 分離対象物供給手段によ り分離 媒体に対して供給される際に流動状態となっていれば足りる。 すな わち、 貯蔵ないし保管されている状態においては、 分離対象物は必 ずしも流動状態であることは必須ではない。
(分離対象物供給手段）
本発明において、 分離対象物供給手段は、 分離対象物を流動状態 で、 分離媒体に供給する機能を有する。 このよ うな機能を発揮する ことが可能な限り、 分離対象物供給手段の構成は特に制限されない
9 。 例えば、 分離対象物供給手段は、 分離対象物を貯蔵ないし保管す るための貯蔵容器、 流動状態と した分離対象物を送液するための送 液手段 （例えばポンプ） 、 および流動状態と した分離対象物を分離 媒体容器まで案内するための流路を含むことができる。
(分離媒体供給手段） '
本発明の装置は、 必要に応じて、 更に分離媒体供給手段を有して いてもよい。 この分離媒体供給手段は、 分離媒体容器に、 分離媒体 を供給する機能を有する。 このよ うな機能を発揮することが可能な 限り、 分離媒体供給手段の構成は特に制限されない。 例えば、 分離 媒体供給手段は、 分離媒体を貯蔵ないし保管するための貯蔵容器、 流動状態とした分離媒体を送液するための送液手段 （例えばポンプ ) 、 および流動状態とした分離媒体を分離媒体容器まで案内するた めの流路を含むことができる。
(分離媒体容器）
分離媒体容器は、 分離媒体を収容する機能を有する。 このよ うな 機能を発揮することが可能な限り、 分離媒体容器の構成 （例えば、 材質、 形状、 個数、 サイズ等） は特に制限されない。 例えば、 一本 の試験管、 ビーカー、 フラスコ、 ペト リ皿等を分離媒体容器として 使用することも、 もちろん可能である。
本発明に好適な分離媒体容器の材質、 形状、 個数、 サイズは、 以 下の通りである。
材質 ： ガラス、 ステンレス、 プラスチック
形状 ： 円柱状、 直方体状、 球状
個数 ： ；！〜 3 0 0 0
サイズ ： 1 L〜 1 0 0 L
本発明においては、 必要に応じて、 生化学的測定ないし臨床検査 において頻繁に使用される、 いわゆるマルチウエルプレー トを分離
10 媒体容器と して使用することもできる。 このよ うなマルチウヱルプ レー トは、 例えば、 個々が分離媒体容器に相当するゥエルの数が、
6〜 3 8 4個程度、 サイズが 5〜 1 5 c m (縦） X 1 0 c m〜 3 0 c m (横） 程度、 厚さが 0. 5〜 5 c m程度のものが好適に使用可 能である。 このようなマルチウエルプレー トの市販品と'しては、 例 えば、 ベタ トン ' ディ ッキンソン社製の商品名 「ファルコン マル チウエルプレー ト」 の製品を挙げることができる。
なお、 いわゆるコ ンビナト リアル化学等において好適に使用可能 な、 マイクロ反応空間を与えるマイクロ リアクター、 マイクロチヤ ネル、 マイ ク ロプラント等の微小な溝を有する容器を、 本発明にお いて使用することもできる。
(分離媒体）
本発明において、 分離媒体は、 分離対象物を分離するための場 （ field) を与える機能を有する。 また、 必要に応じて、 この分離媒 体は、 その中に 1種以上の添加物 （例えば、 上記した細胞の走化因 子） を含んでいてもよい。 本発明においては、 結果と して分離対象 物の分離が実現できる限り、 その途中の経過は問わない （例えば、 この分離に際して、 分離対象物の 1種以上の反応が伴うことも許容 される） 。
本発明において、 分離媒体は、 上記の機能を発揮することが可能 である限り、 その種類、 化学的組成、 量等は特に制限されない。 本 発明においては、 例えば、 固体、 比較的に高粘度の流動体、 ゲル等 が好適に使用可能である。 以下に、 本発明において使用可能な分離 媒体の例を列挙する。
( 1 ) 固体 ： 炭酸カルシウム、 イオン交換樹脂、 セルロース類、 シ リ力ゲル、 等
( 2 ) 高粘度の液体 ： 親水性高分子水溶液、 油、 シリ コーン油、 パ
11 ラフィン油、 等
( 3 ) ハイ ド口ゲル ： アク リルアミ ドゲル、 ァガロースゲル、 寒天 ゲル、 等
上記した中でも、 温度変化に基づく相変化により、 分離媒体の好 適な移送、 回収、 および分離操作が可能な点からは、 後'述するよう な、 温度可逆的なゾル—ゲル変化を示すハイ ドロゲルを用いること が好ましレヽ。
(温度制御手段）
本発明において、 温度制御手段は、 分離媒体容器の温度を制御す る機能を有する。 このような機能を発揮することが可能である限り 、 その種鎮、 構成、 個数等は特に制限されない。 以下に、 本発明に おいて使用可能な温度制御手段の例を列挙する。
( 1 ) 加熱手段と しては、 例えば、 通電によ り発熱する性質を有す るもの （ニク ロ ム、 酸化スズ、 酸化イ ンジウム、 炭素等） で直接的 に分離媒体容器を加熱するか、 または空気や水等の熱媒体を介して 、 間接的に分離媒体容器を加熱する方法等を選択できる。
( 2 ) 冷去 P手段と しては、 例えば、 液体の気化熱を利用したいわゆ るヒー トポンプや、 固体の融解熱 （例えば、 氷） を直接利用したり 、 冷媒を介して間接的に冷却する方法等を選択できる。
( 3 ) 温度制御素段と しては、 例えば、 熱電対ゃサーミ スタ等のセ ンサ一で温度を検知して、 加熱手段および/又は冷却手段の O N Z O F F等を選択できる。
上記した中でも、 加熱および冷却が可能であり、 且つ冷媒等の媒 体が不要 （したがって装置が簡潔化が可能） な点からは、 電気的な いし電子的な素子 （例えばペルチ 素子） が好適に使用可能である
(回収手段）
12 本発明において、 回収手段は、 前記分離媒体から分離物 （必要に 応じて、 分離媒体とともに） を回収する機能を有する。 このよ うな 機能を発揮することが可能である限り、 その種類、 構成、 個数等は 特に制限されない。 例えば、 回収手段は、 分離媒体を回収ないし貯 蔵するための回収容器、 分離物を送液するための送液手段 （例えば ポンプ） 、 および分離物を回収容器まで案内するための流路を含む ことができる。
本努明の装置は、 必要に応じて、 2個以上の回収手段を有してい てもよい。 このよ うに本発明の装置が 2個以上の回収手段を有して いる場合には、 それぞれの回収手段に分離に関連する異なる分離後 の成分を回収 （更にはリサイクル） することが容易となる。
(分離 · 回収装置の一態様）
図 4は、 本発明の分離 · 回収装置の一態様を示す模式平面図であ り、 図 5は、 その模式斜視図である。 図 4および図 5において、 参 照記号は、 それぞれ以下のよ うな関連性を有する部分を示す。
分離媒体容器 ： 2 4—ゥエルプレート 5 0
温度制御手段 ： ペルチェ ' ユニッ ト 4 4、 ケーブル 4 2 4 3、 ヒータ温調ユニッ ト 4 5、 水冷却ユニッ ト 4 6、
分離対象物供給/回収手段 ： 分注ポンプ 4 1、 分注ポンプ移動レ ール 4 9、 1 0 0 0 μ Ι チップ X 9 6本 4 7、 チップ廃棄ボック ス 4 8
本発明の分離 · 回収装置および分離 · 回収方法は上記した構成を 有するが、 このような装置ないし方法において好適に使用可能な分 離媒体 （ゲル） 等の材料、 およびこれらの装置等と必要に応じて組 み合わせて使用可能な各種の方法について、 以下に述べる （説明の 便宜上、 走化性に関連する細胞等の分離に本発明を応用する態様を 中心に述べる） 。
13 (ゲル)
本発明は、 例えば、 細胞および Z又は生物 （以下、 「細胞 · 生物 」 という） を、 化学走性または場の性質の強弱に従って移動する性 質 （電気走性、 磁気走性、 光走性、 温度走性、 粘度走性など） を利 用して、 細胞、 微生物等を分離するためのハイ ドロゲル'、 およびこ のよ う なハイ ドロゲルを利用する細胞 · 生物の分離方法に応用する ことができる。
よ り 詳しくは、 本発明は、 多ぐの生物に本質的に備わっている生 理活性物質の濃度に従って移動する性質 （化学走性） 、 または場の 性質の強弱に従って移動する性質を利用して、 細胞、 微生物等を選 択的に移動させ、 これによ り該細胞 · 生物を分離する （すなわち、 分離 （分画、 分別、 ないし分取） 等の、 選択的な移動を伴う操作を 行う） ためのハイ ドロゲルおよびこのようなハイ ド口ゲルを利用す る細胞 · 生物の分離方法に応用することができる。
本発明の装置等を利用して、 例えば、 ア ト ピー性皮膚炎、 アレル ギー、 リ ゥマチ等の免疫疾患に関連する因子に対する化学走性能の 差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが 可能となる。
更には、 本発明の装置等を利用して、 例えば、 癌の治療法に関連 し癌細胞の転移現象等に関連する因子に対する化学走性能の差異に よって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが可能と なる。
更には、 本発明の装置等を利用して、 例えば、 再生医療の分野に 関連し血管、 神経等の組織、 臓器の誘導、 形成、 再生等に関連する 因子に対する化学走性能の差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが可能となる。
更には、 本発明の装置等を利用して、 例えば、 優良精子の選別技
14 術等に関連し運動能等の差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 な いし分取等） する ことが可能となる。
更には、 本発明の装置等を利用して、 例えば、 電場に対する走性 (電気泳動度等） の差異を利用して細胞を分離 （分画、 分別、 ない し分取等） するこ とが可能となる。 '
一般的に、 運動能を有する生物 （ないしは、 その部分） が、 外部 からの刺激に反応して運動を起こし、 その運動性に一定の方向性が 認められる場合、 この生物の有する性質を走性と呼び、 一般によく 知られた性質である。 この刺激が物質である場合には、 その性質は 化学走性と呼ばれる。 他方、 その刺激が物理的刺激の場合には、 そ の物理的刺激に じて、 電気走性、 磁気走性、 光走性、 温度走性、 粘度走性等と呼ばれている。
上述したような運動能を有する生物と しては下等動物、 植物、 微 生物、 細胞 ·生物が挙げられ、 地球上のほとんどの生物が走性能を 有している と考えられる。 近年、 種々の走性に関する研究の発展に 伴い、 生物の走†生、 特に細胞の走性が生体の重要な機能を荷ってい ることが判明してきた。
例えば、 血管の誘導、 再生には血管内皮細胞の増殖が必要であり 、 血管内皮細胞増殖因子濃度に勾配があるよ うな場に応じて血管が 誘導、 再生されること即ち血管内皮細胞の化学走性能によって誘導 、 再生が行われていることが判明している。 また、 栄養要求性の高 い癌細胞は、 血管内皮細胞増殖因子を分泌することによ り、 ホス ト の血管から癌組,織へ血管を誘導することが良く知られている。 更に 、 血管系は酸素濃度の勾配によっても誘導、 再生されることが判明 している。 血管系の重要な機能が組織、 臓器に酸素を供給すること であることから、 低酸素領域に血管系を誘導、 再生し酸素濃度をコ ントロールするための機能と考えられる。 即ち、 血管内皮細胞は酸
15 素に対して負の化学走性能を示すことになる。
同様に神経網の誘導、 再生も、 生体内では場に神経細胞増殖因子 の濃度勾配を付与することによ り巧妙に行われている。 また、 ァレ ルギー反応を惹起するァレルゲンに反応して白血球等の免疫関連細 胞の化学走性が発揮され、 白血球等が反応部位に集積ざれることは 良く知られている。 更には、 癌の転移現象についても化学走性能の 高い癌細胞によつて起こる可能性が高まつている。
他方、 新しい抗癌剤の開発に於いて、 免疫関連細胞に対して化学 走性を惹起する性質を有し、 且つ癌組織に選択的に集積する薬剤が 注目を集めている。 即ち、 化学走性を利用した薬剤の開発が期待さ れている。
上記したよ うな化学走性以外に、 物理的刺激による走性も良く知 られている。 例えば、 植物の光の方向への成長は走光性と して良く 知られている。 また、 細胞電気泳動に於いて種々の電気走性能を示 す細胞が知られている。 更には、 精子等の蓮動能の高い細胞は、 そ の運動能と機能との高い相関性を有することが判明してきている。 以上のよ うに生物、 特に細胞の有する走性能、 特に化学走性能は 生体の機能制御にとつて非常に重要な性質であり、 生命現象を理解 しょう とい う観点から、 更には、 前述したよ うに各種の免疫疾患、 癌等に対する新しい治療法の開発、 更には病変または欠損している 組織、 器官を誘導、 再生する為の再生医療の開発という観点から、 近年、 大いに注目を集めている。
このよ う に重要な生物の機能である走性能を測定する装置に関し ては従来から研究開発が行われており、 細胞懸濁液と化学走性因子 溶液との間に微孔性の膜を設置し、 該膜の微孔を通過して因子側に 移行する細胞数を測定するボイデンチャンパー方式と、 微孔性膜の かわりに細胞がギリ ギリ通過できる微少流路をシリ コン単結晶基板
16 上に多数形成したアレイ を用いて、 細胞懸濁液と化学走性因子溶液 とを接触させ該微少流路を通過する細胞数を顕微鏡観察によって測 定する方法等である。 しかしながら、 従来、 開発されてきたこれら の装置、 または方法を用いた場合には、 特定の化学走性因子に対し てある閾値以上の化学走性能を有する細胞の数のみの測定しかでき なレ、。
我々の生体を構成している組織、 臓器は非常に多くの種類の細胞 から形成されている。 更に細胞はその環境によって絶えず変化して いると考えられている。 例えば、 免疫担当細胞群も多種の細胞から 成っていて、 リ ンパ球と マク ロファージに大別される。 リ ンパ球に は B リ ンパ球と Tリ ンパ球があり、 B ンパ球は外部刺激によ り多 くの形質細胞へと分化する。 一方、 Tリ ンパ球はその機能によって キラー T細胞、 ヘルパー T細胞、 サブレッサー T細胞等、 生物の多 様な T細胞サブポピュ レーシ ョ ン （subpopulat i on) に分類される 。 また、 マクロファージについても、 多様なサブポピュ レーシ ョ ン が存在することが明らかになりつつある。
また、 癌組織中の癌細胞も多様で、 薬剤または放射線耐性、 増殖 能、 転移性等に大きな分布が存在するこ とが判明している。 更には 、 骨髄中に存在する幹細胞は環境によって多様な細胞に分化するこ とも良く知られている。
当然のことながら、 これらの多種多様な細胞群はそれぞれ独自の 走性能を有しており、 それぞれの走性能毎に細胞の分画ができ、 更 に、 それぞれの走性能を有する細胞を分別、 分取することが可能と なれば、 細胞機能の解明に向かって大きな前進となる。 そして今日 、 有効な治療法のない免疫関連疾患、 癌等の新しい治療法の開発、 およびよ り効率の良い驵織 · 器官の再生医療技術の開発が可能にな るものと考えられる。
17 しかしながら、 前述したように、 現在の細胞走性能の測定技術で は、 多様な走性能を有する細胞 ， 生物の分離 （分画、 分別ないし分 取等） は実際には不可能である。
この本発明の態様によれば、 上記した従来技術の欠点を解消する ように、 細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル等と併用するごとができる この本発明の態様によれば、 更に、 上述したように従来の技術で は達成し得なかった多様な走性能を有する細胞 · 生物の分離 （分画 、 分別ないし分取等） を可能にするように、 ハイ ド口ゲル等と併用 することができる。
この本発明の態様によれば、 更に、 ハイ ドロゲルを用いて、 それ ぞれの走性能に応じて細胞 · 生物を分離するよ うに、 ハイ ドロゲル 等と併用することができる。
この本発明の態様においては、 特定の構成を有するハイ ドロゲル 、 ないしは特定の物質のゲル内またはゲル内外の濃度差を実現でき るハイ ド口ゲルを利用して、 細胞 · 生物の分離を行う ことができる 本態様で用いる細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲルは、 生理活性物質 の濃度差に応じて、 細胞の選択的な移動を可能とする細胞 · 生物分 離用ハイ ド口ゲルである。
本態様では、 例えば、 低温でゾル状態、 高温でゲル化する熱可逆 的なゾルーゲル転移現象を示し、 且つゾルーゲル転移温度よ り高い 温度で該ゲルは実質的に水不溶性である上記細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲルを使用することができる。
本態様では、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移温度よ り低 い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高
18 い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物 を用い ；
前記ゲル形成性の組成物のゾル—ゲル転移温度より高い温度で、 ゲル状態の該組成物の一方の面側に生理活性物質を含有する水溶液 を接触させ、 且つ、 該ゲル状態の組成物の他方の面側に'細胞 · 生物 の懸濁液を接触させる工程、
ゲル状態の組成物内に生理活性物質の濃度勾配を形成しつつ、 該 濃度勾配によって惹起される化学走性によって、 前記懸濁液から細 胞 · 生物をゲル状態の組成物内に移行させる工程、
該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 を使用することができる。
本態様では、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移温度よ り低 い温度では可逆的にゾル状態と なり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高 い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物 を用い ；
ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で、 ゾル状態の前記ゲル形成性 の組成物に細胞 · 生物を添加して、 該組成物内に細胞 · 生物を懸濁 させる工程、
細胞 · 生物が懸濁した前記ゾル状態の組成物を、 そのゾルーゲル 転移温度よ り高い温度でゲル化 させ、 細胞 · 生物が実質的に均一に 内部に分散したゲル状態の組成物を形成する工程、
ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度で、 前記ゲル状態の組成物を、
19 生理活性物質を含有する水溶液に接触させる工程、
前記ゲル状態の組成物内に生理活性物質を移行させて、 組成物中 に生理活性物質の濃度勾配を形成させつつ、 該濃度勾配にしたがつ て該組成物中の細胞 · 生物を、 その化学走性能の違いによってゲル 状態の組成物内で再配置させる工程、 '
該細胞 · 生物が再配置したゲノレ状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該耝成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾル—ゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 を使用することができる。
本態様では、 更に、 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低 い温度では可逆的にゾル状態と なり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高 い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物 を用い ；
前記ゲル形成性の組成物を、 そのゾルーゲル転移温度よ り低い温 度でゾル状態とし、 該ゾル状態の組成物中に生理活性物質を実質的 に均一に混合する工程、
該ゾル状態の組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 所定 の形状を付与したゲル状態とする工程、
ゾルーゲル転移温度より高い温度で、 該ゲル状態の組成物を細胞 ♦ 生物の懸濁液と接触させて、 該懸濁液から細胞 · 生物をゲル状態 の組成物内に移行させる工程、
細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物を、 細胞 · 生物の懸濁液 から分離する工程、 および、
分離したゲル状態の組成物を ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度で
20 ゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物から、 該組成物内に移行した細 胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法を 使用することができる。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
ゲル状態の前記ゲル形成性の組成物を、 物理的性質が連続的に変 化する場に配置し、 該物理的性質の勾配を該ハイ ドロゲル内に形成 する工程、
該ゲル状態の組成物を細胞 · 生物の懸濁液に接触させ、 それぞれ の性質の勾配によって惹起される走性によって、 該細胞 · 生物の懸 濁液から該ゲル状態の組成物内に細胞 · 生物を移行させる工程、 該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 を使用することができる。
本態様では、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低 い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高 い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物 を用い ；
前記ゲル形成性の組成物をゾルーゲル転移温度よ り低い温度でゾ ル状態と し、 該ゾルに細胞 · 生物を添加して、 細胞 · 生物が懸濁し
21 た組成物を形成する工程、
該細胞 · 生物が懸濁した組成物をゾル一ゲル転移温度よ り高い温 度でゲル化させ、 該細胞 ·生物が実質的に均一に内部に分散したゲ ル状態の組成物を形成する工程、
該ゲル状態の組成物を物理的性質が連続的に変化する場に配置し て、 該組成物中にそれぞれの物理的性質の勾配を形成する工程、 該物理的性質の勾配に従って、 ゲル状 Iの組成物中に実質的に均 一に分布していた細胞 · 生物を、 それぞれの物理的性質に対する走 性能の違いによつてゲル状態の組成物で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の糸且成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度より低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 を使用することができる。
(具体的なゲル · 方法）
よ り具体的には、 本発明は、 以下のよ うなゲルないし方法と組み 合わせて、 好適に使用可能である。
[ 1 ] 生理活性物質の濃度差に応じて、 細胞の選択的な移動を可 能とする細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
[ 2 ] 前記選択的な移動が、 前記ゲル と外部環境との間の移動で ある [ 1 ] に記載の細胞 ·生物分離用ハイ ド口ゲル。
[ 3 ] 前記選択的な移動が、 前記ゲル内における移動である [ 1 ] に記載の細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
[ 4 ] 前記ハイ ドロゲルが、 低温でゾル状態、 高温でゲル化する 熱可逆的なゾル—ゲル転移現象を示し、 且つゾルーゲル転移温度よ り高い温度で該ゲルは実質的に水不溶性である [ 1 ] 〜 [ 3 ] のい
22 ずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル。
[ 5 ] 前記ハイ ドロゲルが 0 °Cよ り高く 4 5 °C以下のゾル—ゲル 転移温度を有する [ 4 ] に記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル。
[ 6 ] 前記ハイ ド口ゲルが生理活性物質を含有し、 且つ該生理活 性物質がハイ ド口ゲルの内部と外部で濃度差を有する 〜 [ 5 ] のいずれかに記載の細胞 ' 生物分離用ハイ ドロゲル。
[ 7 ] 前記ハイ ド口ゲルが生理活性物質を実質的に含有せず、 且 っ該生理活性物質がハイ ドロゲルの内部と外部で濃度差を有する [ 1 ] 〜 [ 5 ] のいずれかに記載の細胞 . 生物分離用ハイ ド口ゲル。
[ 8 ] 前記ハイ ドロゲルの内部で生理活性物質の濃度勾配が形成 されている [ 1 ] 〜 [ 7 ] のいずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハ ィ ド口.ゲル。
[ 9 ] 場 （field) の物理的性質が勾配を有し、 且つ該物理的性 質の勾配に基づく走性の差異によ り細胞 · 生物が分離される [ 1 ] 〜 [ 7 ] のいずれかに記載の細胞 . 生物分離用ハイ ド口ゲル。
[ 1 0 ] 前記ハイ ドロゲルが、 水と、 曇点を有する複数のプロ ッ ク と親水性のブロ ックとが結合してなるハイ ドロゲル形成性高分子 とを含む [ 1 ] 〜 [ 9 ] のいずれかに記載の細胞 ' 生物分離用ハイ ドロゲル。
[ 1 1 ] 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲ ル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では 可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では 実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物のゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 ゲル状態の該組成物の一方の面側に生理活性物質を含有する水溶液 を接触させ、 且つ、 該ゲル状態の組成物の他方の面側に細胞 · 生物 の懸濁液を接触させる工程、
23 ゲル状態の組成物内に生理活性物質の濃度勾配を形成しつつ、 該 濃度勾配によって惹起される化学走性によって、 前記懸濁液から細 胞 ·生物をゲル状態の組成物内に移行させる工程、
該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
[ 1 2 ] 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子と を少なく とも含むゲ ル形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度では 可逆的にゾル状態となり、 該ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度では 実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で、 ゾル状態の前記ゲル形成性 の組成物に細胞 · 生物を添加して、 該耝成物內に細胞 · 生物を懸濁 させる工程、
細胞 · 生物が懸濁した前記ゾル状態の組成物を、 そのゾルーゲル 転移温度よ り高い温度でゲル化させ、 細胞 · 生物が実質的に均一に 内部に分散したゲル状態の組成物を形成する工程、
ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度で、 前記ゲル状態の組成物を、 生理活性物質を含有する水溶液に接触させる工程、
前記ゲル状態の組成物内に生理活性物質を移行させて、 組成物中 に生理活性物質の濃度勾配を形成させつつ、 詨濃度勾配にしたがつ て該組成物中の細胞 · 生物を、 その化学走性能の違いによってゲル 状態の組成物内で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
24 前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
[ 1 3 ] 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子と を少なく 'とも含むゲ ル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では 可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では 実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物を、 そのゾルーゲノレ転移温度よ り低い温 度でゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物中に生理活性物質を実質的 に均一に混合する工程、
該ゾル状態の組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 所定 の形状を付与したゲル状態とする工程、
ゾルーゲル転移温度より高い温度で、 該ゲノレ状態の組成物を細胞 • 生物の懸濁液と接触させて、 該懸濁液から細胞 · 生物をゲル状態 の組成物内に移行させる工程、
細胞 ♦ 生物が移行したゲル状態の組成物を、 細胞 · 生物の懸濁液 から分離する工程、 および、
分離したゲル状態の組成物をゾル—ゲル転移温度よ り低い温度で ゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物から、 該組成物内に移行した細 胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法。
[ 1 4 ] 前記ハイ ド口ゲル形成性の組成物が、 0 °Cよ り高く 4 5 °C以下であるゾルーゲル転移温度を有する [ 1 1 ] 〜 [ 1 3 ] のい ずれかに記載の細胞 · 生物の分離方法。
[ 1 5 ] 細胞 · 生物が移行または再配置されたゲル状の組成物か ら、 走化性能または移行距離の異なる細胞 · 生物を含有する複数の 部分をそれぞれ分離して、 該複数の部分のゲノレ状の組成物から細胞
25 • 生物を回収する [ 1 1 ] 〜 [ 1 4] のいずれかに記載の細胞 ' 生 物の分離方法。
[ 1 6 ] 前記ハイ ドロゲルに付与する所定の形状が、 表面積 （ S ) 体積 （V) 比が 1 0 ( c m— 1 ) 以上の形状である [ 1 3 ] に 記載の細胞 · 生物の分離方法。 '
[ 1 7 ] 前記ハイ ドロゲルに付与する所定形状が、 球状、 細紐状 、 ファイバー状、 フ レーク状、 板状、 膜状、 不定形状のいずれかで ある [ 1 6 ] に記載の細胞 · 生物の分離方法。
[ 1 8 ] 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲ ル形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移、?显度よ り低い温度では 可逆的にゾル状態となり、 該ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度では 実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成†生の組成物を用い ； ゲル状態の前記ゲル形成性の組成物を、 物理的性質が連続的に変 化する場に配置し、 該物理的性質の勾配を該ハイ ドロゲル内に形成 する工程、
該ゲル状態の組成物を細胞 · 生物の懸濁液に接触させ、 それぞれ の性質の勾配によつて惹起される走性によって、 該細胞 · 生物の懸 濁液から該ゲル状態の組成物内に細胞 · 生物を移行させる工程、 該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
[ 1 9 ] 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲ ル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では 可逆的にゾル状態とな'り、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では
26 実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物をゾルーゲル転移温度より低い 显度でゾ ル状態とし、 該ゾルに細胞 · 生物を添加して、 細胞 · 生物が懸濁し た組成物を形成する工程、
該細胞 · 生物が懸濁した組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温 度でゲル化させ、 該細胞 · 生物が実質的に均一に内部に分教したゲ ル状態の組成物を形成する工程、
該ゲル状態の組成物を物理的性質が連続的に変化する場に配置し て、 該組成物中にそれぞれの物理的性質の勾配を形成する工程、 . 該物理的性質の勾配に従って、 ゲル状態の組成物中に実質的に均 一に分布していた細胞 · 生物を、 それぞれの物理的性質に する走 性能の違いによつてゲル状態の組成物で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく と も一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度より低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の紐成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
[ 2 0 ] 前記物理的性質が、 電界強度、 磁界強度、 光度、 温度、 および粘度から選ばれる 1以上の物理的性質である [ 1 8 ] または
[ 1 9 ] に記載の細胞 · 生物の分離方法。
[ 2 1 ] 細胞 · 生物が移行または再配置されたゲル状の組成物か ら、 走化性能または移行距離の異なる細胞 ·生物を含有する複数の 部分をそれぞれ分離して、 該複数の部分のゲル状の組成物から細胞 • 生物を回収する [ 1 8 ] 〜 [ 2 0 ] のいずれかに記載の細胞 . 生 物の分離方法。
[ 2 2 ] 前記ハイ ド口ゲル形成性の組成物が、 0 °Cより 高く 4 5
27 °C以下であるゾルーゲル転移温度を有する [ 1 8 ] 〜 [ 2 1 ] のい ずれかに記載の細胞 · 生物の分離方法。
(上記態様の効果）
上記構成を有する本発明の態様においては、 ハイ ド口ゲル （例え ば、 低温でゾル状態、 高温でゲル化するゾルーゲル転移現象を示し 、 該ゾル—ゲル転移が熱可逆的であり、 且つ該ゾルーゲル転移温度 よ り高い温度で該ゲルは実質的に水不溶性であるハイ ドロゲル） を 用いて、 走性能に応じて細胞 ·生物を分離 （分画、 分別ない し分取 等） することが可能となる。 すなわち、 本態様においては、 例えば 、 細胞 · 生物に化学走性を惹起する生理活性物質 (化学走性因子) の濃度勾配を該ハイ ドロゲル中に作り出す、 あるいはハイ ド 口ゲル の内部と外部で生理活性物質の濃度差を持たせることによっ て、 細 胞 · 生物を化学走性の差異によって分離 （分画、 分別ないし分取等 ) することができる。
更に、 本態様においては、 細胞 · 生物に電場、 磁場、 光度、 温度 、 粘度等の諸性質の勾配を該ハイ ドロゲル中に作り出すこと によつ て細胞 ·生物をそれぞれの性質に対する走性の差異によって分離 （ 分画、 分別ないし分取等） することができる。
本態様の 1つの好ましい例においては、 例えば、 上記のハイ ドロ ゲルを用いて、 そのゾル—ゲル転移温度よ り高い温度で、 生理活性 物質を含有する水溶液と分別用細胞 · 生物の懸濁液を隔離し、 該ハ ィ ドロゲル内に該生理活性物質の濃度勾配を作製し、 該濃度勾配に よって惹起される化学走性によって該細胞 · 生物懸濁液から該ハイ ドロゲル内に細胞 · 生物を移行させることができる。 その結果、 分 別用細胞 · 生物の化学走性能の違いによって各種細胞 · 生物のハイ ドロゲル内への移行性または移行距離が異なるため、 該細胞 · 生物 が移行したハイ ドロゲル、 または走化性能の異なる即ち移行距離の
28 異なる細胞 · 生物を含有する部分のハイ ド口ゲルを切り出して、 該 ハイ ド口ゲルのゾルーゲル転移温度より低い温度に冷却することに よ り、 細胞 · 生物を含有するゾル状態を作製することができる。 次 いで大量の細胞 · 生物培養液または保存液を該ゾルに加え、 ゾルー ゲル転移温度より高い温度でもゲル化しないように高分子溶液を希 釈した後、 遠心分離または膜分離等の通常の分別方法で細胞 · 生物 を分離 （分画、 分別ないし分取等） することが可能である。
本態様の他の好ましい例においては、 上記ハイ ドロゲルをゾルー ゲル転移温度よ り低い温度にすることによってゾル状態にし、 分別 用細胞 · 生物を添加し細胞 · 生物懸濁液を作製することができる。 次いで該細胞 · 生物懸濁液を上記のゾルーゲル転移温度より高い温 度にすることによつてゲル化させ、 分別用細胞 ♦ 生物が実質的に均 一に内部に分散したハイ ドロゲルを作製する。 次いで該ハイ ドロゲ ルを生理活性物質 （化学走性因子） を含有する水溶液に接触させ該 ハイ ドロゲル中に該生理活性物質を移行させることによって、 該ハ ィ ドロゲル中に該生理活性物質の濃度勾配を作製する。 該濃度勾配 にしたがって該ハイ ド口ゲル中に実質的に均一に分布していた細胞 • 生物が化学走性能の違いによつてハイ ド口ゲル内の各部位に再配 列される。 次いで上記のハイ ドロゲルの各部位を切り出し、 上述し た方法と同様の方法によって、 細胞 · 生物を化学走性能の違いによ つて分離 （分画、 分別ないし分取等） することが可能である。
本態様の更に他の好ましい例においては、 上記のハイ ドロゲルを ゾルーゲル転移温度よ り低い温度にすることによつてゾル状態のフ J 溶液とし、 該ゾル状態の水溶液に生理活性物質を実質的に均一に漉 合する工程、 該ゾル状態の混合液を該ゾルーゲル転移温度よ り高い 温度に昇温して所定の形状を付与したハイ ドロゲルとする工程、 所定形状のハイ ドロゲルを該ゾルーゲル転移温度より高い温度で細
29 胞 · 生物の懸濁液と接触させる工程、 細胞 · 生物が移行した所定形 状のハイ ドロゲルを細胞 · 生物の懸濁液から回収する工程、 回収し た所定形状のハイ ドロゲルを該ゾルーゲル転移温度よ り低い温度に することによってゾル状態の水溶液と して、 分画、 分別された細胞 • 生物を回収する工程によって目的の細胞 · 生物を分離 （分画、 分 別、 ないし分取等） することも可能である。
本態様の更に他の好ましい例においては、 該ハイ ドロゲルを電界 強度、 磁界強度、 光度、 温度、 粘度等から選ばれる物理的性質が連 続的に変化する場に設置し該性質の勾配を該ハイ ド口ゲル内に作製 し、 次いで該ハイ ドロゲルを分別用細胞 · 生物の懸濁液に接触させ 、 それぞれの性質の勾配によつて惹起される走性によつて該細胞 · 生物懸濁液から該ハイ ド口ゲル内に細胞 · 生物を移行させるこ とが できる。 該分別用細胞 · 生物のそれぞれの物理的性質に対する走性 能の違いによつて各種細胞 · 生物のハイ ド口ゲル内への移行性また は移行距離が異なる。 次いで細胞 · 生物が移行したハイ ドロゲルま たは走性能の異なる、 即ち移行距離の異なる細胞 · 生物を含有する 部分のハイ ドロゲルを切り出し該ハイ ドロゲルのゾル—ゲル転移温 度よ り低い温度に冷却することによ り細胞 · 生物を含有するゾル状 態を作製する。 次いで大量の細胞 · 生物培養液または保存液を該ゾ ルに加え、 ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度でもゲル化しないよう に高分子溶液を希釈した後、 遠心分離または膜分離等の通常の分別 方法で細胞 ， 生物を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） するこ とが 可能である。
本態様の更に他の好ましい例においては、 該ハイ ドロゲルをゾル 一ゲル転移温度よ り低い温度にすることによってゾル状態にし、 分 別用細胞 ·生物を添加し細胞 · 生物懸濁液を作製することができる 。 次いで該細胞 · 生物懸濁液を上記のゾルーゲル転移温度よ り高い
30 温度にすることによつてゲル化させ、 分別用細胞 · 生物が実質的に 均一に内部に分散したハイ ドロゲルを作製する。 次いで該ハイ ドロ ゲルを電界強度、 磁界強度、 光度、 温度、 粘度から選ばれる性質が 連続的に変化する場に設置し該ハイ ド口ゲル中にそれぞれの性質の 勾配を作製する。 該勾配に従って該ハイ ドロゲル中に実質的に均一 に分布していた細胞 · 生物がそれぞれの性質に対する走性能の違い によってハイ ドロゲル内の各部位に再配列される。 次いで上記のハ イ ド口ゲルの各部位を切り出し上記の方法と同様の方法によってそ れぞれの走性能の違いによって細胞 · 生物を分離 （分画、 分別、 な いし分取等） することが可能である。
本発明者らの知見によれば、 本発明の細胞 · 生物分離 （分画、 分 別、 ないし分取等） 用のハイ ドロゲルは、 疎水結合を架橋の少なく とも一部に利用していると推定される。 疎水結合は種々の物理的結 合の中で唯一、 温度昇すると結合が強くなる結合である。 この疎水 結合を架橋結合に用いると、 低温で溶液状態 (ゾル) で高温でゲル 化する本発明に好適に用いられるハイ ドロゲルを合成することが可 能である。 また、 架橋点の疎水結合力を変えることによって、 該ハ ィ ドロゲルのゾルーゲル転移温度を変えることが可能である。 本発 明に使用可能なハイ ドロゲルのゾル— 'ゲル転移温度は、 o °cよ り高 く 4 5 °C以下であるこ とが好適である。 例えば、 上記したハイ ド口 ゲルの物性が、 細胞 · 生物、 微生物、 組織 · 器官等を該ハイ ドログ ルの中に埋入し、 且つ、 該ハイ ドロゲルから回収する工程を、 熱的 損傷または酵素による損傷を実質的に与えることなく実施すること を可能にする。
これに対して、 従来よ り細胞 · 生物 · 組織培養に使用されてきた 寒天ゲル （正の温度一溶解度変化を示す） は、 架橋が主として結晶 化構造によって形成されているため、 結合力が強くゲルがゾルに転
31 移移すするる温温度度はは約約 99 55 °°CCでで生生理理的的温温度度範範囲囲 <<通通常常はは 00 °° (( 〜〜 44 00 °°CC )) よよ りり もも著著ししくく高高いいたためめ細細胞胞 ·· 生生物物、、 微微生生物物、、 組組織織 ·· 器器官官等等のの寒寒天天ゲゲルル 中中へへのの埋埋入入、、 回回収収はは不不可可能能ででああっったた。。 従従架架ののアアルルギギンン酸酸ゲゲルル （（正正のの 温温度度一一溶溶解解変変化化をを示示すす）） のの場場合合はは、、 架架橋橋力力ささイイオオンン結結合合にによよっってて形形成成 さされれてていいるるたためめにに結結合合力力がが強強くく、、 生生理理的的条条件件下下ででゲゲルルをを''ゾゾルルにに転転移移 ささせせるるここととはは困困難難でであありり、、 細細胞胞 ·· 生生物物等等 該該ゲゲルル中中にに埋埋入入、、 回回収収すす るるここととははででききななかかっったた。。 更更にに、、 従従来来ののココララーーゲゲンン、、 ゼゼララチチンンゲゲルル (( いいずずれれもも、、 正正のの温温度度一一溶溶解解度度変変化化をを示示すす）） のの場場合合はは架架橋橋がが結結晶晶化化構構 造造、、 ままたたははィィオオンン結結合合にによよつつてて形形成成さされれてていいるるたためめににゲゲルルををゾゾルル化化 すするるたためめににココララゲゲナナーーゼゼ、、 ゼゼララチチナナーーゼゼ等等のの酵酵素素をを必必要要ととすするる。。 従従 つつてて、、 生生理理的的条条件件下下 （（ココララゲゲナナーーゼゼ、、 ゼゼララチチナナーーゼゼ等等のの使使用用はは生生物物 体体組組織織にに酵酵素素反反応応にによよるる損損傷傷をを与与ええるる）） でで細細胞胞 ·· 生生物物、、 組組織織 ·· 器器官官 等等をを回回収収すするるここととがが困困難難ででああっったた。。
一一方方、、 本本態態様様でで用用いいるるハハイイ ドドロロゲゲルルのの うう 11つつのの重重要要なな性性質質はは、、 該該ハハイイ ドド口口ゲゲルル中中でで細細胞胞 ·· 生生物物、、 微微生生物物、、 組組織織 ·· 器器官官等等がが、、 （（ああるる 程程度度ままでで）） 動動くく ここととががででききるるここととででああるる。。 上上記記のの物物性性をを獲獲得得すするるたた めめににはは上上記記ののハハイイ ドドロロゲゲルルのの三三次次元元網網目目構構造造のの架架橋橋点点結結合合がが強強すすぎぎ なないいここととがが不不可可欠欠ででああるる。。 一一般般的的ににハハイイ ドド口口ゲゲルルのの三三次次元元網網目目のの架架 橋橋点点のの結結合合エエネネルルギギーーをを AA FFととすするるとと、、 橋橋点点のの寿寿命命 （（ てて ）） はは次次式式 でで表表さされれるる。。
Figure imgf000035_0001
ここで架橋点寿命が τの三次元網目構造を有するハイ ドロゲルの 場合は、 l / τ ( s e c " 1 ) より も高 ヽ周波数を有する動作に対 しては該ハイ ドロゲルの架橋点は結合し 状態、 即ち架橋構造体と して対応し、 ΐ Ζ τ ( s e c— 1 ) より 低い周波数を有する動作 に対しては該ハイ ドロゲルの架橋点は非結合の状態、 即ち架橋構造 を有さない液体と して対応する。 これは、 該ハイ ド口ゲルは非常に
32 速い動作に対しては固体と して、 非常にゆつく り した動作に対して は液体と してそれぞれ振舞うことを意味している。 これは細胞 · 生 物、 微生物、 組織等を埋入した該ハイ ドロゲルを運搬する、 または 切断する際に生ずる動作 （通常、 動きの周波数は高く、 約 1 0一 2 s e c— 1 オーダーを越える） に対しては該ハイ ドロゲルは固体と して振舞うのに対して、 該ハイ ド口ゲル中で細胞 · 生物、 微生物、 組織等が、 移動する、 または増殖するよ うな周波数の低い、 約 1 0 一 4 s e c— 1 オーダーよ り小さいゆつく り した動作に対しては液 体と して振舞う。 従って、.該ハイ ド口ゲル中で細胞 · 生物、 微生物 、 組織等がそれぞれの走性能によって移動することが可能である。 上記等の性質を有する三次元網目構造を形成する架橋点の結合ェ ネルギ一としては生理的温度範囲 （ 0 °C〜 4 0 °C ) における熱エネ ルギー （R T ) と同等度であることが好ましく、 数十〜数百 k c a l Z m o 1 と結合エネルギーの高い共有結合、 結晶化構造、 イオン 結合による架橋構造によつて形成される三次元網目構造体は本発明 に使用可能なハイ ド口ゲルとしては不適であり、 数 k c a 1 / m o 1 の結合エネルギーを有する分散力による結合、 水素結合または疎 水結合による三次元網目構造体が本発明に使用可能なハイ ドロゲル と して好適に使用可能である。
前述したように、 疎水結合によって形成される三次元網目構造体 、 即ちハイ ド口ゲルは、 疎水結合は温度の上昇と共に強くなる とい う性質を有するために、 低温でゾル、 高温でゲル化する。 従って、 他の結合、 例えば水素結合、 分散力等による結合を利用したハイ ド 口ゲルとはゾルーゲル転移の温度依存性が逆になる。 疎水性結合を 利用したハイ ドロゲルの物性は、 細胞 · 生物を低温ゾル状態で包埋 することができるため、 包埋時の熱的損傷を回避できるという点で 従来のハイ ド口ゲルよ り も本発明の細胞 · 生物分画用ハイ ド口ゲル
33 としては好適に使用可能である。 更に、 疎水性結合を利用したハイ ドロゲルの転移は熱的に可逆的であるため、 該ゲル 包埋した細胞
• 生物から該ゲルを除去する際にも低温でゲルを溶解でき、 容易に 且つ熱的損傷を与えることなく該ゲルから細胞 · 生^!を回収するこ とが可能である。 '
上述したよ うに本発明の上記した態様によれば、 多様な走性能を 有する細胞 · 生物の分離 （分画、 分別ないし分取等） を可能にする ハイ ドロゲルが提供される。
(細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル）
本発明の上記した態様において、 特に好適に使用可能なゲルにつ いて以下に述べる。
本態様の細胞 · 生物分離 '（分画、 分別、 ないし分敢等） 用ハイ ド 口ゲルは、 その水溶液がゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲル 形成性の高分子を含み、 よ り低い温度でゾル状態、 よ り高い温度で ゲル化する熱可逆的なゾル—ゲル転移を示す。 本発明において、 「 細胞 ·生物」 とは、 「細胞および/又は生物」 の意味であり、 任意 の生理活性物質に対して何らかの走性を示す限り、 1以上の細胞を 含む生物 （植物および動物） に関連するかないしは由来する任意の 細胞および細胞集合体を含む。 本発明において、 この細胞および細 胞集合体の形態は特に制限されず、 例えば、 単細胞、 多細胞の生物 又はその器官、 微生物、 精子、 卵子等を包含する。
(分離）
本発明において 「分離」 とは、 分離対象物 （本態様においては、 上記した細胞 · 生物） を、 それらの有する任意の特'！ ¾ (例えば、 走 性） の差異に基づいて、 それらの空間的な位置に差異をつけるこ と を言う。 本発明において、 この 「空間的な位置に差異をつける」 形 態は特に制限されない。
34 他の観点からは、 本発明において、 「分離」 とは、 分離対象物の 特性 （本態様においては、 上記した細胞および Z又は生物の化学走 性または物理的性質に対応する走性） に基づく、 分離媒体 （本態様 においては、 ゲル） 内および z又は分離媒体一外部環境の間の選択 的な移動を利用して、 該細胞および Z又は生物の配置に'何らかの選 択性を実現できる任意の分離操作を言う。 本発明における 「分離」 と しては、 例えば、 分画、 分別、 ないし分取等が挙げられる。
(ゾルーゲル転移温度）
本発明において 「ゾル状態」 、 「ゲル状態」 および 「ゾルーゲル 転移温度の定義および測定は、 文献 （H. Yoshioka ら、 Journal of Macromolecular Science, A 3 丄 、 1 ) ， 1 1 3 、 1 9 9 4 ) ) に記載された定義および方法に基づく。 即ち、 観測周波数 1 H zに おける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化 （ 1 °C/ 1分） させて測定し、 該試料の貯蔵弾性率 （G一、 弾性項） が損失弾性率 （G" 、 粘性項） を上回る点の温度をゾルーゲル転移 温度とする。 一般に、 G " > G 'の状態がゾルであり、 G " < G " の状態がゲルであると定義される。 このゾルーゲル転移温度の測定 に際しては、 下記の測定条件が好適に使用可能である。
<動的 · 損失弾性率の測定条件 >
測定機器 （商品名） ： ス ト レス制御式レオメーター C S L 7 0 0 、 Carri- Med社製
試料溶液 （ないし分散液） の濃度 （ただし 「ゾルーゲル転移温度 を有する高分子化合物」 の濃度と して） ： 1 0 (重量） ％
試料溶液の量 ： 約 0. 8 g
測定用セルの形状 · 寸法 ： アタ リル製平行円盤 （直径 4. 0 c m ) 、 ギャップ 6 0 0 〃 πι
測定周波数 ： 1 Η ζ適用ス ト レス ： 線形領域内。
35 本発明においては、 細胞 ， 生物の熱的損傷を防ぐ点から、 上記ゾ ルーゲル転移温度は 0 °Cよ り高く、 4 5 °C以下であることが好まし く、 更には、 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下 （特に 4 °C以上 4 0°C以下で ある） ことが好ましい。
このよ うな好適なゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲルは、 後述するような具体的な化合物の中から、 上記したスク リーニング 方法 （ゾルーゲル転移温度測定法） に従って容易に選択することが できる。 本発明に使用可能なハイ ド口ゲルを用いて細胞 ·生物分離
(分画、 分別、 ないし分取等） するという一連の操作においては、 上記したゾルーゲル転移温度 （ a °C) を細胞 · 生物分画、 分別時の 温度 （ b °C) と、 分取するための冷却時の温度 （ c °C) との間に設 定することが好ましい。 すなわち、 上記した 3種の温度 a °C、 b °C 、 および c °Cの間には、 b > a > cの関係があることが好ましい。 より具体的には、 （ b _ a ) は 1〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであ ることが好ましく、 また （ a — c ) は 1〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであることが好ましい。
(細胞選択能）
本発明で好ましく用いられるハイ ドロゲルは、 好適な細胞選択能 を示す点からは、 下記の測定法によ り測定される細胞選択能 Rノ R 。 が 2以上、 より好ましく は 5以上、 更に好ましく は 1 0以上のハ ィ ドロゲルであることが好ましい。 細胞選択能 RZR。 の測定は以 下のようにして行う。
f ML Pを 1 0 - 6 M含有し、 S ZV比 1 0〜 1 5のハイ ドロゲ ル l gを 1 4 mLのディスポーザブル遠沈管内でクェン酸加ヒ ト全 血 1 0 m L と 3 7 °Cで 4時間接触させ、 ハイ ドロゲル中に取り込ま れた赤血球数 （E) と白血球数 （L ) の比 R = L ZEを測定する。 予め測定されたクェン酸加ヒ ト全血中の赤血球数 （ E。 ） と白血球
36 数 （L。 ） の比 R。 = L。 /E。 と、 上記 Rの比 RZR。 を求め、 細胞選択能とする。
(ハイ ドロゲル内での細胞 · 生物等の移動性）
本発明に使用可能なハイ ド口ゲルは、 その中で細胞 · 生物、 微生 物等が自由に移動できる点から、 よ り高い周波数に対し'ては固体的 な挙動を示し、 他方、 よ り低い周波数に対しては液体的な挙動を示 すことが好ましい。 より具体的には、 該ハイ ド口ゲル内の細胞 · 生 物等の移動性は以下の方法で好適に測定することが可能である。
(ハイ ドロゲル内での細胞 · 生物等の移動性測定方法）
本発明に使用可能なハイ ド口ゲル （ハイ ド口ゲルと して 1 m L ) をゾル状態 （ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度） で内径 l c mの試 験管に入れ、 該ハイ ドロゲルのゾルーゲル転移温度よ り も充分高い 温度 （たとえば該ゾルーゲル転移温度よりも約 1 0 °C高い温度） と した水溶中で上記試験管を 1 2時間保持し、 該ハイ ドロゲルをゲル 化させる。 次いで、 該試験管の上下を逆にした場合に溶液/空気の 界面 （メニスカス） が溶液の自重で変形するまでの時間 （T) を測 定する。 ここで 1 /T ( s e c " 1 ) よ り低い周波数の動作に対し ては該ハイ ド口ゲルは液体と して振舞い、 1 /T ( s e c " 1 ) よ り高い周波数の動作に対しては該ハイ ド口ゲルは固体と して振舞う ことになる。 本発明に使用可能なハイ ドロゲルの場合には Tは 1分 〜 2 4時間、 好ましくは 5分〜 1 0時間である。
(定常流動粘度）
本発明に使用可能なハイ ドロゲルのゲル的性質は、 定常流動粘度 の測定によっても好適に測定可能である。 定常流動粘度 77 (ィータ
) は、 例えばク リープ実験によって測定することができる。 タ リー プ実験では一定のずり応力を試料に与え、 ずり歪の時間変化を観測 する。 一般に粘弾性体のク リープ挙動では、 初期にずり速度が時間
37 と ともに変化するが、 その後ずり速度が一定となる。 この時のずり 応力とずり速度の比を定常流動粘度 77 と定義する。 この定常流動粘 度は、 ニュー ト ン粘度と呼ばれることもある。 ただし、 こ こで定常 流動粘度は、 ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で決定され なければならない。 '
具体的な測定方法は、 測定装置と してス ト レス制御式粘弾性測定 装置 C S L型レオメーター （C S L 5 0 0、 米国キャ リ ーメ ド社製 ) を、 測定デパイスにァク リル製円盤 （直径 4 c m) を使用し、 試 料厚み 6 0 0 μ mと して少なく とも 5分間以上の測定時間ク リーブ 挙動 （遅延曲線） を観測する。 サンプリ ング時間は、 最初の 1 0 0 秒間は 1秒に 1回、 その後は 1 0秒に 1回とする。
適用するずり応力 （ス ト レス） の決定にあたっては、 1 0秒間ず り応力を負荷して偏移角度が 2 X 1 0— 3 r a d以上検出される最 低値に設定する。 解析には 5分以降の少なく とも 2 0以上の測定値 を採用する。 本発明に使用可能なハイ ドロゲルは、 そのゾルーゲル 転移温度よ り約 1 0 °C高い温度において、 77が 5 X 1 0 3 〜 5 X 1 0 6 P a · s e cであることが好ましく、 更には 8 X 1 0 3 〜 2 X
1 0 6 ? 3 ' 3 6 じ、 特に 1 1 0 4 ? 3 ' 5 6 。以上、 1 X 1 0
6 P a · s e c以下であることが好ましい。
上記 77が 5 X 1 03 P a · s e c未満では短時間の観測でも流動 性が比較的高くなり、 ゲルによる細胞 · 生物の自由拡散運動の抑制 効果が不十分となったり、 ゲルによる生理活性物質の濃度勾配形成 が不十分となる等の不都合が生じる。 他方、 ηが 5 X 1 06 P a · s e c を超えると、 長時間の観測でもゲルが流動性をほとんど示さ なく なる傾向が強ま り、 ゲル内で細胞 · 生物が走性によって移動す ることが困難となる。 また、 ηが 5 X 1 06 P a · s e c を超える とゲルが脆さを呈する可能性が強ま り、 わずかの純弾性変形の後、
38 一挙にもろく破壊する脆性破壊が生起しやすい傾向が強まる。
(動的弾性率）
本発明に使用可能なハイ ドロゲルのゲル的性質は、 動的弾性率に よっても好適に測定可能である。 該ゲルに振幅 0/ 。'、 振動数を の /
2 π とする歪み γ ( t ) = γ。 c o s co t ( t は時間） 'を与えた際 に、 一定応力を び 。 、 位相差を δ とする σ ( t ) = (7。 c o s ( ω t + δ ) が得られたとする。 I G I = σ。 / γ。 とすると、 動的弹 性率 G， ( ω ) = I G I c o s S と、 損失弾性率 G " ( ω ) = I G I s i n δ との比 （G " / G ' ) が、 ゲル的性質を表す指標となる 本発明に使用可能なハイ ド口ゲルは、 ω / 2 π = 1 H zの歪み （ 速い動作に対応する） に対しては固体と して挙動し、 且つ、 ω Ζ 2 兀 = 1 0 — 4 11 2 の歪み （遅い動作に対応する） に対しては固体と して挙動する。 よ り具体的には、 本発明に使用可能なハイ ド口ゲル は、 以下の性質を示すことが好ましい （このよ うな弾性率測定の詳 細については、 例えば、 文献 ： 小田良平ら編集、 近代工業化学 1 9 、 第 3 5 9頁、 朝倉書店、 1 9 8 5を参照することができる） 。
ω / 2 π = 1 Η ζ (ゲルが固体として挙動する振動数） の際に、 ( G " / G ' ) s = ( t a n δ ) s 力 1未満であることが好まし い （より好ましくは 0 . 8以下、 特に好ましく は 0 . 5以下） 。
ω / 2 π = 1 0 — 4 H z (ゲルが液体と して拳動する振動数） の 際に、 （G " Z G， ） L = ( t a n S ) L が 1以上であることが 好ましい （よ り好ましくは 1 . 5以上、 特に好ましく は 2以上） 。
上記 （ t a n S ) s と、 （ t a n S ) L との比 { ( t a n δ ) s / ( t a n δ ) L } が 1未満であることが好ましい （よ り 好ましくは 0 . 8以下、 特に好ましくは 0 . 5以下） 。
く測定条件 >
39 ハイ ドロゲル形成性高分子の濃度 ： 約 8質量％
温度 ： ハイ ド口ゲルのゾルーゲル転移温度より約 1 0 °C高い温度 測定機器 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国キヤリーメ ド社製）
(ハイ ドロゲル形成性の高分子） '
上述したような熱可逆的なゾルーゲル転移を示す （すなわち、 ゾ ルーゲル転移温度を有する） 限り、 本発明に使用可能なハイ ドロゲ ル形成性の高分子は特に制限されない。 生理的温度 （ 0〜 4 2 °C程 度） において好適なゾルーゲル変化を示すことが容易な点からは、 例えば、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子中の曇点を有する複数のブ ロ ック と親水性のブロ ックの曇点、 両ブロ ックの組成および両プロ ッ クの疎水性度、 親水性度、 および Zまたは分子量等をそれぞれ調 整することによつて達成することが好ましい。 その水溶液がゾル一 ゲル転移温度を有し、 該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態 を示す高分子の具体例としては、 例えば、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドとポ リ エチレンォキサイ ドとのブロ ック共重合体等に代表される ポ リ アルキレンォキサイ ドブロ ック共重合体 ； メ チルセルロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレセノレロース等のエーテノレイヒセノレロース ； キ トサ ン誘導体 （K. R. Holme, et al. Macromolecules, 2 4 , 3 8 2 8 ( 1 9 9 1 ) ) 等が知られている。
ポリ アルキレンォキサイ ドブロ ック共重合体と して、 ポリ プロ ピ レンォキサイ ドの両端にポ リ エチレンォキサイ ドが結合したプル口 ニック （Pluronic) F - 1 2 7 (商品名、 BASF Wyandotte Chemica Is Co. 製） ゲルが開発されている。 このプル口ニック F— 1 2 7 の高濃度水溶液は、 約 2 0 °C以上でハイ ド口ゲルとなり、 これよ り 低い温度で水溶液となることが知られている。 しかしながら、 この 材料の場合は約 2 0質量％以上の高濃度でしかゲル状態にはならず
40 、 また約 2 0質量％以上の高濃度でゲル化温度よ り高い温度に保持 しても、 更に水を加えるとゲルが溶解してしまう。 また、 プルロニ ック F— 1 2 7は分子量が比較的小さく、 約 2 0質量％以上の高度 のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容易に透 過するため、 細胞または、 生物体組織に悪影響を及ぼず可能性があ る。
一方、 メ チノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロ ピルセルロース等に代 表されるエーテル化セルロースの場合は、 通常は、 ゾルーゲル転移 温度が高く約 4 5 °C以上である （N. Sarkar, J. Appl. Po lym. Sc i enc e， 2 4， 1 0 7 3 , 1 9 7 9 ) 。 これに対して、 細胞 · 生物等の 分画、 分別は殆ど 3 7 °C近辺またはそれ以下の温度で実施されるた め、 上記エーテル化セルロースはゾル状態であり、 該エーテル化セ ルロースを用いる方法では細胞 · 生物等の分画、 分別は事実上は困 難である。
上記したように、 その水溶液中がゾルーゲル転移点を有し、 且つ 該転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の 問題点は、 1 ) ゾルーゲル転移温度よ り高い温度でー且ゲル化して も、 更に水を添加するとゲルが溶解してしまう こと、 2 ) ゾルーゲ ル転移温度が細胞 ·生物の分画、 分別温度 （ 3 7 °C近辺またはそれ 以下） よ り も高く、 分画、 分別温度ではゾル状態であること、 3 ) ゲル化させるためには、 水溶液の高分子濃度を非常に高くする必要 があるこ と、 等である。
これに対して、 本発明者の検討によれば、 例えば、 その氷溶液が 好ましく は 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下であるゾルーゲル転移温度を有 するハイ ドロゲル形成性の高分子 （例えば、 曇点を有する複数のブ ロ ック と親水性のプロ ックが結合してなり、 その水溶液がゾルーゲ ル転移温度を有し、 且つ、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で可逆
41 的にゾル状態を示す高分子） を用いて細胞 · 生物等の分離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用基材を構成した場合に、 上記問題は好適に 解決可能であることが判明している。
(好適なハイ ドロゲル形成性の高分子）
本発明の細胞 · 生物等の分離 （分画、 分別、 ないし分'取等） 用基 材と して好適に使用可能な疎水結合を利用したハイ ドロゲル形成性 の高分子は、 曇点を有する複数のプロ ック と親水性のプロ ックが結 合してなることが好ましい。 該親水性のブロ ックは、 ゾル一ゲル転 移温度よ り低い温度で該ハイ ド口ゲルが水溶性になるために存在す ることが好ましく、 また曇点を有する複数のプロ ックは、 ハイ ドロ ゲルがゾルーゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するため に存在することが好ましい。 換言すれば、 曇点を有するブロ ックは 該曇点よ り低い温度では水に溶解し、 該曇点よ り高い温度では水に 不溶性に変化するために、 曇点よ り高い温度で、 該ブロ ックはゲル を形成するための疎水結合からなる架橋点と しての役割を果たす。 すなわち、 疎水性結合に由来する曇点が、 上記ハイ ド口ゲルのゾル 一ゲル転移温度に対応する。 ただし、 該曇点と ゾルーゲル転移温度 とは必ずしも一致しなくてもよい。 これは、 上記した 「曇点を有す るブロ ック」 の曇点は、 一般に、 該プロ ック と親水性ブロック との 結合によって影響を受けるためである。
本発明に用いるハイ ドロゲルは、 疎水性結合が温度の上昇と共に 強くなるのみならず、 その変化が温度に対して可逆的であるという 性質を利用したものである。 1分子内に複数個の架橋点が形成され
、 安定性に優れたゲルが形成される点からは、 ハイ ドロゲル形成性 の高分子が 「曇点を有するブロ ック」 を分子内に複数個有すること が好ましい。 一方、 上記ハイ ド口ゲル形成性の高分子中の親水性ブ ロ ックは、 前述したように、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子がゾル
42 一ゲル転移温度よ り も低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、 上記転移温度よ り高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイ ドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、 含水ゲルの状態 を形成させる機能を有する。
(曇点を有する複数のブロ ック） '
曇点を有するブロ ック と しては、 水に対する溶解度一温度係数が 負を示す高分子のプロ ックであることが好ましく、 よ り具体的には 、 ポリ プロ ピレンオキサイ ド、 プロ ピレンオキサイ ドと他のアルキ レンオキサイ ドとの共重合体、 ポリ N—置換アク リルアミ ド誘導体 、 ポリ N—置換メタアク リルアミ ド誘導体、 N—置換ァク リ ノレアミ ド誘導体と N—置換メタアク リルアミ ド誘導体との共重合体、 ポリ ビュルメチルエーテル、 ポリ ビニルアルコール部分酢化物からなる 群よ り選ばれる高分子が好ましく使用可能である。 上記の高分子 （ 曇点を有するブロ ック） の曇点が 4 °Cよ り高く 4 5 °C以下であるこ とが、 本発明に用いる高分子 （曇点を有する複数のブロ ック と親水 性のブロ ックが結合した化合物） のゾルーゲル転移温度を 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下とする点から好ましい。 ここで曇点の測定は、 例え ば、 上記の高分子 （曇点を有するブロック） の約 1重量％の水溶液 を冷却して透明な均一溶液と した後、 除々に昇温 （昇温速度約 1 °C / i n ) して、 該溶液がはじめて白濁する点を曇点とするこ とに よって行う ことが可能である。
本発明に使用可能なポリ N—置換ァク リルアミ ド誘導体、 ポリ N 一置換メタァク リルアミ ド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。 ポリ 一 N—ァク ロイルビペリ ジン ； ポリ 一 N— n —プロ ピルメ タァ ク リルアミ ド ； ポリ 一 N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド ； ポリ 一 N ， N—ジェチルァク リルアミ ド ； ポリ 一 N—イソプロ ピルメタァク リルアミ ド ； ポリ 一 N—シク ロプロ ピルアク リルアミ ド ； ポリ 一 N
43 —アタ リ ロイルピロ リ ジン ； ポリ 一 N， N—ェチルメ チルァク リ ノレ ア ミ ド ； ポ リ 一 N—シク ロ プロ ピルメ タアク リルアミ ド ； ポ リ 一 N ーェチルァク リルアミ ド。 上記の高分子は単独重合体 （ホモポリマ 一） であっても、 上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共 重合体であってもよい。 このよ うな共重合体を構成する'他の単量体 と しては、 親水性単量体、 疎水性単量体のいずれも用いることがで きる。 一般的には、 親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上 昇し、 疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。 従つ て、 これらの共重合すべき単量体を選択することによつても、 所望 の曇点 （例えば 4 °Cよ り高く 4 5 °C以下の曇点） を有する高分子を 得るこ とができる。
(親水性単量体）
上記親水性単量体と しては、 N—ビュルピロ リ ドン、 ビュルピリ ジン、 ァク リ ルア ミ ド、 メ タアク リルアミ ド、 N—メチルアク リ ル ア ミ ド、 ヒ ドロ キシェチノレメ タァク リ レー ト、 ヒ ドロ キシェチルァ タ リ レー ト、 ヒ ドロ キシメ チルメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロ キシメ チ ルアタ リ レー ト、 酸性基を有するアク リル酸、 メタアク リル酸およ びそれらの塩、 ビニルスルホン酸、 スチレンスルホン酸等、 並びに 塩基性基を有する N， N—ジメチルアミノエチルメタク リ レー ト、 N， N—ジェチルアミ ノエチルメ タク リ ー ト、 N， N—ジメ チルァ ミ ノプロ ピルアク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
(疎水性単量体） · 一方、 上記疎水性単量体としては、 ェチルアタ リ レー ト 、 メチル メ タ ク リ レー ト、 グリ シジルメ タタ リ レー ト等のアタ リ レー ト誘導 体およびメタク リ レー ト誘導体、 N _ n _ブチルメタアク リルアミ ド等の N—置換アルキルメタアク リルアミ ド誘導体、 塩化ビュル、
44 アク リ ロニ ト リル、 スチレン、 酢酸ビュル等が拳げられるが、 これ らに限定されるものではない。
(親水性のブロ ック）
一方、 上記した曇点を有するプロ ック と結合すべき親水性のプロ ックと しては、 具体的には、 メチルセルロース、 デキス トラン、 ポ リエチレンオキサイ ド、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ N—ビュルピ 口 リ ドン、 ポリ ビニルピリ ジン、 ポリ アク リルアミ ド、 ポリ メ タァ ク リルアミ ド、 ポリ N —メチルアク リルアミ ド、 ポリ ヒ ドロキシメ チルアタ リ レー ト、 ポリ アク リル酸、 ポリ メ タク リル酸、 ポリ ビニ ルスルホン酸、 ポリ スチレンスルホン酸およびそれらの塩； ポリ N , N—ジメチルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 ポリ N， N —ジェチ ルアミ.ノエチルメタク リ レー ト、 ポリ N， N—ジメチルァミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられる。
曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロ ック とを結合する方 法は特に制限されないが、 例えば、 上記いずれかのブロ ック中に重 合性官能基 （例えばアタ リ ロイル基） を導入し、 他方のブロックを 与える単量体を共重合させることによって行う ことができる。 また 、 曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロック との結合物は、 曇点を有するプロ ックを与える単量体と、 親水性のプロ ックを与え る単量体とのプロ ック共重合によって得ることも可能である。
また、 曇点を有するブロ ックと親水性のブロ ック との結合は、 予 め両者に反応活性な官能基 （例えば水酸基、 アミ ノ基、 カルボキシ ル基、 イ ソシァネート基等） を導入し、 両者を化学反応により結合 させることによって行う こともできる。 この際、 親水性のプロ ック 中には通常、 反応活性な官能基を複数導入する。
また、 曇点を有するポリ プロ ピレンオキサイ ドと親水性のブロ ッ ク との結合は、 例えば、 ァニオン重合またはカチオン重合で、 プロ
45 ピレンオキサイ ドと 「他の親水性ブロ ック」 を構成するモノマー （ 例えばエチレンォキサイ ド） とを繰り返し逐次重合させることで、 ポリ プロ ピレンオキサイ ドと 「親水性ブロ ック」 （例えばポリェチ レンォキサイ ド） が結合したブ口 ック共重合体を得ることができる このようなブロ ック共重合体は、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドの末 端に重合性基 （例えばァク リ ロイル基） を導入後、 親水性のプロ ッ クを構成するモノマーを共重合させることによつても得ることがで きる。 更には、 親水性のブロック中に、 ポ リ プロ ピレンオキサイ ド 末端の官能基 （例えば水酸基） と結合反応し得る官能基を導入し、 両者を反応させることによつても、 本発明に用いる高分子を得るこ とができる。
また、 ポリ プロ ピレンダリ コールの両端にポリエチレングリ コー ルが結合した、 プル口ニック F— 1 2 7 (商品名、 旭電化工業 （ 株） 製） 等の材料を連結させることによつても、 本発明に用いるハ ィ ドロゲル形成性の高分子を得ることができる。
この曇点を有するプロ ックを含む態様における本発明の高分子は 、 曇点よ り低い温度においては、 分子内に存在する上記 「曇点を有 するブロ ック」 が親水性のブロ ック とともに水溶性であるため、 完 全に水に溶解し、 ゾル状態を示す。 しかし、 この高分子の水溶液の 温度を上記曇点よ り高い温度に加温すると、 分子内に存在する 「曇 点を有するブロ ック」 が疎水性となり、 疎水的相互作用によって、 別個の分子間で会合する。 一方、 親水性のブロックは、 この時 （曇 点よ り高い温度に加温された際） でも水溶性であるため、 本発明の 高分子は水中において、 曇点を有するブロ ック間の疎水性会合部を 架橋点と した三次元網目構造を持つハイ ド口ゲルを生成する。 この ハイ ドロゲルの温度を再び、 分子内に存在する 「曇点を有するプロ
46 ック」 の曇点よ り低い温度に冷却すると、 該曇点を有するブロ ック が水溶性となり、 疎水性会合による架橋点が解放され、 ハイ ドロゲ ル構造が消失して、 本発明の高分子は、 再び完全な水溶液となる。 このよ う に、 好適な態様における本発明の高分子のゾル—ゲル転移 は、 分子内に存在する曇点を有するプロックの該曇点における可逆 的な親水性、 疎水性の変化に基づく ものであるため、 温度変化に対 応して、 完全な可逆性を有する。
(ゲルの溶解性）
上述したよ うにその水溶液がゾルーゲル転移温度を有する高分子 を少なく とも含む本発明に使用可能なハイ ドロゲルは、 該ゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度 （ d °C) で実質的に水不溶性を示し、 ゾル 一ゲル転移温度よ り低い温度 （ e °C) で可逆的に水可溶性を示す。 上記した高い温度 （ d °C) は、 ゾルーゲル転移温度よ り 1 °C以上高 い温度であることが好ましく、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 高い温度 であることが更に好ましい。 また、 上記 「実質的に水不溶性」 とは 、 上記温度 （ d °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解する上記高分子 の量が、 5. 0 g以下 （更には 0. 5 g以下、 特に 0. l g以下） であることが好ましい。 一方、 上記した低い温度 （ e °C) は、 ゾル 一ゲル転移温度よ り （絶対値で） 1 °C以上低い温度であることが好 ましく、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 低い温度であることが更に好ま しい。 また、 上記 「水可溶性」 とは、 上記温度 （ e °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解する上記高分子の量が、 0. 5 g以上 （更には 1. 0 g以上） であることが好ましい。 更に 「可逆的に水可溶性を 示す」 とは、 上記ハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液が、 一旦 （ ゾルーゲル転移温度よ り高い温度において） ゲル化された後におい ても、 ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度においては、 上記した水可 溶性を示すこ とをいう。
47 上記高分子は、 その 1 0 %水溶液が 5 °Cで、 1 0〜3， 0 0 0セ ンチボイズ （更には 5 0〜 1 , 0 0 0センチボイズ） の粘度を示す ことが好ましい。 このような粘度は、 例えば以下等の測定条件下で 測定することが好ましい。
粘度計 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国 キャ リ ーメ ド社製）
ローター直径 ： 6 0 mm
ローター形状 ： 平行平板
測定周波数 ： 1 H z (ヘルツ）
本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子の水溶液は、 上記 ゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量の水中に 浸漬しても、 該ゲルは実質的に溶解しない。 上記細胞 ' 生物等の分 離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用基材の上記特性は、 例えば、 以 下のようにして確認することが可能である。 すなわち、 本発明に使 用可能なハイ ド口ゲル形成性の高分子 0. 1 5 gを、 上記ゾルーゲ ル転移温度よ り低い温度 （例えば水冷下） で、 蒸留水 1. 3 5 gに 溶解して 1 0 W%の水溶液を作製し、 該水溶液を径が 3 5 mmのプ ラスチックシャーレ中に注入し、 3 7 °Cに加温することによって、 厚さ約 1. 5 m mのゲルを該シャーレ中に形成させた後、 該ゲルを 含むシャーレ全体の重量 （ f グラム） を測定する。 次いで、 該ゲル を含むシャーレ全体を 2 5 O m L中の水中に 3 7 °Cで 1 0時間静置 した後、 該ゲルを含むシャーレ全体の重量 （ gグラム） を測定して 、 ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。 この際、 本発明 に使用可能なハイ ドロゲル形成性の高分子においては、 上記ゲルの 重量減少率、 すなわち （ f 一 g ) Z ίが、 5. 0 %以下であること が好ましく、 更には 1 . 0 %以下 （特に 0. 1 %以下） であること が好ましい。 本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性の高分子の水
48 溶液は、 上記ゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量 （体積比で、 ゲルの 0. 1〜 1 0 0倍程度） の水中に浸漬して も、 長期間に亘つて該ゲルは溶解することがない。 このような本発 明に用いる高分子の性質は、 例えば、 該高分子内に曇点を有するブ ロ ッ ク が 2個以上 （複数個） 存在することによって達成される。 こ れに対して、 ポリ プロピレンォキサイ ドの両端にポリエチレンォキ サイ ドが結合してなる前述のプル口ニック F— 1 2 7を用いて同様 のゲルを作成した場合には、 数時間の静置で該ゲルは完全に氷に溶 解することを、 本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは 、 水に対する濃度、 すなわち { (高分子） Z (高分子 +水） } X I 0 0 ( % ) で、 2 0 %以下 （更には 1 5 %以下、 特に 1 0 %以下） の濃度でゲル化が可能なハイ ド口ゲル形成性の高分子を用いること が好ましい。
(生理活性物質）
本発明中の生理活性物質とは、 細胞や生物に対して結合性、 反応 性、 あるいは誘引性のある物質をいう。 例えば、 走化性因子 （化学 走性因子） 、 抗体、 サイ ト力インおよびその受容体、 細胞接着因子 等を挙げることができる。
化学走性とはある化学物質 （化学走性因子） の濃度差が刺激とな つて細胞、 または微生物が該濃度差に従って集合したり逃避したり する性質である。 化学走性は多くの微生物、 白血球、 癌細胞、 精子 等の細胞が有している性質であり微生物、 細胞 · 生物がそれぞれ特 異的な化学走性因子を認識する能力を有している。 例えば典型的な 化学走性因子と しては好中球、 マクロフ ァージに働く免疫グロブリ ン由来因子等、 好中球に働く補体由来因子である C 3 a、 C 5 a、 N—ホルミ ノレー M e t - L e u - P h e ( f ML P) 等、 マク ロ フ
49 ァージに働く リ ンパ球由来因子であるリ ンホカイン等、 好酸球に働 くペプチド性因子、 ェカレクチン等が挙げられる。 これらはアレル ギー反応に関連する免疫担当細胞に対する化学走性因子である。 先に述べたよ うに最近では血管の誘導、 再生に関連する血管内皮 細胞増殖因子、 神経網の誘導、 再生に関連する神経細胞 '増殖因子等 の各種細胞増殖因子も化学走性因子と考えられている。 また血管系 は酸素濃度の勾配によっても誘導、 再生されることが分かっていて 、 酸素は負の走化性因子と言える。 また、 癌細胞の転移に関しても 化学走性因子がかかわつていることが分かってきた。 以上のよ うに 細胞に直接、 作用する免疫関連、 癌関連薬剤は多くの場合、 化学走 性を有するものと考えることができる。
(物理走性因子）
物理走性とはある物理的因子の強度差が刺激となつて細胞、 ある いは微生物が該強度差に従って集合したり、 逃避したりする性質で ある。 物理走性は多く の微生物細胞が有している性質であり、 それ ぞれ特異的な物理走性因子を認識する能力を有している。 例えば、 典型的な物理走性因子と しては、 電場、 磁場、 重力場、 光度、 温度 、 粘度等である。
(走化因子)
本発明において、 走化因子は、 対象とする細胞について下記の測 定法によ り測定される細胞誘引能 N / N。 が 1 . 2以上、 よ り好ま しく は 2以上、 更に好ましく は 1 0以上の走化因子であることが好 ましい。 細胞誘引能の測定は、 例えば以下のよ うにして行う ことが できる。
後述の製造例 8で得られる本発明に使用可能なハイ ド口ゲル形成 性高分子 （T G P— 5 ) 1 gを走化因子を含有する 9 gの生理食塩 水に 4 °Cで溶解し、 本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子
50 濃度 1 0 w t %の水溶液を調製する。 ここでハイ ドロゲル形成性高 分子水溶液中の走化因子の濃度は、 対象となる細胞を誘引しうる範 囲に設定する必要があり、 通常は 1 0— 6 M〜 l 0— 5 Mの範囲と する。 この水溶液 1 gを 3 7 °Cに昇温して表面積 1 0〜 1 5 c m2 ( S ZV比 ： 1 0〜 1 5 ) のハイ ドロゲルとする。 具体的には例え ば、 該水溶液を 2 3 Gの注射針付き 1 m Lシリ ンジに充填して 4 °C に冷却し、 これを 3 7 °Cの生理食塩水 1 0 0 m L中に 5 ~ 1 0秒間 で押し出す。 この時得られる細紐状のハイ ドロゲルの直径は約 3 m m、 長さ約 1 4 c mとなるので、 表面積約 1 3 c m2 のハイ ド口ゲ ルが得られる。 上記の走化因子 1 0 - 6 M〜 l 0— 5 Mを含む S · V比 1 0〜 1 5のハイ ド口ゲル 1 g と、 対象となる細胞の懸濁液 （ 細胞数 ： 1 06 個 Zm L ) を 1 4 m Lのディスポーザブル遠沈管内 で接触させ、 3 7 °Cで 4時間ゆるやかに回転攪拌する。 ハイ ドロゲ ルを残してデカンテーショ ンによ り細胞懸濁液を除去、 3 7 °Cの生 理食塩水 1 0 m Lを新たに加えて、 ハイ ドロゲル表面に付着した細 胞を洗浄除去する。 この洗浄操作 3回繰り返した後、 4°Cに冷却し てハイ ドロゲルを溶解し、 ハイ ドロゲル中に遊走した細胞数 Nを測 定する。 一方、 走化因子を含有しない本発明に使用可能なハイ ドロ ゲルについて上記と同様の測定を行い、 ハイ ドロゲル中に遊走した 細胞数 N。 を測定し、 遊走因子の細胞誘引能 NZN。 を求める。
(化学走性能によ り細胞 · 生物を分離する装置および方法） 本発明に使用可能なハイ ドロゲルを用いて化学走性能によ り細胞 を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） する装置および方法はハイ ド 口ゲル内で細胞 · 生物を遊走させるまでの手段によ り、 例えば次の 3種類に大別される。 1 ) 生理活性物質を含有する水溶液と分別用 細胞 · 生物の懸濁液をハイ ドロゲルで隔離し、 該ハイ ドロゲル内に 該生理活性物質の濃度勾配を作製し、 該濃度勾配によって惹起され
51 る化学走性によって該細胞 · 生物懸濁液から該ハイ ドロゲル内に細 胞 · 生物を移行させる方法、 2 ) 細胞 · 生物が実質的に均一に内部 に分散したハイ ド口ゲルを作製し、 次いで該ハイ ド口ゲルを該ゾル 一ゲル転移温度よ り高い温度で生理活性物質を含有する水溶液に接 触させ該ハイ ド口ゲル中に該生理活性物質を移行させるヒとによつ て該ハイ ドロゲル中に該生理活性物質の濃度勾配を形成させ、 該濃 度勾配にしたがって該ハイ ドロゲル中に実質的に均一に分布してい た細胞 · 生物が化学走性能の違い（こよつてハイ ド口ゲル内の各部に 再配列される方法、 3 ) ゾル状態のハイ ド口ゲル形成性高分子の水 溶液に生理活性物質を均一に混合し、 該ゾル状態の混合液を該ゾル 一ゲル転移温度よ り高い温度に昇温して所定の形状を付与したハイ ドロゲルと して、 該ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度で細胞 · 生物 の懸濁液と接触させ、 細胞 · 生物を所定形状のハイ ドロゲル中へ移 行させる方法である。
上記 1 ) および 2 ) の方法による本発明の態様を模式的に示した ものが図 6であり、 上記 3 ) の方法による態様を模式的に示したも のが図 7である。 上記のいずれの方法を採用するかは、 目的の細胞 • 生物の種類等によって適宜選択すれば良い。 ハイ ドロゲルの形状 も目的に応じて適宜選択すれば良く、 円柱状、 円盤状、 直方体状、 球状、 細紐状、 ファイバー状、 フ レーク状、 板状、 膜状、 不定形状 等任意の形状とすることができる。
特に上記 3 ) の方法を採用する場合は、 生理活性物質 （走化因子 ) を含有するハイ ドロゲルとその周囲に配置された細胞懸濁液中の 細胞との接触頻度を高めるために、 ハイ ドロゲルに付与する所定の 形状は単位体積当たりの表面積を大きくすることが有利であり、 球 状、 細紐状、 フ ァイバー状、 フ レーク状、 板状、 膜状、 不定形状の いずれかとすることが望ましい。 また、 このハイ ド口ゲルに付与す
52 る所定幵 状が、 表面積 （ S ) Z体積 （V) 比が 1 0 ( c m— 1 ) 以 上の形状であることが好ましく、 特に 3 0 ( c m— 1 ) 以上、 更に は 6 0 ( c m— 1 ) 以上であることが好ましい。
また 3 ) の方法を採用する場合は、 ハイ ドロゲルとその周囲に配 置された細胞懸濁液中の細胞との接触頻度を高めるために、 細胞懸 濁液を携拌あるいは循環させることが好ましい。 また、 ハイ ドロゲ ルとその周囲に配置された細胞懸濁液の組を多数並列に処理するこ ともできる。 この時、 各組においてハイ ド口ゲル中の走化因子濃度 を変えたり、 各組のハイ ドロゲルと細胞懸濁液との接触時間を変え たりすることによ り、 目的とする細胞 · 生物を分画 · 回収すること ができる。
以下に本発明の具体的な態様を挙げて説明する。
(白血球の分画 · 回収）
f M L P 、 N—— formyl—methionyl—丄 eucyl— phenylalanine： 分十 量 4 c5 7. り， chemotactic peptidesノ、 L P S (Lipopolysacch aride) 等は白血球 （好中球） の走化因子と して知られている。 こ れらの走化因子の濃度勾配を本発明に使用可能なハイ ドロゲル中に 形成させ、 白血球を含む細胞群 （例えば末梢血） と接触させると、 これら走化因子によつて惹起される走化性の高い細胞と低い細胞が ハイ ド ロゲル中の走化因子の濃度に応じてハイ ドロゲル内で分離さ れる。 その後、 目的の細胞が存在するハイ ド口ゲルの部分を切り出 し、 冷ま [3してハイ ドロゲルをゾル化させ、 生理食塩水等で希釈して 遠心分離等の方法で目的とする細胞のみを回収することができる。
また、 f ML Pや L P Sに親和性を有する細胞を血液中から大量 に回収 したい場合は、 これらの走化因子を低温ゾル状態の本発明に 使用可能なハイ ドロゲル水溶液に溶解し、 例えばこの水溶液をその ゾル—ゲル転移温度よ り高い温度の生理食塩水中に滴下して微小液
53 滴の形状のままゲル化させ、 この走化因子を含有する微小な本発明 に使用可能なハイ ド口ゲルをゾル—ゲル転移温度よ り高い温度に保 持して生理食塩水から回収し、 これを血液中に分散させる。 そのま ま、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度に保持して攪拌すると、 f
M L Pや L P Sに親和性を有する細胞のみが微小液滴形状の本発明 に使用可能なハイ ドロゲル中に取り込まれる。 該ゾルーゲル転移温 度よ り高い温度に保持して細胞を取り込んだ本発明に使用可能なハ イ ド口ゲルを遠心操作によ り回収し、 それを洗浄する。 その後、 転 移温度よ り低い温度にして細胞を取り込んだ本発明に使用可能なハ ィ ドロゲルをゾル化させ、 生理食塩水等で希釈し、 更に洗浄を繰り 返すことによつて本発明に使用可能なハイ ド口ゲルを取り除き、 目 的細胞を回収する。 この方法の特徴は、 細胞浮遊液中で細胞だけで なく、 走化因子を含んだ本発明に使用可能なハイ ド口ゲルも自由に 動く ことができ、 更に本発明に使用可能なハイ ドロゲルの大きさ · 形状から非常に高い単位量当たり の表面積が生み出されることから 、 細胞と本発明に使用可能なハイ ドロゲルとの高頻度の接触性が期 待できる。 また種々の走化因子を本発明に使用可能なハイ ドロゲル に封入したり、 時間、 温度等の条件に変化を与えることによ り、 小 型でマルチプレックスタイプでの機能的回収が期待できる。
(幹細胞移植用高定着性細胞の分画 · 回収）
ヒ ト造血幹細胞移植においては、 造血細胞の中の C D 3 4陽性細 胞中に多分化能を有する造血幹細胞が含まれていることが知られて おり、 移植 ドナーの造血細胞中 C D 3 4陽性率が造血幹細胞移植の 評価のひとつと して利用されている。 最近では、 この C D 3 4陽性 細胞の中でもケモカイン受容体 C X C R— 4のリ ガンドである St ro mal ce l l der ived fac tor - 1 ( S D F— 1 ) 等のケモカインに対 して遊走能を示す細胞が移植レシピエントの骨髄への h o m i n g
54 活性が高いことが注目されている。 S D F— 1に対して高い遊走能 を示す細胞の数が多いほど、 移植ドナー細胞のレシピエント骨髄へ の定着率が高いという報告もある。 C D 3 4陽性細胞中の S D F— 1 に対する反応性を評価し、 また S D F— 1に反応する細胞を分離 するために S D F— 1 を含有した本発明に使用可能なハイ ドロゲル を利用する。 移植ドナーの骨髄液、 末梢血、 あるいは臍帯血よ り採 取した造血細胞よ り C D 3 4陽性細胞を磁気ビーズ法により分離し 、 その C D 3 4陽性細胞浮遊液中に S D F— 1 を含有した本発明に 使用可能なハイ ド口ゲルを共浮遊させ、 一定時間撹拌培養し、 S D F— 1に反応して本発明に使用可能なハイ ドロゲル内に入り込んだ C D 3 陽性細胞を分離回収する。 その回収率は S D F— 1反応性 細胞率をあらわし、 ドナー細胞の homing活性を評価しうることが期 待できる。 更にこの分離した細胞はそのまま high-homing活性を持 つた造 I&L幹細胞と して移植が可能である。
(精子の走化性を利用した機能的分離および体外受精法）
精子は受精のために特殊化した細胞で、 鞭毛を有し、 洗練された 運動機能である走化性を示す、 生物の一生のなかで唯一個体を離れ て重要な役割を果たす細胞である。 この走化性が受精を可能にして いる。 この走化性に基づく遊走能の高い精子のみを卵細胞との受精 に利用するために本発明に使用可能なハイ ドロゲルを利用する。 採 取した清液を洗浄後、 その精子を少量のゾル状態の本発明に使用可 能なハイ ドロゲルに浮遊させ、 そのままそのゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化させる。 更にその精子を含む微小ゲル状の本発 明に使用可能なハイ ドロゲルの周り を、 別途用意した適当な量で適 当な濃度の本発明に使用可能なハイ ドロゲルで覆う。 この外側の本 発明に使用可能なハイ ドロゲルの量 · 濃度は遊走能の高い精子のみ がハイ ド口ゲル内を移動することが可能で、 しかも一定時間内にこ
55 の本発明に使用可能なハイ ド口ゲルから外部の浮遊液中に出られる ように調整する。 培養液中に卵細胞を置いたプラスチックシャーレ 内に精子を含んだ本発明に使用可能なハイ ドロゲルをそのゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度で浮遊させる。 運動機能の高い精子のみが 本発明に使用可能なハイ ドロゲル内で高い走化性を示し'、 本発明に 使用可能なハイ ド口ゲル内で機能的に選択された高い走化性を示す 精子のみが培養液中へ湧出してく る。 したがって、 卵細胞は走化性 の高い精子とのみ受精することができるようになる。
以下に実施例を示し、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 の範囲は特許請求の範囲によ り限定されるものであり、 以下の実施 例によって限定されるものではない。 実施例
製造例 1 (分離媒体の製造例）
ポリ プ ロ ピレンォキサイ ドーポリエチレンォキサイ ド共重合体 （ プロ ピレ ンォキサイ ド /エチレンォキサイ ド平均重合度約 6 0 / 1 8 0、 旭電化工業 （株） 製 ： プル口ニック F— 1 2 7 ) 1 0 gを乾 燥クロ口 ホルム 3 O m Lに溶解し、 五酸化リ ン共存下、 へキサメチ レンジィ ソシァネー ト 0 . 1 3 gを加え、 沸点還流下に 6時間反応 させた。 溶媒を減圧留去後、 残さを蒸留水に溶解し、 分画分子量 3 万の限外濾過膜 （アミ コン P M— 3 0 ) を用いて限外濾過を行い、 高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。 得られた水溶液を凍 結して、 F— 1 2 7高重合体および F— 1 2 7低重合体を得た。
上記によ り得た F - 1 2 7高重合体 （本発明に使用可能なハイ ド 口ゲル形成性高分子、 T G P— 1 ) を、 水冷下、 8質量％の濃度で 蒸留水に溶解した。 この水溶液をゆるやかに加温していく と、 2 1 °Cから徐々に粘度が上昇し、 約 2 7 °Cで固化して、 ハイ ド口ゲルと
56 なった。 このハイ ド口ゲルを冷却すると、 2 1 °Cで水溶液に戻った 。 この変化は、 可逆的に繰り返し観測された。 一方、 上記 F— 1 2 低重合体を、 氷点下 8質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、 6 0 °C以上に加熱しても全くゲル化しなかった。
製造例 2 '
ト リ メチロールプロ ノ、。ン 1 モルに対し、 エチレンォキサイ ド 1 6
0 モノレをカチオン重合によ り付加して、 平均分子量約 7 0 0 0のポ リエチレンォキサイ ドト リオールを得た。
上記によ り得たポリ エチレンォキサイ ドト リオール 1 0 0 gを蒸 留水 1 0 0 0 m Lに溶解した後、 室温で過マンガン酸力 リ ウム 1 2 gを徐々に加えて、 そのまま約 1時間、 酸化反応させた。 固形物を 濾過によ り除いた後、 生成物をク ロ 口ホルムで抽出し、 溶媒 （クロ ロ ホノレム） を減圧留去してポリエチレンォキサイ ドト リカルボキシ ル体 9 0 gを得た。
上記によ り得たポリエチレンォキサイ ド ト リカルボキシル体 1 0 g と、 ポリ プロ ピレンォキサイ ドジァミ ノ体 (プロ ピレンォキサイ ド平均重合度約 6 5、 米国ジェファーソンケミカル社製、 商品名 ： ジ工ファーミ ン D— 4 0 0 0、 曇点 ： 約 9 °C ) 1 0 g とを四塩化炭 素 1 0 0 0 m Lに溶解し、 ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド 1 . 2 gを加えた後、 沸点還流下に 6時間反応させた。 反応液を冷却し、 固形物を濾過によ り除いた後、 溶媒 （四塩化炭素） を減圧留去し、 残さ を真空乾燥して、 複数のポリ プロ ピレンォキサイ ドとポリェチ レンォキサイ ドとが結合した本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成 性高分子 （T G P — 2 ) を得た。 これを氷冷下、 5質量％の濃度で 蒸留水に溶解し、 そのゾルーゲル転移温度を測定したところ、 約 1 6 °Cであった。
製造例 3
57 N—イ ソプロ ビルアク リルアミ ド (ィ一ス トマンコダック社製） 9 6 g 、 N—ァク リ ロキシスクシンイ ミ ド （国産化学 （株） 製） 1 7 g、 および n — ブチルメタタ リ レー ト （関東化学 （株） 製） 7 g をクロ口ホルム 4 O O O m Lに溶解し、 窒素置換後、 N， N ' —ァ ゾビスイソブチロ ニ ト リル 1 . 5 gを加え、 6 0 °Cで 6 '時間重合さ せた。 反応液を濃縮した後、 ジェチルエーテルに再沈 （再沈殿） し た。 濾過により固形物を回収した後、 真空乾燥して、 7 8 gのポリ ( N—ィ ソプロ ビノレァク リルアミ ドーコ 一 N—ァク リ ロキシスクシ ンイミ ド―コ— n ーブチルメタク リ レー ト ） を得た。
上記によ り得 こポリ （ N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ドーコ — N —アタ リ ロキシス クシンイ ミ ド一 コ ー n—ブチノレメタク リ レー ト） に、 過剰のイ ソプロ ピルアミ ンを加えてポリ （N—イ ソプロ ピルァ ク リルアミ ド一コ 一 n —ブチルメタタ リ レー ト） を得た。 このポリ ( N—イソプロ ビノレアク リルアミ ド一 コ 一 n —ブチルメ タク リ レー ト） の水溶液の曇点は 1 9 °Cであった。
前記のポリ （N" —ィ ソプロ ピルァク リルアミ ドーコ一 N—ァク リ ロキシスクシンィ ミ ドーコ ー n —ブチルメ タク リ レー ト） 1 0 g 、 および両末端ァミ ノ化ポリエチレンォキサイ ド （分子量 6 ， 0 0 0 、 川研ファイ ンケ ミカル （株） 製）' 5 g をクロ 口ホルム 1 0 0 0 m Lに溶解し、 5 0 °Cで 3時間反応させた。 室温まで冷却した後、 ィ ソプロピルアミ ン 1 gを加え、 1時間放置した後、 反応液を濃縮し 、 残渣をジェチノレエーテル中に沈澱させた。 濾過によ り固形物を回 収した後、 真空乾燥して、 複数のポリ （N—イ ソプロ ピルアク リル アミ ドーコ一 n—プチルメタク リ レー ト） とポリエチレンォキサイ ドとが結合した本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P - 3 ) を得 こ。
このよ うにして得た T G P— 3を氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留
58 水に溶解し、 そのゾルーゲル転移温度を測定したところ、 約 2 1 °C であった。
製造例 4 (滅菌方法）
上記した本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P 一 3 ) の 2. 0 gを、 E O G (エチレンオキサイ ドガス'） 滅菌パッ グ （ホギメディカル社製、 商品名 ： ハイブリ ッ ド滅菌パッグ） に入 れ、 E O G滅菌装置 （イージーパック、 井内盛栄堂製） で E O Gを パッグに充填し （ E O G濃度 ： 9 0 0 m g / L程度） 、 室温にて一 昼夜放置した。 更に 4 0 °Cで半日放置した後、 E O Gをバッグから 抜き、 エアレーシ ヨ ンを行った。 バッグを真空乾燥器 （ 4 0 °C) に 入れ、 時々エアレーショ ンしながら半日放置することにより滅菌し た。
この滅菌操作によ り高分子のゾル—ゲル転移温度が変化しないこ とを、 別途確認した。
製造例 5
N—ィ ソプロ ピルァク リ ルア ミ ド 3 7 g と、 n _ブチルメ タタ リ レー ト 3 g と、 ポ リ エチレンオキサイ ドモノアタ リ レー ト （分子量 4， 0 0 0、 日本油脂 （株） 製 ： PME— 4 0 0 0 ) 2 8 g とを、 ベンゼン 3 4 0 m Lに溶解した後、 2， 2 ' —ァゾビスイソプチ口 二 ト リル 0. 8 gを加え、 6 0 °Cで 6時間反応させた。 得られた反 応生成物にクロ 口ホルム 6 0 O m Lを加えて溶解し、 該溶液をエー テル 2 0 L (リ ッ トノレ） に滴下して沈澱させた。 得られた沈殿を濾 過により 回収し、 該沈澱を約 4 0 °Cで 2 4時間真空乾燥した後、 蒸 留水 6 L に再び溶解し、 分画分子量 1 0万のホローフアイパー型限 外濾過膜 （アミ コン社製 H 1 P 1 0 0 - 4 3 ) を用いて 1 0 °Cで 2 Lまで濃縮した。 該濃縮液に蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記希釈 操作を再度行った。 上記の希釈、 限外濾過濃縮操作を更に 5回繰り
59 返し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外濾過によ り濾 過されなかったもの （限外濾過膜内に残留したもの） を回収して凍 結乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明に使用可能なハイ ドロゲル形 成性高分子 （T G P — 4 ) 6 0 gを得た。
上記によ り得た本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P — 4 ) 1 g を、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶 液のゾル—ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度 は 2 5 °Cであつ†こ。
製造例 6
製造例 3の本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （T G
P - 3 ) を 1 0質量0 /0の濃度で蒸留水に溶解し、 3 7 °Cにおける V を測定したところ 、 5 • 8 X 1 0 5 P a ' s e cであった。 一方
、 寒天を 2質量％の濃度で蒸留水に 9 0 °Cで溶解して、 1 0 °Cで 1 時間ゲル化させた後、 3 7 °Cにおける 77 を測定したところ、 その V は機器の測定限界 ( 1 X 1 0 7 P a - s e c ) を越えていた。
製造例 7
N—ィ ソプロ ピルァク リルアミ ド 7 1 . 0 gおよび n—ブチルメ タク リ レート 4. 4 gをエタノール 1 1 1 7 gに溶解した。 これに ポリ エチレングリ コールジメ タク リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株） 製） 2 2 . 6 gを水 7 7 3 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N , N， ， N， ーテ ト ラメチルエチレンジアミ ン (T EME D) 0 . 8 m L と 1 0 %過硫酸ァンモニゥム （A P S ) 水溶液 8 m Lを 加え 3 ◦分間攪拌反応させた。 更に T E M E D O . 8 m L と 1 0 % A P S水溶液 8 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結させ た。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加え て希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 Lま
60 で濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0 万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ りろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成 性高分子 （T G P— 5 ) 7 2 gを得た。
上記によ り得た本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) 1 gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶 液のゾルーゲノレ転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度 は 2 0 °Cであった。
製造例 8
N—イソプロ ピルァク リルアミ ド 4 2. 0 gおよび n—プチルメ タク リ レー ト 4 . 0 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これにポ リエチレングリ コーノレジメタク リ レー ト ( P D E 6 0 0 0、 日本油 脂 （株） 製） 1 1. 5 gを水 6 5. 1 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N， N， ， N ' ーテ ト ラメチルエチレンジアミ ン (T EME D) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸ァンモニゥム （A P S ) 水溶液 4 m Lを 加え 3 0分間攪拌反応させた。 更に T EME D O . 4 m Lと 1 0 % A P S水溶液 4 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結させ た。 反応液を 5 °C以下に冷却後、 5 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加えて希 釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 5 °Cで 2 Lまで濃縮 した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0 万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ り ろ過
61 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成 性高分子 （T G P— 6 ) 4 0 gを得た。
上記により得た本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P - 6 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した'。 この水溶 液のゾル—ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度 は 7 °Cであった。
製造例 9
N—ィ ソプ ピルァク リルァ K 4 5. 5 gおよび n—ブチルメ タク リ レ ― ト 0 . 5 6 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これに ポリェチレングリ コールジメタク リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株 ) 製 ) 1 1 . 5 gを水 6 5. 1 gに溶解した水溶液を加え
、 36. 流下 7 0 °cに加温した 窒奉気流下 7 0 °Cを保ちながら、
N， N， N， ， Ν' —テ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D ) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸ァンモニゥム （ A P S ) 水溶液 4 m L を加え 3 0分間攪拌反応させた。 更に T EME D O . 4 mL と 1 0 % A P S水溶液 4 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結さ せた。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加 えて希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 L まで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ り ろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成 性高分子 （T G P— 7 ) 2 2 gを得た。
上記により得た本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 （
62 T G P— 7 ) l gを、 9 gの蒸留水に水冷下で溶解した。 この水溶 液のゾルーゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度 は 3 7 °Cであった。
実施例 1 (分析用手順)
( 1 ) 冷却 2 4ゥエルプレート各ゥヱルに、 走化因子 ( 4種類 o r 4濃度） を含む氷冷 T G P水溶液 （ 1 5 m L遠沈管 X 4本） を 4
O O Lずつ分注 （X 6 ゥエル） する。 チップ交換 4回。
( 2 ) プレートを 3 7 °Cに加温し、 T G P水溶液をゲル化させる。
( 3 ) 3 7 °Cに加温した細胞懸濁液 （ 5 0 m L遠沈管 X I本） を T G Pゲル上に 4 0 0 μ Lずつ分注する （約 1 0 mL) 。
( 4) プレートに蓋をして 3 7 °Cで 3 0分間静置する。
( 5 ) プレー トの蓋をはずし、 3 7 °Cに加温した生食 （ 5 0 mL遠 沈管 X 1本） を 1 m Lずつ 4 ゥエルに分注し、 4ゥエルについてそ のまま 1 mLずつを吸引廃棄する （チップは 1本） 。
( 6 ) チップを交換し、 上記 4ゥエルについて （ 5 ) と同じ操作を 3回繰り返す。
( 7 ) ( 5 ) の操作開女台から 1 5分後に次の 4ゥエルについて （ 5 ) , ( 6 ) の操作を行う。
( 8 ) ( 7 ) の操作を残り 1 6 ゥエル （ 4列） について、 1 5分毎 に行う。
( 9 ) 各ゥ ルに 3 7 °Cの発色試薬を 5 0 Lずつ分注する。
( 1 0 ) プレートに蓋をして 3 7 °Cで 2 4時間培養する。
( 1 1 ) 冷却振倒してプレー ト リーダーで吸光度 （蛍光強度） を測 定する。
実施例 2 (分取用手順）
( 1 ) 冷却 2 4ゥヱルプレー ト各ゥエルに、 走化因子 （ 4種類また は 4濃度） を含む氷冷 T G P水溶液 （ 1 5 m L遠沈管 X 4本） を 4
63 O O ii Lずつ分注 （X 6 ゥエル） する。 チップ交換 4回。
( 2 ) プレー トを 3 7 °Cに加温し、 T G P水溶液をゲル化させる。
( 3 ) 7 °Cに加温した細胞懸濁液 （ 5 0 m L遠沈管 X I本） を T G Pゲル上に 4 0 0 ずつ分注する （約 1 0 m L ) 。
( 4 ) プレー トに蓋をして 3 7 °Cで 3 0分間 （時間可変） 静置する
( 5 ) プレー トの蓋をはずし、 3 7 °Cに加温した生食 （ 5 0 m L遠 沈管 X 1本） を 1 m Lずつ 4ゥエルに分注し、 4ゥエルについてそ のまま 1 m Lずつを吸引廃棄する。 （チップは 1本）
( 6 ) チップを交換し、 上記 4ゥヱルについて （ 5 ) と同じ操作を 3回繰り返す。
( 7 ) 上記 （ 5 ) 、 （ 6 ) の操作を全てのゥエルについて同様に続 けて行う。
( 8 ) プレー トを 4 °Cに冷却し、 氷冷した生食 （ 5 0 m L遠沈管 X 1本） l m L をゥ ルに分注し、 ゥェルの細胞含有 T G P溶液 （ 1
. 4 m L) を走化因子ごとに氷冷 1 5 m L遠沈管 （ 4本） に回収す る。
( 9 ) 上記 （ 8 ) の操作を操り返す。
参考例 1 (好中球遊走能）
f M L P N -formyl-methionyl - leucyl- phenylalanine： 分子量 4 3 7. 6 , chemotactic peptides, S I GMA社製） を 0 M、 1 0 - 6 M、 1 0— 7 M、 1 0— 8 Mそれぞれ含む軟寒天培地 （na calai tesque社製軟寒天末濃度 ： 0. 6 %となるように D' MEM 培地 (Dulbecco's Modification Eagle's Medium, GIBC0社製、 1 0 %の F C S (Fetal Calf Serum)を含む） に溶解したもの） を 4 2 °Cで調製し、 直径 3 5 mmのポ リ スチレンディ ッシュ （SUMIL0N 社製） に各 l m L (厚さ約 l mm) を入れて室温でゲル化させた。
64 製造例 8で得られた本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分子 (T G P - 5 ) を製造例 4 と同様にして E O G滅菌し、 その 1 gを 9 の 0 ' ME M培地に 4 °Cで溶解し、 上記の軟寒天ゲルの上にそ れぞれ 0 . 5 m L (厚さ約 0 . 5 mm) ずつ注入し、 室温でゲル化 させた。 このハイ ドロゲ /レのゾルーゲル転移温度は 1 8 °Cであった 。 上記の本発明に使用可食 なハイ ド口ゲル層の上に 8 . Ο μ πιのポ アサイズのフイノレター付 t issue culture insert (N UN C社製） を付置し、 その中にヒ ト末梢血白血球 1 0 7 個を含む細胞浮遊液 0 . 5 m Lを入れ、 3 7 °Cイ ンキュベーター内に静置した。 3 7 °Cで .3時間静置した後、 ディ ッシュをイ ンキュベーターから取り出した 。 該ディ ッシュを氷上で冷去卩し、 tissue culture insertを除去、 本発明に使用可能なハイ ドロゲルをゾル化させた。 永冷下液状の本 発明に使用可能なハイ ドロゲルを回収し、 生理食塩水で希釈して遠 心 （ 3 0 0 0 r p m、 5分間） した。 沈降した細胞を 2 0 μ ~Lの 生理食塩水に再浮遊させて細胞数を力ゥント し、 本発明に使用可能 なハイ ドロゲル中へ移行した好中球の数を測定した。 また、 本発明 に使用可能なハイ ドロゲ /レを除去した後、 軟寒天中まで移行した細 胞数を顕微鏡下で観察し、 結果を表 1 にまとめた。
(走化因子濃度とハイ ドロゲル中遊走細胞数）
(表 1 )
表 1 走化因子濃度とハイ ドロゲル中遊走細胞数
Figure imgf000068_0001
上記表 1 に示す結果は、 走化因子である f M L Pのゲル中におけ る濃度が高いほど、 ί M L Ρ反応性細胞の遊走能が高くなることを
65 示している。 また該細胞は f ML P濃度の高い方向へ遊走すること も示している。
参考例 2 (好中球の選択的分画回収）
製造例 8で得られた本発明に使用可能なハイ ドロゲル形成性高分 子 （T G P— 5 ) を製造例 4 と同様にして E O G滅菌し、 その l g を 9 gの D' MEM培地 (Dulbecco' s Modification Eagle' s Medi um, GIBCO社製、 1 ◦ %Fetal Calf Serumを含む） に氷冷下で溶解 した。 この水溶液のゾル—ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾル 一ゲル転移温度は 1 8 °Cであった。
f ML Pを上記ハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 5 ) の D， MEM培地に 4 °Cで溶解した （濃度 ： 1 0— 6 M) 。 この f ML P 含有ハイ ド口ゲル形成性高分子 (T G P - 5 ) D， ME M培地を 2 3 Gの注射針付 1 m Lシリ ンジに入れ 4 °Cに冷却した。 この 4 °Cの 水溶液 1 m Lをデイ スポーザブル遠沈管 （ファルコン社製、 1 4 m L ) に入れた 3 7 °Cのリ ン酸緩衝食塩水 （ P B S ) 1 0 m Lに押し 出し、 細紐状のハイ ドロゲルを形成させた。 3 7 °Cに保持しながら 、 細紐状のハイ ドロ ゲルを残して P B Sをデカンテーシヨ ンによ り 除去し、 代わりにへパリ ン加ヒ ト全血 1 O m Lを遠沈管内の細紐状 のハイ ドロゲルに加えて 3 7でで 4時間ゆるやかに回転攪拌した。 3 7 °Cに保持しなが ら、 へパリ ン加ヒ ト全血を除去、 3 7 °Cに加温 した P B Sで細紐状のハイ ドロゲルを洗浄した。 洗浄後、 4 °Cに冷 却して細紐状のハイ ドロゲルをゾル化させ、 P B Sで希釈、 遠心洗 浄し、 ゲル中に取り 込まれた細胞のライ ト · ギムザ染色標本を作製 し顕微鏡観察した結果、 f ML Pに反応しゲル内に遊走した細胞の みが観察された。 その細胞の分画は好中球および単球が優位で、 赤 血球や血小板等 f M L Pに非反応性の細胞はほとんど観察されなか つた。
66 比較参考例
f M L Pをハイ ドロゲル中に含有させなかった以外は、 参考例 2 と全く同様の実験を行った。 この比較例で得られたハイ ドロゲル内 に取り込まれた細胞を観察したところ、 赤血球、 血小板、 白血球い ずれもほとんど観察されなかった。 ' 産業上の利用可能性
上記構成を有する本発明の分離 '· 回収装置を用いた場合には、 分 離対象物を流動状態で、 分離媒体に供給し、 分離媒体で必要な分離 を行うに際して、 温度制御手段による適切な温度制御が可能となる ため、 デリケートな分離を行った後であっても、 分離された成分の 速やか且つ容易な回収が可能となる。
67

Claims

1 . 分離対象物を流動状態で、 分離媒体に供給するための分離対 象物供給手段と、
分離媒体を収容するための分離媒体容器と、 '
前記分離媒体容器の温度を制御するための温度制御手段と、
ニー一
前記分離媒体から分離物を回収するための回収手段とを少なく と も含むことを特徴とする分離 · 回収装置。
2 . 分離媒体を流動状態で、 前の記分離媒体容器に供給するための 分離媒体供給手段を更に有する請求項 1 に記載の分離 · 回収装置。
3 . 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際に固体状態であ る請求項 1 または 2に記載の分離 · 回収装置。
4 . 前記分離媒体が、 温度変化に応じた変化を生ずる媒体である 請求項 1 〜 3 のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
5 . 前記温度変化に応じた変化が、 相変化、 粘度の変化、 分離能 の変化、 疎水性の変化、 および架橋密度の変化からなる群から選ば れる少なく と も 1種の変化である請求項 4に記載の分離 · 回収装置
6 . 前記相変化が、 ゾル—ゲル転移である請求項 5に記載の分離 • 回収装置。
7 . 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際にゲル状態であ る請求項 1 〜 6のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
8 . 前記分離媒体が、 分離対象物の分離を行う際にゲル状態であ り、 且つ分離物を回収する際にゾル状態である請求項 7に記載の分 離 · 回収装置。
9 . 前記ゾル状態が、 3 7 °C以下の低温におけるゾル状態である 請求項 8に記載の分離 · 回収装置。
68
1 0 . 前記分離対象物が生体関連物質である請求項 1〜 9のいず れかに記載の分離 · 回収装置。
1 1 . 前記生体関連物質が細胞分散体である請求項 1 0に記載の 分離 · 回収装置。
1 2 . 前記温度制御手段がペルチヱ素子を含む請求項' 1〜 1 1 の いずれかに記載の分離 · 回収装置。
1 3 . 前記分離媒体容器がマルチゥ ルプレー トである請求項 1 〜 1 2のいずれかに記載の分離 · 回収装置。
1 4 . 低温でゾル状態、 高温でゲル状態を呈する熱可逆的なゾル 一ゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性高分子の水溶液を用い、
( 1 ) 該ゾルーゲル転移温度よ り低温に保持した前記高分子の水 溶液を、 分離媒体容器に供給する工程、
( 2 ) 分離媒体容器を加温して、 高分子の水溶液をゲル化させる 工程、
( 3 ) 分離媒体容器の温度を高分子水溶液のゾルーゲル転移温度 よ り高温に維持しつつ、 該転移温度より高い温度に保持した分離対 象物を含む流体を、 分離媒体容器に供給して、 該流体を前記ゲルと 接触させる工程、 および
( 4 ) 前記ゾルーゲル転移温度よ り高温を保持しつつ、 分離対象 物を第 1 の回収容器へ回収する工程、 を少なく とも含むこ とを特徴 とする分離 · 回収方法。
1 5 . 前記工程 （ 4 ) の後に、 分離媒体容器を前記ゾルーゲル転 移温度よ り低温に冷却してハイ ド口ゲルをゾル状態と し、 分離対象 物を含む高分子水溶液を第 2の回収容器へ回収する工程を更に含む 請求項 1 4に記載の分離 · 回収方法。
1 6 . 前記分離対象物が、 細胞分散液である請求項 1 4または 1 5に記載の分離 · 回収方法。
69
1 7 . 前記高分子水溶液が、 更に走化因子を含む請求項 1 4〜 1 のいずれかに記載の分離 · 回収方法。
70
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