MXPA05001570A - Matriz biosintetica y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una matriz biosintetica consistente en un hidrogel que se forma por reticulacion de un polimero sintetico y un biopolimero. La matriz es consistente, biocompatible y no citotoxica y puede dar soporte a celulas en crecimiento in vivo. La matriz puede ser disenada para contener ademas uno o mas agentes bioactivos. La matriz tambien puede contener celulas encapsuladas y dispersadas en esta, las cuales son capaces de proliferar tras la depositacion de la matriz in vivo. Tambien se proporcionan los metodos de preparacion de la matriz biosintetica y el uso de esta in vivo para la manipulacion de tejidos o para aplicaciones de suministro de medicamentos.

Description

MATRIZ BIOSINTETICA Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo de la ingeniería o manipulación de tejidos, y en particuar, a una matriz biosintética que consiste en un idrogel conveniente para uso in vivo.

ANTECEDENTE La ingeniería de tej idos es un campo de rápido crecimiento que comprende diversas tecnologías dirigidas a sustituir o restablecer la función de tejidos y órganos. El objetivo principal en la ingeniería de tejidos es la regeneración de un tejido defectuoso mediante el uso de materiales que puedan integrarse en el tejido existente para restablecer la función normal del tejido. La ingeniería de tejidos, por tanto, requiere de materiales que puedan dar soporte al crecimiento superficial, el crecimiento interno o encapsulación de células y, en muchos casos, la regeneración de nervios.

Las composiciones de polímeros encuentran amplia aplicación en la ingeniería de tejidos. Se sabe que los biopolímeros naturales como los colágenos, fibrina, alginatos y agarosa son no tóxicos y dan soporte al crecimiento superficial, el crecimiento interno y la encapsulación de células vivas. Sin embargo, por lo regular las matrices obtenidas de polímeros naturales tienen consistencias deficientes para la trasplantación. Por el contrario, las matrices preparadas a partir de polímeros sintéticos pueden formularse para que muestren las características físicas determinadas con anticipación como la resistencia del gel, así como características biológicas como la capacidad de degradación. Los informes de que los análogos sintéticos de los polímeros naturales como polilisina, poli(etilen imina) , y similares pueden mostrar efectos citotóxicos [Lynn & Langer, J. Amer. Chem. Soc, 122: 10761-10768 (2000)] han dado origen al desarrollo de polímeros sintéticos alternativos para aplicaciones de la ingeniería de tej idos .

Los hidrogeles son polímeros reticulados, insolubles en agua y que contienen agua, los cuales ofrecen buena biocompatibilidad y tienen una menor tendencia a inducir trombosis, incrustación e inflamación y como tales son candidatos ideales para propósitos de la ingeniería de tejidos. El uso de los hidrogeles en la biología celular es bien conocido [véase, por ejemplo, A. Atala y R. P. Lanza, eds., "Methods in Tissue Engineering" Academic Press, San Diego, 2002] . Se ha descrito una amplia variedad de hxdrogeles para aplicaciones in vivo [véase, por ejemplo, la revisión de Jeong, y col., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 37-51 (2002)] . Los hxdrogeles a base de N-isopropilacrilamida (NiPAAm) y algunos co-polímeros de éste, por ejemplo son no tóxicos y pueden dar soporte al crecimiento de células encapsuladas in vitro [Vernon, y col., Macromol. Symp. 109: 155-157 (1995); Stile, y col., Macromolecules, 32 7370-9 (1999); Stile y col., Biomacromolecules 3: 591-600 (2002) ; Stile, y col., Biomacromolecules 2: 185-194 (2001) ; Webb y col., MUSC Orthopaedic J. , 3: 18-21 (2000) ; An y col., Patente US No. 6,103,528] . Los polímeros NiPAAm sensibles a la temperatura también han sido descritos para utilizarlos en inmunoensayos [Patente US No. 4,780,409] . No obstante, a pesar de las variaciones en las condiciones de la síntesis y los mejoramientos para favorecer la biocompatibilidad, todavía es difícil obtener una interfaz hospedero-implante imperceptible y la integración completa del implante de hidrogel en el hospedero [Hicks y col., Surv. Ophthalmol . 42: 175-189 (1997) ; Trinkaus-Randall y Nugent, J. Controlled Reléase 53 : 205-214 (1998) ] .

Se han documentado modificaciones de los geles de polímeros sintéticos con un segundo polímero obtenido de fuentes naturales para generar una estructura de red de polímero interpenetrante ("IPN") [por ejemplo, véase Gutowska y col., Macromolecules 27: 4167 (1994); Yoshida y col., iVature, 374: 240 (1995); Wu & Jiang, Patente US No. 6,030,634; Park y col., Patente US No. 6,271,278] . No obstante, estas estructuras con frecuencia se desestabilizan por la extracción del componente obtenido en forma natural a través de medios de cultivo y por los fluidos fisiológicos. Los polímeros obtenidos en forma natural también tienden a biodegradarse con rapidez dentro del cuerpo, dando origen a la desestabilización de los implantes in vivo.

También se han descrito hidrogeles más adecuados consistentes en composiciones de polímeros reticulados. Por ejemplo, la Patente US No. 6,388,047 describe una composición que consiste en un macrómero hidrofóbico y un polímero hidrofílico que se reticulan para formar un hidrogel por polimerización por radicales libres. La Patente US No. 6,323,278 describe una composición de polímeros reticulados que puede formarse in situ y que consiste en dos polímeros sintéticos, contiene múltiples grupos electrofílicos y el otro contiene múltiples grupos nucleofilicos. Las Patentes US No. 6,388,047 y 6,384,105 describen sistemas que deben reticularse por química de radicales libres, lo cual requiere el uso de los iniciadores que son bien conocidos por ser citotóxicos (los compuestos azo, persulfato) , dando origen de este modo a posibles efectos colaterales si el idrogel ha de ser utilizado en el tejido o con células encapsuladas.

La Patente US No. 6,384,105 describe compuestos poliméricos biodegradables , que pueden ser inyectados, consistentes en poli (fumarato de propileno) y poli (etilen glicol) -dimetacrilato los cuales pueden ser reticulados in situ. Los hidrogeles descritos en esta patente se basan en gran medida en polímeros con un esqueleto de óxido de polietileno. Aunque se sabe que estos polímeros son biocompatibles , se desconoce su habilidad para soportar el crecimiento celular.

La Patente US No. 6,566,406 describe hidrogeles reticulados, biocompatibles, que se forman a partir de precursores solubles en agua que tienen grupos electrofílicos y nucleofíclicos capaces de reaccionar y de reticulación in situ. Los precursores están descritos como un polímero de '~ óxido de polialquileno y un reticulador. Como ya se mencionó, se desconoce la habilidad de los polímeros con esqueleto de óxido de polialquileno para soportar el crecimiento celular.

Por tanto, sería muy conveniente una matriz mejorada que sea biocompatible , suficientemente consistente para funcionar como un implante y que pueda dar soporte al crecimiento celular in vivo.

Se proporciona esta información anterior con el propósito de dar a conocer la información que el solicitante considera de importancia posible para la presente invención. No se admite necesariamente, ni debe considerarse, que cualquiera de la información anterior constituye la técnica anterior para la presente invención.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN ün objetivo de la presente invención es proporcionar una matriz biosintética y los usos de ésta. De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proporciona un co-polimero sintético conveniente para la preparación de una matriz biosintética, que consiste en uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó ?,?-dialquilo, uno o más co-monómero (s) hidrofílico y uno o más co-monómero (s) ácido acril o metacrilcarboxílico derivado para contener una porción reactiva pendiente que pueda reticular moléculas bioactivas, el polímero sintético tiene una masa molecular promedio numérico entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 1,000,000.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona una matriz biosintética que consiste en el co-polímero sintético, un biopolímero y un disolvente acuoso, en donde el co-polímero sintético y el biopolímero se reticulan para formar un hidrogel .

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan los usos de la matriz biosintética como un andamio para la regeneración de te idos, para la sustitución de tejido dañado o retirado en un animal, o para recubrir implantes quirúrgicos .

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan las composiciones que contienen: uno o más agente (s) bioactivo(s) o una pluralidad de ' células; un co-polímero sintético de la invención; un biopolímero; y un disolvente acuoso.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un implante para utilizarlo en la ingeniería o manipulación de tejidos que consiste en una matriz biosintética preformada, la matriz consiste en un disolvente acuoso y un biopolímero reticulado con un co-polímero sintético de la invención.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso del implante como una córnea artificial .

De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un proceso para preparar un co-polímero sintético, que consiste en: (a) dispersar uno o más co-monómero(s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó N,N-dialquilo, uno o más co-monómero (s) hidrofílico (s) y uno o más co-monómero (s) ácido acril- o metacrilcarboxílico derivado para contener una porción pendiente que pueda ser reticulada, en un disolvente, en presencia de un iniciador; (b) permitir que el co-monómero acrilamida sustituido con N-alquilo ó ?,?-dialquilo, el co-monómero hidrofílico y el co-monómero ácido acril- o metacrilcarboxílico se polimericen para formar un co-polímero sintético, y (c) como una opción, purificar el co-polímero sintético; y un proceso para preparar una matriz biosintética que consiste en la preparación de un co-polímero sintético, dispersar el co-polímero sintético y un biopolímero en un medio acuoso y permitir que el co-polímero sintético y el biopolímero se réticulen para obtener la matriz biosintética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la estructura general de un terpolímero de conformidad con una modalidad de la invención, que consta de N-isopropilacrilamida, (NiPAAm) , ácido acrílico (AAc) y N-acriloxisuccinimida (ASI) .

La Figura 2 presenta los resultados clínicos del trasplante en cerdos de las córneas artificiales preparadas a partir de la matriz biosintética de conformidad con una modalidad de la invención.

La Figura 3 representa los resultados de la microscopía confocal in vivo a las seis semanas postoperatorias de las córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de conformidad con una modalidad de la invención y trasplantadas en cerdos .

La Figura 4 representa la valoración in vivo par la sensibilidad corneal de las córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de conformidad con una modalidad de la invención y trasplantadas en cerdos .

Las Figuras 5, 6 y 7 representan los resultados de la valoración morfológica y bioquímica de las córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de conformidad con una modalidad de la invención y trasplantadas en cerdos .

La Figura 8 muestra: (A) la estructura de un terpolímero que contiene un agente bioactivo reticulado de conformidad con una modalidad de la invención, (B) un andamio corneal compuesto de colágeno reticulado y el terpolimero que se muestra en (A) , y (C) muestra un andamio corneal compuesto del colágeno termogelificado solamente .

Las Figuras 9 y 10 se representan los resultados del suministro de un hdirogel que contiene colágeno y un terpolímero-agente bioactivo de conformidad con una modalidad de la invención en cerebros de ratón y rata .

La Figura 11 muestra el módulo (A) y el esfuerzo a la falla (B) obtenidos de las mediciones de sacar la sutura como función de las relaciones de concentración de los grupos amino de N-acriloxisuccinimida a colágeno para matrices de hidrogel de conformidad con una modalidad de al invención.

La Figura 12 representa la transmisión (A) y dispersión inversa (B) de la luz a través de la región visible como función de las relaciones de concentración de los grupos amino de N-acriloxisuccinimida a colágeno para matrices de liidrogel de conformidad con una modalidad de la invención.

La Figura 13 representa la transmisión (A) y la dispersión inversa (B) de la luz a través de la región visible como función de las relaciones de concentración de los grupos amino de N-acriloxisuccinimida a colágeno para una matriz de hidrogel de conformidad con otra modalidad de la invención.

La Figura 14 representa el restablecimiento de la sensibilidad al tacto para un implante de córnea de cerdo que consiste en un hidrogel de conformidad con una modalidad de la invención.

La Figura 15 representa el procedimiento de implantación corneal por gueratoplastia lamelar en cerdos y las imágenes microscópicas confocales, clínicas, in vivo de implantes de 6 semanas consistentes en un hidrogel de conformidad con una modalidad de la invención. Barra = 25 µ?? para D-F, 15 µ?a para G-O.

La Figura 16 representa la regeneración corneal post-quirúrgica en cerdos que recibieron implantes corneales consistentes en un hidrogel de conformidad con una modalidad de la invención. Barra = 100 µ?? para A-F, 40 µp? para G-I, 200 nm para J-L, 20 µt? para M-O, 30 µt? para P-R.

La Figura 17 representa la integración implante-hospedero post-quirúrgica a las 6 semanas después de la cirugía en cerdos que recibieron los implantes corneales consistentes en un hidrogel de conformidad con una modalidad de la invención. Barra = 100 µ?? en todos los casos .

La Figura 18 representa la sensibilidad corneal al tacto en implantes en cerdos que recibieron implantes corneales consistentes en un hidrogel de conformidad con una modalidad de la invención.

La Figura 19 representa los resultados de las pruebas de compatibilidad de inervación en diferentes matrices de hidrogel .

La Figura 20 representa el crecimiento de células epiteliales y la estratificación en diversos hidrogeles.

(A) vistas de baja amplificación del crecimiento epitelial en los hidrogeles (la intercalación es mayor amplificación) y (B) recuentos de los espesores de las células del crecimiento del epitelio sobre los hidrogeles .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Debe entenderse que esta invención no se limita a los pasos de proceso específicos y los materiales descritos en la presente, sino que abarca los equivalentes de ésta como se darán cuenta los expertos en la técnica pertinente. También debe entenderse que los términos empleados en la presente son para propósitos de describir modalidades específicas solamente y no se pretende que sean limitantes.

DEFINICIONES A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado como lo comprende comúnmente una persona con las habilidades ordinarias en la técnica a la que pertenece esta invención.

El término "hidrogel" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a un material polimérico reticulado que muestra la habilidad para hincharse en agua y soluciones acuosas sin disolverse y retiene una parte significativa de agua o la solución acuosa dentro de su estructura .

El término "polímero" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a una molécula consistente en monómeros individuales unidos entre sí. En el contexto de la presente invención, un polímero puede consistir en monómeros que se unen "extremo a extremo" para formar una molécula lineal, o puede consistir en monómeros que se unen entre sí para formar una estructura ramificada.

El término "monómero" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a una molécula orgánica sencilla que puede formar una cadena larga sola o en combinación con otras moléculas orgánicas semejantes para producir un polímero .

El término "co-polímero" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polímero que consiste en dos o más monómeros diferentes. Los co-polímeros pueden ser regulares, aleatorios, en bloques o injertados. Un co-polímero regular se refiere a un co-polímero en el cual los monómeros se repiten en un diseño regular (por ejemplo, para los monómeros A y B, un co-polímero regular puede tener una secuencia: ABABABAB) . Un co-polímero aleatorio es un co-polímero en el que los diferentes monómeros se ordenan al azar o en forma estadística en cada molécula polimérica individual (por ejemplo para los monómeros A y B, un co-polímero aleatorio puede tener una secuencia: ?????????????) . Por el contrario, un co-polímero en bloques es un co-polímero en el que diferentes monómeros se separan en zonas apartadas dentro de cada molécula de polímero individual (por ejemplo para los monómeros A y B, un co-polímero en bloques puede tener una secuencia: ????????????) . Un co-polímero injertado se refiere a un co-polímero que se prepara por la unión de un polímero o polímeros de un tipo a otra molécula polimérica de una composición diferente .

El término "terpolímero" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a un co-polímero que consiste en tres diferentes monómeros.

El término "bio-polímero" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polímero que puede encontrarse en la naturaleza, los polímeros que pueden encontrarse en la naturaleza incluyen, pero no se limitan a, proteínas y carbohidratos. El término "bio-polímero" también incluye las formas derivadas de los polímeros que se encuentran en la naturaleza que hayan sido modificados para facilitar la reticulación a un polímero sintético de la invención.

El término "polímero sintético", cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polímero que no se encuentra en la naturaleza y que se produce por síntesis química o recombinante .

Los términos "alquilo" y "alquilo inferior" se utilizan de manera indistinta en la presente para referirse a un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado de 1 a 8 átomos de carbono o un grupo cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono. Estos términos además se ejemplifican por grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, 1-butilo (ó 2-metilpropilo) , i-amilo, - n-amilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares .

El término "agente bioactivo" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a una molécula o compuesto que ejerce un efecto fisiológico, terapéutico o diagnóstico in vivo. Los agentes bioactivos pueden ser orgánicos o inorgánicos. Los ejemplos representantes incluyen proteínas, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y fragmentos de estos, compuestos antitumorales y antineoplásicos , compuestos antivirales, compuestos antiinflamatorios, compuestos antibióticos como los compuestos antimicóticos y antibacterianos, medicamentos reductores del colesterol, analgésicos, agentes de contraste para la producción de imágenes diagnósticas médicas, enzimas, citocinas, anestésicos locales, hormonas, agentes anti-angiogénicos , neurotransmisores, oligonucleótidos terapéuticos, partículas virales, vectores, factores de crecimiento, retinoides, factores de la adhesión celular, glucoproteínas de la matriz extracelular (como laminita) , hormonas, factores osteogénicos , anticuerpos y antígenos .

El término "biocompatible" , cuando se utiliza en la presente, se refiere a una habilidad para ser incorporado en un sistema biológico, como puede ser en un órgano o tejido de un animal, sin estimular una respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, fíbrosis u otra respuesta adversa del tejido.

Cuando se utiliza en la presente, el término "aproximado" se refiere a una variación de +/-10% del valor nominal . Debe entenderse que una variación como esta siempre está incluida en cualquier valor determinado que se proporcione en la presente, se mencione o no específicamente. 1. MATRIZ BIOSINTÉTICA La presente invención proporciona una matriz biosintética que consiste en un hidrogel que se forma por reticulación de un polímero sintético y un biopolímero. El biopolímero puede estar en su forma natural o puede ser derivado para facilitar la reticulación al polímero sintético. La matriz es consistente, biocompatible y no tóxica. La matriz puede formarse en solución acuosa a pH neutro y puede diseñarse para contener además uno o más agentes bioactivos como los factores de crecimiento, retinoides, factores de la adhesión celular, enzimas, péptidos, proteínas, nucleótidos, medicamentos y similares. El agente bioactivo puede estar unido en forma covalente al polímero sintético o puede estar encapsulado y dispersado dentro de la matriz final, dependiendo de las demandas para el uso final de la matriz. La matriz también puede contener células en capsuladas o dispersadas en ésta, que sean capaces de proliferación y/o diversíficación tras la depositación de la matriz in vivo.

En una modalidad de la presente invención, la matriz biosintética da soporte al crecimiento celular. El crecimiento celular como este puede ser el recubrimiento de la superficie epitelial y/o endotelial (es decir, crecimiento bidimensional, 2D) y/o crecimiento de células tridimensional (3D) que consiste en el crecimiento dentro de la propia matriz.

En otra modalidad de la invención, la matriz biosintética da soporte al crecimiento interno del nervio. Como se sabe en la técnica, el crecimiento de nervio en tej ido trasplantado se lleva a cabo durante un tiempo prolongado, por lo regular en el orden de meses o años. El crecimiento de los nervios en la matriz puede llevarse a cabo con mayor rapidez que el crecimiento de los nervios en el tejido trasplantado, dando origen así a la regeneración más rápida del tej ido funcional , por ejemplo, el crecimiento interno del nervio puede llevarse a cabo en el transcurso de semanas .

La matriz biosintética puede ser diseñada para aplicaciones específicas. Por ejemplo, la matriz puede utilizarse en aplicaciones de manipulación de tejidos y puede preformarse en una forma específica para este propósito. La matriz también puede utilizarse como un vehículo para el suministro de medicamentos para permitir la liberación prolongada de un compuesto terapéutico o diagnóstico en un lugar específico dentro del cuerpo de un animal .

Con el fin de que sea conveniente para la implantación in vivo para propósitos de manipulación de tejidos, la matriz biosintética debe mantener su forma a las temperaturas fisiológicas, debe ser considerablemente insoluble en agua, deberá ser adecuadamente consistente y dar soporte al crecimiento de las células . También se desea que la matriz soporte el crecimiento de los nervios . 1.1 Polímero sintético De conformidad con la presente invención, el polímero sintético que se incorpora en la matriz biosintética es un co-polímero que consiste en uno o más derivados acrilamida, uno o más co-monómeros hidrofílicos y uno o más co-monómeros de ácido carboxílico derivados que contengan porciones pendientes que puedan ser reticuladas .

Cuando se utiliza en la presente, un derivado de acrilamida" se refiere a una acrilamida o metacrilamida sustituida con N-alquilo ó N, -dialquilo . Los ejemplos de los derivados de acrilamida convenientes para utilizarlos en el polímero sintético de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: N-metilacrilamida, N-etilacrilamida, N-isopropilacrilamida (NiPAAm) , N-octilacrilamida, N-ciclohexilacrilamida, N-metil-N-etilacrilamida, N-metilmetacrilamida, N-etilmetacrilamida, N-isopropilmetacrilamida, N,N-dimetilacrilamida, ?,?-dietilacrilamida, N,N-dimetilmetacrilamida, ?,?-dietilmetacrilamida, N,N-diciclohexilacrilamida, N-metil-N-ciclohexilacrilamida, N-acriloilpirrolidina, N-vinil-2-pirrolidinona, N-metacriloilpirrolidina, y combinaciones de estos.

Un "co-monómero hidrofílico" en el contexto de la presente invención es un monómero hidrofílico que sea capaz de co-polimerización con el derivado de acrilamida y los componentes ácidos carboxílicos derivados del polímero sintético. El co-monómero hidrofílico se elige para proporcionar adecuada solubilidad para la polimerización, solubilidad acuosa del co-polímero y libertad a partir de la transición de fases del co-polímero final y el hidrogel. Los ejemplos de los co-monómeros hidrofílicos convenientes son los compuestos acril- o metacríl-hidrofílicos como pueden ser los ácidos carboxílicos que incluyen el ácido acrilico, el ácido metacrílico y derivados de estos, acrilamida, metacrilamida, derivados de acrilamida hidrofílieos, derivados hidrofilicos de _ metacrilamida, esteres del ácido acrilico hidrofilicos, esteres hidrofilicos del ácido metacrílico, viniletanol y sus derivados y etilen glicoles . Los ácidos carboxílicos y los derivados pueden ser, por ejemplo, ácido carboxílico, ácido metacrílico, metacrilato de 2-hidroxietilo (????.) o una combinación de estos. Los ejemplos de los derivados de acrilamida hidrofilicos incluyen, pero no se limitan a N,N-dimetilacrilamida, N,N-dietilacrilamida, 2- [N,N-dimetilamino] etilacrilamida, 2- [N,N-dietilamino] etilacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, 2- [?,?-dimetilamino] etilmetacrilamida, 2- [N,N-dietilamino] etilmetacrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, o combinaciones de estos. Los ejemplos de los esteres acrílieos hidrofilicos incluyen, pero no se limitan a, 2- [?,?-dietilamino] etilacrilato, 2- [N,N-dimetilamino] etilacrilato, 2- [N,N-dietilamino] etilmetacrilato, 2- [N,N-dimetilamino] etilmetacrilato, o combinaciones de estos.

Cuando se utiliza en la presente, un "co-monómero de ácido carboxílico derivado" se refiere a un ácido acril-o metacrilcarboxílico hidrofílico, por ejemplo ácido acrílico, ácido metacrilico, o una versión sustituida de estos, que haya sido químicamente derivado para contener uno o más porciones reticuladoras , como pueden ser los grupos succinimidilo, imidazoles, benzotriazoles y p-nitrofenoles . El término "grupo succinimidilo" se propone para comprender las variaciones del grupo succinimidilo genérico, como pueden ser los grupos sulfosuccinimidilo . Otras estructuras semejantes como el ácido 2- (rimorfolino) etansulfónico también serán evidentes para los expertos en la técnica. En el contexto de la presente invención, el grupo seleccionado como una porción reticuladora actúa para aumentar la reactividad del grupo ácido carboxílico al cual se une hacia las aminas primarias (es decir, a los grupos -NH2) y tioles (es decir, grupos -SH) . Los ejemplos de los grupos convenientes para la derivación de los co-monómeros de ácido carboxílico para utilizarlos en el polímero sintético incluyen, pero no se limitan a: N-succinimida, ácido N-succinimida-3-sulfónico, -benzotriazol, N-imidazol y p-nitrofenol .

En una modalidad de la presente invención, el polímero sintético consiste en: (a) uno o más derivados de acrilamida de la fórmula general I : en donde : Rx, R2, R3, R4 y R5 se eligen de manera independiente del grupo de: H y alquilo inferior; (b) uno o más co-monómero (s) hidrofílico (s) (que puede ser igual o diferente de (a) ) que tenga la fórmula general II : en donde : Y es O ó está ausente; R6 y R7 se eligen independientemente del grupo de : H y alquilo inferior; R8 es ?,. alquilo inferior ó -0R' , donde R' es H o alquilo inferior; y R9 es H, alquilo inferior ó -C(O)R10, y R10 es -NR4R5 ó -0R" , donde R" es H ó CH2CH2OH; y (c) uno o más ácido (s) carboxílico (s) derivado que tenga la fórmula general III: en donde : R12 Y Ri3 se eligen independientemente del grupo de: H y alquilo inferior; y Q es -succinimido, 3-sulfo-succinimido (sal sódica) , N-benzotriazolilo, N-imidazolilo o p- nitrofenilo .

En una modalidad, el polímero sintético consiste en uno o más derivados de acrilamida de la fórmula general I, uno o más co-monómeros idrofílieos de la fórmula general II y uno o más ácidos carboxílicos derivados de la fórmula general III, como ya se describió, en donde el término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tenga de 1 a 8 átomos de carbono .

En otra modalidad, el polímero sintético consiste en uno o más derivados de acrilamida de la fórmula general I, uno o más co-monómeros hidrofílieos de la fórmula general II y uno o más ácidos carboxílicos derivados de la fórmula general III, como ya se describió, en donde el término "alquilo inferior" se refiere a un grupo cicloalquilo que tenga- de 3 a 8 átomos de carbono, como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

El co-polímero puede ser lineal o ramificado, regular, aleatorio o en bloques. De conformidad con la presente invención, el polímero sintético final consiste en una pluralidad de porciones reactivas pendientes disponibles parar reticulación, o formación de injerto, de las biomoléculas adecuadas .

Un trabajador con los conocimientos ordinarios en la técnica se dará cuenta que el grupo de los compuestos comprendido por el término "derivado de acrilamida" y el grupo de los compuestos comprendidos por el término co-monómero hidrofílico" se superpone considerablemente y que puede elegirse un solo monómero que satisfaga las funciones de estos componentes en el co-polímero. Así pues, por ejemplo, cuando se elige un derivado de acrilamida que sea suficientemente hidrofílico para conferir en el polímero sintético las propiedades deseadas, entonces puede elegirse un componente co-monómero hidrofílico que sea idéntico al derivado de acrilamida seleccionado dando como resultado un co-polímero que contenga dos monómeros diferentes solamente (es decir, el derivado de acrilamida/co-monómero hidrofílico y el co-monómero ácido carboxilico derivado) . Por otra parte, cuando se desea hidrofilicidad aumentada más allá de la que proporciona el derivado de acrilamida seleccionado, entonces puede elegirse uno o más co-monómeros hidrofílicos diferentes dando origen a un co-polímero que contenga al menos tres monómeros diferentes .

En una modalidad de la presente invención, el derivado de acrilamida y el co-monómero hidrofílico que se utiliza en la preparación del polímero sintético son el mismo. En otra modalidad, el derivado de acrilamida y el co-monómero hidrofílico que se utiliza en la preparación del polímero sintético son diferentes .

La hidrofilicidad total del · co-polímero se regula para conferir solubilidad en agua a 0°C hasta las temperaturas fisiológicas sin precipitación o transición de fases. En una modalidad de la presente invención, el co-polímero es soluble en agua entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 37 °C.

El co-polímero debe ser suficientemente soluble en solución acuosa para facilitar la formación del hidrogel . De conformidad con una modalidad de la presente invención, por tanto, el término "soluble en agua" se propone para referirse a una solubilidad acuosa del co-polímero de al menos aproximadamente 0.5% en peso/volumen (p/v) . En otra modalidad, el co-polímero tiene una solubilidad acuosa de entre aproximadamente 1.0% p/v y aproximadamente 505 p/v. En otras modalidades, el co-polímero tiene una solubilidad acuosa de aproximadamente 5% p/v y aproximadamente 45% p/v y entre aproximadamente 10% p/v y aproximadamente 35% p/v.

' Como se sabe en la técnica, la mayor parte de los polímeros sintéticos tienen una - distribución de la masa molecular y algunos promedios diferentes de la masa molecular suelen distinguirse, por ejemplo, la masa molecular promedio numérico ( n) y la masa molecular promedio ponderado (Mw) . El peso molecular de un polímero sintético por lo regular se define en términos de su masa molecular promedio numérico (Mn) , que a su vez se define como la suma de ±Mi dividida entre la suma de n¿, donde ¾ es el número de moléculas en la distribución con masa M¿ . el polímero sintético para utilizarlo en la matriz de la presente invención por lo regular tiene una masa molecular promedio numérico (Mn) entre 2000 y 1,000,000. En una modalidad de la presente . invención, la Mn del polímero es entre aproximadamente 5,000 y aproximadamente 90,000. En otra modalidad de la presente invención, la Mn del polímero es entre aproximadamente 25,000 y aproximadamente 80,000. En otra modalidad, la Mn del polímero es entre aproximadamente 30,000 y aproximadamente 50,000. En otra modalidad, la Mn del polímero es entre aproximadamente 50,000 y aproximadamente 60,000.

También se conoce en la técnica que algunos polímeros solubles en agua muestran una menor temperatura de solución crítica (LCST) ó "temperatura de enturbiamiento" . La LCST de un polímero es la temperatura en la que se observa separación de fases (es decir, el polímero comienza a separarse del medio acuoso que le rodea) . Por lo regular, para aquellos polímeros o hidrogeles que son claros, la LCST también corresponde a la temperatura a la cual comienza a perderse la claridad. Será muy evidente que para algunas aplicaciones de ingeniería de tejidos, la presencia o ausencia de la separación de fases en el hidrogel final puede no ser importante a condición de que el hidrogel todavía soporte el crecimiento celular. Para otras aplicaciones, no obstante, una falta de separación de fases en el hidrogel final puede ser crucial. Por ejemplo, para aplicaciones ópticas, será importante la claridad (y por tanto la ausencia de cualquier transición de fases) .

Así pues, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, los co-polímeros con una LCST entre aproximadamente 35°C y alrededor de 60 °C se eligen para utilizarlos en los hidrogeles. En otra modalidad, para utilizarlos en los hidrogeles se eligen co-polímeros con una LCST entre aproximadamente 42 °C y alrededor de 60 °C. También se sabe en la técnica que la LCST de un polímero puede afectarse por la presencia de algunos solutos, como puede ser iones o proteínas, y por la naturaleza de los compuestos reticulados o unidos al polímero. Estos efectos pueden determinarse en forma empírica utilizando las técnicas conocidas y la selección de un polímero sintético con la LCST adecuada para una aplicación específica se considera dentro de las habilidades ordinarias del trabajador técnico.

Con el fin de que el polímero sintético sea adecuadamente consistente y termoestable, es importante que la relación del (los) derivado (s) de acrilamida al (los) co-monómero (s) hidrofílico (s) se optimice cuando se utilizan diferentes monómeros para estos componentes. Por consiguiente, el (los) derivado (s) de acrilamida estarán presentes en el polímero sintético en la rela.ción molar más alta. Además, el número de co-monómero (s) ácido carboxílico derivado presente (s) en el polímero final determinará la habilidad del gel sintético para formar enlaces cruzados con el biopolímero en la matriz biosintética . La selección de las relaciones molares convenientes de cada componente para proporcionar un polímero sintético final con las propiedades deseadas está dentro de las habilidades ordinarias de un trabajador de esta técnica.

De conformidad con una modalidad de la presente invención, cuando se están utilizando monómeros diferentes como los componentes derivado de acrilamida y co-monómero hidrofílico, la cantidad del derivado de acrilamida en el polímero es entre 50% y 90%, la cantidad del co-monómero hidrofílico es entre 5% y 50%, y la cantidad del co-monómero ácido carboxílico derivado es entre 0.1% y 15%, en donde la suma de las cantidades del derivado de acrilamida, el co-monómero hidrofílico y el co-monómero ácido carboxílico derivado es 100%, en donde el valor del porcentaje representa la relación molar.

De conformidad con otra modalidad de la invención, el polímero sintético se prepara utilizando el mismo monómero como el derivado de acrilamida y el co-monómero hidrofílico, y la relación molar del derivado de acrilamida/co-monómero hidrofílico es entre aproximadamente 50% y aproximadamente 99.5%, y la relación molar del co-monómero ácido carboxílico derivado es entre aproximadamente 0.5% y aproximadamente 50%.

De conformidad con otra modalidad, la relación molar combinada del derivado de acrilamida y el co-monómero hidrofílico es entre aproximadamente 80% y aproximadamente 99%, y la relación molar del co-monómero ácido carboxílico derivado es entre aproximadamente 1% y aproximadamente 20%.

Un experto en la técnica observará que la selección y la relación de los componentes en el polímero sintético dependerá en diversos grados de la aplicación final para la matriz biosintética . Por ejemplo, para aplicaciones oftálmicas es importante que la matriz final sea clara, mientras que para otras aplicaciones de manipulación de tejidos, la claridad de la matriz puede no ser un factor primordial .

En una modalidad de la presente invención, el polímero sintético es un co-polímero aleatorio o en bloques que consiste en un derivado de acrilamida, un co-monómero hidrofílico y un co-monómero ácido carboxílico derivado (un "terpolímero") . En otra modalidad, el polímero sintético es un terpolímero que consiste en un raonómero NiPAAm, monómero ácido acrílico (AAc) y un monómero de ácido acrílico derivado . En otra modalidad, el polímero sintético es un terpolímero que consiste en el monómero NiPAAm, el monómero acrilamida (AAm) y el monómero ácido acrílico derivado. En otra modalidad, el monómero ácido acrílico derivado es ¦ N-acriloxisuccinimida. En otra modalidad, se prepara un terpolímero con una relación de alimentación que comprende el monómero NiPAAm, el monómero AAc y N-acriloxisuccinimida en una relación de aproximadamente 85:10:5% molar.

En una modalidad alternativa de la invención, el polímero sintético es un co-polímero aleatorio o en bloques que consiste en un derivado de acrilamida/co-monómero hidrofílico y un co-monómero ácido carboxílico. En otra modalidad, el polímero sintético consiste en el monómero DMAA y un monómero ácido acrílico derivado . En otra modalidad, el monómero ácido acrílico derivado es N-acriloxisuccinimida . En otra modalidad se prepara un polímero sintético con una relación de alimentación que consiste en el monómero DMAA y N-acriloxisuccinimida en una relación de aproximadamente 95:5% molar. 2.2 Biopolímero Los biopolímeros son polímeros que se encuentran en la naturaleza, como las proteínas y los carbohidratos. De acuerdo con la presente invención, la matriz biosintética consiste en un biopolímero o una versión derivada de éste reticulada al polímero sintético por medio de porciones reticuladoras pendientes en este último. Así pues, para los propósitos de la presente invención, el biopolímero contiene uno o más grupos que pueden reaccionar con la porción reticuladora (por ejemplo una amina primaria o un tiol) , o pueden derivarse para contener un grupo como éste. Los ejemplos de los biopolímeros convenientes para utilizarlos en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, colágenos (incluidos los tipos I, II, III, IV y V) , colágenos desnaturalizados (o gelatinas) , colágenos recombinantes , fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteínas , alginato, quitosana, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina y glucosaminoglucanos (o proteoglucanos) . Un experto en la técnica se dará cuenta que algunos de estos biopolímeros pueden necesitar ser derivados para contener un grupo reactivo conveniente como ya se indicó, por ejemplo, es necesario que los glucosaminoglucanos sean desacilados o desulfatados para poseer un grupo amino primario. Una derivación como esta puede obtenerse por las técnicas normales y se considera dentro de las habilidades ordinarias de un trabajador de la técnica.

Los biopolímeros convenientes para utilizarlos en la invención pueden adquirirse de diversas fuente comerciales o pueden prepararse de fuentes naturales por las técnicas bien conocidas . 1.3 Agentes bioactivos Como ya se mencionó, el polímero sintético que ha de ser incluido en la matriz biosintética de la presente invención contiene una pluralidad de porciones reticuladoras pendientes. Será evidente que se puede lograr suficiente reticulación del sintético [sic] y biopolímeros para lograr una matriz considerablemente consistente sin la reacción de todos los grupos reticuladores libres. Por tanto, como una opción, es posible utilizar los grupos en exceso para unir en forma covalente los agentes bioactivos deseados a la matriz. Los ejemplos no limitantes de los agentes bioactivos que pueden incorporarse en la matriz por reticulación incluyen, por ejemplo, los factores de crecimiento, retinoides, enzimas, factores de la adhesión celular, glucoproteínas de la matriz extracelular (como laminina, fibronectina, tenascina y similares), hormonas, factores osteogénicos , citocinas, anticuerpos, antigenos y otras proteínas con actividad biológica, algunos compuestos farmacéuticos, así como péptidos, fragmentos o motivos obtenidos de proteínas biológicamente activas.

En una modalidad de la presente invención, los grupos reticuladores son grupos succinimidilo y los agentes bioactivos convenientes para formar el injerto al polímero son aquellos que contienen grupos amino primario o tiol, o que pueden ser derivados fácilmente para contener estos grupos. 2. MÉTODO PARA PREPARAR LA MATRIZ BIOSINTETICA 2.1 Preparación del polímero sintético La copolimerización de los componentes para el polímero sintético puede lograrse utilizando los métodos normales conocidos en la técnica [por ejemplo, véase A. Rawe "Principies of Polymer Chemistry" , Capitulo 3. Plenum Press, New York 1995]. Las cantidades normalmente adecuadas de cada uno de los monómeros se dispersan en un disolvente conveniente en presencia de un iniciador. La mezcla se mantiene a una temperatura adecuada y se deja proceder la reacción de copolimerización durante un tiempo predeterminado. El polímero resultante entonces puede purificarse de la mezcla por los métodos habituales, por ejemplo por precipitación.

El disolvente para la reacción de copolimerización puede ser un disolvente no acuoso sin uno o más monómeros es sensible a la hidrólisis o puede ser un disolvente acuoso. Los disolventes acuosos convenientes incluyen, pero no se limitan a agua, soluciones amortiguadoras y salinas. Los disolventes no acuosos convenientes por lo regular son éteres cíclicos (como dioxano) , hidrocarburos clorados (como cloroformo) ó hidrocarburos aromáticos (como benceno) . El disolvente puede ser purgado con nitrógeno antes de su uso, si se desea. En una modalidad de la presente invención, el disolvente es un disolvente no acuoso. En otra modalidad, el disolvente es dioxano.

Los iniciadores de la polimerización convenientes son conocidos en la técnica y por lo regular son iniciadores radicales libres. Los ejemplos de los iniciadores convenientes incluyen, pero no se limitan a 2 , 2' -azobisisobutironitrilo (AIBN) , otros compuestos azo como 2 , 2 ' -azobis-2-etilpropionitrilo; 2 , 2 ' -azobis-2-ciclopropilpropionitrilo, 2 , 2 ' -azobisciclohexanonitrilo; 2 , 2 ' -azobisciclooctanonitrilo, y compuestos peróxido, como peróxido de dibenzoilo y sus análogos sustituidos, y persulfatos como de sodio, potasio y similares.

Una vez que se ha preparado el polímero, y se ha purificado si es necesario, puede caracterizarse por diferentes técnicas normales. Por ejemplo, la relación molar de la composición del polímero puede determinarse por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (de protón y/o carbono 13) y la estructura de las uniones puede determinarse por espectroscopia de infrarrojo. La masa molecular puede determinarse por cromatografía de permeación en gel y/o cromatografía líquida de alta resolución. La caracterización térmica del polímero también puede llevarse a cabo, si se desea, por ejemplo por la determinación del punto de fusión y las temperaturas de. transición vitrea utilizando análisis calorimétrico de barrido diferencial. Las propiedades de la solución acuosa como la formación de micelas y gel, y la LCST pueden determinarse utilizando la observación visual, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de UV-visible e instrumentos de dispersión de luz láser.

En una modalidad de la presente invención, el polímero sintético se prepara dispersando los monómeros en dioxano purgado con nitrógeno en presencia del iniciador AIBN y dejando que la polimerización proceda a una temperatura de alrededor de 60°C hasta 70 °C. El polímero resultante se purifica por precipitación repetida . 2.2 Preparación del hidrogel La reticulación del polímero sintético y el biopolímero puede lograrse fácilmente mezclando cantidades adecuadas de cada polímero a temperatura ambiente en un disolvente conveniente. El disolvente común es un disolvente acuoso, como puede ser una solución salina, solución amortiguadora, medio de cultivo de células o una versión diluida o modificada de estos .

Un experto en la técnica observará que para preservar la estructura de la triple hélice de los polímeros como el colágeno y evitar la fibrilogénesis y/o opacificación del hidrogel, la reacción de reticulación debe realizarse en medios acuosos con un control estrecho del pH y la temperatura. Las concentraciones importantes de aminoácidos en medios nutrientes por lo regular utilizados para cultivos celulares pueden provocar reacciones colaterales con las porciones reticuladoras del polímero sintético, lo cual puede dar origen a diversificación de estos grupos a partir de la reacción de reticulación. El uso de un medio libre de aminoácidos y otros materiales proteináceos puede ayudar a evitar estas reacciones colaterales y, por tanto, aumentar el número de enlaces cruzados que se forman entre los polímeros sintéticos y biopolímeros . La ejecución de la reacción de reticulación en solución acuosa a temperaturas ambiente o fisiológicas permite que se lleve a cabo la reticulación y la hidrólisis mucho más lenta de cualquier grupo reticulador residual .

De otro modo, es posible incluir un paso de terminación para hacer reaccionar cualquier grupo reticulador residual en la matriz. Por ejemplo, uno o más pasos de lavado en una solución amortiguadora conveniente que contenga lisina terminará cualquiera de los grupos reticuladores residuales así como eliminará cualquiera de los productos colaterales generados durante la reacción de reticulación. Los grupos reticuladores sin reaccionar también pueden terminarse con una amina polifuncional como lisina o trietilentetraamina dando origen a la formación de otros enlaces cruzados cortos, entre cadenas. Los pasos de lavado utilizando solución amortiguadora solamente también pueden llevarse a cabo si se desea para eliminar cualquiera de los productos colaterales de la reacción de reticulación. Si es necesario, después del paso de reticulación es posible aumentar la temperatura de la suspensión del polímero reticulado para permitir que se forme el hidrogel por completo .

De conformidad con la presente invención, los componentes del hidrogel se reticulan químicamente para que sean considerablemente no extractables , es decir, el biopolímero y el polímero sintético no exudan extensamente del gel en las condiciones fisiológicas . De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la cantidad del biopolímero o polímero sintético que puede ser extraída de la matriz hacia el medio acuoso en las condiciones fisiológicas durante un periodo de 24 horas es menor que 5% en peso de cualquier componente. En otra modalidad, la cantidad de biopolimero o polímero sintético que puede ser extraída de la matriz hacia el medio acuoso en las condiciones fisiológicas durante un tiempo de 24 horas es menor que 2% en peso de cualquier componente. En otras modalidades, la cantidad que puede ser extraída durante un periodo de 24 horas es menor que 1% en peso, menor que 0.5% en peso y menor que 0.2% en peso .

La cantidad del biopolimero y/o polímero sintético que puede ser extraída de la matriz hacia el medio acuoso puede determinarse in vitro utilizando las técnicas normalizadas (por ejemplo, el método de la Canasta de la ÜSP) . Por lo regular la matriz se coloca en una solución acuosa de un pH predeterminado, por ejemplo aproximadamente pH 7.4 para simular las condiciones fisiológicas. La suspensión puede o no estar en agitación. Las muestras de la solución acuosa se retiran en intervalos de tiempo predeterminados y se ensayan en cuanto al contenido del polímero por las técnicas analíticas normalizadas .

Un experto en la técnica comprenderá que la cantidad de cada polímero que ha de ser incluida en el hidrogel dependerá de la elección de los polímeros y la aplicación sugerida para el hidrogel. En general, el uso de mayores cantidades iniciales de cada polímero dará origen a la formación de un gel más consistente debido al menor contenido de agua, y la presencia de una cantidad más grande de polímero reticulado. Mayores cantidades de agua o disolvente acuoso producirán un hidrogel blando, De conformidad con la presente invención, el hidrogel final contiene -entre aproximadamente 20 y 99.6% en peso de agua o disolvente acuoso, entre aproximadamente 0.1 y 30% en peso del polímero sintético y entre aproximadamente 0.3 y 50% en peso del biopolímero.

En una modalidad de la presente invención, el hidrogel final contiene entre aproximadamente 40 y 99.6% en peso de agua o disolvente acuoso, entre aproximadamente 0.1 y 30% en peso de polímero sintético y entre aproximadamente 0.3 y 30% en peso del biopolímero. En otra modalidad, el hidrogel final contiene entre aproximadamente 60 y 99.6% en peso de agua o disolvente acuoso, entre aproximadamente 0.1 y 10% en peso del polímero sintético y entre aproximadamente 0.3 y 30% en peso del biopolímero. En otra modalidad, el hidrogel final contiene entre aproximadamente 80 y 98.5% en peso de agua o disolvente acuoso, entre aproximadamente 0.5 y 5% en peso del polímero sintético y entre aproximadamente 1 y 15% en peso del biopolímero. En otras modalidades, el hidrogel final contiene entre aproximadamente 95 a 97% en peso de agua o disolvente acuoso y entre aproximadamente 1-2% en peso del polímero sintético y alrededor de 2-3% en peso del biopolímero; y alrededor de 94 a 98% en peso de agua o disolvente acuoso y entre alrededor de 1-3% en peso del polímero sintético y aproximadamente 1-3% en peso del biopolímero.

Del mismo modo, las cantidades relativas de cada polímero que ha de ser incluido en el hidrogel dependerán del tipo de polímero sintético y. biopolímero que se utilice y de la aplicación propuesta para el hidrogel . Un experto en la técnica se dará cuenta que las cantidades relativas del biopolímero y el polímero sintético tendrán influencia en las propiedades finales del gel en diferentes formas, por ejemplo, cantidades altas del biopolímero producirán un hidrogel muy rígido. Un experto en la técnica se dará cuenta que las cantidades relativas de cada polímero en la matriz final pueden describirse en términos de la relación peso: peso del biopolímero: polímero sintético o en términos de equivalentes de los grupos reactivos . De acuerdo con la presente invención, la relación peso por peso del biopolímero: polímero sintético es entre aproximadamente 1:0.07 y aproximadamente 1 : 1 . En una modalidad, la relación p/p del biopolímero: polímero sintético es entre 1:1.3 y 1:7. En otra modalidad, la relación p/p del biopolímero: polímero sintético es entre 1:1 y 1:3. En otra modalidad, la relación p/p del biopolímero: polímero sintético es entre 1:0.7 y 1:2.

En otra modalidad de la presente invención, la matriz contiene un biopolímero proteináceo y un polímero sintético que contiene grupos N-acriloxisuccinimida pendientes. En esta modalidad de la invención, la relación del biopolímero: polímero sintético se describe en términos de equivalentes molares de los grupos amino libres en el biopolímero a los grupos N-acriloxisuccinimida y es entre 1:0.5 y 1:20. En otra modalidad, esta relación es entre 1:1.8 y 1:10. En otras modalidades, la relación es entre 1:1 y 1:5, y entre 1:1 y 1:3. 2.3 Incorporación de agentes bioactivos en la matriz biosintética Es posible incorporar agentes bioactivos en la matriz si se desea por unión covalente (o por "injertación") al polímero sintético a través de porciones reticuladoras pendientes o por encapsulación dentro de la matriz. Los ejemplos de los agentes bioactivos que pueden unirse en forma covalente al componente polímero sintético de la matriz se proporcionan en lo anterior. Si es necesario, el agente bioactivo puede derivarse primero por los procedimientos normalizados para obtener grupos reactivos adecuados para la reacción con los grupos reticuladores . Para la unión covalente de un agente bioactivo, el polímero sintético primero reacciona con el agente bioactivo y luego este polímero sintético modificado posteriormente se retícula al biopolímero como ya se describió. La reacción del agente bioactivo con el polímero sintético puede llevarse a cabo en las condiciones normales, por ejemplo mezclando el agente bioactivo y el polímero sintético juntos en un disolvente no acuoso, como N, -dimetilformamida, dioxano, dimetilsulfóxido y ?,?-dimetilacrilamida . El uso de un disolvente no acuoso evita la hidrólisis de los grupos reactivos durante la incorporación del agente bioactivo. De otro modo, la reacción puede llevarse a cabo en un disolvente acuoso como ya se describió para la reacción de reticulación.

Los agentes bioactivos que no son convenientes para la formación del injerto al polímero, por ejemplo, aquellos que no contienen grupos amino primario o tiol libres para la reacción con los grupos reticuladores en el polímero sintético, o que no pueden ser derivados para obtener estos grupos, pueden ser atrapados en la matriz final. Los ejemplos de los agentes bioactivos que pueden ser atrapados en la matriz incluyen, pero no se limitan a, medicamentos farmacéuticos, agentes de diagnóstico, vectores virales, ácidos nucleicos y similares. Para atraparlo, el agente bioactivo se adiciona a una solución del polímero sintético en un disolvente adecuado antes de mezclar el polímero sintético y el biopolímero para formar el hidrogel reticulado. De otro modo, el agente bioactivo puede ser adicionado a una solución que contenga el polímero sintético y el biopolímero antes del paso de reticulación. El agente bioactivo se mezcla en la solución del polímero de modo que se disperse en una forma considerablemente uniforme en ésta, y posteriormente se forma el hidrogel como se describe en lo anterior. Los disolventes adecuados para utilizarlos con el agente bioactivo dependerán de las propiedades del agente y puede determinarlo fácilmente un experto en la técnica . 2.4 Captura, o aprisionamiento de células en la matriz biosintética La matriz biosintética de conformidad con la presente invención también puede contener células atrapadas en ésta y de este modo permitir el suministro de las células a un tejido u órgano in vivo. Una gama de diferentes tipos de células puede ser suministrada utilizando la matriz biosintética, por ejemplo, miocitos, células oculares (por ejemplo de las diferentes capas de la córnea), adipocitos, fibromioblastos , células ectodérmicas , células musculares, osteoblastos (es decir, células óseas) , condrocitos (es decir, células de cartílago) , células endoteliales, fibroblastos, células pancreáticas, hepatocitos, células de las vías biliares, células de la médula ósea, células neurales, células genitourinarias (incluidas las células nefríticas) , o combinaciones de estas . También puede utilizarse la matriz para suministrar células primordiales totipotentes , células progenitoras fluripotentes o comprometidas o células reprogramadas (dediferenciadas) en un sitio in vivo, de modo que puedan producirse células del mismo tipo que las del tejido. Por ejemplo, en la matriz pueden suministrarse células primordiales mesenquimales, las cuales son no diferenciadas. Los ejemplos de las células primordiales mesenquimales incluyen aquellas que pueden diversificarse para producir osteoblastos (para generar nuevo tejido óseo), condrocitos (para generar nuevo tejido cartilaginoso) , y fibroblastos (para producir nuevo tejido conectivo). De otro modo, pueden utilizarse células progenitoras comprometidas capaces de proliferar para proporcionar células del mismo tipo que las presentes en el sitio ín vivo, por ejemplo mioblastos, osteoblastos, fibroblastos y similares .

Las células pueden quedar fácilmente atrapadas en la matriz final por la adición de las células a una solución del polímero sintético antes de mezclarlo con el biopolímero para formar el hidrogel reticulado. De otro modo, es posible adicionar las células a una solución que contenga el polímero sintético y el biopolímero antes del paso de reticulación. El polímero sintético puede reaccionar con un agente bioactivo antes de mezclarlo con la célula si se desea. Por lo regular, para la encapsulación de las células en la matriz, los diferentes componentes (células, polímero sintético y biopolímero) se dispersan en un medio acuoso, como puede ser un medio de cultivo de célula o una versión diluida o modificada de éste. La suspensión celular se mezcla suavemente en la solución del polímero hasta que las células se dispersen de manera considerablemente uniforme en la solución, entonces se forma el hidrogel como ya se describió. 2.5 Otros elementos La presente .invención también contempla la inclusión optativa de uno o más materiales de refuerzo en la matriz biosintética para mejorar las propiedades mecánicas de la matriz como la resistencia, resiliencia, flexibilidad y/o resistencia al rasgado. Así pues, la matriz puede ser reforzada con fibras flexibles o rígidas, malla de fibras, paño de fibras y similares. El uso de materiales de refuerzo como estos es conocido en la técnica, por ejemplo, el uso de fibras, paños u hojas hechas de fibrillas de colágeno, celulosa oxidada o polímeros como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico ó politetrafluoroetileno en aplicaciones médicas que puedan ser implantadas .

El material de refuerzo puede ser incorporado en la matriz utilizando los protocolos normalizados. Por ejemplo, una solución acuosa del polímero sintético y el biopolímero en una solución amortiguadora adecuada puede adicionarse a un paño o malla de fibras, como puede ser Interceed (Ethicon Inc., New Brunswick, N. J.) . La solución acuosa fluirá hacia los intersticios del paño o malla antes de ser sometida a reticulación y de este modo formará un hidrogel con el paño o la malla incrustada en éste. Pueden utilizarse moldes adecuados para garantizar que las fibras o la malla de fibras estén contenidas por completo dentro del hidrogel si se desea. La estructura compuesta posteriormente puede lavarse para eliminar cualquiera de los productos colaterales generados durante la reacción de reticulación. Por lo regular, las fibras utilizadas son de naturaleza hidrofílica para garantizar la humectación completa de la solución acuosa de los polímeros . ün experto en la técnica se dará cuenta que, para aplicaciones que requieren claridad óptica elevada, la estructura del refuerzo debe seleccionarse para evitar dispersión de luz de la matriz compuesta final, por ejemplo mediante el uso de nanofibras y/o la coincidencia cuidadosa del índice de refracción del refuerzo y el hidrogel . 3. VALORACIÓN DE LA MATRIZ BIOSINTETICA De conformidad con la presente invención, la matriz biosintética consiste en un hidrogel con o sin agentes bioactivos adicionados y/o células encapsuladas . Con el fin de que sea conveniente para implantes in vivo para propósitos de ingeniería de tejidos, la matriz biosintética debe mantener su forma a las temperaturas fisiológicas, debe ser .adecuadamente consistente, debe ser considerablemente insoluble en agua y dar soporte al crecimiento de las células . También puede ser deseable que la matriz soporte el crecimiento de nervios . Debe ser evidente que para algunas aplicaciones especializadas, la matriz puede requerir de otras características. Por ejemplo, para propósitos quirúrgicos, la matriz puede necesitar ser relativamente flexible asi como bastante fuerte para soportar la manipulación quirúrgica con la aguja e hilo de la sutura, y para aplicaciones oftálmicas, como la reparación o sustitución de la córnea, será importante la claridad óptica de la matriz. 3.2 Valoración física/química Cuando se utiliza para aplicaciones de ingeniería de tejidos, la matriz biosintética debe cumplir los parámetros mecánicos necesarios para prevenir que la matriz se rasgue o rompa cuando se someta a procedimientos quirúrgicos y proporcionar el soporte adecuado para el crecimiento celular una vez colocada. La habilidad de la matriz para resistir el rasgado se relaciona con su resistencia mecánica propia, la forma y espesor de la matriz y la tensión que se le aplique.

La habilidad de la matriz biosintética para soportar las fuerzas cortantes, o el rasgado, pueden determinarse aproximadamente aplicando fuerzas en direcciones contrarias al ejemplar utilizando dos pares de pinzas. De otro modo, puede utilizarse un aparato conveniente para medir cuantitativamente la habilidad de la matriz para soportar las fuerzas cortantes . Para este propósito se dispone en el comercio de tensiómetros , por ejemplo de MTS, Instron y Colé Parmer.

Para la valoración, es posible formar la matriz en lioj as y luego cortarla en tiras de tamaños adecuados . De otro modo, es posible moldear la matriz en la forma deseada para propósitos de ingeniería de tejidos y puede probarse la matriz moldeada completa. Para calcular la resistencia a la tracción, la fuerza a la ruptura, o "falla" , de la matriz se divide entre el área del corte transversal de la muestra a prueba, dando como resultado un valor que puede expresarse en fuerza (N) por área unitaria. La rigidez (módulo) de la matriz se calcula a partir de la pendiente de la porción lineal de la curva esfuerzo/deformación. La deformación es el cambio de longitud en tiempo real durante la prueba dividido entre la longitud inicial de la muestra a prueba antes de comenzar la prueba. La resistencia al rompimiento es la longitud final de la muestra a prueba cuando esta se rompe menos la longitud de la muestra a prueba inicial, dividida entre su longitud inicial.

Un experto en la técnica podrá observar que debido a la suavidad de los hidrogeles y la exudación del componente acuoso cuando se sujeta con pinzas, puede ser dificil obtener de los hidrogeles datos significativos de la resistencia a la tracción. La determinación cuantitativa de la resistencia a la tracción en los hidrogeles puede obtenerse, por ejemplo, mediante el uso de mediciones cuando se quita una sutura en muestras de la matriz moldeada. Por lo regular, una sutura se coloca aproximadamente 2 mm a partir del borde de una muestra a prueba y se mide la fuerza máxima que es necesario aplicar para rasgar la sutura a través de la muestra. Por ejemplo, para una muestra a prueba de matriz destinada para aplicaciones oftálmicas que haya sido moldeada en la forma y espesor de una córnea humana, es posible insertar dos suturas diametralmente opuestas en la matriz, como seria necesario para el primer paso en la implantación ocular. Las dos suturas entonces pueden ser separadas a aproximadamente 10 mm/min en un instrumento conveniente, como puede ser el Instron Tensile Tester. La resistencia al rompimiento de la matriz se calcula, junto con la elongación al rompimiento y el módulo elástico [véase, por ejemplo, Zeng y col., J. Biomech. , 34: 533-537 (2001)] . Los expertos en la técnica observarán que, para aquellas matrices biosintéticas destinadas para aplicaciones quirúrgicas, no es necesario que las matrices sean tan fuertes (es decir, que tengan la misma habilidad para resistir el rasgado) como el tejido mamífero. E factor determinante para la resistencia de la matriz en estas aplicaciones es si un cirujano cuidadoso y experimentado puede o no suturarla en el lugar.

Si se desea, la LCST de la matriz de hidrogel biosintética puede medirse utilizando las técnicas normalizadas. Por ejemplo, la LCST puede calcularse calentando las muestras de la matriz a aproximadamente 0.2°C por minuto y observando visualmente el punto de enturbiamiento (véase, por ejemplo, H. Uludag, y col., J. Appl. Polym. Sci . 75: 583-592 (2000)).

La permeabilidad de la matriz biosintética puede determinarse valorando el coeficiente de permeabilidad de la glucosa y/o los tamaños promedio de los poros para la matriz utilizando las técnicas normalizadas, como puede ser la valoración de la permeabilidad PBS utilizando una celda de permeabilidad y/o microscopía de fuerzas atómicas . De conformidad con una modalidad de la presente invención, la matriz biosintética tiene un tamaño de poro promedio de entre aproximadamente 90 nm y aproximadamente 500 nm. En otra modalidad, la matriz tiene un tamaño de poro promedio entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 300 nm.

También es posible medir la transmisión óptica y dispersión de luz para matrices destinadas para aplicaciones oftálmicas utilizando un instrumento construido sobre especificaciones que mida la transmisión y dispersión [véase, por ejemplo, Priest y Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci . 39: S352 (1998)] . 3.2 Valoración in vitro Será evidente que la matriz biosintética debe ser no citotóxica y debe ser biocompatible para que sea conveniente para utilizarla i vivo. La citotoxicidad de la matriz biosintética puede valorarse " utilizando las técnicas normalizadas como el ensayo de Ames para detectar actividad mutagénica, el ensayo de linfoma de ratón para detectar la habilidad de la matriz para inducir mutación génica en una linea de células de mamífero, los ensayos de aberración cromosomal in vitro utilizando, por ejemplo, las células de ovario de hámster chino (CHO) para detectar cualquiera de los rearreglos del DNA o el daño inducido por la matriz . Otros ensayos incluyen el ensayo de las cromátidas hermanas, que determina cualquier cambio entre los brazos de un cromosoma inducido por la matriz y los ensayos de los micronúcleos de ratón in v tro para determinar cualquier daño a los cromosomas o al uso mitótico. Los protocolos para estos y otros ensayos normalizados son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase OECD Guídelines for the Testing of Chemicals y los protocolos desarrollados por el ISO.

También es posible valorar in vitro la habilidad de la matriz para soportar el crecimiento celular utilizando las técnicas normalizadas. Por ejemplo, las lineas procedentes de una linea de células adecuadas , como pueden ser las lineas epiteliales humanas, pueden ser sembradas directamente sobre la matriz o sobre un material adecuado que rodee la matriz . Después del crecimiento en presencia de un medio de cultivo conveniente durante un lapso de tiempo adecuado, es posible realizar la microscopía confocal y exámenes histológicos de la matriz para determinar si las células han crecido sobre la superficie de y/o dentro de la matriz .

La habilidad de la matriz para soportar crecimiento interior de las células nerviosas también puede valorarse in vitro. Por ejemplo, una fuente de nervio, como puede ser los ganglios de la raíz dorsal, pueden incrustarse en un material adecuado que rodee la matriz o insertarse directamente en la matriz, ün ejemplo de un material conveniente sería un gel a base de colágeno suave. Las células procedentes de una línea de células adecuadas entonces puede sembrarse directamente sobre la matriz o sobre un material adecuado que rodee la matriz, y la matriz puede ser incubada en presencia de un medio de cultivo conveniente durante un lapso de tiempo predeterminado. El examen de la matriz, directamente y/o en presencia de un marcador específico del nervio, por ejemplo por inmunofluorescencia utilizando un marcador fluorescente específico del nervio y microscopía confocal, para el crecimiento del nervio indicará la habilidad de la matriz para soportar crecimiento interno neural .

Para valorar la habilidad de la matriz para soportar el crecimiento celular es posible adicionar al medio de cultivo, a la matriz o ambos suplementos del crecimiento durante experimentos . Los suplementos del crecimiento específicos que se empleen dependerán del tipo de células que se valoren y pueden determinarlos fácilmente los expertos en la técnica. Los suplementos convenientes para células nerviosas, por ejemplo, incluyen laminina, acetato de retinilo, ácido retinóico y factores de crecimiento del nervio para células nerviosas . 3.3 Valoración in vivo Para valorar la biocompatibilidad de la matriz biosintética y su habilidad para soportar el crecimiento de células in vivo, es posible implantar la matriz en un modelo animal adecuado para inmunogenicidad, inflamación, estudios de liberación y degradación, así como la determinación del crecimiento de las células . En la valoración pueden incluirse los animales testigo convenientes. Los ejemplos de los testigos convenientes incluyen, por ejemplo, animales no operados, animales que hayan recibido aloinjertos de dimensiones semejantes procedentes de un animal donante y/o animales que hayan recibido implantes de dimensiones semejantes de un material normalizado, aceptado para implantes.

En las diferentes etapas posteriores a la implantación pueden tomarse biopsias para valorar el crecimiento celular sobre la superficie de y/o en el implante, y es posible utilizar exámenes histológicos y técnicas inmunohistoquímicas para determinar si ha ocurrido crecimiento interno del nervio y si están presentes células inflamatorias o inmunitarias en el lugar del implante. Por ejemplo, es posible utilizar las diferentes cepas [sic] especificas de las células conocidas en la técnica para valorar los tipos de células presentes, asi como los diferentes anticuerpos específicos de las células, como pueden ser los anticuerpos anti-neurofilamentos que pueden utilizarse para indicar la presencia o ausencia de células del nervio. Además, la medición dé los potenciales de acción del nervio utilizando las técnicas normalizadas proporcionará una indicación si los nervios son o no f ncionales . El examen microscópico confoncal in vivo puede utilizarse para verificar el crecimiento de las células y el nervio en el animal en tiempos post-operativos elegidos. Cuando sea adecuado, es posible medir la sensibilidad al tacto por las técnicas conocidas, por ejemplo, utilizando estesiómetro . El restablecimiento de la sensibilidad al tacto indica la regeneración de los nervios funcionales . 4. APLICACIONES La presente invención proporciona una matriz biosintética que es consistente, biocompatible y no citotóxica y, por tanto, conveniente para utilizarla como un andamio para permitir la regeneración de tejidos in vivo. Por ejemplo, es posible utilizar la matriz biosintética para implantación en un paciente para sustituir tejido que haya sido dañado o retirado, para cubrir heridas, como tejido sellante o adhesivo, como un sustituto de la piel o sustituto de la córnea, o como un veneer corneal . La matriz puede ser moldeada en una configuración adecuada antes de la implantación, por ejemplo puede ser preformada para llenar el espacio dejado por tejido dañado o retirado. De otro modo, cuando se utiliza como implante, es posible dejar que la matriz se forme in situ inyectando los componentes en el tejido dañado y permitiendo que los polímeros se reticulen y gelifiquen a la temperatura fisiológica.

En una modalidad de la presente invención, la matriz se preforma en una configuración adecuada para propósitos de ingeniería de tejidos. En otra modalidad, la matriz se preforma como una córnea artificial de espesor completo o como una matriz de espesor parcial conveniente como un veneer para la córnea.

La matriz biosintética puede utilizarse sola, y como tal soportará el crecimiento interno de células nuevas in situ. De otro modo, es posible sembrar la matriz con células antes de la implantación y soportará el crecimiento superficial de estas células in vivo para reparar y/o sustituir el tejido circundante. Se contempla que las células pueden obtenerse del paciente, o pueden ser de origen alogénico o xenogénico. Por ejemplo, es posible cosechar las células de un paciente (antes o durante la cirugía para reparar el tejido) y procesarlas en condiciones estériles para obtener un tipo específico de células como pueden ser las células pluripotentes , células primordiales o células precursoras . Estas células entonces pueden sembrarse en la matriz, como ya se describió, y posteriormente la matriz puede implantarse en el paciente.

También es posible utilizar la matriz para recubrir implantes quirúrgicos para ayudar a sellar tej idos o para ayudar a adherir los implantes a las superficies titulares, por ejemplo por la formación de enlaces cruzados entre grupos reticuladores sin reaccionar sobre el componente polímero sintético del' hidrogel y los gruos ámino primario o tiol presentes en el tejido. Por ejemplo, puede utilizarse una capa de la matriz para parchar perforaciones en las córneas, o puede aplicarse a catéteres o implantes de mama para reducir fibrosis . La matriz también puede aplicarse a injertos vasculares ó stents para llevar al mínimo las pérdidas de sangre o fluido seroso, para parches o mallas artificiales para llevar al mínimo la fibrosis y contribuir con la adhesión de los implantes a las superficies del tejido.

También es posible utilizar la matriz como un sistema de suministro para suministrar un agente bioactivo a una zona específica en un paciente. El agente bioactivo puede ser suministrado como una solución junto con el polímero sintético y el biopolímero de modo que la matriz que contiene el agente bioactivo pueda formarse in situ, o la matriz que contiene el agente bioactivo pueda preformarse y ser implantada. Una vez dentro del cuerpo, el agente bioactivo puede liberarse de la matriz, por ejemplo, por procesos de difusión controlada o, si el agente bioactivo está · unido en forma covalente a la matriz, por disociación enzimática a partir de la matriz y la liberación posterior por procesos de difusión controlada. De otro modo, el agente bioactivo puede ejercer sus efectos desde dentro de la matriz.

En una modalidad de la presente invención, la matriz biosintética se utiliza como una córnea artificial. Para esta aplicación, la matriz se preforma como una córnea artificial de grosor completo o como una matriz de espesor parcial conveniente para un veneer de córnea. De acuerdo con esta modalidad, el hidrogel se diseña para que tenga una elevada transmisión óptica y baja dispersión de luz. Por ejemplo, los hidrogeles que contienen un terpolímero sintético p (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) o copolímero p (DMAA-co-ASI) reticulado al colágeno tienen elevada transmisión óptica, muy baja dispersión de luz y son capaces de permanecer claros hasta 55 °C. 5. KITS La presente invención también contempla los kits o equipos que contienen la matriz biosintética . Los kits pueden consistir en una forma "lista para usarse" de la matriz o pueden contener los componentes individuales necesarios para preparar la matriz en proporciones adecuadas (es decir, el polímero sintético y el biopolímero) . Como una opción, el kit además puede contener uno o más agentes bioactivos preunidos al polímero sintético, o como componentes individuales que pueden ser unidos al polímero sintético durante la preparación de la matriz. Además de los kits pueden contener las instrucciones para su uso, uno o más disolventes convenientes, uno o más instrumentos para ayudar con la inyección o colocación de la composición final de la matriz dentro del cuerpo de un animal (como una eringa, pipeta, pinzas fórceps, gotero o vehículo de suministro aprobado para uso médico similar) , o una combinación de estos . Los componentes individuales del kit pueden ser empacados en recipientes separados . El kit además puede contener un aviso en la forma indicada por la institución gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos biológicos, cuyo aviso manifieste la aprobación de la institución para la fabricación, uso o venta para aplicaciones en humanos o animales .

Para obtener una mejor comprensión de la invención en la presente descrita se establecen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para propósitos ilustrativos. Por tanto, no deben limitar el alcance de esta invención en ningún sentido.

EJEMPLOS Abreviaturas RTT: Tendón cola de rata dd¾0: Agua destilada, deionizada PBS: Salina amortiguada con fosfato D-PBS: Salina amortiguada con fosfato Dulbecco AIBN: Azobis - isobut ironitrilo NiPAAm: N-isopropilacrilamida pNiPAAm: Poli (N-isopropilacrilamida) AAC: Ácido acrílico DMAA N, N-dimetilacrilamida ASI : N-acriloxisuccinimida pNIPAAm-co-AAc : Copolímero de NiPAAm y AAc poli (NiPAAm-co-AAc-co-ASI : Terpolímero de NIPAAM, AAc y ASI poli (DMAA-co-ASI) Copolimero de DMAA y ASI GPC: Cromatografía de permeacion en gel NMR Resonancia magnética nuclear YIGSR: Pentapéptido terminado en amida (tirosina-isoleucina-glicina-serina- arginina) Todas las matrices de gel descritas en los Ej emplos que se mencionan en adelante utilizaron colágeno I estéril , como puede ser telocolágeno ( tendón de cola de rata, RTT) 6 atelocolágeno (bovino o porcino) , los cuales pueden prepararse en el laboratorio o más convenientemente están disponibles en el comercio (por ej emplo de Becton Dickinson en una concentración de 3 . 0-3 . 5 mg/mL en ácido acético 0 . 02N y en ácido clorhídrico 0 . 012N para colágeno bovino y porcino . Estos colágenos pueden almacenarse durante varios meses a 4 ° C . Además , las soluciones de estos colágenos pueden estar cuidadosamente condentradas para obtener soluciones muy viscosas, con claridad óptica de 3-30% p/v de colágeno, convenientes para preparar matrices más consistentes.

Las soluciones de colágeno se ajustan a las condiciones fisiológicas, es decir, la concentración iónica salina y el pH 7.2-7.4, mediante el uso de hidróxido de sodio acuoso en presencia de salina amortiguada con fosfato (PBS) . El PBS, libre de aminoácidos y otros nutrientes, se utilizó para evitar la depleción de la reactividad reticuladora por reacciones colaterales con las moléculas que contienen -NH2, permitiendo así el uso de la concentración mínima de grupos reticuladores y llevando al mínimo cualquier riesgo de toxicidad celular.

El polvo del homopolímero pNiPAAm está a la disposición en el comercio (por ejemplo de Polyscience) . Los demás polímeros fueron sintetizados como se menciona a continuación.

EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE UN HIDROGEL pNiPAAm-COLÁGENO Se preparó un hidrogel de pNiPAAm-colágeno para obtener un hidrogel alternativo contra el cual se pudieran comparar las propiedades de los hidrogeles de la presente invención.

Una solución al 1% p/v del homopolímero pNiPA&m en ddH20 se esterilizó en autoclave. Esta solución se mezcló con solución de colágeno RTT estéril [3.0-3.5 mg/mL (p/v) en ácido acético (0.02N) en agua] (1:1 vol/vol) en un tubo de ensayo estéril a 4°C bombeando con jeringa para obtener el mezclado completo sin formación de burbujas. El mezclado en frío evita gelificación prematura o fibrilogénesis del colágeno. El pNiPAAm-colágeno luego se vertió sobre una placa de plástico (caja de cultivo no tratada) o un molde (por ej emplo un molde de lente de contacto) y se dejó secar al aire en condiciones estériles en una campana de flujo laminar durante al menos 2-3 días a temperatura ambiente. Después del secado a peso constante (~7% de residuo de agua) , se separó la matriz formada del molde. La separación de la matriz del molde se facilitó enjuagando el molde con PBS estéril a temperatura ambiente. El remojo continuo de la mezcla libre en esta solución da un gel a la temperatura fisiológica, pH y concentración iónica, que posteriormente fue sometido a la valoración para el crecimiento celular y valoración en animales in vivo (véase los Ejemplos 6 y 7) .

EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DE UN TERPOLÍMERO SINTÉTICO Un terpolímero reactivo con colágeno, poli (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) (Figura 1) , se sintetizó copolimerizando los tres monómeros : N-isopropilacrilamida, (NiPAAm, 0.85 moles), ácido acrílico (AAc, 0.10 mol) y N-acriloxisuccinimida (ASI, 0.05 mol). La relación molar de la alimentación fue 85:10:5 (NiPAAm:AAc : SI) , el iniciador por radicales libres AIBN (0.007 mol/mol) de los monómeros totales) y el disolvente, dioxano (100 mL) , se purgó con nitrógeno antes de adicionar el AIBN. La reacción continuó durante 24 horas a 65 °C.

Después de la purificación por precipitación repetida para eliminar las trazas del homopolímero, se encontró que la composición del terpolímero sintetizado (rendimiento de 82%) fue 84.2:9.8:6.0 (relación molar) por NMR protónica en THF-D8. La Mn y Mw del terpolímero fue 5.6 X 104 Da y 9.0 x 104 Da, respectivamente, por GPC acuosa .

Una solución de 2 mg/mL del terpolímero en D-PBS permaneció clara incluso hasta 55 °C, consistente con su elevada LCST. Una solución de 10 mg/mL en D-BPS solo se enturbió levemente a 43 °C. La falla para separar el homopolímero formado en la reacción de polimerización en lotes (debido a que el coeficiente de reactividad del NiPAAm es mayor que el del AAc o el ASI) a partir del terpolímero proporcionó soluciones acuosas e hidrogeles que se enturbian a ~32°C y superior.

EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE UN POLÍMERO SINTÉTICO QUE CONTIENE UN AGENTE BIOACTIVO Se sintetizó un terpolímero que contenía el pentapéptido YIGSR (un motivo de unión de las células del nervio) mezclando el terpolímero preparado en el Ejemplo 2 (1.0 g) con 2.8 ig del pentapéptido laminina (YIGSR, de Novabiochem) en N, -dimetilformamida . Después de' la reacción durante 48 h a temperatura ambiente (21 °C) , el producto polimérico se precipitó del dietil éter y luego se secó en vacío. Los grupos ASI que permanecían después de la reacción con el pentapéptido estaban disponibles para la reacción posterior con colágeno. La estructura de este polímero se muestra en la Figura 8A.

EJEMPLO 4: PREPARACIÓN DE HIDROGEL COLÁGENO-TERPOLÍMERO Un hidrogel de terpolímero-colágeno reticulado se preparó mezclando 4% de atelocolágeno bovino neutralizado (1.2 mL) con el terpolímero preparado en el Ejemplo 2 [0.34 mL (100 mg/mL en D-PBS)] mezclando con jeringa a 4°C (colágeno: terpolímero 1.4: 1 p/p) .

Después del bombeo cuidadoso con jeringa para producir una solución homogénea sin burbujas, las alícuotas fueron inyectadas en moldes de plástico lentes de contacto y se incubaron a temperatura ambiente (21 °C) durante 24 horas para permitir la reacción de los grupos colágeno -NH2 con los grupos ASI así como la hidrólisis más lenta de los grupos ASI residuales a los grupos AAc. Las muestras moldeadas luego se incubaron a 37 °C durante 24 horas en un ambiente de 100% humedad para obtener un hidrogel final. El hidrogel contenía 95.4 ± 0.1% de agua, 2.3% de colágeno y 1.6% de terpolímero. Las matrices fueron moldeadas para tener un espesor final entre 150-200 µ?? ó 500-600 µp?. Cada matriz de hidrogel resultante se separó de su molde en solución de PBS y posteriormente se sumergió en PBS con un contenido de 1% de cloroformo y 0.5% de glicina. Este paso de lavado eliminó N-hidroxisuccinimida producida en la reacción de reticulación, terminó cualquiera de los grupos ASI sin reaccionar en la matriz por conversión de los grupos ácido acrílico y se esterilizó la matriz de hidrogel. Como una alternativa, es posible tratar los geles moldeados con glicina acuosa para garantizar que se terminen todos los ASI antes del contacto con las células .

Los residuos de succinimida que quedaron en los geles preparados a partid de colágeno y terpolimero estuvieron por debajo del limite de detección con IR después del lavado.

EJEMPLO 5: PREPARACIÓN DE UN HIDROGEL CON UN CONTENIDO DE AGENTE BIOACTIVO Los hidrogeles reticulados de colágeno-terpolimero que contenían el factor de adhesión celular YIGSR se prepararon mezclando perfectamente colágeno bovino al 4%, neutralizado, viscoso (1.2 mL) con el terpolimero al cual se unió en forma covalente el pentapéptido laminina (YIGSR) (del Ejemplo 3; 0.34 mL, 100 mg/mL) a 4°C, siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4.

El contenido de YIGSR de los geles extensamente lavados fue 4.3 x 10"11 moles/mL (2.6 x 10"8 g/mL) del gel hidratado se cuantificó etiquetando los grupos tirosina (portadores de amino primario) con 125I utilizando el método de yodógeno y midiendo la radiactividad con un contador gama normalizado (Beckman, Gamma 5500) . La concentración final del polímero total en cada hidrogel equilibrado en PBS, hidratado fue 3.4% p/v (conteniendo colágeno y terpolimero YIGSR a 2.0 y 1.4% p/v, respectivamente) .

EJEMPLO 6: COMPARACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS MATRICES DE HIDROGEL Los termogeles de colágeno tienen poca consistencia y se aplastan y rompen fácilmente y desde luego se opacan (véase la Figura 8C) . Los termogeles de colágeno se prepararon neutralizando el colágeno y colando en los mismos moldes como se describe en lo anterior en los Ejemplos 4 y 5. Luego el colágeno moldeado se incubó, primero durante 24 horas a 21°C, después a 37°C, para formar espontáneamente termogeles translúcidos (producidos por autoasociacion de las triples hélices de colágeno en microfibrillas) .

El coeficiente de permeabilidad de la glucosa en PBS (pH 7.4) a través de los hidrogeles preparados como se describe en el Ejemplo 5 se calculó a partir de las mediciones en una celda de permeacion separando periódicamente alícuotas del permeado, adicionando trifosfato de adenosina y convirtiendo la glucosa en glucosa-6-fosfato con la enzima hexocinasa. Esta última reaccionó con el dinucleótido dicotinamida adenina en presencia de deshidrogenada y el dinucleótido reducido resultante se cuantificó por su absorción de la luz UV a 340 nm en solución (Bondar, R. J. & Mead, D. C. (1974) Clin Chem 20, 586-90) . Las topografías de las superficies del hidrogel, completamente sumergidas en solución PBS, fueron examinadas por microscopía de fuerza atómica (Molecuular Image Co . , EUA) en el modo de "contacto". A partir de esta técnica se compararon los tamaños de los poros con los diámetros promedio de los poros calculados a partir de la permeabilidad del PBS de los hidrogeles como ya se describió (Bellamkonda, R., Ranieri, J. P. & Aebischer, P. (1995) J Neurosci Res 41, 501-9) . Los hidrogeles tuvieron índices de refracción (1.343 + 0.003) comparables con la película de la lágrima (1.336-1.357) en el ojo humano (Patel, Si, arshall, J. & Fitzke, F. W. 3rd (1995) J Refract Surg 11, 100-5). Estos mostraron elevada claridad óptica en comparación con marices que contienen solo colágeno (Figura 8B y C) . Los hidrogeles tuvieron diámetro de poro de 140-190 nm (a partir de la microscopía de fuerza atómica y permeabilidad en PBS) y un coeficiente de permeabilidad por difusión de glucosa de 2.7 x 10~s cm2/s, que es mayor que el valor del est *roma natural (-0.7 x 10- 6 cm2/s, calculado a partir de los coeficientes de difusión (2.4 x 10 cm2/s) y de solubilidad (0.3) publicados (McCarey, B. E. & Schmidt, F. H. (1990) Curr Eye Res 9, 1025-39)).

Las siguientes propiedades de los hidrogeles preparados como está descrito en los Ejemplos 4 y 5 indican que estos están reticulados : • insoluble en agua • bastante fuerte para soportar el manejo quirúrgico con hilo y aguja para sutura, y la unión a un anillo corneal humano • relativamente flexible durante el manejo • demuestra un aumento en el esfuerzo a la falla y módulo aparente durante la prueba de tracción por sobre x2 continuo a partir de una relación equivalente ASI/-NH2 de 0.5 a 1.5.

Las matrices preparadas como ya se describió, pero con diferentes relaciones de los grupos amino del colágeno a los grupos ASI en el polímero sintético tuvieron transmisión óptica elevada y baja dispersión en la región visible (Figura 8B, 12 y 13) . Por el contrario, el termogel de colágeno, preparado a partir de colágeno como ya se describió, tuvo baja transmisión y elevada dispersión, consistente con su apariencia opaca (Figura 8C, 12) . Matrices de termogel como estas con hasta 3 p/v de colágeno fueron demasiado débiles para permitir el montaje para las pruebas de extracción de la sutura.

La determinación cuantitativa de los hidrogeles surge del uso de las mediciones de extracción de la sutura en muestras moldeadas en la configuración y espesor de una córnea humana. Esta consistió en la inserción de dos suturas diametralmente opuestas, como se necesita para el primer paso en la implantación ocular, y la separación - de estas dos suturas a 10 mm/min en un aparato Instron Tensile Tester, un procedimiento bien establecido para la evaluación de los componentes de las válvulas cardiacas . Las suturas empleadas fueron suturas de nailon 10-0. La resistencia al rompimiento del gel se calcula, junto con la elongación al rompimiento y el módulo elástico. El módulo y el esfuerzo a la falla de las mediciones de extracción de la sutura mostraron que se alcanzaron valores máximos a las proporciones específicas de los grupos amino del colágeno a los grupos ASI (Figura 11) .

Los hidrogeles preparados como está descrito en los Ejemplos 4 y 5 tienen elevada transmisión óptica y muy baja dispersión de luz, en comparación con la córnea humana, según se mide con un instrumento construido sobre especificaciones que mide la transmisión y dispersión [Priest y Munger, Invest. Ophthalmol . ' Vis . Sci . 39: S352-S361 (1998] . La dispersón inversa y la transmisión de luz a través de la región visible para los hidrogeles preparados como en el Ejemplo 4 mostraron excelente desempeño excepto a elevadas concentraciones del terpolímero (elevadas proporciones de la amina del colágeno al ASI del terpolímero, Figura 12) . Del mismo modo, un termogel (libre del polímero sintético reticulador) tuvo una muy baja transmisión y elevada dispersión inversa (Figura 12) . Los hidrogeles descritos en el Ejemplo 5 también mostraron excelente desempeño en este análisis como se observa en la Figura 12 (la relación 1:1 de colágeno a terpolímero-pentapéptido se representa por los cuadros oscuros) .

Por el contrario, los geles de colágeno-homopolímero pNiPAAm (como está descrito en el Ejemplo 1; 1.0:0.7 a 1.0:2.0 p/p) fueron opacos a 37°C. Además, el colágeno y el pNiPAAm fueron extraídos de este hidrogel en PBS (aproximadamente 50% en peso de pérdida en 48 h) .

EJEMPLO 7: VALORACIÓN IN VIVO DE DIFERENTES MATRICES BIOSINTÉTICAS Los hidrogeles formados como está descrito en los Ejemplos 1, 4 y 5 fueron moldeados para formar córneas artificiales e implantados en los ojos de cerdos (Figura 2) .

Como los implantes corneales in vivo, los geles del Ejemplo 1 exudan residuos blancos después de 5 a 6 d.ías de implantados en ojos de cerdos.

El hidrogel preparado a partir de 4% de colágeno y pentapéptido-terpolímero como está descrito en el Ejemplo 5 demostró buena biocompatibilidad al igual que el hidrogel colágeno-terpolimero preparado como está descrito en el Ejemplo 4. Se observó sobrecrecimiento más rápido de las células epiteliales completas y formación de múltiples capas cuando se utilizó el primer hidrogel, en comparación con el hidrogel de colágeno-terpolimero que mostró crecimiento de células epiteliales más lento, menos adyacentes, sin formación de múltiples capas.

Las imágenes del microscopio confocal, in vivo, del hidrogel de espesor completo preparado a partir de colágeno y el pentapéptido-terpolímero (del Ejemplo 5; concentración final: colágeno 2.3% en peso; terpolimero + pentapéptido 1.6% en peso) e implantado en ojos de cerdos mostró que las células del epitelio crecieron sobre esta matriz y se estratificaron. La membrana basal estaba regenerada y estuvieron presentes semidesmosomas, indicando un epitelio anclado de manera estable. Se encontraron células estromales dispersadas dentro de la A matriz después de solo tres semanas. Los implantes se volvieron sensibles al tacto en el transcurso de tres semanas de la implantación (Cochet-Bonnet Aesthesiometer) indicando crecimiento interno del nervio funcional (Figuras 4 y 14) . El crecimiento interno del nervio también se observó directamente por microscopía confocal e histología. No se observó ningún signo clínico de inflamación o reacción inmunitaria adversa durante un lapso de 8 semanas después de la implantación. Véase las Figuras 2, 3 y 5-7.

Con mayor detalle : La Figura 5 muestra la valoración morfológica y bioquímica de una sección a través de la córnea del cerdo a las tres semanas después de la implantación: (A) tinción picro-sirius para colágeno y (B) tinción H&E para células. La Figura 7 muestra: (A) una sección a través de la córnea del cerdo a las tres semanas después de la implantación, teñida con rojo picro-sirius, la cual demuestra la interfaz estromal-implante (cabeza de flecha) . La superficie del implante ha sido recuperada por un epitelio estratificado. (B) una sección semejante a las 8 semanas después de la implantación. Las células estromales se han movido hacia el implante y el implante parece haber sido sustituido por tejido subepitelial (flechas) . (C) una mayor amplificación del epitelio (teñido con H&E) mostró la membrana basal regenerada (flecha) . (D) una sección correspondiente teñida con anticuerpo anti-colágeno tipo VII que reconoce semidesmosomas unidos a la membrana basal (flecha) . (E) los semidesmosomas (flechas) unidos a las membranas básales subyacentes se visualizan claramente por microscopía electrónica de transmisión (TEM) . (F) una elevación plana de la córnea de cerdo mostrando los nervios (cabezas de flechas) dentro del implante, teñido con un anticuerpo anti-neurofilamento .

La Figura 3 muestra las imágenes del microscopio confocal del monte completo de las córneas de cerdos a las 6 semanas después de la operación mostrando un epitelio corneal regenerado y la membrana basal sobre la superficie del implante. Se muestran los · modelos de crecimiento del nervio ín vitro dentro del compuesto colágeno-terpolímero y dentro del estroma hospedero subycacente, como también las células estromales en crecimiento interno.

El restablecimiento de la sensibilidad al tacto fue rápido (<14 días después de la operación) en comparación con el restablecimiento mínimo en el aloinjerto trasplantado durante el mismo lapso de tiempo para otros seis animales que recibieron aloinjertos de córneas de cerdos donantes de dimensiones semejantes (Figura 14) .

EJEMPLO 8: DEPOSITACIÓN DE LAS MATRICES DE COLÁGENO- TERPOLIMERO EN CEREBRO DE ROEDOR Después de la eutanasia, el cerebro completo de cada ra.tón o rata utilizada se escindió y colocó dentro de un bastidor estereotáxico. Dos microlitros (2 mL) [sic] o tres microlitos (3 mL) [sic] de hidrogel con un contenido de colágeno, terpolímero-pentapéptido a 0.33% de colágeno- 0.23% de terpolimero ó 0.63% de colágeno- 0.44% de terpolimero se inyectó durante un lapso de 6 a 10 minutos, respectivamente, en cada cerebro de ratón individual, en las siguientes coordenadas: 0.3 mm desde el bregma, 3.0 mm de profundidad y 2.0 mm desde la línea media. Para ratas, se inyectaron 4 a 6 microlitros de hidrogel durante 10 min, en cada cerebro, a 0.7-0.8 mm desde el bregma, 6 mm de profundidad y 4 mm a partir de la línea central. Las muestras de hidrogel fueron mezcladas con colorante azul de Coomassie para la visualización .

Los resultados indican el suministro directo, preciso, de una pequeña cantidad de hidrogel en el estrato del cerebro, en estas muestras (Figuras 9 y 10) . Esto sugiere que es posible utilizar el hidrogel como un sistema de suministro para células o medicamentos hacia lugares específicos en volúmenes muy pequeños .

EJEMPLO 9: VALORACIÓN IN VIVO DE UN HIDROGEL QUE CONTIENE UN AGENTE BIOACTIVO Los hidrogeles estériles preparados como está descrito en el Ejemplo 5 se enjuagaron perfectamente en PBS antes de la implantación. Siguiendo los lineamientos de la Association for Research in Vision and Ophthalmology para uso en animales, cada matriz corneal de tejido manipulado (TM) (5.5 mm de diámetro y 200 ± 50 µ??? de espesor) se implantó en la córnea derecha de un micro-cerdo Yucatán (Charles River Wiga, Sulzbach, Alemania) (véase la Figura 15A-C) . Las córneas no operadas contralaterales sirvieron como testigos. Bajo anestesia general se hizo una incisión circular de diámetro de 5.0 mm en parte del espesor utilizando una trefina Barraquer (Geuder, Heidlberg, Alemania) . Se retiró el tejido corneal hospedero y se sustituyó con un implante 0.50 mm más grande de diámetro para permitir la aposición adecuada de la herida entre el injerto y el tejido hospedero. Después de la cirugía se suturó la membrana amniótica sobre toda la superficie corneal durante una semana para mantener los implantes en el lugar. En las muestras suturadas, los implantes fueron suturados en el tejido hospedero utilizando 8 suturas de nailon 10-0 interrumpidas. La medicación post -operatoria consistió en dexametasona (qid) y gentamicina (qid) durante 21 días, n = 3 cerdos con suturas y 3 sin suturas.

Se realizaron los seguimientos diarios en cada cerdo hasta 7 días después de la operación y luego cada semana. Los exámenes incluyeron examen con lámpara de rendija para garantizar que las córneas fueron óptimamente claras, tinción con fluoresceína' de sodio para valorar la integridad epitelial y la función de barrera (Josephson, J. E. & Caffery, B. E. (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci 29, 1096-9), mediciones de la presión introcular para garantizar que las córneas no estuvieran bloqueando el flujo del humor acuoso, y exámenes microscópicos confocales in vivo (Confiscan 3, Nidek, Erlangen, Alemania) para valorar el crecimiento interno de las células y el nervio. Se midió la sensibilidad corneal al tacto utilizando un estesiómetro Cochet-Bonnet (Handaya Co., Tokio, Japón) en cinco puntos dentro del área del implante de cada córnea (cuatro periféricos, uno central) como ya se describió (Millodot, M. (1984) Ophthalmic Physiol Opt 4, 305-18) . Del mismo modo fueron evaluados los animales que recibieron aloinjertos de córneas donantes de cerdos .

Para los exámenes inmunohistoquímicos e histopatológicos , los tejidos y construcciones fueron fijadas en PFA al 4% en PBS 0.1M. Para la inmunolocalización del nervio, se permeabilizaron montes planos con un coctel detergente (Brugge, J. S. & Ericsson, R. L. (1977) Nature 269, 346-8) (NaCl 150 mM, ácido etilendiamino tetraacético 1 mM, Tris 50 mM, 1% de Nonidet P-40, 0.5% de desoxicolato de sodio, 0.1% de dodecil sulfato de sodio) , se bloquearon para tinción no específica con 4% de suero bovino fetal el PBS y se incubaron- en anticuerpo anti-neurofilamento 200 (Sigma, Oakville, Canadá) . Estos luego fueron incubados con FITC ó anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 (Sigma; Amersham, Baie D'Urfé, Canadá, respectivamente) y se llevó a cabo la visualización por microscopía confocal.

Para la histología y otra inmunohistoquimica, las muestras fueron procesadas, injertadas en parafina y seccionadas. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) para exámenes histopatológicos (Jumblatt, M. M. & Neufeld, A. H. (1983) I vest Ophthal ol Vis Sci 24, 1139-43). Se realizó la inmunofluorescencia como se describe antes en los cortes desparafinizados para la expresión de colágeno tipo VII (Sigma, Munich, Alemania) , un marcador de semidesmosomas (Gipson, I. K. , Spurr-Michaud, S. J. & Tisdale, A. S. (1988) Dev Biol 126, 253-62) . La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo utilizando peroxidadas-diaminobencidina (DAB) y se llevó a cabo la visualización con lo siguiente: con anticuerpo AE1/AE3 (Chemicon, Temecula, CA, EUA) para marcadores epiteliales, anticuerpo anti-vimentina (Roche, Laval, Canadá) para fibroblastos estromales, anticuerpo anti-actina del músculo liso, 1A4 (Cell Marque, Austin, TX) para fibroblastos estromales activados (miofibroblastos) y anticuerpo SP1-D8 (DHSB, Iowa, EUA) para la síntesis de procolágeno 1 (para localizar sitios de la síntesis de colágeno de novo) . La tinción CD15 y CD45 para células inmunitarias (Becton-Dickinson, Oakville, Canadá) se realizó utilizando el kit de ARK peroxidasa (DAKO, Mississauga, Canadá) para preconjugar los anticuerpos primarios a sus anticuerpos secundarios respectivos y peroxidasa para la visualización. Para los anticuerpos anti-vimentina, anti-actina del músculo liso y SP8-D1, la recuperación del antígeno se realizó por pretratamiento con Proteinase-K (2 mg/mL) durante 30 min a 37°C antes de la incubación del anticuerpo primario. Se utilizó tinción con ülex eurpaeus ag-gultinin (UEA) lectina para visualizar la depositación de mucina de la película de lágrima (Shatos, M. A., Rios, J. D., Tepavcevic, V., Kano, H., Hodges, . & Darte, D. A. (2001) invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1455-64) . Las muestras fueron incubadas con UEA biotinilada (Sigma) , luego se hicieron reaccionar con avidina-horseradish peroxidasa y se visualizaron con DAB. Para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) , todas las muestras fueron tratadas en la resina para fijación, tinción y encapsulado habitual (Karnosvsky' s , 0s04, acetato de uranilo, epoxi) .

Ninguna reacción inflamatoria o inmune adversa se observó por exámenes clínicos después de la implantación de las matrices biosintéticas o las córneas de cerdo. El crecimiento interno de las células epiteliales sobre el implante fue completo a los 4 días después de la operación. Durante una semana el epitelio regenerado mostró exclusión del colorante fluoresceína sódica, indicando que el epitelio estaba intacto y tenía propiedades de barrera reestablecidas . Las presiones intraoculares fueron entre 10 y 14 mm de mercurio (Hg) antes de la operación, y 10-16 mmHg después de la operación a lo largo del tiempo del estudio de hasta 6 semanas, mostrando que los implantes no bloquearon el flujo del humor acuoso dentro del ojo. Los implantes conservaron la claridad óptica (biomicroscopia de lámpara de ranura) y se observó reestratificación epitelial en todos los animales a las tres semanas después de la cirugía. La microscopía confocal clínica in vivo de las matrices estromales implantadas a las tres semanas después de la cirugía mostró un epitelio regenerado (Figura 15D) , nervios recién crecidos (Figura 15G) y células estromales (Figura 15J) y endoteliales (Figura 15M) con morfología celular muy parecida a la de los testigos no operados (Figura 15F, I, L, O) . La morfología de las células epiteliales y endoteliales en los aloinjertos (Figura 15E, N) fue semejante a la de los controles. No se observaron nervios subepiteliales y estromales en los aloinjertos a las tres semanas después de la cirugía (Figura 15H, K) .

Con mayor detalle, la Figura 15 muestra: (A-C) procedimiento de gueratoplastia lamelar (L P) en un micro-cerdo Yucatán. (A) : se utilizó una trefina para cortar una incisión circular de profundidad predefinida (25? µt?) en la córnea. Las capas corneales existentes se separaron y (B) se sustituyeron con un implante de matriz biosintética (flecha, de 250 µp? de espesor) , la cual se suturó en el lugar (C) . Las suturas se indican por las cabezas de las flechas .

(D-0) microscopía confocal in vivo de la matriz biosintética implantada. (D) : imagen confocal mostrando el epitelio corneal regenerado sobre- la superficie del implante. El testigo aloinjertado correspondiente (E) contiene epitelio donante, mientras que el testigo no operado (F) tiene un epitelio intacto. (G) : los nervios regenerados (cabezas de las flechas) están presentes en la interfaz entre el implante y el epitelio regenerado superpuesto. Estos corresponden a los nervios subepiteliales en el testigo no operado (I) . No obstante, en el aloinjerto (H) están ausentes los nervios subepiteliales. (J-L) : las células estromales y haces de nervios en ramificación (cabeza de flecha) más profundos dentro del estroma subyacente de las córneas con implante (J) , el aloinjerto ( ) y en una zona correspondiente en el testigo (L) . (M-O) : el epitelio en las corneas con implante (M) , aloinjerto (N) y los testigos no operados (0) están intactos y muestran morfología semejante.

Los cortes histológicos a través de las córneas con implantes mostraron una interfaz del implante-tej ido hospedero distinta pero uniforme (Figura 16A) que se asemeja a la de las córneas testigo que recibieron aloinjertos (Figura 16B) . En ambas córneas con implantes o aloinjertos, el epitelio regenerado estaba estratificado. Los exámenes detallados mostraron un epitelio completamente diferenciado que se tiñó positivamente por marcadores de anticuerpos AE1/AE3 (Figura 16D, E) recubriendo una membrana basal regenerada que fue positiva para colágeno tipo VII, un marcado para semidesmosornas en la interfaz membrana basal-epitelio (Figura 16G, H) . Las observaciones con TE indicaron morfología consistente con la presencia de semidesmosomas (Figura 16J, K) . En los implantes, los nervios en crecimiento positivos para los neurofilamentos habían comenzado a restablecer una red subepitelial y mostraron extensión hacia las células epiteliales (Figura 16M) . No obstante, no se localizaron nervios subepiteliales en las córneas aloinj ertadas (Figura 16N) . La película de lágrima fue restablecida en las córneas con implantes (Figura 1SP) como en el aloinj erto (Figura 16Q) .

Con mayor detalle, la Figura 16 muestra: regeneración corneal post- uirúrgica .

(A-F) se muestran cortes teñidos con H&E. Las células estromales están presentes en el implante (A) y el testigo aloinj ertado (B) y ambas parecen estar integradas de manera uniforme en el hospedero. (Los símbolos son como sigue: e, epitelio; i, implante; g. aloinj erto; s, estroma) . (C) : testigo no operado. El epitelio regenerado del implante (D) y el epitelio donador del testigo aloinj ertado (E) expresaron marcadores de diferenciación de la citoqueratina, semejantes al testigo no operado (F) .

(G-I) : inmunolocalización de colágeno tipo VII, un marcador para semidesmosomas , en la interfaz epitelio-implante (flechas) en el implante (G) , aloinj erto (H) y testigo (I) .

(J-L) : TEM de la interfaz epitelio-implante . Las placas de semidesmosomas (cabezas de flechas) y fibrillas de anclaje (flechas) se han formado dentro de la matriz biosintética entre las células epiteliales y el implante subyacente (J) , simulando las estructuras que normalmente se encuentran en la interfaz epitelial-estromal como se demuestra en el aloinj erto (K) y el testigo (L) .

Monte plano de la córnea mostrando fibras nerviosas (flechas) dentro del implante (M) , y testigo no operado (0) pero ausente en el aloinj erto (N) , teñido con un anticuerpo anti-neurofilamento . La unión de UEA (cabezas de flecha) a la superficie epitelial sobre el implante (P) y el aloinjerto (Q) indican el restablecimiento de la película lagrimal en todos los casos. Testigo no operado (R) .

Los resultados inmunohistoquímicos indican que las células dentro del implante y el aloinj erto estuvieron sintetizando procolágeno I. No obstante, se observó más síntesis de procolágeno en los aloinj ertos como lo indica la tinción más intensa en los aloinjertos en comparación con los implantes (Figura 17G, H) . Tanto los aloinjertos como los implantes tuvieron células estromales que fueron positivas para vicentina (Figura 17A, B) , indicando un fenotipo fibroblástico . Asimismo, ambos mostraron tinción uniforme de la actina muscular y por tanto la presencia de fibroblastos estromales activados, aunque los implantes mostraron menos células positivas que los aloinj ertos (Figura 17D, E) .

Con mayor detalle, la Figura 17 muestra: la integración implante-hospedero a las 6 semanas posteriores a la cirugía.

(A-C) : tinción para procolágeno tipo I. Se observa tinción positiva en la matriz de la matriz biosintética implantada (A) y el testigo aloinjertado (B) indicando sitios de depositación de nuevo colágeno. El testigo no operado (C) no tuvo síntesis de nuevo colágeno.

(D-F) : la tinción para vicentina a través del estroma identifica los fibroblastos estromales . La tinción a lo largo de la matriz biosintética implantada (D) demuestra invasión celular. Las células también pueden ser observadas dentro del aloinjerto implantado (E) y a lo largo del testigo no operado (F) .

(G-I) : la tinción de actina del músculo liso indica miofibroblastos activados y el potencial de cicatrización. En el implante de la matriz biosintética (G) , la tinción ocasionalmente está presente en la matriz biosintética, pero no se encuentra en el estroma hospedero, ni en la zona de transición entre hospedero e implante . La tinción positiva en la córnea implantada con el aloinjerto (H) se identifica en el aloinjerto, y en la zona de transición, pero no en el estroma hospedero intacto. (I) :. testigo no operado .

La sensibilidad corneal al tacto medida en 5 puntos sobre el implante corneal en 3 cerdos antes y después de la operación utilizando un estesiómetro Cochet-Bonnet mostró una caída drástica en la sensibilidad al tacto después de la cirugía. No obstante, se observó recuperación entre 7 y 14 días y a los 21 días después de la operación, la sensibilidad había regresado a los niveles previos a la operación (Figura 18; todos los grupos, n = 3. *P < 0.01 por medidas repetidas ANOVA con comparaciones Tukey de 2 sentidos) . La sensibilidad al tacto regresó a la misma velocidad y al mismo nivel en todos los puntos periféricos y central probados en el implante . En los animales testigo que habían recibido aloinjertos corneales donantes, sin embargo, las córneas conservaron la estética durante el lapso de .6 semanas (Figura 18) .

Los implantes recuperados después de 6 semanas in vivo fueron examinados por espectroscopia de infrarrojo (Midac m, FTIR spectrometer, condensador de haces ZnSe y celda de diamante) e indicaron claramente la presencia del terpolímero.

EJEMPLO 10: PREPARACIÓN DE UN COPOLÍMERO SINTÉTICO Se sintetizó un co-polímero poli (DMAA-co-ASI) mediante la copolimerización de los monómeros : N,N-dimetilacrilamida (DMAA) y N-acriloxisuccinimida (ASI) .

La relación molar de alimentación fue 95:5 (DMAA:ASI) . El iniciador por radicales libres AIBN y el disolvente, dioxano, fueron purgados con nitrógeno antes del uso y la reacción de polimerización procedió a 70 °C durante 24 h.

Después de la purificación por precipitación repetida para eliminar trazas de homopolímero, la composición del copolímero sintetizado (rendimiento 70%) se encontró en 94.8; 5.2 (relación molar) por NMR protónica. Se determinó la masa molecular (Mn) en 4.3 x 104, por GPC acuosa. La polidispersidad (PD; Mw/Mn) = 1.70 también se determinó por GPC.

EJEMPLO 11: PREPARACIÓN DE UN HIDROGEL COLÁGENO-COPOLÍMERO Se preparó un hidrogel colágeno- co-polímero reticulado mezclando 5% de colágeno bovino neutralizado (1.0 mL) con el co-polímero sintético preparado en el Ejemplo 9 [0.2 mL (200 mg/mL en D-PBS) ] mezclando con jeringa. Después del bombeo cuidadoso con jeringa para producir una solución homogénea sin burbujas, las alícuotas fueron inyectadas en moldes de lentes de contacto de plástico y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas para permitir la reacción de los grupos NH2 del colágeno con los grupos ASI en el copolímero así como hacer más lenta la hidrólisis de los grupos ASI residuales a los grupos AAc.

Las muestras moldeadas fueron luego incubadas a 37°C durante 24 horas en un ambiente de 100% humedad para proporcionar el hidrogel final. Con la gelificación, el hidrogel contenía 94.8% de agua, 2.9% de colágeno y 2.3% de co-polímero sintético. Las matrices fueron- moldeadas para un espesor final entre 150-200 µp? ó 500-600 µt?. Cada matriz de hidrogel resultante fue separada de su molde en solución de PBS y posteriormente se sumergió en PBS con un contenido de 1% de cloroformo y 0.5% de glicina. Este paso de lavado eliminó la N-hidroxisuccinimida producida en la reacción de reticulación y terminó cualquiera de los grupos ASI residuales en la matriz por conversión a los grupos ácido acrílico.

Los residuos succinimida que quedaron en los geles preparados a partir de colágeno y copolímero estuvieron por debajo de los límites de detección del IR después del lavado .

EJEMPLO 12: PROPIEDADES FÍSICAS DEL HIDROGEL COLÁGENO- CO-POLÍMERO La dispersión inversa de luz y la transmisión de luz a través de la región visible y con luz blanca para los hidrogeles preparados como en el Ejemplo 10 como función de las relaciones amina del colágeno a ASI del copollmero se muestran en las Figuras 13A y B.

El copollmero del Ejemplo 10 y sus hidrogeles no tuvieron punto de enturbiamiento detectable (LCST) hasta 60°C.

EJEMPLO 13: PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LOS DIFERENTES HIDROGELES 11.1 Biocompatibilidad Tres discos de 12 mm de diámetro y 650 de espesor, cada uno de hidrogeles de colágeno-poli (DMAA-co-ASI) , colágeno-poli (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) -pentapéptido y 3% de colágeno fueron enjuagados durante 30 minutos en PBS . Cada uno de estos se colocó sobre un inserto de membrana de 12 mm disponible en el comercio para una caja de cultivo y se adhirió a la membrana con un recubrimiento delgado de gelatina. Después de secar durante 10 minutos, 1 x 104 células epiteliales corneales humanas (HCEC) se suspendieron en un medio libre de suero que contenía el factor de crecimiento epidermal (Keratinocyte Serum-Free Médium (KSFM; Life Technologies, Burlington, Canadá)) fueron adicionadas a la parte superior de los geles, y células KSFM fueron adicionadas al pozo subyacente. Los cultivos fueron incubados a 37°C con 5% de C02.

En el transcurso de 12 horas las células se hablan adherido a la superficie de la matriz en todas las muestras . Se cambió el medio cada segundo día adicionando KSFM a las inserciones y a los pozos exteriores . Las HCEC fueron crecidas hasta confluencia sobre los geles y la confluencia se alcanzó durante el mismo día (5 días) . El medio en las inserciones y los pozos circundantes fue sustituido por medio que contenía suero (medio SHEM modificado (Jumblatt, M. M. & Neufeld, A. H. (1983) Invest Ophthalmol Vis Sci 24, 1139-43)) . Después de 2 días más, el medio se eliminó de las inserciones y el volumen del SHEM en los pozos subyacentes se redujo a 0.5 mL. Se permitió que el epitelio se estratificara durante otros 7 días y se observara la capa de células .

Después de 7 días, las membranas se fijaron en 4% paraformaldehído en PBS durante 30 minutos a 4°C. Se prepararon las muestras para crioseccionado por equilibrio en 30% de sacarosa en PBS seguido por congelación instantánea en una mezcla 1:1 de sacarosa al 30% en PBS y OCT. Estas fueron crioseccionadas a 13 µt? y se visualizó la estructura por tinción con HandE. El número de capas de células en el epitelio estratificado se determinó por conteo de los núcleos e identificando los contornos celulares . El termogel de colágeno logró un espesor epitelial de aproximadamente 2 células, lo cual contrasta con mucha deficiencia con el epitelio corneal humano que contiene entre aproximadamente 5 y 7 capas ce células. No obstante, las HCEC cultivadas e inducidas a estratificación sobre colágeno- (DMAA-co-ASI) y colágeno-p (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) -pentapéptido, dio como resultado un epitelio de aproximadamente 4.5 capas de células de espesor que incluyeron aparentemente capas externas queratinizadás sugiriendo diferenciación adecuada del epitelio (Figura 20) . 11.2 Inervación del hidrogel Discos de 12 milímetros de diámetro y 650 µp? de espesor cada uno de termogel colágeno- (DMAA-co-ASI) , colágeno- (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) -pentapéptido y 3% de colágeno fueron enjuagados durante 30 minutos en PBS. Los discos se depositaron en una caja de cultivo de 6 cm y a través de cada uno se perforaron 4 agujeros de 1 ram.

Estos agujeros fueron llenados a una tercera parte con un tapón de 0.3% de colágeno reticulado con glutaraldehído e interrumpidos con glicina. Después de 10 minutos, ganglios de. la raíz dorsal de pollos E8 fueron sumergidos en la misma mezcla de colágeno y se colocaron en los agujeros. Se llenó el resto de los agujeros con colágeno reticulado, y se dejaron en reposo durante 30 minutos a 37 °C. Los cultivos fueron crecidos durante 4 días en KSF suplementado con B27, N2 y ácido retinóico 1 n durante 4 días y se vigiló la extensión de las neuritas por microscopía de campo brillante. Los discos inervados fueron fijados en 4% de paraformaldehído en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, fueron teñidos para inmunorreactividad NF200 y se visualizaron por inmunofluorescencia . La ubicación se observó sobre la superficie y en el centro del disco del polímero. Aunque hubo alguna extensión de neuritas sobre la superficie del termogel de colágeno, ninguna pudo observarse extendiéndose hacia el propio termogel. En los hidrogeles, las neuritas podían observarse extendiéndose hacia la matriz. También, en ambos hidrogeles se pudo observar inervación extensa sobre la superficie de la matriz, sugiriendo una mejor inervación superficial que la que se observó con el termogel de colágeno (Figura 19; A representa el termogel de colágeno, B representa el hidrogel de colágeno-p (NiPAAm-co-AAc-co-ASI) -pentapéptido y C representa el hidrogel colágeno- (D AA-co-ASI) ) . La columna de la izquierda representa visualizaciones inmunofluorescentes de la mitad de los polímeros teñida para el marcador de neurofilamentos de nervios-NF200. La columna media representa una vista de campo brillante de la superficie del polímero con las neuritas extendiéndose desde la fuente ganglionar. La columna derecha representa una visualización inmunofluorescente de la misma vista superficial del polímero teñido para inmunorreactividad NF200. Las flechas indican las neuritas extendiéndose en la mitad del polímero. La córnea humana intacta demuestra superficie subepitelial y nervios profundos sugiriendo que estas matrices son biocompatibles para los nervios y pueden emular el estroma corneal .

La invención siendo así descrita, será evidente que puede modificarse en diversas formas . Estas variaciones no están consideradas como apartadas del espíritu y alcance de la invención, y todas estas modificaciones, como serán obvias para un experto en la técnica, se proponen para estar incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (110)

1. REIVINDICACIONES
2. Un copolímero sintético que consta de uno o más co-monómeros acrilamida sustituidos con N-alquilo ó N, -dialquilo, uno o más co-monómeros hidrofílicos y uno o más co-monómeros ácido acril o metacril carboxilicos derivados para que contengan una porción pendiente que pueda ser reticulada, un copolímero sintético con una masa molecular promedio numérico entre aproximadamente 2,000 y aproximadamente 1,000,000, en donde el co-polimero sintético es reactivo con aminas primarias a través de la porción pendiente que puede ser reticulada.
3. El copolímero sintético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: (a) el co-monómero acrilamida sustituido con N- alquilo ó N, -dialquilo, tiene una estructura de la fórmula I: en donde : Ri, R2, R3, R4 y R5 se eligen de manera independiente del grupo de: H y alquilo inferior; (b) el co-monómero hidrofilico tiene una estructura de la fórmula II: en donde : Y es 0 ó está ausente; R6 y R7 se eligen independientemente del grupo de: H y alquilo inferior; Re es H, alquilo inferior ó -OR' , donde R' es H o alquilo inferior; y Rg es H, alquilo inferior ó -C(0)Rio y Rio es -NR4R5 ó -OR", donde R" es H ó CH2CH2OH; y (c) el co-monómero ácido acril o metacrilcarboxilico tiene una estructura de la fórmula III: en donde : Rii/ R12 Y ¾3 se eligen independientemente del grupo de: H y alquilo inferior; y Q es N-succinimido, 3-sulfo-succinimido (sal sódica) , N-benzotriazolilo, N-imidazolilo o p-nitrofenilo .
4. El co-polímero sintético de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo o N, N-dialquilo y uno o más co-monómero (s) hidrofxlico (s) son el mismo.
5. El co-polímero sintético de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo o N,N-dialquilo y uno o más co-monómero (s) hidrofxlico (s) son diferentes.
6. El co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el alquilo o alquilo inferior es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono. El co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el alquilo o alquilo inferior es el grupo cicloalquilo que tiene entre 3 y 6 átomos de carbono.
7. El co-polímero sintético de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación molar combinada del co-monómero acrilamida sustituido con N-aqluilo ó N, -dialguilo y el co-monómero hidrofílico es entre aproximadamente 50% y aproximadamente 99.5%, y la relación molar del co-monómero ácido acril o metacrilcarboxílico derivado es entre aproximadamente 0.5% y aproximadamente 50%, en donde la suma de las relaciones molares es el 100%
8. El co-polímero sintético de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque la relación molar del co-monómero acrilamida sustituido con N-aqluilo ó N,N-dialquilo es entre aproximadamente 50% y aproximadamente 90%, la relación molar del co-monómero hidrofílico es entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50%, y la relación molar del co-monómero ácido acril o metacrilcarboxílico derivado es entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 15%, en donde la suma de las relaciones molares es el 100% El co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó N,N-dialquilo se elige del grupo de: N-metilacrilamida, N-etilacrilaraida, N-isopropilacrilamida (NiPAAm) , N-octilacrilamida, N-ciclohexilacrilamida, N-metil-N-etilacrilamida, N-metilmetacrilamida, N-etilmetacrilamida, N-isopropilmetacrilamida, N,N-dimetilacrilamida, N, N-dietilacrilamida, N,N-dimetilmetacrilamida, N, N-dietilmetacrilamida, N,N-diciclohexilacrilamida, N-metil-N-ciclohexilacrilamida, N-acriloilpirrolidina, N-vinil-2-pirrolidinona, H-metacriloilpirrolidina, y combinaciones de estos .
9. El co-polimero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque uno o más co-monómero (s) hidrofílico (s) se elige del grupo de: ácido acrílico, ácido metacrílico, metacrilato de 2-hidroxietilo (HE A) , ?,?-dimetilacrilamida, N,N-dietilacrilamida, 2- [?,?-dimetilamino] etilacrilamida, 2- [N,N-dietilamino] etilacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, 2- [?,?-dimetilamino] etilmetacrilamida, 2- [N,N- dietilamino] etilmetacrilamida, N-vinil-2- pirrolidinona, 2- [?,?-dietilamino] etilacrilato, 2- [?,?-dimetilamino] etilacrilato, 2- [N,N- dietilamino] etilmetacrilato, 2- [N,N- dimetilamino] etilmetacrilato, o combinaciones de estos .
10. 10. El co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque uno o más co-monómero (s) ácido acril o metacrilcarboxílico se elige del grupo de: ácido acrílico, ácido metacrílico, y versiones sustituidas de estos, y la porción que puede ser reticulada es un grupo succinimidilo, un imidazol, un benzotriazol, un p-nitrofenol 6 ácido 2- (N- morfolino) etansulfónico .
11. 11. El co-polimero sintético de conformidad con la reivindicación 2 que consiste en N,N- dimetilacrilamida y N-acriloxisuccinimida.
12. 12. El co-polímero sintético de conformidad con la reivindicación 3 que consiste en N- isopropilacrilamida, ácido acrílico y N- acriloxisuccinimida .
13. Una matriz biosintética que consta de: (a) un copolímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ; (b) un biopollmero; y (c) un disolvente acuoso, en donde el co-polímero sintético y el biopolímero se reticulan a través de la porción pendiente que puede ser reticulada para formar un hidrogel .
14. La matriz biosintética de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la cantidad del co-polímero sintético es entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 30% en peso, la cantidad de biopolímero es entre aproximadamente 0.3% y aproximadamente 50% en peso, y la cantidad del disolvente acuoso es entre aproximadamente 20% y aproximadamente 99.6% en peso.
15. La matriz biosintética de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque el biopolímero se elige del grupo de: colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes, gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosana, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglucano) y derivados de éstos .
16. La matriz biosintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, además contiene uno o más agente (s) bioactivo (s) .
17. La matriz biosintética de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o más agentes bioactivos están unidos en forma covalente al copolímero sintético mediante la porción pendiente que puede ser reticulada.
18. La matriz biosintética de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el agente bioactivo comprende el pentapéptido que tiene la secuencia YIGS .
19. 19. La matriz biosintética de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque en la matriz se dispersa uno o más agentes bioactivos .
20. 20. La matriz biosintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20 además comprende una pluralidad de células dispersadas en la matriz.
21. 21. El uso de la matriz biosintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 como andamio para la regeneración de tej idos en un animal que necesite de ésta.
22. 22. El uso de la matriz biosintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 para la sustitución de tejido dañado o retirado en un animal que necesite de ésta.
23. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 23 , caracterizado porque el tejido es piel o parte de un órgano
24. El uso de. conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el tejido es una córnea o una parte de una córnea.
25. El uso de la matriz biosintética de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 para recubrir implantes quirúrgicos .
26. Una composición que contiene: (a) uno o más agentes bioactivos; (b) el co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ; (c) un biopolímero; y (d) un disolvente acuoso.
27. 27. Una composición que contiene: (a) una pluralidad de células; (b) el co-polímero sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ; (c) un biopolímero; y (d) un disolvente acuoso.
28. La composición de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizada porque la cantidad de polímero sintético es entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 30% en peso, la cantidad del biopolímero es entre aproximadamente 0.3% y aproximadamente 50% en peso y la cantidad del disolvente acuoso es entre aproximadamente 20% y aproximadamente 99.6% en peso.
29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, caracterizada porque el biopolímero se elige del grupo de: colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes , gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosana, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglucano) y derivados de éstos .
30. 30. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, caracterizada porque el co-polímero sintético y el biopolímero están reticulados .
31. 31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizada porque el agente bioactivo está unido en forma covalente al co-polimero sintético mediante la porción pendiente que puede ser reticulada.
32. 32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30 ó 32, la cual se formula como una solución inyectable, en donde el co- polimero sintético y el biopolímero pueden reticularse para formar un hidrogel in vivo.
33. 33. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, la cual es un hidrogel preformado .
34. Un implante para utilizarlo en ingeniería de tejidos que consiste en una matriz biosintética preformada, la matriz contiene un disolvente acuoso y un biopolímero reticulado con el co-polímero sintético de conformidad con . cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
35. El implante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el biopolímero se elige del grupo de: colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes, gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosana, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglucano) y derivados de éstos .
36. El implante de conformidad con la reivindicación 35 ó. 36, caracterizado porque la cantidad del co-polímero sintético es entre aproximadamente 0.1% y aproximadamente 30% en peso, la cantidad de biopolímero es entre aproximadamente 0.3% y aproximadamente 50% en peso, y la cantidad del disolvente acuoso es entre aproximadamente 20% y aproximadamente 99.6% en peso.
37. 37. El implante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porgue la matriz biosintética soporta crecimiento interno de los nervios .
38. 38. El implante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, además comprende uno o más agentes bioactivos .
39. El implante de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente bioactivo está unido en forma covalente al co-polimero sintético mediante la porción pendiente que puede ser reticulada.
40. 40. El implante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40, además comprende una pluralidad de células dispersadas en la matriz .
41. El implante de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque las células son células primordiales o células precursoras.
42. El uso del implante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 40 como córnea artificial.
43. Un proceso para preparar un co-polímero sintético, que consiste en: (a) dispersar uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó N,N-dialquilo, uno o más co-monómeros hidrofílicos y uno o más co- monómeros ácido acril- o metacrilcarboxílico, derivado para contener una porción pendiente que pueda ser reticulada, en un disolvente en presencia de un iniciador; (b) permitir que uno o más co-monómero (s) acrilamida sustituidos con N-alquilo ó N,N- dialquilo, uno o más co-monómeros hidrofílicos y uno o más co-monómeros ácido acril- o metacrilcarboxílico se polmericen para formar un co-polímero sintético, y (c) como una opción purificar el co-polímero sintético .
44. Un proceso para preparar una matriz biosintética que consiste en los pasos de: (a) preparar un co-polímero sintético por el proceso de conformidad con la reivindicación 44; (b) dispersar el co-polímero sintético y un biopolímero en un medio acuoso; y permitir que el co-polímero sintético y el biopolímero se reticulen para obtener la matriz biosintética .
45. 45. El proceso de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, caracterizado porque el co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó N,N-dialquilo y el co-monómero hidrofilico son el mismo.
46. 46. El proceso de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, caracterizado porque el co-monómero (s) acrilamida sustituido con N-alquilo ó N,N-dialquilo y el co-monómero hidrofilico son diferentes.
47. 47. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 además comprende mezclar el co-polímero sintético ' con uno o más agentes bioactivos antes del paso (b) y dejar que el agente bioactivo se reticule con el co-polímero sintético a través de la porción pendiente que puede ser reticulada.
48. 48. El proceso de conformidad con la reivindicación 45 además comprende mezclar el co-polímero sintético y el biopolímero con una pluralidad de células en el paso (b) .
49. Un co-polímero sintético producido por el proceso de conformidad con la reivindicación 44.
50. Una matriz biosintética producida por el proceso de conformidad con la reivindicación 45.
51. Un implante ocular, que consiste en: (a) un polímero sintético; y (b) un biopolímero, reticulado al polímero sintético, el biopolímero esta distribuido a lo largo del implante y es eficaz para dar soporte a la adhesión de las células o al crecimiento celular sobre el implante cuando el implante se coloca en un ojo.
52. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el biopolímero se distribuye prácticamente a todo lo largo del implante .
53. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el biopolímero se distribuye de una manera considerablemente uniforme por todo el implante.
54. 54. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el implante está estructurado para ser colocado entre el epitelio córneo y un estroma corneal .
55. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el implante es un veneer corneal .
56. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el biopolímero está reticulado al polímero sintético a través de una porción pendiente que puede ser reticulada sobre el polímero sintético.
57. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el polímero sintético se obtiene de un monómero derivado de acrilamida y el biopolímero consiste en un componente proteínico .
58. El implante de la reivindicación 57, caracterizado porque el monómero derivado de acrilamida incluye un componente poli (N-isopropilacrilamida) .
59. El implante de la reivindicación 57, caracterizado porque el componente proteína incluye un componente colágeno .
60. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el implante es un hidrogel.
61. 61. El implante de la reivindicación 51, caracterizado porque el biopolímero está reticulado al polímero sintético de modo que cada polímero prácticamente no sea extraído del implante en las condiciones fisiológicas .
62. 62. El implante de la reivindicación 51 además comprende un agente bioactivo ubicado sobre o en el implante .
63. 63. El implante de la reivindicación - 51 , caracterizado porque el implante se forma como una lente .
64. 64. El implante de la reivindicación 63, caracterizado porque el implante se forma como una lente de contacto .
65. 65. Un implante ocular que consta de : (a) un polímero sintético; y (b) un biopolímero reticulado al polímero sintético para formar una matriz moldeada para colocarse sobre o en una córnea de un ojo.
66. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el implante es una córnea artificial.
67. 67. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque la matriz se forma como un veneer corneal .
68. 68. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque la matriz se forma como una lente.
69. 69. El implante'' de la reivindicación 66, caracterizado porque la matriz se forma como una lente de contacto .
70. 70. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque la matriz se forma para que sea colocada entre un estroma corneal y un epitelio corneal .
71. 71. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el polímero sintético se obtiene de al menos un monómero derivado de acrilamida.
72. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el polímero sintético consiste en un co- polímero de tres diferentes monomeros .
73. 73. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el polímero sintético se obtiene de un co- monómero derivado de acrilamida, un co-monómero idrofílico y un co-monómero ácido carbox lico.
74. 74. El implante de la reivindicación 65 , caracterizado porque el polímero sintético se obtiene de un componente N-isopropilacrilamida .
75. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el biopolímero consiste en una proteína o un carbohidrato eficaces para facilitar el crecimiento celular sobre el implante.
76. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el biopolímero consiste en un colágeno, o un fragmento de colágeno.
77. El implante de la reivindicación 66, caracterizado porque la matriz incluye un polímero obtenido de un componente N-isopropilacrilamida y un componente proteína .
78. 78. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque la matriz es un hidrogel.
79. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el biopolímero se distribuye por todo el implante .
80. El implante de la reivindicación 65, caracterizado porque el polímero sintético y el biopolímero se reticulan entre sí de modo que cada polímero sea considerablemente no extractable del implante en las condiciones fisiológicas y de modo que al menos la adhesión de las células o el crecimiento celular sea soportado sobre el implante ocular.
81. Un implante ocular que consiste en: (a) un cuerpo de una lente estructurada para que sea colocada sobre o en una córnea de un ojo; y (b) un agente bioactivo reticulado a un componente del cuerpo de la lente y presente en una cantidad eficaz para favorecer el crecimiento del nervio en el implante .
82. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en un polímero sintético y un biopolímero reticulado al polímero sintético .
83. 83. El implante de la reivindicación 82, caracterizado porque el biopolímero está reticulado al polímero sintético por porciones pendientes que pueden ser reticuladas sobre el polímero sintético.
84. 84. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el implante es un veneer corneal .
85. 85. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente está estructurado para que sea colocado entre un estroma corneal y un epitelio corneal de un ojo.
86. 86. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente está estructurado como una lente de contacto .
87. 87. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el agente bioactivo consiste en una proteína que tiene un motivo de unión de células nerviosas .
88. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el agente bioactivo consiste en un péptido.
89. El implante de la reivindicación 88, caracterizado porque el péptido tiene una secuencia de aminoácidos YIGSR.
90. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en polímero sintético y un biopolímero, y el agente bioactivo está reticulado al polímero sintético.
91. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el agente bioactivo está encapsulado en el cuerpo de la lente .
92. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente tiene un índice de refracción en un intervalo semejante al índice de refracción de la película de las lágrimas en un ojo humano .
93. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente incluye una pluralidad de poros con un diámetro en un intervalo de entre aproximadamente 140 nm a aproximadamente 190 nm.
94. 94. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente tiene una permeabilidad de difusión de la glucosa mayor que una permeabilidad de difusión de la glucosa de un estroma natural de un oj o humano .
95. 95. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente tiene claridad óptica.
96. 96. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en un polímero sintético obtenido de al menos un monómero derivado de acrilamida.
97. 97. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en un co- polímero de tres monomeros diferentes .
98. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de lente consiste en un polímero sintético obtenido de un co-monómero derivado de acrilamida, un co-monómero hidrofílico y un co- monómero ácido carboxílico.
99. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de lente se obtiene de un componente N-isopropilacrilamida.
100. 100. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en una proteína o un carbohidrato eficaces para facilitar el crecimiento de la célula sobre el implante .
101. 101. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente consiste en un colágeno o un fragmento de colágeno.
102. 102. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente incluye un polímero obtenido de un componente N-isopropilacrilamida y un componente proteina.
103. 103. El implante de la reivindicación 82, caracterizado porque el cuerpo de la lente es un hidrogel.
104. 104. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque el cuerpo de la lente incluye un polímero sintético, y un biopolímero distribuido por todo el implante .
105. 105. El implante de la reivindicación 104, caracterizado porque el biopolímero se distribuye prácticamente por todo el implante.
106. 106. El implante de la reivindicación 104, caracterizado porque el biopolímero se distribuye de manera considerablemente uniforme por todo el implante.
107. 107. El implante de la reivindicación 81, además comprende células vivas ubicadas en el cuerpo de la lente .
108. 108. El implante de la reivindicación 107, caracterizado porque las células vivas incluyen células oculares .
109. 109. El implante de la reivindicación 81 además comprende un elemento de refuerzo provisto en el cuerpo de la lente .
110. 110. El implante de la reivindicación 81, caracterizado porque la cantidad del agente bioactivo es eficaz para favorecer la sensibilidad al tacto del implante después de que el implante se coloca en un ojo.