ES2580161T3

ES2580161T3 - Sistemas de geles blandos en la modulación del desarrollo de células madre

Info

Publication number: ES2580161T3
Application number: ES08826041.9T
Authority: ES
Inventors: Makoto Funaki; Paul A. Janmey; Jessamine Winer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2016-08-19
Anticipated expiration: 2028-06-30
Also published as: WO2009005769A2; EP2173859A4; DK2173859T3; JP5780759B2; CN101855337A; WO2009005769A3; HK1143603A1; US20100227399A1; CA2691787A1; EP2173859B1; EP2173859A2; JP2010532166A; US11083190B2; CN101855337B; JP6328032B2; JP2015043780A

Abstract

Un método de inducción de la diferenciación de una población de células madre mesenquimales quiescentes en una población de un tipo de célula de interés, comprendiendo dicho método las etapas de (a) mantener dicha población de células madre mesenquimales en quiescencia, conservando la capacidad de que dicha población de células madre mesenquimales se diferencie en múltiples tipos de células y conservando la capacidad proliferativa de dicha población de células madre mesenquimales en presencia de un aparato que contiene un gel o una matriz de gel que tiene un módulo de cizalla en un intervalo de 150-750 Pa; y (b) cultivar dicha población de células madre mesenquimales en presencia de un medio de inducción, induciendo de este modo la diferenciación de dicha población de células madre mesenquimales en una población de un tipo de célula de interés.

Description

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DESCRIPCION

Sistemas de geles blandos en la modulacion del desarrollo de celulas madre Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de modulacion del desarrollo de celulas madre usando geles blandos. Espedficamente, la invencion proporciona metodos para la modulacion del desarrollo de celulas madre, usando geles que tienen propiedades viscoelasticas optimizadas.

Antecedentes de la invencion

Las celulas madre mesenquimales adultas tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en multiples linajes celulares de tejidos mesenquimales. Por lo tanto, se han tenido en cuenta aplicaciones clmicas de estas celulas, tales como reemplazo de tejidos danados o veldculos para agentes antineoplasicos. En este momento, las aplicaciones de celulas madre mesenquimales adultas aun estan limitadas a un estado preclmico, en parte debido al rapido envejecimiento de estas celulas ex vivo, lo que limita su expansion y modificacion tecnica. Se ha indicado que la inmortalizacion de celulas madre mesenquimales mediante transduccion de la telomerasa supera problemas asociados con el envejecimiento acelerado. Sin embargo, su capacidad de autorrenovacion ilimitada puede conducir a un crecimiento fuera de control, una vez que se han implantado en tejidos. De hecho, en entornos in vitro se observo transformacion de celulas madre mesenquimales transducidas con telomerasa.

Por tanto, la regulacion del crecimiento de celulas madre mesenquimales adultas es una de las etapas clave para sus aplicaciones clmicas.

Engler et al Cell Vol. 126, n.° 4, paginas 677-689 (2006) muestran que la elasticidad de la matriz conduce a la especificacion del linaje de celulas madre. Las celulas madre mesenquimales (CMM) vfrgenes mostraron que especificaban linaje y estaban dedicadas a fenotipos con extrema sensibilidad hacia elasticidad a nivel tisular.

Zhou et al, Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 23(4), paginas 369-371 (2007) se refieren al efecto del cultivo bajo en suero en la sincroma del ciclo celular de celulas madre mesenquimales. Las CMC se cultivaron e identificaron con CD44, CD90, CD71 y CB11b por citometna de flujo. El ciclo celular y la apoptosis se detectaron en cultivo normal y bajo en suero por citometna de flujo. Se descubrio que el cultivo prolongado en medio con privacion de suero indujo la detencion del ciclo celular en el estadio G0/G1.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de modulacion del desarrollo de celulas madre usando geles blandos. Espedficamente, la invencion proporciona metodos de modulacion del desarrollo de celulas madre, usando geles que tienen propiedades viscoelasticas optimizadas.

La presente invencion proporciona un metodo de induccion de la diferenciacion de una poblacion de celulas madre mesenquimales quiescentes en una poblacion de un tipo de celula de interes, comprendiendo dicho metodo las etapas de (a) mantener dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en quiescencia, conservando la capacidad de que dicha poblacion de celulas madre mesenquimales se diferencie en multiples tipos de celulas y conservando la capacidad proliferativa de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en presencia de un aparato que contiene un gel o una matriz de gel que tiene un modulo de cizalla en un intervalo de 150-750 Pa; y (b) cultivar dicha

poblacion de celulas madre mesenquimales en presencia de un medio de induccion, induciendo de este modo la

diferenciacion de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en una poblacion de un tipo de celula de interes.

En una realizacion, la poblacion de un tipo de celula de interes es una poblacion de adipocitos.

En una realizacion, la poblacion de un tipo de celula de interes es una poblacion de osteoblastos.

En algunas realizaciones:

(a) el gel o la matriz de gel comprende adicionalmente un suero animal; y/o

(b) la etapa de mantenimiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o una matriz de gel esta precedida por una etapa de cultivo de la poblacion de celulas madre mesenquimales en un aparato de cultivo tisular; y/o

(c) la etapa de mantenimiento se realiza directamente despues del aislamiento, purificacion o enriquecimiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales a partir de una muestra biologica.

En una realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion adipogenico.

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En algunas realizaciones:

(a) el gel o matriz de gel comprende acrilamida y bisacrilamida; y/o

(b) el gel o la matriz de gel es bidimensional o tridimensional; y/o

(c) el gel o la matriz de gel se recubre con una protema de adhesion; y/o

(d) la poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales adulta; y/o

(e) La poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales humanas.

En algunas realizaciones:

(a) el gel o el gel en la matriz tiene una concentracion total de acrilamida de 3 % y una concentracion total de bisacrilamida de 0,06% a 0,5%, una concentracion total de acrilamida de 5,5% y una concentracion total de bisacrilamida de 0,05 % a 0,075 % o una concentracion total de acrilamida de 7,5 % y una concentracion total de bisacrilamida de 0,01 % a 0,03 %; y/o

(b) la protema de adhesion es un colageno, una fibronectina, o una combinacion de los mismos.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. A. Propiedades mecanicas de sustratos de poliacrilamida. El modulo de cizalla de los geles de poliacrilamida se midio con un intervalo de proporciones de acrilamida (indicado como porcentajes cerca de las lmeas de datos) a bisacrilamida (indicado como agente de reticulacion). El modulo de cizalla (G'), expresado en Pascales, aumenta a masa polimerica constante con agente de reticulacion creciente. El aumento de la concentracion de acrilamida del 3 al 12% tambien crea un gran intervalo de rigidez de 10 a 50.000 Pa. La lmea continua indica la rigidez teorica de una red de tipo gomoso si cada reticulacion era elasticamente eficaz. B. Forma de la celula y estructura de F-actina de CMMh en matrices ngidas o blandas. C. Forma de la celula y estructura de F-actina de CMMh en geles blandos y vidrio.

Figura 2. Incorporacion de BrdU en CMMh.

Figura 3. El efecto de la rigidez de la matriz en la diferenciacion de adipocitos. A. Grafico de porcentaje de celulas positivas. Primera barra en cada serie: Tincion con Oil Red O. Segunda barra: tincion de PPARy2.

Figura 4. Estructura de F-actina en astrocitos sembrados en geles ngidos o blandos.

Figura 5. Cuantificacion del aumento de la actividad de Rho de geles blandos con respecto a duros. Se sembraron astrocitos en geles de poliacrilamida con diversas rigideces. Se cuantifico el nivel de carga de GTP de Rho.

Figura 6. Las celulas de melanoma se propagan mas en matrices ngidas. Representacion grafica de area.

Figura 7. Las celulas de melanoma se adhieren a geles blandos y ngidos con la misma eficiencia.

Figura 8. Poblacion mas grande de celulas de melanoma en geles ngidos.

La Figura 9 muestra imagenes de CMM humanas en varios sustratos de diferentes elasticidades de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion.

La Figura 10 muestra la cantidad de bromodesoxiuridina (BrdU) captada en CMM humanas en sustratos de diversas elasticidades de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion.

La Figura 11 muestra (A-D) una ilustracion del efecto de un ambiente casi tridimensional en la forma y proliferacion de celulas madre de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion.

La Figura 12 muestra la respuesta de CMC humanas a medio de induccion adipogenico de acuerdo con diversas realizaciones en la invencion.

La Figura 13 muestra la deposicion de calcio visualizada con Alizarin Red S despues de estimulacion de las CMM humanas con medio de osteoinduccion de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion.

La Figura 14 muestra un diagrama de flujo para preparar un sistema para inducir quiescencia, diferenciacion y proliferacion en celulas madre adultas de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion.

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La figura 15 muestra ilustraciones esquematicas de realizaciones de sistemas de la presente invencion.

Descripcion detallada de la invencion

En el presente documento se describen geles y matrices de geles que tienen una rigidez en el intervalo de 0,01-50 kPa, metodos para fabricarlo y metodos para conservar una poblacion de celulas madre mesenquimales o estudiar celulas madre mesenquimales que los comprenden.

En el presente documento tambien se describe un metodo de fabricacion de un gel de poliacrilamida con una rigidez en el intervalo de 150-750 Pa, que comprende las etapas de polimerizar una composicion que comprende acrilamida y bisacrilamida, produciendo de esta manera un gel de poliacrilamida blando y recubrir el gel de poliacrilamida blando con una composicion que comprende un colageno de tipo I y una fibronectina, fabricando de este modo un gel de poliacrilamida que tiene una rigidez en el intervalo de 150-750 Pa. En otra realizacion, la composicion tiene una relacion de mezcla de acrilamida: bisacrilamida de entre 100:1 y 30:1. En otra realizacion, el gel tiene una relacion de mezcla de acrilamida: bisacrilamida de entre 100:1 y 30:1. En otra realizacion, la composicion tiene una concentracion total de acrilamida de 3-5 %. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel tiene una concentracion total de acrilamida de 3-5 %. En otra realizacion, la composicion es una solucion. En otra realizacion, la composicion es una suspension. En otra realizacion, la composicion es cualquier otro tipo de composicion conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En el presente documento tambien se describe un metodo de fabricacion de una matriz de fibrina con una rigidez en un intervalo de 150-750 Pa, que comprende las etapas de polimerizar una composicion que comprende una protema de fibrina o fibrinogeno, produciendo de este modo una matriz de fibrina blanda, en la que la concentracion de la protema de fibrina o fibrinogeno en la matriz de fibrina blanda es de 3-10 mg/ml, y recubrir la matriz de fibrina blanda con una composicion que comprende una protema de adhesion, fabricando de este modo una matriz de fibrina que tiene una rigidez en un intervalo de 150-750 Pa.

En el presente documento tambien se describe un metodo para preservar una poblacion de celulas madre mesenquimales, comprendiendo el metodo la etapa de cultivar la poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o matriz de gel con una rigidez en un intervalo de 150-750 Pa, preservando de este modo una poblacion de celulas madre mesenquimales. En otra realizacion, la etapa de cultivar se realiza en ausencia de induccion qmmica. En otra realizacion, la etapa de cultivar se realiza en ausencia de un medio de induccion. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En el presente documento tambien se describe un metodo para preservar una celula madre mesenquimal, comprendiendo el metodo de la etapa de cultivar la poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o matriz de gel con una rigidez en un intervalo de 150-750 Pa, preservando de este modo una celula madre mesenquimal. En otra realizacion, la etapa de cultivar se realiza en ausencia de induccion qmmica. En otra realizacion, la etapa de cultivar se realiza en ausencia de un medio de induccion. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En el presente documento tambien se describe un metodo para inducir la quiescencia de una celula transformada, que comprende la etapa de cultivar la celula transformada en un gel o matriz de gel de los metodos de la presente invencion, induciendo de este modo la quiescencia de una celula transformada. En otra realizacion, la celula transformada es una celula cancerosa. En otra realizacion, la celula transformada es una celula neoplasica. En otra realizacion, la celula transformada es cualquier otro tipo de celula transformada conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En otra realizacion de los metodos de la presente invencion, la longitud de los telomeros de la poblacion de celulas madre mesenquimales se mantiene. “Mantenerse” se refiere, en otra realizacion, a una falta de cambio sustancial en cuanto a la longitud. En otra realizacion, el termino se refiere a una falta de cambio medible en cuanto a la longitud. En otra realizacion, el termino se refiere a una falta de suficiente cambio en cuanto a la longitud que afecte a la capacidad proliferativa. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion de los metodos de la presente invencion, la poblacion de celulas madre mesenquimales se mantiene en un estado quiescente. “Quiescente” se refiere, en otra realizacion, a una falta de replicacion significativa. En otra realizacion, el termino se refiere a un gran porcentaje de celulas detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, las celulas se detienen en la fase G1. En otra realizacion, las celulas se detienen en la fase G2. En otra realizacion, “quiescencia” se refiere a cualquier otra definicion del termino aceptada en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En una realizacion, cuando la celula madre es una celula mesenquimal humana derivada de medula osea, la matriz extracelular (MEC) tiene una elasticidad de aproximadamente 250 Pa y comprende una mezcla de colageno y fibronectina. En otra realizacion, el colageno es colageno de cola de rata, y la fibronectina es fibronectina humana. La relacion de colageno y fibronectina puede variar, y en una realizacion, la relacion de colageno con respecto a fibronectina es de aproximadamente 5:1. Tambien pueden usarse otras relaciones de colageno y fibronectina. Un experto habitual en la tecnica apreciara que el colageno y la fibronectina pueden obtenerse de otras fuentes, y que

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pueden usarse sustancias distintas de colageno y fibronectina para presentar elasticidad y unirse con integrinas en la superficie de la membrana celular de manera que se induzca la quiescencia de la celula.

De acuerdo con realizaciones de la presente invencion, el material extracelular (MEC) esta provisto de una elasticidad aparente apropiada acoplando el MEC con un sustrato de tal manera que una celula madre se entra en contacto con el MEC detecta la elasticidad del sustrato. En consecuencia, el sustrato puede ser un material cuya elasticidad, cuando se acopla al MEC, detecta una celula madre que entra en contacto con el MEC. En algunas realizaciones, el sustrato es vidrio. En otras realizaciones, el sustrato es un gel con una elasticidad de 250 Pa, o un gel con una elasticidad de 7.500. Estos geles pueden ser geles de poliacrilamida, y, como conocen los expertos en la materia, la elasticidad de los geles de poliacrilamida puede modificarse, por ejemplo, cambiando las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida en la formulacion de gel. La fabricacion de geles de diversa elasticidad que pueden usarse en el metodo de la presente invencion sera obvia para un experto en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva.

La elasticidad del ambiente biologico in vivo de una celula madre puede determinarse extrayendo una muestra de tejido fisiologico del ambiente in vivo inmediato de la celula madre, y midiendo despues el modulo de cizalla de esa muestra tisular. En la presente memoria descriptiva se describen procedimientos ejemplares para preparar y medir la elasticidad de tejido de rata y de tejido bovino. La siguiente tabla 1 proporciona la elasticidad de diversos tipos de tejidos:

Tabla 1

Especie: Tejido Elasticidad (en Pa) (Media ± DT)

Bovino: Medula osea 220 ± 50

Rata: Grasa subcutanea 160 ± 70

Rata: Grasa visceral 130 ± 70

Rata: Hfgado 403 ± 28

Rata: Musculo esqueletico 2251±166

En una realizacion, las CMM humanas en geles de 250 Pa estan en un estado quiescente esperando una senal adicional para determinar su destino. En una realizacion, las CMMh experimentaran diferenciacion adipogenica (inducida por factores qmmicos), o en otras realizaciones, un regreso al ciclo celular (inducido por el acoplamiento de las celulas con una superficie ngida), o diferenciacion osteogenica (que parece requerir induccion tanto qmmica como un sustrato ngido). La estimulacion de celulas cultivadas en geles blandos con factores de diferenciacion adipogenicos da como resultado en una realizacion un numero notablemente alto de celulas que acumulan gotas de lfpidos. En una realizacion, se requiere induccion qmmica para la diferenciacion de osteoblastos. El requisito de estimulacion mecanica y qmmica sincronizada explica, en una realizacion, como las CMM humanas pueden compartimentalizarse en tejidos compatibles, tales como medula osea, y aun asf resistir a la diferenciacion espontanea.

Como la elasticidad de la matriz, en otra realizacion, la eleccion de ligando extracelular afecta en gran medida a la adhesion y diferenciacion de CMM humanas. Se encuentra colageno de tipo I en una diversidad de tejidos incluyendo hueso y tejido adiposo, y se usa regularmente como un sustrato para experimentos de adhesion celular. En una realizacion, en gel de 250 Pa, el colageno solo no garantiza la adhesion eficaz de una mayona de celulas. En una realizacion, una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina a una relacion de 10:1 proporciona la mejor adhesion de las celulas a los geles de 250 Pa sin afectar al potencial de diferenciacion.

Las CMM humanas tienen la capacidad de remodelar su microambiente alterando la expresion de metaloproteasas de matriz y esto ayuda en una realizacion a promover la diferenciacion eficaz despues de obtener una adhesion inicial fuerte.

En una realizacion, la smtesis de ADN en CMM humanas se reduce drasticamente cuando estas se cultivan en geles blandos, desarrollando un fenotipo redondo. Esto se diferencia de otros tipos de celulas proliferativas tales como fibroblastos NIH 3T3, celulas endoteliales aorticas bovinas y celulas epiteliales NRK que continuan dividiendose todas cuando se cultivan en geles blandos. Por tanto, la quiescencia de celulas madre en geles de 250 Pa no es una insuficiencia de citocinesis inducida por forma general, sino que mas bien es una sensibilidad espedfica a estas celulas a la conformidad de sustrato. Por consiguiente, en el presente documento se describe un metodo para mantener celulas madre en un estado quiescente, que comprende suspender las celulas madre en un gel de fibronectina/colageno que tiene G' de 250 Pa.

En una realizacion, cuando las CMM humanas no proliferativas se presentan con un sustrato de vidrio recubierto con matriz de gel proteico, las celulas desarrollan una morfologfa fusiforme y vuelven a entrar en el ciclo celular. En otra realizacion, la presencia de un sustrato ngido anula las senales ffsicas de una matriz conforme. En una realizacion,

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no esta presente una poblacion significativa de celulas que muestre un fenotipo neuronal con protuberancias de tipo neurita en geles blandos de 250 Pa sin ninguna induccion qmmica.

En una realizacion, la elasticidad del sustrato regula la diferenciacion de celulas con fenotipos espedficos. En otra realizacion, las propiedades mecanicas solas no dirigen la diferenciacion de celulas madre. Esto se debe a que varios tejidos en el organismo tienen elasticidades similares. Por ejemplo, todos los tejidos cerebral, graso y de medula osea, tienen un modulo de almacenamiento de aproximadamente 200 Pa, aunque todos mantienen poblaciones unicas de celulas. En una realizacion, se almacenas CMM humanas in vivo en la medula osea de un individuo durante decadas y aun conservan multipotencialidad. En una realizacion, se cultivan CMM humanas ex vivo en plastico de cultivo tisular ngido y conservan multipotencialidad durante varios pases. En una realizacion se integran estfmulos tanto mecanicos como qmmicos por la celula para determinar su respuesta. En otra realizacion, aunque los estfmulos qmmicos pueden anular las influencias de las mecanicas del sustrato, en otras realizaciones, un ambiente mecanico inapropiado evita una respuesta celular normal a agonistas qmmicos. En una realizacion, las celulas quiescentes se diferencian en osteoblastos solamente como resultado del cambio de su ambiente tanto ffsico como qmmico a los que estimulan la osteogenesis. Por consiguiente y en una realizacion, una matriz con elasticidad apropiada tiene la capacidad de mantener una poblacion quiescente de celulas madre mesenquimales de medula osea multipotenciales que responden a estfmulos tanto mecanicos como qmmicos que conducen la proliferacion y diferenciacion.

La Figura 14 ilustra un diagrama de flujo para preparar una realizacion de un sistema para inducir quiescencia, diferenciacion y proliferacion en celulas madre adultas de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion. Se prepara soluciones de acrilamida y bisacrilamida en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) hasta un volumen total de 500 pl. En una realizacion, el ajuste de la concentracion de acrilamida y bisacrilamida permite obtener un amplio intervalo de rigidez. La polimerizacion se inicia con TEMED (N,N,N',N'- tetrametilendiamina) y persulfato de amonio para formar un gel. En la etapa 601, solucion de acrilamida/bisacrilamida (poliacrilamida), se deposita una gota (por ejemplo, aproximadamente 200 pl) del gel polimerizado en un cubreobjetos de vidrio previamente modificado con 3- aminopropiltrimetoxisilano y glutaraldehido. En la etapa 602, recubrimiento con N- hidroxisuccinimida en tolueno, se aplican aproximadamente 15 pl de ester de N-hidroxisuccinimida de acido acnlico 2 % en tolueno a la solucion de la etapa 601 y, en la etapa 603, cubreobjetos superior, un cubreobjetos clorosilanizado se coloca sobre la gota. En la etapa 604, retirada de cubreobjetos, el cubreobjetos superior se retira despues de completarse la polimerizacion y, opcionalmente, el gel se ilumina con luz ultravioleta durante aproximadamente 10-15 minutos (no mostrado). En la etapa 605, ligando de MEC, se hace reaccionar acrilato de N-succinimida en la parte superior del gel con un ligando de matriz extracelular, que en una realizacion es una mezcla de 0,1 mg/ml de colageno de tipo I y 0,02 mg/ml de fibronectina. En una etapa adicional (no representada), los geles se lavan tres veces con PBS y se dejan en PBS hasta la etapa 606, celulas en gel, cuando se siembran celulas madre en las celulas. Cuando se siembran celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea en este material, las celulas se vuelven quiescentes incluso en presencia de estfmulos qmmicos que provocan proliferacion o diferenciacion.

Por consiguiente, en el presente documento se describe un metodo para inducir o mantener la quiescencia y sostener la actividad biologica en una celula madre somatica ex vivo que comprende: poner en contacto la celula madre somatica con una matriz de gel que comprende un material extracelular que se une con integrina en la membrana de la celula madre somatica; teniendo dicha matriz de gel una elasticidad sustancialmente similar a la elasticidad del microambiente biologico predominante in vivo de la celula madre somatica del mismo tipo in vivo; y proporcionar a la celula madre somatica material nutriente para sostener la actividad biologica de la celula madre somatica ex vivo.

En un metodo de la presente invencion, una celula madre puede ponerse en contacto con MEC apropiado de diversas maneras. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria descriptiva, el MEC puede formar una capa acoplada al sustrato, y la celula madre puede colocarse en el MEC. Como alternativa, la celula puede colocarse en MEC acoplado al sustrato y adicionalmente ponerse en contacto con MEC colocado en la celula, por ejemplo, colocando en la celula una estructura que acopla MEC con un sustrato que presenta la elasticidad aparente apropiada para la celula madre.

En otra realizacion, puede haber dos formulaciones de MEC: una primera formulacion, que puede incluir o no materiales nutrientes, que se acoplan con el sustrato; y una segunda formulacion que incluye materiales nutrientes y que no se acoplan con el sustrato. En la presente memoria descriptiva se describen estructuras y configuraciones para poner en contacto celulas madre con un MEC apropiado (incluyendo sustratos y, opcionalmente, materiales de enlace para unir el sustrato con el MEC), incluyendo, por ejemplo, la Figura 6, y son obvios para un experto en la tecnica a la luz de la presente memoria descriptiva.

En realizaciones de los metodos de la presente invencion, una celula madre que no esta en un estado quiescente se pone en contacto con MEC de acuerdo con metodos de la presente invencion de tal manera que se induce la quiescencia en la celula y pasa de un estado no quiescente a un estado quiescente. En otras realizaciones, una celula madre quiescente se pone en contacto con MEC de acuerdo con metodos de la presente invencion de tal manera que la quiescencia se mantenga en la celula y no pase a un estado quiescente.

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Por consiguiente, en el presente documento se describe un metodo para modular el desarrollo de una celula madre mesenquimal, que comprende la etapa de suspender la celula madre mesenquimal en una matriz de gel que comprende un agente gelificante en el que dicha matriz de gel se recubre con un colageno de tipo I, una fibronectina, o una combinacion de los mismos y en el que dicha matriz de gel se mantiene a una rigidez predeterminada; y exponer la matriz de gel a un factor de crecimiento modulador, por lo que la exposicion al producto qmmico o factor ffsico da como resultado un aumento de la rigidez de la matriz de gel que coincide con la rigidez del MEC en el microambiente en el cual se pretende diferenciar la celula madre mesenquimal.

En otra realizacion, mas del 80 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 80 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 70 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 70 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 75 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 75 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 82 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 82 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 85 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 85 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 87 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 87 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 90 % de las celulas estan detenidas en ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 90 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 92 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 92 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 93 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 93 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 94 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 94 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 95 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 95 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 96 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 96 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 97 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 97 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 98 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 98 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, mas del 99 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. En otra realizacion, al menos el 99 % de las celulas estan detenidas en el ciclo celular. Cada posibilidad representa realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la replicacion se reduce en 50 % en relacion con la replicacion en una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 60 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 65 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se

reduce en 70 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 75 % en

relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 80 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 85 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 90 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 95% en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la

replicacion se reduce en 97 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se

reduce en 98 % en relacion con una placa de cultivo tisular. En otra realizacion, la replicacion se reduce en 99 % en

relacion con una placa de cultivo tisular. Cada posibilidad representa realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un metodo de la presente invencion comprende adicionalmente la etapa de sembrar posteriormente (por ejemplo, despues de cultivar en presencia de un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion) la poblacion de celulas madre mesenquimales en un aparato de cultivo tisular. En otra realizacion, el aparto de cultivo tisular contiene medio de induccion. En otra realizacion, la etapa de siembra posterior se realiza con induccion qmmica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En el presente documento tambien se describe un metodo para estudiar la proliferacion o diferenciacion de una celula madre mesenquimal que comprende la etapa de cultivar la celula madre mesenquimal en un gel o una matriz de gel con una rigidez en un intervalo de 150-750 Pa, estudiando por lo tanto la proliferacion o diferenciacion de una celula madre mesenquimal.

La poblacion de adipocitos de los metodos de la presente invencion es, en otra realizacion, una poblacion que comprende adipocitos. En otra realizacion, la poblacion se enriquece con respecto a adipocitos. En otra realizacion, la poblacion es una poblacion de adipocitos parcialmente purificada. En otra realizacion, los adipocitos se afslan de una fuente biologica, seguido de una etapa de purificacion o enriquecimiento. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se realiza despues de cultivo. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se realiza despues de cultivo y de una etapa de purificacion o enriquecimiento. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

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En otra realizacion, la poblacion celular de los metodos de la presente invencion se cultiva en presencia de un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion. En otra realizacion, la poblacion celular se cultiva en el gel o matriz de gel. En otra realizacion, la poblacion celular se cultiva en el gel o matriz de gel. En otra realizacion, la poblacion celular se cultiva en un aparato de cultivo tisular que contiene el gel o la matriz de gel. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion “poblacion de celulas madre mesenquimales” se refiere a una poblacion que comprende celulas madre mesenquimales (CMM). En otra realizacion, la poblacion se enriquece con respecto a CMM. En otra realizacion, la poblacion es una poblacion de CMM parcialmente purificada. En otra realizacion, las CMM se afslan de una fuente biologica, seguido de una etapa de purificacion o enriquecimiento. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se realiza despues de cultivo. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se realiza despues de cultivo y de una etapa de purificacion o enriquecimiento. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, las celulas “mesenquimales” de los metodos de la presente invencion se afslan o purifican de medula osea. En otra realizacion, las celulas son celulas madre mesenquimales derivadas de medula osea. En otra realizacion, las celulas se afslan o purifican de tejido adiposo. En otra realizacion, las celulas se afslan o purifican de cartflago. En otra realizacion, las celulas se afslan o purifican de cualquier otro tejido conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

Un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion tienen un modulo de cizalla de 150-750 Pa.

En otra realizacion, un gel o una matriz de gel de los metodos y composiciones de la presente invencion tienen una rigidez equivalente a la de un tejido biologico. En otra realizacion, el tejido biologico es medula osea. En otra realizacion, el tejido biologico es tejido graso. En otra realizacion, el tejido biologico es cualquier otro tejido biologico conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En una realizacion, la matriz de gel descrita en el presente documento es capaz de formar geles de diversas fuerzas, dependiendo de su estructura y concentracion asf como, en otra realizacion, de factores ambientales tales como fuerza ionica, pH y temperatura. La viscosidad y el comportamiento del gel combinados denominado “viscoelasticidad” en una realizacion, se examinan determinando el efecto que tiene una fuerza oscilante en el movimiento del material. En otra realizacion el modulo elastico (G'), modulo viscoso (G”) y viscosidad compleja (n*) son los parametros que se busca cambiar usando los metodos descritos en el presente documento, y estos se analizan en otra realizacion modificando la tension o presion de forma armonica con el tiempo (Tabla 1). Estos parametros derivan del modulo complejo (G*), que es la relacion de tension maxima frente a presion maxima, y el angulo de fase (5), que es el angulo en el que estan fuera de fase la tension y la presion.

Tabla^i=Relaci6n=enfr;e=m6djulos=dinamicosianguto=deJ;aseJ6)=yjrecuenciaJw)

Termino: Sfmbolo Definicion Informacion proporcionada

Modulo complejo: G* [(G')2 + (G” )2]0,5 Todas las caractensticas viscoelasticas

Modulo elastico, modulo de almacenamiento: G' G* cos 5 Energfa almacenada por cada ciclo de deformacion; comportamiento de tipo solido o elastico

Modulo viscoso, modulo de perdida: G” G* sin 5 Energfa disipada por ciclo de deformacion; comportamiento de tipo lfquido o viscoso

Viscosidad compleja: n* G*/o> Flujo viscoelastico

En una realizacion, en las matrices de gel descritas en el presente documento, parte de la deformacion provocada por tension de cizalla es elastica y volvera a cero cuando se retire la fuerza. La deformacion restante, tal como la deformacion creada por el desplazamiento deslizante de las cadenas a traves del disolvente en una realizacion, no volvera a cero cuando se retire la fuerza. Bajo una fuerza constante, el desplazamiento elastico permanece constante en una realizacion, mientras que el desplazamiento deslizante continua, aumentando de este modo.

En una realizacion, el termino “elastico” o “elasticidad”, y terminos similares se refieren a una propiedad ffsica de las matrices de gel descritas en el presente documento, concretamente la deformabilidad del gel bajo fuerza mecanica y la capacidad de la matriz de gel para conservar su forma original cuando se retire la fuerza deformante. En otra realizacion, la expresion “modulo elastico” se refiere al modulo de Young y es una medida de la relacion de (a) la tension uniaxial a lo largo de un eje del material con respecto a (b) la tension normal adjunta a lo largo de ese eje.

El modulo de cizalla (resultante de la tension cambiante) es la relacion de la tension de cizalla con respecto a la presion de cizalla. A partir de la relacion compleja similar a la anterior se deduce que:

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donde G* es el modulo de cizalla complejo, G' es el modulo de almacenamiento en fase, i es un factor relacionado con el material y G” es el modulo de perdida dirigido de forma similar fuera de fase; G* = E (G'2 + G”2). La frecuencia con la que estos parametros se cruzan corresponde a un tiempo de relajacion (t) espedfico del material.

En una realizacion, las propiedades viscoelasticas lineales de las matrices de gel descritas en el presente documento se determinan por mediciones en un flujo de cizalla oscilante a amplitud pequena y con frecuencia angular variable. Los valores para G' y G” se determinan en gran medida aqu por la concentracion de los derivados de celulosa en la solucion acuosa y la magnitud del valor de viscosidad representativo. Por lo tanto, en lo sucesivo en el presente documento, solamente se considera la evolucion relativa de G' y G” con frecuencia angular (w) creciente. En otra realizacion, a una concentracion de 1,5 a 2 % (p/p) de derivado de celulosa de solucion acuosa y a una temperatura de aproximadamente 20 °C, el comportamiento de G' y G” para los derivados de celulosa es tal que a una frecuencia angular (w) baja, el modulo de almacenamiento G' es menor que el modulo de perdida G”, pero con el aumento de la frecuencia angular G' aumenta mas que G”. En otra realizacion, G', por encima de una cierta frecuencia angular, finalmente se hace mayor que G”, y la solucion a valores altos de frecuencia angular reacciona por lo tanto predominantemente de forma elastica. Este comportamiento se atenua o cambia usando los metodos de modulacion descritos en el presente documento.

En otra realizacion, el termino “elasticidad” se refiere a la propiedad ffsica de un material que define su capacidad para deformarse por tension, sea la deformacion reversible o no. Como se usan en la presente memoria descriptiva, la elasticidad y la rigidez estan inversamente relacionadas y la elasticidad (rigidez) de un material puede medirse usando un reometro de espectrometro de fluidos RFS III, disponible en Rheometrics, Piscataway, NJ, usando una presion de cizalla oscilante del 2% a una frecuencia de 10 radianes por segundo. La elasticidad y otras 10 propiedades reologicas de las celulas y de otros tejidos fisiologicos puede medirse usado cualquiera de una diversidad de metodos conocidos por los expertos en la materia. Dichos metodos pueden implicar el uso de reometros o microscopios de fuerza atomica, como ejemplo (vease, por ejemplo, Engler AJ, Rehfeldt F, Sen S, Discher DE, "Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation," Methods Cell Biol. 2007;83:521-45; 15 Yeung T, Georges PC, Flanagan LA, Marg B, Ortiz M, Funaki M, Zahir N, Ming W, Weaver V, Janmey PA, "Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion," Cell Motil Cytoskeleton. Ene 2005; 60(1): 24-34.).

En una realizacion, la expresion “viscosidad intrmseca” ([n*]) se refiere al Kmite de la viscosidad reducida extrapolada a concentracion cero. Al igual que la viscosidad reducida, tiene unidades de concentracion redproca, por ejemplo, ml g-1.

En una realizacion, la rigidez o dureza, se refiere a los valores de G' observados o medidos.

En otra realizacion, un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion se recubren con una solucion que comprende una protema de adhesion. En otra realizacion, la protema de adhesion es un colageno. En otra realizacion, la protema de adhesion es un colageno de tipo I. En otra realizacion, la protema de adhesion es una fibronectina. En otra realizacion, la protema de adhesion es cualquier otra protema de adhesion conocida en la tecnica. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel se recubren con una solucion que comprende una combinacion de protemas de adhesion. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel se recubren con una solucion que comprende un colageno y una fibronectina. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel se recubre con una solucion que comprende un colageno de tipo I y una fibronectina. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el colageno de LOS metodos de la presente invencion es un colageno recombinante. En otra realizacion, el colageno se purifica de una fuente biologica. En otra realizacion, el colageno es un colageno de tipo I. En otra realizacion, el colageno es cualquier otro tipo de colageno conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la fibronectina de los metodos de la presente invencion es una fibronectina recombinante. En otra realizacion, la fibronectina se purifica de una fuente biologica. En otra realizacion, la fibronectina es una fibronectina de tipo I. En otra realizacion, la fibronectina es cualquier otro tipo de fibronectina conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

El agente gelificante de los metodos de la presente invencion es, en otra realizacion, una acrilamida. En otra realizacion, el agente gelificante es una mezcla de acrilamida-bisacrilamida. En otra realizacion, el agente gelificante comprende acrilamida. En otra realizacion, el agente gelificante comprende una mezcla de acrilamida-bisacrilamida. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un gel de acrilamida de los metodos de la presente invencion tiene una relacion de acrilamida:bisacrilamida de entre 100:1 y 30:1. En otra realizacion, el gel de acrilamida se prepara a partir de una solucion que tiene una relacion de acrilamida:bisacrilamida de entre 100:1 y 30:1. En otra realizacion, la relacion es de entre 100:1 y 20:1. En otra realizacion, la relacion de acrilamida:bisacrilamida es de entre 100:1 y 40:1. En otra realizacion, la relacion es entre 100:1 y 50:1. En otra realizacion, la relacion es entre 100:1 y 60:1. En otra

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realizacion, la relacion es entre 100:1 y 70:1. En otra realizacion, la relacion es entre 120:1 y 30:1. En otra

realizacion, la relacion es entre 120:1 y 40:1. En otra realizacion, la relacion es entre 120:1 y 50:1. En otra

realizacion, la relacion es entre 120:1 y 60:1. En otra realizacion, la relacion es entre 120:1 y 70:1. En otra

realizacion, la relacion es entre 90:1 y 20:1. En otra realizacion, la relacion es entre 90:1 y 30:1. En otra realizacion,

la relacion es entre 90:1 y 40:1. En otra realizacion, la relacion es entre 90:1 y 50:1. En otra realizacion, la relacion es entre 90:1 y 60:1. En otra realizacion, la relacion es entre 80:1 y 20:1. En otra realizacion, la relacion es entre 80:1 y 30:1. En otra realizacion, la relacion es entre 80:1 y 40:1. En otra realizacion, la relacion es entre 80:1 y 50:1.

En otra realizacion, la relacion es 30:1. En otra realizacion, la relacion es 20:1. En otra realizacion, la relacion es 25:1. En otra realizacion, la relacion es 35:1. En otra realizacion, la relacion es 40:1. En otra realizacion, la relacion es 45:1. En otra realizacion, la relacion es 50:1. En otra realizacion, la relacion es 55:1. En otra realizacion, la relacion es 60:1. En otra realizacion, la relacion es 65:1. En otra realizacion, la relacion es 70:1. En otra realizacion, la relacion es 75:1. En otra realizacion, la relacion es 80:1. En otra realizacion, la relacion es 85:1. En otra realizacion, la relacion es 90:1. En otra realizacion, la relacion es 95:1. En otra realizacion, la relacion es 100:1.

Cada relacion de acrilamida:bisacrilamida representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un gel de acrilamida de los metodos de la presente invencion tiene una concentracion de acrilamida total de 3-5 %. En otra realizacion, el gel de acrilamida se prepara a partir de una solucion que tiene una concentracion de acrilamida total de 3-5 %. En otra realizacion, la concentracion de acrilamida total es del 2 %. En otra realizacion, la concentracion es del 2,5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 3 %. En otra realizacion, la concentracion es del 3,5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 4 %. En otra realizacion, la concentracion es del 4,5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 5,5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 6 %. En otra realizacion, la concentracion es del 2-5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 2,5 a 5%. En otra realizacion, la concentracion es del 3,5 a 5%. En otra realizacion, la concentracion es del 2-4 %. En otra realizacion, la concentracion es del 2-4,5 %. En otra realizacion, la concentracion es del 2-5 %. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el agente gelificante de los metodos de la presente invencion es una protema fibrina. En otra realizacion, el agente gelificante es una protema de fibrinogeno. En otra realizacion, el fibrinogeno esta desprovisto de factores de coagulacion. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la concentracion de la protema de fibrina o fibrinogeno recombinante en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion es 3-10 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3-12 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3-9 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3-8 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3-7 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3-6 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-12 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-10 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-9 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-8 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-7 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2-6 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4-12 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4-10 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4-9 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4-8 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4-7 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 5-12 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 5-10 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 5-9 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 5-8 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 2,5 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 3,5 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 4,5 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 5 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 6 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 7 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 8 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 9 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 10 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 11 mg/ml. En otra realizacion, la concentracion es 12 mg/ml. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, una protema fibrina o fibrinogeno de los metodos de la presente invencion es una protema fibrina o fibrinogeno de un animal heterotermo. En otra realizacion, la protema fibrina o fibrinogeno es una protema fibrina o fibrinogeno de un animal homeotermo. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de un pez. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de un salmon. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de cualquier otro pez conocido en la tecnica. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de cualquier otro heterotermo conocido en la tecnica. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de un mairnfero. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es fibrina o fibrinogeno humano. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es fibrina o fibrinogeno bovino. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de cualquier otro mamffero conocido en la tecnica. En otra realizacion, la fibrina o el fibrinogeno es de cualquier otro homeotermo conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el agente gelificante es agarosa. En otra realizacion, el agente gelificante es agar. En otra realizacion, el agente gelificante es un glucosaminoglicano. En otra realizacion, el agente gelificante es un colageno. En otra realizacion, el agente gelificante es carragenina. En otra realizacion, el agente gelificante es carragenano. En otra realizacion, el agente gelificante es goma de algarrobo. En otra realizacion, el agente gelificante es glicerina. En

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otra realizacion, el agente gelificante de los metodos de la presente invencion es cualquier otro agente gelificante conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el gel o la matriz de gel de los metodos de la presente invencion es un gel o una matriz de gel bidimensional. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel es un gel o una matriz de gel tridimensional. En otra realizacion, el gel o la matriz de gel es cualquier otro tipo de gel o matriz de gel conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion comprende ademas un suero animal. En otra realizacion, el suero animal es un suero bovino fetal. En otra realizacion, el suero animal es un suero de ternero bovino. En otra realizacion, el suero animal es un suero de caballo. En otra realizacion, el suero animal es cualquier otro tipo de suero animal que contenga factor de crecimiento conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion comprende ademas un inhibidor de proteasa.

En otra realizacion, un inhibidor de proteasa de los metodos de la presente invencion inhibe la funcion de una peptidasa. En otra realizacion, el inhibidor de proteasa es una protema. En algunas realizaciones, el inhibidor de proteasa es un inhibidor de cistema proteasa, un inhibidor de serina proteasa (serpina), un inhibidor de tripsina, un inhibidor de treonina proteasa, un inhibidor de proteasa aspartica o un inhibidor de metaloproteasa. En otra realizacion, un inhibidor de proteasa es un inhibidor suicida, un inhibidor de estado de transicion o un agente quelante.

En otra realizacion, el inhibidor de proteasa es inhibidor de tripsina de soja (SBTI). En otra realizacion, el inhibidor de proteasa es AEBSF-HCl. En otra realizacion, el inhibidor es acido (epsilon)-aminocaproico. En otra realizacion, el inhibidor es (alfa) 1-antiquimotripsina. En otra realizacion, el inhibidor es antitrombina III. En otra realizacion, el inhibidor es (alfa) 1 -antitripsina (inhibidor de [alfa] 1-proteinasa). En otra realizacion, el inhibidor es APMSF-HCl (sulfonil fluoruro de 4-amidinofenil-metano). En otra realizacion, el inhibidor es esprotinina. En otra realizacion, el inhibidor es benzamidina-HCl. En otra realizacion, el inhibidor es quimostatina. En otra realizacion, el inhibidor es DFP (diisopropilfluoro-fosfato). En otra realizacion, el inhibidor es leupeptina. En otra realizacion, el inhibidor es PEFABLOC® SC (clorhidrato de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonil fluoruro). En otra realizacion, el inhibidor es PMSF (fenilmetil sulfonil fluoruro). En otra realizacion, el inhibidor es TLCK (1-cloro-3-tosilamido-7-amino-2-heptanona HCl). En otra realizacion, el inhibidor es TPCK (1-cloro-3-tosilamido-4-fenil-2-butanona). En otra realizacion, el inhibidor es inhibidor de tripsina de clara de huevo (ovomucoide). En otra realizacion, el inhibidor es inhibidor de tripsina de soja. En otra realizacion, el inhibidor es aprotinina. En otra realizacion, el inhibidor es pentamidina isetionato. En otra realizacion, el inhibidor es pepstatina. En otra realizacion, el inhibidor es guanidinio. En otra realizacion, el inhibidor es alfa2-macroglobulina. En otra realizacion, el inhibidor es un agente quelante de cinc. En otra realizacion, el inhibidor es yodoacetato. En otra realizacion, el inhibidor es cinc. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la cantidad de inhibidor de proteasa que se utilia en los metodos de la presente invencion es 0,1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,3 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,4 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,6 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,8 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 1,5 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 2,5 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 3 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 5 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 7 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 10 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 12 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 15 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 30 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 50 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 70 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 100 mg/litro.

En otra realizacion, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,1-1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,2-1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,3-1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,5-1 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,1-2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,2-2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,3-2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 0,5-2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 1-2 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 1-10 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 2-10 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 3-10 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 5-10 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 1-20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 2-20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 3-20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 5-20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 10-20 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 10-100 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 20-100 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 30-100 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 50-100 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 10-200 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 20-200 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 30-200 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 50-200 mg/litro. En otra realizacion, la cantidad es 100-200 mg/litro.

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En otra realizacion, la cantidad de inhibidor de proteasa que se utiliza en los metodos de la presente invencion es 1000 u.i.k. (unidades inactivadoras de kalicrema)/litro. En otra realizacion, la cantidad es 10 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 12 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 15 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 20 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 30 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 40 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 50 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 70 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 100 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 150 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 200 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 300 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 500 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 700 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 1500 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 3000 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 4000 u.i.k./litro. En otra realizacion, la cantidad es 5000 u.i.k./litro

Cada cantidad del inhibidor de proteasa representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la proteasa a la que se dirige el inhibidor de proteasa de los metodos de la presente invencion es una seria proteasa. En otra realizacion, la proteasa es tripsina. En otra realizacion, la proteasa es quimotripsina. En otra realizacion, la proteasa es carboxipeptidasa. En otra realizacion, la proteasa es aminopeptidasa. En otra realizacion, la proteasa es cualquier otra proteasa que actue en el duodeno o en el intestino delgado. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

La poblacion de celulas madre mesenquimales de los metodos de la presente invencion es, en otra realizacion, una poblacion de celulas madre mesenquimales adultas. En otra realizacion, la poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales juveniles. En otra realizacion, la poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales infantiles. En otra realizacion, la poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales fetales. En otra realizacion, la poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales humanas. En otra realizacion, la poblacion de celulas madre mesenquimales es de cualquier animal conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre hematopoyetica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es un adipocito. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora endotelial. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre neural. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora residente en tejido adulto. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora pancreatica residente en tejido adulto. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula beta nativa regenerativa. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre gastrointestinal. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre epitelial hepatopancreatica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre epidermica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre epitelial intestinal. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre retiniana. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre epitelial neuronal. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre muscular. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre endotelial. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula madre de sangre periferica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es cualquier otro tipo de celula madre conocido en la tecnica

En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora condrogenica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora adipogenica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora del estroma de la medula. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora miogenica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora osteogenica. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula progenitora de tendon. En otra realizacion, el tipo celular de interes es cualquier otro tipo de celula progenitora conocida en la tecnica.

En otra realizacion, el tipo celular de interes es un tipo celular descendiente. En otra realizacion, el tipo celular de interes es un condrocito. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula del estroma. En otra realizacion, el tipo celular de interes es una celula del miotubo. En otra realizacion, el tipo celular de interes es un osteocito. En otra realizacion, el tipo celular de interes es un tenocito. En otra realizacion, el tipo celular de interes es cualquier otro tipo celular descendiente conocido en la tecnica.

El metodo de la presente invencion comprende la etapa de incubar las celulas madre mesenquimales en un medio de induccion. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de osteoblastos. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre hematopoyeticas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de adipocitos. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras endoteliales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre neurales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras residentes en tejido adulto. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras pancreaticas residentes en tejido adulto. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de

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induccion de las celulas progenitoras beta nativas regenerativas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre gastrointestinales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre epiteliales hepatopancreaticas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre epidermicas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre epiteliales intestinales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre retinianas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre epiteliales neuronales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre musculares. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre endoteliales. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas madre de sangre periferica. En otra realizacion, el medio de induccion es cualquier otro tipo de medio de induccion conocido en la tecnica.

En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras condrogenicas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras adipogenicas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras del estroma de la medula. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras miogenicas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras osteogenicas. En otra realizacion, el medio de induccion es un medio de induccion de celulas progenitoras de tendon. En otra realizacion, el medio de induccion es cualquier otro tipo de celula progenitora conocida en la tecnica.

En otra realizacion, el medio de induccion es cualquier otro tipo de medio de induccion conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

La etapa de cultivo de los metodos de la presente invencion se realiza, en otra realizacion, durante al menos 5 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 4 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 6 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 7 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 8 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 10 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 12 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 15 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 20 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 25 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 30 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 35 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 40 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 50 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante al menos 60 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 4 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 6 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 7 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 8 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 10 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 12 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 15 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 20 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 25 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 30 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 35 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 40 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 50 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 60 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 4 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 6 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 7 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 8 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 10 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 12 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 15 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 20 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 25 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 30 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 35 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 40 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 50 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante 60 dfas. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza durante mas de 60 dfas. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la etapa de mantenimiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion esta precedida de una etapa de cultivo de las celulas madre mesenquimales en un aparato de cultivo tisular. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es un disco. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es una placa. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es un matraz. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es un frasco. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es un tubo. En otra realizacion, el aparato de cultivo tisular es cualquier otro tipo de aparato de cultivo tisular conocido en la tecnica. En otra realizacion, la etapa de cultivo esta precedida de una etapa de cultivo de las celulas madre mesenquimales en medio de cultivo tisular; por ejemplo, no en presencia de un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion. En otra realizacion, la etapa de cultivo de las celulas en un aparato de cultivo tisular o en medio de cultivo tisular se realiza despues del aislamiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales de una muestra biologica. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza despues de purificacion de la poblacion de celulas madre mesenquimales de una muestra biologica. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza despues de enriquecimiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales en una muestra biologica.

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Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, la etapa de cultivo de la poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o en una matriz de gel de los metodos de la presente invencion se realiza directamente despues del aislamiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales de una muestra biologica. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza directamente despues de la purificacion de la poblacion de celulas madre mesenquimales de una muestra biologica. En otra realizacion, la etapa de cultivo se realiza directamente despues del enriquecimiento de la poblacion de celulas madre mesenquimales en una muestra biologica. “Directamente” se refiere, en otra realizacion, a una etapa de cultivo en ausencia de cultivo primero en un aparato de cultivo tisular. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

La poblacion de celulas progenitoras de los metodos de la presente invencion es, en otra realizacion, una poblacion de celulas madre hematopoyeticas. En otra realizacion, la poblacion de celulas progenitoras es una poblacion precursora de celulas endoteliales. En otra realizacion, la poblacion de celulas progenitoras es una poblacion de celulas satelite (por ejemplo, precursores de celulas musculares). En otra realizacion, la poblacion de celulas progenitoras es una poblacion de progenitores neurales amplificadores de transito de la corriente migratoria rostral. En otra realizacion, la poblacion de celulas progenitoras es una poblacion de celulas del estroma de la medula osea. En otra realizacion, la poblacion de celulas progenitoras es cualquier otra poblacion de celulas progenitoras conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

"Poblacion de celulas progenitoras" se refiere, en otra realizacion, a una poblacion que comprende celulas progenitoras. En otra realizacion, la poblacion se enriquece con respecto a celulas progenitoras. En otra realizacion, la poblacion es una poblacion celular progenitora parcialmente purificada. En otra realizacion, las celulas progenitoras se afslan de una fuente biologica, seguida de una etapa de purificacion o enriquecimiento. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se sigue de cultivo. En otra realizacion, el aislamiento de la fuente biologica se sigue de cultivo y una etapa de purificacion o enriquecimiento. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

Tambien se describe en el presente documento un metodo para diferenciar una celula transformada en un tipo celular diferenciado, que comprende la etapa de cultivar la celula transformada en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion, diferenciando de este modo una celula transformada en un tipo celular diferenciado. En otra realizacion, el tipo celular diferenciado es una celula progenitora. En otra realizacion, el tipo celular diferenciado es un tipo celular descendiente. En otra realizacion, el tipo celular diferenciado es un tipo celular tisular. En otra realizacion, el tipo celular diferenciado es uno de los tipos celulares anteriores. En otra realizacion, el tipo celular diferenciado es cualquier otro tipo de tipo celular diferenciado conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En otra realizacion, una celula o poblacion celular preparada por un metodo de la presente invencion se usa para reemplazar tejidos danados en un sujeto. En otra realizacion, una celula o poblacion celular preparada por un metodo de la presente invencion se usa como vehfculo para agentes antineoplasicos (Kassem M, Ann N Y Acad Sci. Mayo 2006; 1067: 436-42). Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En la tecnica se conocen bien metodos para determinar la capacidad proliferativa y fuerza de diferenciacion de celulas madre mesenquimales, y se describen, por ejemplo, en Baxter Ma et al (Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells. 2004; 22(5): 675-82), Liu L et al (Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 10 mar 2004; 294 (1): 1 -8), y Bonab MM et al (Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 10 mar 2006; 7: 14). Cada posibilidad representa otra realizacion de la presente invencion.

En otra realizacion, una ventaja de los metodos de la presente invencion es la falta de inmortalizacion de celulas madre mesenquimales. En otra realizacion, una ventaja es la falta de evolucion de celulas cancerosas de una poblacion de celulas madre mesenquimales. En otra realizacion una ventaja es la conservacion de la capacidad de las celulas diana para diferenciarse en multiples tipos celulares. En otra realizacion, una ventaja es la conservacion de la capacidad proliferativa de las celulas. En otra realizacion, una ventaja es la conservacion de la capacidad de las celulas para apoyar el crecimiento de celulas hematopoyeticas. En otra realizacion, una ventaja es la capacidad de las celulas diana para diferenciarse sin un requisito de inhibicion de contacto. En otra realizacion, la diferenciacion es una consecuencia de la inhibicion de proliferacion. Cada posibilidad representa otra realizacion de la presente invencion.

En el presente documento tambien se describen metodos para inducir la proliferacion de una celula madre somatica quiescente. Se ha descubierto que la puesta en contacto de una celula madre con un material que es menos elastico que la elasticidad del microambiente in vivo de origen natural del mismo tipo de celula madre es eficaz para inducir la proliferacion de la celula madre. Las realizaciones de la divulgacion incluyen por lo tanto poner en contacto la celula madre somatica con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas en la superficie de la membrana celular y que tienen elasticidad aparente para la celula madre menor que la elasticidad del material predominante en el microambiente biologico de una celula madre somatica in vivo del mismo tipo que la celula

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madre somatica. Por ejemplo, la proliferacion de celulas madre quiescentes puede inducirse colocandolas en un portaobjetos de vidrio que tiene una rigidez de mas de 1 gigaPascal (una fraccion pequena de la elasticidad de la mayona de los tipos de tejido humanos o animales) y que se recubre con un material que entra en contacto con las integrinas en la celula. En otras realizaciones, puede inducirse la proliferacion de una celula madre poniendo en contacto la celula con un material aparente para la celula que tiene una elasticidad de menos de 0,1 de la elasticidad del microambiente in vivo natural de la celula madre. En otras realizaciones, puede inducirse la proliferacion poniendo en contacto la celula madre con un material que tiene una elasticidad aparente para la celula madre de menos de aproximadamente 0,5 veces (por ejemplo, de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,5 veces) la elasticidad del microambiente in vivo natural de la celula madre.

En realizaciones, la celula tambien puede estar provista de material de crecimiento de nutrientes, por ejemplo, incluyendo factores de crecimiento y suero, para promover la proliferacion y mantener la actividad biologica de la celula madre y su descendencia ex vivo. Los expertos en la materia conocen la formulacion del material de crecimiento de nutrientes para tipos celulares particulares y no debena ser necesaria ninguna variacion de materiales de crecimiento de nutrientes conocidos para tipos particulares de celulas madre para la practica de este aspecto de la presente invencion.

Al igual que otros aspectos de la presente invencion y de la divulgacion, pueden llevarse a la practica realizaciones de este aspecto inductor de proliferacion con celulas madre, incluyendo CMM. Las CMM pueden recogerse de tejido vivo, como se describe en esta memoria descriptiva, o pueden obtenerse de otras fuentes tales como cultivos in vitro y celulas madre congeladas de forma criogenica. Dichas celulas pueden estar en un estado quiescente de origen natural o en un estado quiescente inducido artificialmente y pueden incluir, por ejemplo, celulas en las que se ha inducido o mantenido la quiescencia usando los metodos de la presente invencion. En consecuencia, las celulas en las que puede inducirse la proliferacion de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento pueden incluir celulas madre mesenquimales (CMM) derivadas de medula osea, celulas madre renales, celulas madre hepaticas, celulas madre derivadas de musculo esqueletico, celulas madre derivadas de hueso, CMM de pulpa dental, CMM derivadas de musculo cardiaco, CMM derivadas de lfquido sinovial, CMM de cordon umbilical y otros tipos de celulas que puede identificar un experto en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva.

La proliferacion de celulas madre de acuerdo con la divulgacion es reversible, permitiendo que se induzcan estados alternos de quiescencia y proliferacion en una celula. Por ejemplo, los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para inducir y mantener la quiescencia en una celula madre, por ejemplo, poniendo en contacto la celula madre con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas en la superficie celular y que tienen elasticidad aparente para la celula aproximadamente igual que la elasticidad del microambiente in vivo de la celula. Despues, puede inducirse la proliferacion en la celula poniendo en contacto la celula con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas y que tienen elasticidad aparente para la celula sustancialmente menor que la elasticidad del microambiente in vivo de la celula. Despues, la quiescencia puede inducirse y mantenerse poniendo el contacto las celulas descendientes resultantes con un material que incluye compuestos de union a integrina y que tiene elasticidad aparente para las celulas aproximadamente igual que el microambiente in vivo de las celulas.

En otra realizacion, la proliferacion de celulas madre se induce en un estado quiescente de acuerdo con un metodo descrito en el presente documento. Despues, puede inducirse que estas celulas quiescentes proliferen, como se ha descrito anteriormente.

La presente invencion proporciona ademas metodos para inducir la diferenciacion de una celula madre somatica en la que la actividad biologica se esta manteniendo y se ha inducido la quiescencia o se esta manteniendo de acuerdo con los metodos de la presente invencion. Las realizaciones de este aspecto de la presente invencion incluyen la etapa de poner en contacto dichas celulas con un material de diferenciacion que comprende estfmulos qmmicos seleccionados para estimular la diferenciacion de las celulas frente a un tipo celular predeterminado y proporcionar a las celulas un material nutriente de celulas diferenciadas para mantener la actividad biologica de las celulas con diferenciacion estimulada. En algunas realizaciones, la etapa de puesta en contacto puede precederse de una etapa que comprende inducir (o permitir) la proliferacion, por ejemplo ex vivo, de la celula madre somatica poniendo en contacto la celula madre con un material que tiene una elasticidad menor que la elasticidad del microambiente natural de la celula diana de diferenciacion pretendida.

Puede inducirse diferenciacion en celulas madre quiescentes o proliferativas mantenidas en actividad biologica de acuerdo con la presente invencion, usando metodos conocidos o evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, si la celula madre es una celula madre mesenquimal derivada de medula osea humana, puede efectuarse diferenciacion de la celula en adipocitos poniendo en contacto la celula con un medio adipogenico (como se analiza en el Ejemplo 1) en un sustrato con una elasticidad de aproximadamente 250 Pa, como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva. Usando informacion que puede obtenerse a partir de esta memoria descriptiva o como se describe en esta memoria descriptiva, con respecto a la reologfa de diversos tipos de tejidos, asf como el medio de diferenciacion a usar para inducir que las celulas madre se diferencien en diversos tipos de celulas, resultana evidente para los expertos en la materia que los metodos de la presente invencion pueden usarse para inducir que una celula madre mesenquimal derivada de medula osea

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humana se diferencie en uno o mas de al menos los siguientes tipos de celulas: osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos, celulas de los islotes beta pancreaticos y celulas neuronales. Mas generalmente, usando informacion sobre reologfa de diversos tipos de tejidos y medios de diferenciacion usados para inducir diferenciacion de diversos tipos de celulas madre en diversos tipos de celulas, resultana facilmente evidente para los expertos en la materia inducir diferenciacion, en cualquiera de los tipos de celulas madre identificados en la presente memoria descriptiva, en uno o mas de un osteoblasto, un condrocito, un miocito, un adipocito, una celula de los islotes beta pancreaticos, una celula neuronal u otro tipo de celula.

En realizaciones de este aspecto de la invencion, las celulas diferenciadas se ponen en contacto con un medio que incluye nutrientes para mantener la actividad biologica de las celulas. Por ejemplo, si se usa un metodo de la presente invencion para inducir que una celula madre mesenquimal derivada de medula osea humana se diferencie en adipocitos, los adipocitos resultantes pueden ponerse en contacto con un medio nutriente para mantener su actividad biologica. El medio nutriente puede comprender DMEM (balo contenido en glucosa), suero bovino fetal e insulina. Otros medios nutrientes, y metodos para poner en contacto celulas diferenciadas con ellos, resultaran evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva.

En el presente documento tambien se describe un sistema artificial para inducir o mantener la quiescencia y la integridad biologica sostenible de una celula madre somatica. En realizaciones, el sistema incluye una sustancia de ligando de material extracelular (MEC) para poner en contacto una celula madre, un material sustrato unido a la sustancia de ligando de MEC y un medio para proporcionar nutrientes a la celula madre y mantener su actividad biologica. Cuando la sustancia de ligando de MeC se une al material de sustrato, tiene elasticidad similar a la elasticidad del material predominante in vivo en el microambiente biologico de una celula madre in vivo del mismo tipo. Las realizaciones del sistema pueden adaptarse para inducir quiescencia en cualquiera de los tipos celulares en los que puede inducirse quiescencia de acuerdo con los metodos de la invencion descritos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, pueden adaptarse realizaciones del sistema para inducir quiescencia en una celula madre somatica o una celula madre embrionaria, una celula madre humana o una celula madre animal, una celula madre mesenquimal (CMM) somatica, una CMM derivada de medula osea, una celula madre renal, una celula madre derivada hepatica, una CMM derivada de musculo esqueletico, una CMM derivada de hueso, una CMM de pulpa dental, una CMM derivada de musculo cardiaco, una CMM derivada de lfquido sinovial o una CMM de cordon umbilical.

En realizaciones, cuando la sustancia de ligando de MEC se une con el sustrato y entra en contacto con una celula madre, el material MEC se une con integrinas en la superficie de la celula madre de manera que induce la entrada en quiescencia de la celula madre, como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva.

En realizaciones de dicho sistema, puede haber un material de union que una el material de ligando de MEC con el material sustrato. Por ejemplo, cuando el material sustrato comprende un gel de poliacrilamida y el MEC comprende una mezcla de colageno - fibronectina, el material de union puede ser NHS, incluyendo espedficamente N- hidroxisuccinimida ester de acido acnlico. Dependiendo de la naturaleza del material sustrato y del material extracelular, los expertos en la materia pueden determinar facilmente materiales de union, que tambien pueden caracterizarse como agentes de reticulacion, para usar para unir el material sustrato y el MEC en diversas realizaciones de sistemas de la presente divulgacion.

En realizaciones, cuando la capa de ligando de MEC se acopla al sustrato, la capa de ligando de MEC tiene elasticidad aparente para la celula madre sustancialmente similar a la elasticidad del material predominante en el microambiente biologico de una celula madre in vivo del mismo tipo que la celula madre que entra en contacto con la capa de ligando de MEC. Esta elasticidad aparente de la capa de ligando de MEC puede ser independiente de, casi independiente de, o dependiente de la elasticidad del sustrato. En realizaciones, la elasticidad del sustrato es sustancialmente similar a la elasticidad del material predominante en el microambiente biologico de una celula madre in vivo del mismo tipo que la celula madre que entra en contacto con la capa de ligando de MEC, y la capa de ligando de MEC presenta a la celula madre sustancialmente la misma elasticidad que la elasticidad del sustrato con el que se acopla.

El sistema artificial descrito en el presente documento puede implementarse usando una diversidad de estructuras. En realizaciones, el material del sustrato forma una matriz, y el MEC se dispersa en la matriz. En realizaciones, un material de union tambien puede dispersarse en la matriz del sustrato para unir el material de la matriz del sustrato con el MEC. Por ejemplo, de acuerdo con una realizacion, una mezcla 5:1 de colageno derivado de colas de rata (0,5 mg/ml) y fibronectina derivada de seres humanos (0,1 mg/ml), y un reticulador de N-hidroxisuccinimida ester de acido acnlico (NHS), se dispersan en un gel de poliacrilamida. El gel se formula de modo que la elasticidad de la estructura sea de aproximadamente 250 Pa. Cuando se ponen en contacto CMM derivadas de medula osea con la estructura de poliacrilamida-NHS-fibronectina-colageno, se induce a que entren en quiescencia. Cuando las CMM que entran en contacto con la estructura tambien estan provistas de material nutriente adecuado, su actividad biologica se mantiene en un estado quiescente.

En realizaciones, el material sustrato forma una capa, y el MEC forma una capa unida, directa o indirectamente, con la capa de sustrato. En otras realizaciones, el material de union forma una capa de union que une la capa de ligando

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de MEC con la capa de sustrato. La capa de union puede actuar para presentar la elasticidad del sustrato a la capa de ligando de MEC de manera que permita que la capa de ligando de MEC presente esa elasticidad a la celula madre en la que se va a inducir quiescencia. En una realizacion, la capa de union incluye composiciones de reticulacion apropiadas y otros materiales que cumplen estas funciones. Por ejemplo, la capa de acoplamiento puede comprender NHS o, en realizaciones espedficas, N- hidroxisuccinimida ester de acido acnlico.

En realizaciones, el material sustrato es un gel de poliacrilamida. Como se conoce en la tecnica, la elasticidad de los geles de poliacrilamida puede ajustarse cambiando las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida en el gel. Resultana evidente para los expertos en la materia, a la luz de la presente memoria descriptiva, como preparar geles de poliacrilamida u otros geles o materiales sustrato para su uso en los sistemas de la presente invencion.

Como resulta evidente adicionalmente a la luz de la presente memoria descriptiva, las realizaciones pueden utilizar otras estructuras. Por ejemplo, puede crearse una estructura casi tridimensional sembrando celulas madre en una capa de MEC como se ha descrito anteriormente, dejando las celulas reposar sobre la capa de MEC sumergiendo el sistema con celulas en medio, y colocando en las celulas otra capa de MEC con elasticidad aparente apropiada, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1.

En otra realizacion, una ventaja de los metodos de la presente invencion es la resistencia de la matriz de gel o gel a degradacion proteolttica. En otra realizacion, una ventaja es la resistencia a la remodelacion activa por las celulas. En otra realizacion, una ventaja es la resistencia de la fibrina heterotermica (por ejemplo, salmon) a proteasas secretadas por neuronas de marnffero en comparacion con fibrina de mamffero (por ejemplo humana o bovina). En otra realizacion, una ventaja es la menor frecuencia de transferencia de enfermedad infecciosa de fibrina heterotermica (por ejemplo, salmon) en comparacion con fibrina de mairnfero (por ejemplo humana o bovina). Cada posibilidad representa otra realizacion de la presente invencion.

En otra realizacion, la celula diana de los metodos de la presente invencion es una CMM inmortalizada.

En el presente documento tambien se describe un metodo para inducir la detencion del crecimiento de una CMM inmortalizada, que comprende la etapa de cultivar la CMM inmortalizada en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion, induciendo de este modo la detencion del crecimiento de una CMM inmortalizada. En otra realizacion, en el presente documento se proporciona un metodo para inhibir el crecimiento de una poblacion de CMM inmortalizada, que comprende la etapa de cultivar la CMM inmortalizada en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion, inhibiendo de este modo el crecimiento de una poblacion de CMM inmortalizada. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En otra realizacion, la celula diana de los metodos de la presente invencion es una celula transformada. En otra realizacion, la celula transformada es una celula de melanoma. En otra realizacion, la celula transformada es cualquier otro tipo de celula transformada conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

Como se proporciona en el presente documento, las celulas M2 mostraron un tamano mas grande y poblaciones celulares mas grandes en sustratos mas ngidos. En otra realizacion, una poblacion celular aumentada es un resultado del crecimiento aumentado de las celulas en sustratos ngidos. En otra realizacion, una poblacion aumentada se debe a la muerte aumentada de celulas en sustratos blandos. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En el presente documento tambien se describe un metodo para inducir la detencion del crecimiento de una celula transformada, que comprende la etapa de cultivar la celula transformada en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion, induciendo de este modo la detencion del crecimiento de una celula transformada. En otra realizacion, en el presente documento se proporciona un metodo para inhibir el crecimiento de una poblacion de celulas transformadas, que comprende la etapa de cultivar la celula transformada en un gel o una matriz de gel de los metodos de la presente invencion, inhibiendo de este modo el crecimiento de una poblacion de celulas transformadas. Cada posibilidad representa una realizacion distinta.

En otra realizacion, un sustrato blando de los metodos de la presente invencion da como resultado un aumento en la forma unida a GDP inactiva de una protema GTP en las celulas diana. En otra realizacion, la protema GTP es Rho. En otra realizacion, la protema GTP es Rac. En otra realizacion, la protema GTP es Cdc42. En otra realizacion, la protema GTP es cualquier otra protema GTP conocida en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, el miembro de la familia Rho senaliza mediante la formacion de adhesiones focales. En otra realizacion, la activacion de Rho inhibe la expresion de p2lWAF1/c1p1. En otra realizacion, la inhibicion de p21 activa las quinasas dependientes de ciclina (CDK). En otra realizacion, la activacion de Rho induce la regulacion negativa y degradacion de p27K1p1, otro inhibidor de CDK. En otra realizacion, la activacion de Rho induce ROCK, dando como resultado la activacion de la ruta Ras-Raf-MEK-ERK. En otra realizacion, esta ruta induce la trascripcion de ciclina D1 mediada por Ras. En otra realizacion, esto induce la progresion de la fase G1. En conjunto, se mostro que la

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activacion de Rho conduda a progresion de la fase G1. En otra realizacion, la activacion de Rac o de Cdc42 regula positivamente la ciclina E1 y ciclina D1, dando como resultado la progresion de la fase G1. En otra realizacion, la activacion de una protema de union a GTP pequena de la familia de Rho da como resultado la transduccion de senal para potenciar la progresion del ciclo celular. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un sustrato blando de los metodos de la presente invencion reduce la contractilidad del sistema de actomiosina de la celula diana. En otra realizacion, esto induce que las celulas diana cesen la proliferacion. En otra realizacion, esto induce que las celulas diana se hagan competentes para estfmulos adicionales para reiniciar la proliferacion. En otra realizacion, esto induce que las celulas diana sean competentes para estimulos adicionales para comprometerse a diferenciacion terminal. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, un sustrato blando de los metodos de la presente invencion induce la activacion de actomiosina. En otra realizacion, el sustrato blando induce actomiosina regulada por Rho. En otra realizacion, el sustrato blando induce miosina II. En otra realizacion, el sustrato blando induce miosina II regulada por Rho. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, una composicion de los metodos de la presente invencion comprende ademas un activador de un miembro de la familia Rho. En otra realizacion, la composicion comprende ademas un inhibidor de un miembro de la familia de Rho. En otra realizacion, el miembro de la familia Rho es Rho. En otra realizacion, el miembro de la familia Rho es Rac. En otra realizacion, el miembro de la familia Rho es Cdc42. En otra realizacion, el miembro de la familia Rho es cualquier otro miembro de la familia Rho conocido en la tecnica. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion. En otra realizacion, la composicion comprende ademas un activador de actomiosina. En otra realizacion, la composicion comprende ademas un inhibidor de actomiosina. En otra realizacion, la composicion comprende ademas un activador de miosina II. En otra realizacion, la composicion comprende ademas un inhibidor de miosina II. Cada posibilidad representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En la tecnica se conocen bien metodos para polimerizar geles de acrilamida. En otra realizacion, se anaden 1,5 pl de TEMED (FisherBiotech CAS n.° 110189) y 5 pl de persulfato de amonio 10 % con la cantidad apropiada de H2O para producir un volumen final de 1.000 pl, la solucion se transfiere con una pipeta a un cubreobjetos y sobre la solucion se coloca un cubreobjetos superior, despues, 10 minutos mas tarde, se desprende. Cada metodo representa una realizacion distinta de la presente invencion.

En otra realizacion, para reticular protemas de adhesion en el gel o la matriz de gel, se utiliza un reticulador heterobifuncional. En otra realizacion, el agente de reticulacion heterobifuncional es sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidil6(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato, Pierce n.° 22589). En otra realizacion, el reticulador heterobifuncional es cualquier otro reticulador heterobifuncional conocido en la tecnica. En otra realizacion, el sulfo- SANPAH se usa de la siguiente manera. Se disuelve sulfo-SANPAH 1 mg/ml en H2O, y con una pipeta, se transfieren 200 pl de esta solucion a la superficie del gel. El gel de poliacrilamida se coloca despues debajo de una lampara de luz ultravioleta a una distancia de 15,24 cm y se irradia durante 10 min. Despues, se lava tres veces, utilizando, en cada lavado, 3 ml de HEPES 200 mM, pH 8,6. Despues de aspirarse la ultima solucion de HEPES, con una pipeta se transfieren 200 pl de una solucion de fibronectina de pez 0,14 mg/ml (Sea Run Holdings, South Freeport, ME) o de colageno de tipo I 0,14 mg/ml sobre el gel de poliacrilamida. La placa multipocillo que aloja los geles se incuba despues a 5°C durante 4 h. Cada metodo representa una realizacion distinta de la presente invencion.

Para ensamblar un sistema como se ha descrito anteriormente o para llevar a cabo de otro modo los metodos de la presente invencion, puede proporcionarse un kit de componentes. En una realizacion, dicho kit incluye como componentes distintos: (1) un sustrato, o materiales para preparar un sustrato; (2) opcionalmente, materiales para preparar y/o aplicar una capa de recubrimiento; y (3) materiales para preparar y/o aplicar material de ligando de MEC para formar una capa de ligando de MEC. El componente del sustrato puede, por ejemplo, comprender un gel de poliacrilamida de una elasticidad predeterminada, un gel de poliacrilamida con materiales para ajustar la elasticidad del gel a una elasticidad o a un intervalo de elasticidades predeterminados, o materiales para preparar un gel u otro sustrato adecuado con la elasticidad deseada. En realizaciones, el kit incluye un dispositivo para montar o sostener el gel para facilitar la aplicacion de la capa de ligando de MEC y opcionalmente una capa de acoplamiento para acoplar el sustrato a la capa de ligando de MEC. Como resulta evidente para los expertos en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva, para facilitar el almacenamiento, el envfo y el ensamblaje de los kits, pueden combinarse diversos componentes de los kit descritos en el presente documento.

Las realizaciones de dicho kit tambien pueden incluir materiales para preparar y/o aplicar la capa de ligando de MEC. Por ejemplo, el kit puede incluir material de ligando de MEC para la aplicacion directa al sustrato. En otras realizaciones, el kit puede incluir componentes individuales o ingredientes del material de la capa de ligando de MEC, con instrucciones para prepararlo y aplicarlo a los otros componentes del kit. Opcionalmente, el kit puede incluir materiales e instrucciones para ensamblar y aplicar una capa de acoplamiento para acoplar el sustrato a la

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capa de ligando de MEC. En una realizacion espedfica, un kit de un sistema descrito en el presente documento para inducir quiescencia en una CMM derivada de medula osea humana incluye lo siguiente:

(a) una placa de Petri de vidrio (u otro aparato para soportar el sustrato y contener el resto de los componentes);

(b) materiales para preparar un gel de poliacrilamida con una dureza de aproximadamente 250 Pa para actuar como el sustrato, incluyendo cantidades apropiadas de acrilamida y bisacrilamida;

(c) reticulador de ester de N-hidroxisuccinimida de acido acnlico (NHS) para aplicar al gel para formar una capa de acoplamiento; y

(d) materiales para preparar una capa de ligando de MEC, incluyendo los materiales identificados en el Ejemplo 1, para preparar un material extracelular de fibronectina-colageno 1:5.

En una realizacion, un kit de la presente divulgacion comprende un gel de poliacrilamida formulado con una elasticidad para inducir quiescencia en celulas madre de un tipo espedfico; una solucion que incluye composiciones de reticulacion para aplicacion al gel; material extracelular formulado para unirse con integrinas en la superficie del tipo de celulas especificado; y, opcionalmente, material nutriente adecuado (que tambien puede preparar los usuarios) para inducir quiescencia en las celulas.

En algunas realizaciones del kit, el kit comprende una capa de material que proporciona tanto elasticidad como ligandos de MEC. En otra realizacion, el kit puede comprender las siguientes tres capas de materiales:

a) un sustrato de gel que confiere elasticidad al sistema;

b) ligandos de MEC; y

c) reticuladores que conectan ligandos de MEC con el sustrato.

En las realizaciones de kits de la presente divulgacion, los componentes del kit se colocan en un receptaculo, tal como una bolsa o envase de plastico que contiene solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas realizaciones, el receptaculo tambien puede contener conservantes tales como azida sodica. Los componentes pueden hidratarse en el kit, por ejemplo, durante el almacenamiento. En algunas realizaciones, el receptaculo se sella y/o se protege con armazones apropiados para evitar que se produzcan danos al sistema. El kit puede expedirse a baja temperatura, tal como a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C.

En las realizaciones de kits de la presente divulgacion, los usuarios pueden abrir el receptaculo y colocar los componentes del kit en un material apropiado, tal como una placa de cultivo tisular. Los usuarios tambien pueden retirar cualquier material duro sobre los componentes para exponer los ligandos de MEC y lavar los componentes con un tampon tal como PBS. Los usuarios pueden despues sembrar celulas en el sistema poniendo una suspension celular que comprende celulas, medio y suero, segun sea necesario.

Los metodos de la presente invencion pueden llevarse a la practica in vivo asf como ex vivo. Dichos sistemas pueden incluir, por ejemplo, estructuras porosas para la insercion en tejidos espedficos o en el sistema circulatorio para mantener una celula madre en quiescencia en el organismo. Por ejemplo, pueden dispersarse celulas madre, MEC correspondientes y, opcionalmente, material de union, en una matriz polimerica que tiene elasticidad apropiada aparente para las celulas madre para inducir o mantener la quiescencia, y que tambien tiene suficiente porosidad para permitir que los nutrientes in vivo alcancen la celula y permitir que las protemas y otros factores expresados por la celula abandonen la matriz. Otras realizaciones pueden incluir casetes u otros dispositivos que inducen o mantienen la quiescencia de las celulas madre, y que pueden implantarse en un hospedador.

En el presente documento tambien se describe una celula madre quiescente mantenida en actividad biologica ex vivo. Los ejemplos de dicha celula madre incluyen una celula madre somatica o una celula madre embrionaria, una celula madre humana o una celula madre animal, una celula madre mesenquimal (CMM), CMM derivadas de medula osea, una celula madre renal, una celula madre derivada hepatica, una CMM derivada de musculo esqueletico, una CMM derivada de hueso, una CMM de pulpa dental, una CMM derivada de musculo cardiaco, una CMM derivada de lfquido sinovial o una CMM de cordon umbilical. En realizaciones, los metodos de la presente invencion se usan para inducir o mantener una celula madre en un estado quiescente, y para mantener la actividad biologica de dichas celulas madre quiescentes.

En consecuencia, en el presente documento tambien se describe un aparato para modular el crecimiento de una celula madre mesenquimal que comprende: una matriz de gel que tiene una rigidez en el intervalo de 150-750 Pa; y un medio de induccion de adipocitos, en el que dicho gel o dicha matriz de gel se recubre con un colageno de tipo I, con una fibronectina o con una combinacion de los mismos.

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En otras realizaciones, los geles y las matrices de gel de cualquiera de los metodos descritos anteriormente tienen cualquiera de las caractensticas de un gel o de una matriz de gel de los metodos de la presente invencion. Cada caractenstica representa una realizacion distinta de la presente invencion.

Seccion de detalles experimentales

Ejemplo 1: Medicion de la rigidez de diversos tejidos y preparacion de geles de poliacrilamida que se aproximan a las rigideces de los tejidos

Materiales y metodos experimentales Preparacion de geles de poliacrilamida

Se prepararon soluciones de acrilamida y bisacrilamida (Fisher Biotech, Loughborough, Leicestershire, UK) que conteman una masa polimerica constante de 7,5 % y concentraciones de bisacrilamida de 0,01 %, 0,03 % o 0,3 % para alterar la rigidez. La acrilamida, bisacrilamida, el persulfato de amonio y la N,N,N',N'-Tetrametilendiamina (TEMED) bajo una capa no acuosa de tolueno que contema N-hidroxisuccinimida ester de acido acnlico 0,5 % (Sigma, St. Louis, MS) se polimerizo entre dos cubreobjetos, modificados qmmicamente de la siguiente manera: 200 pl de NaOH 0,1 N se transfirieron con pipeta para cubrir la superficie de un cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diametro (Fisherbrand, catalog n.° 12-545-102; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) ) durante 5 minutos. La solucion de NaOH se aspiro, y se aplicaron 200 pl de 3-APTMS (3-aminopropiltrimetoxilano, Sigma N° 28-1778, St. Louis, MO) durante 3 min. El portaobjetos de vidrio se aclaro cuidadosamente con agua desionizada para retirar mediante lavado cualquier resto de solucion de 3-APTMS y se anadieron 200 pl de glutaraldehfdo al 0,5 %v (Sigma N° G7651) en H2O sobre el cubreobjetos durante 20 minutos. El cubreobjetos de vidrio se aclaro con agua, se coloco un cubreobjetos de vidrio de 18 mm de diametro en la parte superior de un trozo de parafilm dentro de una placa de cultivo tisular, y se transfirieron con pipeta algunas gotas de una solucion Surfasil al 10 % en volumen (Pierce no. 42800, Pierce, Rockford, IL) en cloroformo sobre el parafilm cerca del cubreobjetos. La placa de cultivo tisular con una tapa medio cerrada se coloco dentro de un evaporador al vacfo durante 10 minutos.

El N-succinimidil acrilato incorporado en la superficie del gel se hizo reaccionar con 0,2mg/ml de laminina (Collaborative Biomedical, Bedford, MA) para producir un recubrimiento uniforme de ligandos adhesivos. Despues de lavar con tampon HEPES para retirar trazas de disolvente no-polimerizado, los pocillos que conteman los geles de poliacrilamida (PA) se cargaron con medio de cultivo y se permitio que se equilibrasen durante una noche a 35 °C.

Caracterizacion viscoelastica de armazones materiales

Los modulos de cizalla dinamica de los geles se midieron en un espectrometro de fluido reometrico III, controlado por tension (Rheometrics, Piscataway, NJ). Una muestra de 500 pl se polimerizo entre dos placas de acero, y el modulo de cizalla G'(w), que describe la resistencia elastica, se calculo a partir de la tension de cizalla en fase con un esfuerzo de cizalla osciladora del 2 %(1 rad/s). Los modulos de cizalla dinamica de los tejidos se midieron de manera similar. Se corto una muestra de 8 mm de diametro usando un punzon de acero inoxidable y se coloco entre las placas. El G' (u>) prolongado se midio por oscilacion a una tension del 2 %y el modulo de cizalla G(t) prolongado se midio aplicando una tension continua al 10 %y permitiendo que la muestra reposara durante 30 segundos.

RESULTADOS

Se prepararon geles de poliacrilamida y se recubrieron con una mezcla de 0,14 mg/ml de colageno de tipo I y 0,14 mg/ml de fibronectina de pez. Ajustando la concentracion de acrilamida y bisacrilamida, se consiguio un amplio intervalo de rigidez (Figura 1A). La rigidez de los geles de poliacrilamida no afecta a la cantidad ni a la distribucion de la matriz extracelular en los geles. Se uso tambien reometna in vitro para determinar las propiedades elasticas de los tejidos relevantes para las celulas madre mesenquimales (Tabla 1). Se prepararon geles de poliacrilamida con G' de 200 Pa (en el presente documento usados como un ejemplo de “geles blandos” y denominados como tal) o 7.500 Pa (en el presente documento usados como un ejemplo de “geles ngidos” y denominados como tal); los geles blandos imitan la rigidez de los tejidos grasos y de medula osea.

Tabla 1. Rigidez de los tejidos. Se obtuvieron tejidos de rata de tres ratas Sprague-Dawlev.

Tejido: Rigidez (Pa)

Medula osea bovina: 225 ± 25

Grasa subcutanea de rata: 157 ± 36

Grasa visceral de rata: 130 ± 40

Hfgado de rata: 403 ± 28

Musculo esqueletico de rata: 2251±166

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Por lo tanto, se prepararon geles de poliacrilamida que imitaban la rigidez de tejidos biologicos. Ejemplo 2: Forma celular y estructura de F-actina de CMMh en geles blandos y ngidos MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Se sembraron de forma dispersa CMMh en geles ngidos o geles blandos recubiertos con colageno de tipo I y fibronectina. Las celulas se incubaron durante 24 horas en DMEM + suero de ternero fetal al 10%, se fijaron y se tineron con faloidina Alexa Fluor 488.

RESULTADOS

Se investigo el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la forma y la estructura de F-actina de CMMh (celulas madre mesenquimales humanas). Las celulas se incubaron en presencia de suero en matrices con diversas rigideces durante 24 horas para permitir la adherencia y la propagacion. Las CMMh sembradas en geles rigidos o vidrio adoptaron una forma ahusada y mostraron fibras de tension y F-actina cortical (como se muestra por tincion con faloidina Alexa Fluor 488), mientras que las celulas sembradas en geles blandos mostraron un aspecto redondeado, caredan de fibras de tension y conteman agregados de F-actina (Figura 1B-C).

Por lo tanto, las CMMh detectan la rigidez de la matriz extracelular, lo que influye en su forma y estructura de F- actina.

Ejemplo 3: Inhibicion de la proliferacion de CMMh en geles blandos.

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Se incubaron CMMh con BrdU (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante una noche en presencia de suero. Las celulas se fijaron y se inmunotineron para BrdU (Invitrogen). Se contaron mas de 50 celulas tres veces en campos elegidos aleatoriamente.

RESULTADOS

Se midio la incorporacion de 5-bromo-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato (BrdU) en CMMh como un marcador de la progresion del ciclo celular (Figura 2). Se sembraron celulas de forma dispersa en geles blandos, geles ngidos o en superficies de vidrio, recubriendose todos ellos con colageno de tipo I y fibronectina. Como control, tambien se prepararon celulas confluyentes en superficies de vidrio. Como se esperaba, las CMMh sembradas de forma dispersa en superficies de vidrio incorporaron eficazmente BrdU, lo que indicaba un alto nivel de proliferacion. Cuando las celulas fueron confluyentes en las superficies de vidrio, muy pocas CMMh incorporaron BrdU debido a una inhibicion por contacto. El 42 % de las CMMh en geles rigidos incorporaron BrdU, lo que indicaba que estaba proliferando una gran poblacion de celulas, aunque significativamente menor que la de las celulas sembradas de forma dispersa en una superficie de vidrio. Por otro lado, ninguna CMMh en geles blandos incorporo BrdU, incluso aunque las celulas fuesen viables como se evaluo por la ausencia de tincion de azul de tripano. Ademas, la incubacion continuada de CMMh sembradas de forma dispersa en matrices produjo una densidad celular diferente dependiendo de la rigidez de las matrices con mayor densidad en matrices mas ngidas.

Por lo tanto, las matrices blandas inhiben la proliferacion de las CMMh incluso en presencia de suero.

Ejemplo 4: Las CMMh en geles blandos son competentes para diferenciarse en adipocitos

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Estudios de diferenciacion de adipocitos

Se sembraron CMMh de suspensiones celulares en placas de cultivo tisular de 96 pocillos recubiertas con colageno de tipo I mas fibronectina a una densidad de 3,5 x 104 celulas/pocillo. Despues de incubar las celulas en DMEM que contema FCS 10% (medio de cultivo, "MC") durante 24 horas, se indujo la diferenciacion de las celulas en adipocitos incubando durante 3 dfas (2 ciclos celulares) en medio de induccion adipogenico (MIA) (MC, dexametasona 1 pM, indometacina 200 pM, insulina 10 pg/ml y metilisobutilxantina 0,5 mM) manteniendo despues en medio de mantenimiento adipogenico (MC, insulina 10 pg/ml). 8 dfas despues de cambiar a MIA, se evaluo la diferenciacion de adipocitos bien por tincion con Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o bien por inmunotincion con respecto a PPARy2 usando anticuerpos contra PPARy2. Se contaron mas de 50 celulas tres veces en campos elegidos aleatoriamente. Los anticuerpos contra PPARy2 los proporciono el Dr. Mitchell A. Lazar, Universidad de Pensilvania.

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RESULTADOS

Para confirmar la viabilidad de las CMMh en geles blandos, se midio su capacidad para diferenciarse en adipocitos de dos maneras; (a) inmunotincion de receptores activados por proliferadores de peroxisoma gamma 2 (PPARy2), uno de los factores de transcripcion clave para la adipogenesis, y (b) tincion con Oil Red O para medir la acumulacion de Kpidos. Cuando se indujo la diferenciacion en adipocitos de CMMh confluyentes en una superficie de vidrio mediante una mezcla de dexametasona, indometacina, 3-isobutil-1-metil-xantina e insulina en medio que contema suero de ternero fetal, aproximadamente el 40 % de las celulas mostraron un fenotipo de adipocito (Figura 3A). Por el contrario, en geles blandos con induccion, la tasa de diferenciacion alcanzo mas del 80 %, significativamente mayor que la de vidrio; sin induccion, no se observo ninguna diferenciacion de adipocitos. Ademas, las CMMh sembradas de forma dispersa en vidrio mostraron un alto nivel de proliferacion (Figura 2) y no se diferenciaron en adipocitos (Figura 3B). Estos resultados indican ademas que las CMMh podnan tener que dejar el ciclo celular como un requisito previo para la diferenciacion terminal.

Por lo tanto, las CMMh sembradas de forma dispersa en geles blandos son completamente viables y son competentes para la diferenciacion de adipocitos.

Ejemplo 5: Estructura de F-actina en astrocitos sembrados en geles ngidos o blandos

Para caracterizar adicionalmente y cuantificar la respuesta de las celulas a la rigidez de la matriz, tambien se ensayo el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la estructura de F-actina en astrocitos. Se aislaron astrocitos primarios de embriones de ratas Sprague-Dawley de la siguiente manera: se extrajeron embriones (E17-E19) por cesarea de una rata Sprague-Dawley con gestacion programada y se retiraron las cortezas. El tejido se digirio con tripsina/DNasa a 37 °C, se centrifugo (1000 g x 5 min), y se filtro para dar una suspension celular. Para cultivos que conteman tanto neuronas como celulas gliales, las celulas se sembraron directamente en placas con sustratos. Se mantuvieron cultivos de astrocitos primarios durante 14 dfas en cultivo con una serie de tripsinizaciones para retirar las neuronas. Los cultivos usados para los experimentos fueron > 98 % de astrocitos como se determino por inmunocitoqmmica de GFAP. Las celulas se cultivaron en una incubadora a 37 °C y con CO2 5 % en medio de Eagle modificado por Dulbecco (BioWhittaker, East Rutherford, NJ) complementado con F12 de Ham (Sigma) y suero bovino fetal al 5 % (Hyclone, Logan, UT) durante 7 dfas seguido de 5 dfas adicionales de cultivo en Neurobasal (Gibco, Carlsbad, CA) tambien complementado con suero bovino fetal al 5 %, 1-glutamina 2 mM, estreptomicina 50 mcg/ml y penicilina 50 unidades/ml.

Las celulas se incubaron en presencia de suero en geles de poliacrilamida ngidos (11 kPa) o blandos (150 Pa) durante 48 horas para permitir la adherencia y propagacion. Las celulas se fijaron, y se visualizo la estructura de F- actina con faloidina. Como se muestra en la Figura 4, se observaron fibras de tension y F-actina cortical en los astrocitos sembrados en geles ngidos. Por el contrario, en astrocitos sembrados en geles blandos, no habfa fibras de tension y solamente se observaron carcasas de actina cortical. Por lo tanto, los astrocitos sembrados en geles blandos detectaron la flexibilidad de la matriz y en consecuencia no mostraron fibras de tension.

Ejemplo 6: Bajo nivel de carga de GTP de RHO en astrocitos sembrados en geles blandos

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Ensayo de extraccion de rhotequina

Las celulas se lavaron con solucion salina tamponada con Tris helada y se lisaron en tampon de RIPA (Tris 50 mM, pH 7,2, Triton X-100 1 %, desoxicolato sodico 0,5 %, SDS 0,1 %, NaCl 500 mM, MgCh 10 mM, 10 pg/ml de cada uno de leupeptina y aprotinina, y PMSF 1 mM). Se clarificaron lisados celulares por centrifugacion a 13.000 x g a 4 °C durante 10 min, y se incubaron volumenes iguales de lisados con perlas de GST-RBD (20 pg) a 4 °C durante 45 min. Las perlas se lavaron 4 veces con tampon B (tampon Tris que contiene Triton X-100 1 %, NaCl 150 mM, MgCh 10 mM, 10 mg/ml de cada uno de leupeptina y aprotinina y PMSF 0,1 mM). Se detectaron protemas Rho unidas por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal contra RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Se realizo analisis densitometrico usando sistema de Alphalmager™ (Alpha Innotech). La cantidad de Rho unido a RBD se normalizo con respecto a la cantidad total de Rho en lisados celulares para la comparacion de la actividad de Rho (nivel de Rho unido a GTP) en muestras diferentes.

RESULTADOS

Para determinar si la perdida de fibras de tension inducida por geles blandos en astrocitos esta asociada o no con la inactivacion de Rho, se sembraron astrocitos en geles de poliacrilamida con diversas rigideces y se incubaron en presencia de suero durante 48 horas. Se prepararon lisados celulares y se ensayo la carga de gTp de Rho usando GST-rhotequina y un ensayo de extraccion de rhotequina. Se calculo la relacion de Rho unido a GTP frente al total. Los astrocitos sembrados en geles blandos mostraron un bajo nivel de Rho unido a GTP (Figura 5), lo que indica la atenuacion de la actividad de Rho en astrocitos sembrados en una matriz blanda, que da como resultado la ausencia de fibras de tension en las celulas.

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Ejemplo 7: Las celulas de melanoma modulan su propagacion. basandose en la rigidez en la matriz extracelular MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Se sembraron de forma dispersa celulas M2 en matrices de diversas rigideces recubiertas con una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina. Despues de 24 horas de incubacion. se midio el area celular delimitando los Kmites celulares. Se contaron mas de 30 celulas 3 veces en campos elegidos aleatoriamente.

RESULTADOS

Para ensayar si las celulas trasformadas modulan su comportamiento de acuerdo con el nivel de rigidez en la matriz extracelular. se midio el efecto de la rigidez sobre la propagacion celular en lmeas celulares de melanoma humano, denominadas celulas M2. Como se muestra en la Figura 6. las celulas M2 mostraron un mayor tamano en sustratos mas ngidos. Por lo tanto, las celulas M2 transformadas tienen una capacidad de modular su comportamiento (por ejemplo. propagacion celular) de acuerdo con las propiedades mecanicas de la matriz.

Ejemplo 8: Cantidad reducida de celulas de melanoma en geles blandos

Para determinar el efecto de la rigidez de la matriz en el tamano de la poblacion de celulas M2. se sembraron celulas M2 en geles blandos o ngidos (el mismo numero en cada uno) y se recubrieron con una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina. Se evaluo la eficacia de la adherencia celular a cada sustrato despues de 24 horas de incubacion en presencia de suero. cuando se adhirieron completamente celulas M2 y proliferaron en ambos geles. Como se muestra en la Figura 7. no hubo diferencias significativas en el numero de celulas adheridas entre geles blandos y ngidos. lo que indica que la rigidez de la matriz no afecta a la adherencia de celulas M2. Despues de una incubacion de 72 horas. aunque se adhirio el mismo numero de celulas a cada sustrato (Figura 7). las 48 horas adicionales de incubacion provocaron una poblacion de celulas significativamente mayor en geles ngidos (Figura 8). No se observo ninguna diferencia observable en el numero de celulas que flotaban en el medio entre geles blandos y ngidos despues de 72 horas de incubacion.

Estos resultados demuestran ademas metodos para cuantificar respuestas de CMMh a sustratos blandos.

Ejemplo 9: Uso de geles blandos para la conservacion prolongada de CMMh sin atenuar la viabilidad y la autorrenovacion

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Se preparan geles de poliacrilamida blandos con G' de aproximadamente 200 Pa recubiertos con una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina en cubreobjetos de vidrio como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se colocan geles de poliacrilamida en placas de 6 pocillos cubiertas con gel de agarosa 1 %. para evitar la adhesion celular fuera de los geles de poliacrilamida. o de los cubreobjetos de vidrio. Se siembran 5 x 104 CMMh de pase 2 en geles de poliacrilamida blandos o directamente en placas de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertas con colageno de tipo I mas fibronectina. y se incuban en DMEM complementado con suero de ternero fetal (FCS) 10%. Se suspenden muestras de CMMh identicas en DMEM que contiene FCS 10 % y dimetilsulfoxido (dMsO) 10 % y se mantienen congeladas en vapor de nitrogeno lfquido de acuerdo con el protocolo convencional (Gordon SL et al. Cryobiology. Sep 2001; 43 (2): 182-7). Despues de alcanzar 90% de confluencia. las celulas que se habfan sembrado directamente en placas de cultivo tisular se tripsinizan y se subcultivan en nuevas placas de cultivo tisular de 6 pocillos a una densidad de 5 x 104 celulas/pocillo. Las celulas en las placas de cultivo tisular se mantienen hasta que alcanzan el pase 10. Las celulas sembradas en geles de poliacrilamida blandos se vuelven a alimentar con DMEm nuevo complementado con FCS 10 % dos veces cada 7 dfas. Cuando las CMMh mantenidas en placas de cultivo tisular alcanzan el pase 10. se descongelan CMMh reservadas en vapor de nitrogeno lfquido para generar una suspension celular.

RESULTADOS

Para determinar la viabilidad de CMMh sometidas a conservacion prolongada en un estado quiescente en geles blandos. se almacenan CMMh en geles blandos hasta que las CMMh mantenidas en placas de cultivo tisular alcanzan el pase 10. La viabilidad de estas celulas se compara con la de las celulas reservadas en vapor de nitrogeno lfquido. Las celulas adheridas a geles blandos o a placas de cultivo tisular se tripsinizan. mientras que las celulas almacenadas en nitrogeno lfquido se descongelan. para generar una suspension celular. La viabilidad se determina por tincion con azul de tripano de las suspensiones celulares. Por lo tanto. el almacenamiento en gel blando es un medio eficaz para mantener la viabilidad de las CMMh.

Para medir la fuerza de proliferacion de las CMMh almacenadas en incubacion prolongada en geles blandos. se preparan celulas que se han mantenido en geles blandos. en placas de cultivo tisular. o que se han mantenido congeladas en vapor de nitrogeno lfquido. y se realiza un ensayo de incorporacion de BrdU volviendo a sembrar celulas de cada fuente en placas de cultivo tisular recubiertas con colageno de tipo I mas fibronectina e incubando

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en presencia de suero y BrdU durante 12 horas. Las celulas se fijan y se inmunotinen con respecto a BrdU incubando celulas con anticuerpos anti-BrdU (Invitrogen).

Ejemplo 10: Uso de geles blandos para la conservacion prolongada de CMMh sin atenuar la diferenciacion MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Ensayos de diferenciacion de osteoblastos

Suspensiones de CMMh de pase 10 se siembran en placas de cultivo tisular de 96 pocillos recubiertas con colageno de tipo I mas fibronectina a una densidad de 103 celulas/pocillo. Despues de incubar las celulas en MC durante 24 horas, se induce la diferenciacion de las celulas en osteoblastos cambiando el medio a medio de induccion osteogenico (MIO) (MC, acido ascorbico-2-fosfato 50 jM, p-glicerofosfato 10 mM, y dexametasona 100 nM), cambiando el medio cada 3 dfas durante 3 semanas. Se evalua la diferenciacion de osteoblastos fijando las celulas con acetona/citrato y tinendo con respecto a actividad fosfatasa alcalina con Fast Blue RR/naftol (Sigma-Aldorich, Kit n.° 85).

RESULTADOS

A continuacion, se mide la fuerza de diferenciacion de CMMh sometidas a conservacion prolongada en un estado quiescente en geles blandos. Se tripsinizan CMMh almacenadas en geles blandos o en placas de cultivo tisular para realizar suspensiones generadas; en paralelo, se preparan suspensiones celulares descongelando las CMMh mantenidas congeladas en nitrogeno lfquido. La diferenciacion de adipocitos se evalua como se ha descrito en el Ejemplo 4.

En estudios adicionales, se mide la produccion de adipocitos despues de incubar CMMh directamente en el gel blando, sin sembrar previamente en placas de cultivo tisular y tripsinizacion.

En estudios adicionales, se mide la produccion de osteoclastos en suspensiones celulares preparadas a partir de geles blandos, placas de cultivo tisular o almacenamiento congelado.

En estudios adicionales, se mide la produccion de osteoclastos despues de incubar CMMh directamente en el gel blando, sin sembrar previamente en placas de cultivo tisular y tripsinizacion.

Ejemplo 11: Implicacion de proteinas de union a GTP pequenas de la familia Rho y sistema de actomiosina en la regulacion del crecimiento de celulas madre por rigidez de la matriz

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Ensayos de la familia de Rho

Se preparan geles de poliacrilamida con G' de aproximadamente 200 Pa (geles blandos) y con G' de aproximadamente 7500 Pa (geles ngidos) en cubreobjetos de vidrio, y se recubren geles y cubreobjetos con una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina. Se colocan geles de poliacrilamida o cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos cubiertas con gel de agarosa al 1 % para evitar la adhesion celular fuera de los geles de poliacrilamida o cubreobjetos de vidrio. Se siembran 5 x 104 CMMh en un gel de poliacrilamida o un cubreobjetos de vidrio, despues se incuban en presencia de suero durante 24 horas. Las celulas se someten a un ensayo de precipitacion para investigar el nivel de carga de GTP de Rho, Rac y Cdc42 usando su kit de ensayo de activacion (Upstate Biotech, Charlottesville, VA).

Transfeccion de celulas con formas de Rho dominantes negativas o constitutivamente activas

Se clona ADNc para la GTPasa Rho candidata a partir de una genoteca de ADNc de tugado de rata, y se introduce una mutacion que crea una forma D/N o C/A de una protema Rho (Qui RG et al, Proc Natl Acad Sci USA. 5 dic 1995; 92 (25): 11781-5; Lu X et al, Curr Biol. 1 dic 1996; 6 (12): 1677-84), y a cada ADNc se le anade una secuencia que codifica un marcador de myc. Se crea un adenovirus recombinante que expresa proteinas de la familia Rho mutantes y se usa para sobreexpresar las proteinas mutantes en CMMh.

RESULTADOS

Para estudiar adicionalmente el papel de las proteinas de la familia Rho en la transmision de informacion acerca de la matriz extracelular, se ensayan actividades de proteinas de la familia Rho en CMM cultivadas en geles blandos o ngidos. Se identifican proteinas de la familia Rho adicionales implicadas en la trasmision de estas senales.

En experimentos adicionales, la forma dominante negativa (D/N) o la forma constitutivamente activa (C/A) de una protema de la familia Rho de interes se sobreexpresa en CMMh. Se utiliza adenovirus recombinante que expresa

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LacZ como un control negativo. Se preparan CMMh de geles blandos, geles ngidos o cubreobjetos de vidrio, se incuban durante 24 horas, despues se dejan no infectadas o infectadas con adenovirus que expresa LacZ o formas mutantes de protemas de la familia Rho. Despues de 36 horas de incubacion, se anade BrdU al medio, y las celulas se incuban durante 12 horas adicionales en medio que contiene suero, despues se fijan y se inmunotinen con respecto a marcador de myc y BrdU usando anticuerpos anti myc (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y anticuerpos anti BrdU (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se usa comparacion del numero de celulas positivas para tincion con BrdU entre celulas no infectadas y celulas infectadas con adenovirus LacZ para confirmar que la infeccion por adenovirus en sf misma no tiene efecto en el crecimiento de CMMh. El numero de celulas positivas para incorporacion de BrdU se compara con el numero positivo para tincion con marcador de myc. La modulacion negativa de la detencion del crecimiento inducida por matriz blanda o promocion de crecimiento inducida por matriz ngida por formas C/A y D/N de protemas de la familia Rho, respectivamente, indica implicacion de la protema de la familia Rho sobreexpresada en la regulacion del crecimiento de CMMh por rigidez de matriz.

Ejemplo 12: determinacion del papel de la actomiosina en la regulacion del crecimiento de celulas madre

Para estudiar el papel de la actomiosina en la regulacion del crecimiento de CMMh en geles blandos antes de comprometerse a linajes celulares espedficos, las CMMh se siembran en cubreobjetos de vidrio recubiertos con una mezcla de colageno de tipo I y fibronectina durante 24 horas, despues se incuban con BrdU en presencia o ausencia de 2,3-butanodiona monoxima (BDM) 20 mM, blebistatina 100 pM o citocalasina D (CD) 0,25 pM/ml durante 12 horas adicionales. A lo largo del experimento, las celulas se incuban en presencia de suero. Despues de la incubacion, las celulas se fijan y se inmunotinen con respecto a BrdU. Se evalua el efecto en el crecimiento de CMMh de la inhibicion de miosina II por BDM o blebistatina, o la alteracion de filamentos de actina por CD.

Ejemplo 13: crecimiento y diferenciacion de CMMh en geles de fibrina tridimensionales blandos

MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES

Reparacion y siembra de geles de fibrina

Se rehidrata fibrinogeno de salmon (Searun Holdings, Freeport, ME) en H2O y se diluye hasta 3 (para gel blando) o 18 mg/ml (para gel ngido) en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se polimerizan almuotas de 400 microlitros (pl) con 2 unidades/ml de trombina de pez (Searun Holdings) en pocillos de cultivo tisular. La rigidez de los geles de fibrina de salmon preparados de fibrinogeno 3 y 18 mg/ml es de 250 Pa y 2150 Pa, respectivamente. Antes de la polimerizacion, se mezclan 104 CMMh con solucion de fibrinogeno en dMeM que contiene FCS 10 %, en el que las celulas se incuban durante 24 horas.

RESULTADOS

El analisis de proliferacion de CMM en geles blandos y ngidos de fibrina se evalua incubando celulas durante 12 horas adicionales en presencia de suero y BrdU, seguido de fijacion e inmunotincion para la incorporacion de BrdU.

La fuerza de diferenciacion de CMMh en geles de fibrina se evalua a traves de la eficacia de la diferenciacion de adipocitos. Se induce la diferenciacion de CMM en geles de fibrina en adipocitos cambiando el medio a Medio de Induccion Adipogenico (“MIA” DMEM + FBS 10 %, dexametasona 1 micromolar (pM), indometacina 200 pM, insulina 10 microgramos (pg)/ml y metilisobutilxantina 0,5 mM) durante 3 dfas, manteniendo despues las celulas en Medio de Mantenimiento Adipogenico (MC, insulina 10 pg/ml). 8 dfas despues de cambiar a Medio de Induccion Adipogenico, se evalua la diferenciacion de adipocitos bien por tincion con Oil Red O o bien por inmunotincion anti PPARy2. Se comparan los porcentajes de celulas positivas para tincion con Oil Red O o tincion con PPARy2 entre geles de fibrina blandos y ngidos.

En otros experimentos, se anaden inhibidores de proteasa a la matriz para impedir o inhibir la degradacion proteolftica u otra remodelacion activa de las celulas.

Ejemplo 14: uso de CMMh de la presente invencion para mantener la viabilidad de celulas madre hematopoyeticas

Se siembran suspensiones de CMM de pase 10 en placas de cultivo tisular de 96 pocillos recubiertas con colageno de tipo I mas fibronectina a una densidad de 103 celulas/pocillo. Despues de incubar las celulas en MC durante 24 horas, las celulas se cultivan en presencia de un gel blando o una matriz blanda, como se ha descrito en los Ejemplos anteriores. Los cultivos de celulas madre mesenquimales resultantes se anaden despues a cultivos de celulas madre hematopoyeticas para mantener la viabilidad de estas ultimas celulas.

En estudios adicionales, se incuban CMMh directamente en el gel blando, sin siembra previa en placas de cultivo tisular y tripsinizacion.

Habiendose descrito las realizaciones preferidas de la invencion con referencia a los dibujos acompanantes, ha de entenderse que la invencion no esta limitada a las realizaciones en concreto y que los expertos en la materia pueden efectuar diversos cambios y modificaciones en la misma sin alejarse del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo de induccion de la diferenciacion de una poblacion de celulas madre mesenquimales quiescentes en una poblacion de un tipo de celula de interes, comprendiendo dicho metodo las etapas de (a) mantener dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en quiescencia, conservando la capacidad de que dicha poblacion de celulas madre mesenquimales se diferencie en multiples tipos de celulas y conservando la capacidad proliferativa de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en presencia de un aparato que contiene un gel o una matriz de gel que tiene un modulo de cizalla en un intervalo de 150-750 Pa; y (b) cultivar dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en presencia de un medio de induccion, induciendo de este modo la diferenciacion de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en una poblacion de un tipo de celula de interes.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha poblacion de un tipo de celula de interes es una poblacion de adipocitos.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha poblacion de un tipo de celula de interes es una poblacion de osteoblastos.
4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que

(a) dicho gel o matriz de gel comprende ademas un suero animal; y/o

(b) la etapa de mantenimiento de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en un gel o una matriz de gel se precede de una etapa de cultivo de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales en un aparato de cultivo tisular; y/o

(c) la etapa de mantenimiento se realiza directamente despues del aislamiento, la purificacion o el enriquecimiento de dicha poblacion de celulas madre mesenquimales a partir de una muestra biologica.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el medio de induccion es un medio de induccion adipogenico.
6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que

a) dicho gel o matriz de gel comprende acrilamida y bisacrilamida; y/o

b) dicho gel o la matriz de gel es bidimensional o tridimensional; y/o

c) dicho gel o la matriz de gel se recubre con una protema de adhesion; y/o

d) dicha poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales adultas; y/o

e) dicha poblacion de celulas madre mesenquimales es una poblacion de celulas madre mesenquimales humanas.
7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que

(a) dicho gel o el gel en dicha matriz de gel tiene una concentracion total de acrilamida de 3 % y una concentracion total de bisacrilamida de 0,06 % a 0,5 %, una concentracion total de acrilamida de 5,5 % y una concentracion total de bisacrilamida de 0,05 % a 0,075 % o una concentracion total de acrilamida de 7,5 % y una concentracion total de bisacrilamida de 0,01 % a 0,03 %; y/o

(b) dicha protema de adhesion es un colageno, una fibronectina, o una combinacion de los mismos.