ES2577714T3 - Geles de baja rigidez para la modulación del crecimiento de MSC - Google Patents

Description

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La “población de células madre mesenquimales” se refiere, en otra realización, a una población que comprende células madre mesenquimales (MSC). En otra realización, la población se enriquece con respecto a MSC. En otra realización, la población es una población de MSC parcialmente purificada. En otra realización, las MSC se aíslan de una fuente biológica, seguida de una etapa de purificación o enriquecimiento. En otra realización, el aislamiento de la fuente biológica se sigue de cultivo. En otra realización, el aislamiento de la fuente biológica se sigue de cultivo y una etapa de purificación o enriquecimiento. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

Las células “mesenquimales” de métodos de la presente invención se aíslan o purifican, en otra realización, a partir de médula ósea. En otra realización, las células son células madre mesenquimales derivadas de médula ósea. En otra realización, las células se aíslan o purifican de tejido adiposo. En otra realización, las células se aíslan o purifican de cartílago. En otra realización, las células se aíslan o purifican de cualquier otro tejido conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, un gel o una matriz de gel de los métodos de la presente invención tienen una rigidez de 150750 pascales (Pa). En otra realización, un gel o una matriz de gel de los métodos de la presente invención tienen un módulo de cizalla de 150-750 Pa. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, un gel o una matriz de gel de los métodos de la presente invención tienen una rigidez equivalente a un tejido biológico. En otra realización, el tejido biológico es médula ósea. En otra realización, el tejido biológico es tejido graso. En otra realización, el tejido biológico es cualquier otro tejido biológico conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En una realización, la matriz de gel descrita en el presente documento es capaz de formar geles de diversas potencias, dependiendo de su estructura y concentración así como, en otra realización, factores ambientales tales como fuerza iónica, pH y temperatura. La viscosidad y el comportamiento del gel combinados denominados “viscoelasticidad” en una realización, se examinan determinando el efecto que tiene una fuerza oscilante en el movimiento del material. En otra realización el módulo elástico (G’), módulo viscoso (G”) y viscosidad compleja (η*) son los parámetros que se busca cambiar usando los métodos descritos en el presente documento, y estos se analizan en otra realización variando la tensión o presión de forma armónica con el tiempo (Tabla 1). Estos parámetros se derivan del módulo complejo (G*), que es la relación de tensión máxima frente a presión máxima, y el ángulo de fase (ω), que es el ángulo en que están fuera de fase la tensión y la presión.

Tabla 2. Relación entre módulos dinámicos, ángulo de fase (δ) y frecuencia (ω).

Término

Símbolo Definición Información proporcionada

Módulo complejo

G* [(G’)2 + (G”)2]0,5 Todas las características viscoelásticas

Módulo elástico, módulo de almacenamiento Módulo viscoso, módulo de pérdida Viscosidad compleja

G’ G” η* G* cos δ G* sin δ G*/ω Energía almacenada por cada ciclo de comportamiento tipo sólido o elástico Energía disipada por ciclo de comportamiento de tipo líquido o viscoso Flujo viscoelástico deformación; deformación;

En una realización, en las matrices de gel descritas en el presente documento, parte de la deformación provocada por tensión de cizalla es elástica y volverá a cero cuando se retire la fuerza. La deformación restante tal como la deformación creada por el desplazamiento deslizante de las cadenas a través del disolvente en una realización no volverá a cero cuando se retire la fuerza. Bajo fuerza constante el desplazamiento elástico permanece constante en una realización, mientras que el desplazamiento deslizante continúa, aumentando de este modo.

En una realización, el término “elástico” o “elasticidad”, y términos similares se refieren a una propiedad física de las matrices de gel descritas en el presente documento, concretamente la deformabilidad del gel bajo fuerza mecánica y la capacidad de la matriz de gel para conservar su forma original cuando se retire la fuerza deformante. En otra realización, la expresión “módulo elástico” se refiere a módulo de Young y es una medida de la relación de (a) la tensión uniaxial a lo largo de un eje del material con respecto a (b) la tensión normal adjunta a lo largo de ese eje.

El módulo de cizalla (resultante de la tensión cambiante) es la relación de la tensión de cizalla con respecto a la presión de cizalla. Se deduce a partir de la relación compleja similar a la anterior que:

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donde G* es el módulo de cizalla complejo, G’ es el módulo de almacenamiento en fase, i es un factor relacionado con el material y G” es el módulo de pérdida dirigido de forma similar fuera de fase; G* = E (G’2 + G”2). La frecuencia con la que estos parámetros se cruzan corresponde a un tiempo de relajación (τ) específico del material.

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realización, el gel o la matriz de gel es cualquier otro tipo de gel o matriz de gel conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención comprende además un suero animal. En otra realización, el suero animal es un suero bovino fetal. En otra realización, el suero animal es un suero de ternero bovino. En otra realización, el suero animal es un suero de caballo. En otra realización, el suero animal es cualquier otro tipo de suero animal que contenga factor de crecimiento conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención comprende además un inhibidor de proteasa.

En otra realización, un inhibidor de proteasa de métodos de la presente invención inhibe la función de una peptidasa. En otra realización, el inhibidor de proteasa es una proteína. En algunas realizaciones, el inhibidor de proteasa es un inhibidor de cisteína proteasa, un inhibidor de serina proteasa (serpina), un inhibidor de tripsina, un inhibidor de treonina proteasa, un inhibidor de proteasa aspártica o un inhibidor de metaloproteasa. En otra realización, un inhibidor de proteasa es un inhibidor suicida, un inhibidor de estado de transición o un agente quelante.

En otra realización, el inhibidor de proteasa es inhibidor de tripsina de soja (SBTI). En otra realización, el inhibidor de proteasa es AEBSF-HCl. En otra realización, el inhibidor es ácido (épsilon)-aminocaproico. En otra realización, el inhibidor es (alfa) 1-antiquimotripsina. En otra realización, el inhibidor es antitrombina III. En otra realización, el inhibidor es (alfa) 1-antitripsina (inhibidor de [alfa] 1-proteinasa). En otra realización, el inhibidor es APMSF-HCl (sulfonil fluoruro de 4-amidinofenil-metano). En otra realización, el inhibidor es esprotinina. En otra realización, el inhibidor es benzamidina-HCl. En otra realización, el inhibidor es quimostatina. En otra realización, el inhibidor es DFP (diisopropilfluoro-fosfato). En otra realización, el inhibidor es leupeptina. En otra realización, el inhibidor es PEFABLOC® SC (clorhidrato de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonil fluoruro). En otra realización, el inhibidor es PMSF (fenilmetil sulfonil fluoruro). En otra realización, el inhibidor es TLCK (1-cloro-3-tosilamido-7-amino-2-heptanona HCl). En otra realización, el inhibidor es TPCK (1-cloro-3-tosilamido-4-fenil-2-butanona). En otra realización, el inhibidor es inhibidor de tripsina de clara de huevo (ovomucoide). En otra realización, el inhibidor es inhibidor de tripsina de soja. En otra realización, el inhibidor es aprotinina. En otra realización, el inhibidor es pentamidina isetionato. En otra realización, el inhibidor es pepstatina. En otra realización, el inhibidor es guanidinio. En otra realización, el inhibidor es alfa2-macroglobulina. En otra realización, el inhibidor es un agente quelante de cinc. En otra realización, el inhibidor es yodoacetato. En otra realización, el inhibidor es cinc. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, la cantidad de inhibidor de proteasa utilizado en métodos de la presente invención es 0,1 mg/litro. En otra realización, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,3 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,4 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,6 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,8 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 1 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 1,5 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 2,5 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 3 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 5 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 7 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 10 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 12 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 15 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 30 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 50 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 70 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 100 mg/litro.

En otra realización, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,1-1 mg/litro. En otra realización, la cantidad de inhibidor de proteasa es 0,2-1 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,3-1 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,5-1 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,1-2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,2-2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,3-2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 0,5-2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 1-2 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 1-10 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 2-10 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 3-10 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 5-10 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 1-20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 2-20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 3-20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 5-20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 10-20 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 10-100 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 20-100 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 30-100 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 50-100 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 10-200 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 20-200 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 30-200 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 50-200 mg/litro. En otra realización, la cantidad es 100-200 mg/litro.

En otra realización, la cantidad de inhibidor de proteasa utilizado en métodos de la presente invención es 1000 u.i.k. (unidades inactivadoras de kalicreína)/litro. En otra realización, la cantidad es 10 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 12 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 15 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 20 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 30 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 40 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 50 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 70 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 100 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 150 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 200

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u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 300 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 500 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 700 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 1500 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 3000 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 4000 u.i.k./litro. En otra realización, la cantidad es 5000 u.i.k./litro

Cada cantidad del inhibidor de proteasa representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, la proteasa a la que se dirige el inhibidor de proteasa de métodos de la presente invención es una seria proteasa. En otra realización, la proteasa es tripsina. En otra realización, la proteasa es quimotripsina. En otra realización, la proteasa es carboxipeptidasa. En otra realización, la proteasa es aminopeptidasa. En otra realización, la proteasa es cualquier otra proteasa que actúe en el duodeno o el intestino delgado. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

La población de células madre mesenquimales de métodos de la presente invención es, en otra realización, una población de células madre mesenquimales adultas. En otra realización, la población de células madre mesenquimales es una población de células madre mesenquimales juveniles. En otra realización, la población de células madre mesenquimales es una población de células madre mesenquimales infantiles. En otra realización, la población de células madre mesenquimales es una población de células madre mesenquimales fetales. En otra realización, la población de células madre mesenquimales es una población de células madre mesenquimales humanas. En otra realización, la población de células madre mesenquimales es de cualquier animal conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre hematopoyética. En otra realización, el tipo celular de interés es un adipocito. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora endotelial. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre neural. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora residente en tejido adulto. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora pancreática residente en tejido adulto. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula beta nativa regenerativa. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre gastrointestinal. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre epitelial hepatopancreática. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre epidérmica. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre epitelial intestinal. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre retiniana. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre epitelial neuronal. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre muscular. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre endotelial. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula madre de sangre periférica. En otra realización, el tipo celular de interés es cualquier otro tipo de célula madre conocido en la técnica

En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora condrogénica. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora adipogénica. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora del estroma de la médula. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora miogénica. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora osteogénica. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula progenitora de tendón. En otra realización, el tipo celular de interés es cualquier otro tipo de célula progenitora conocida en la técnica.

En otra realización, el tipo celular de interés es un tipo celular descendiente. En otra realización, el tipo celular de interés es un condrocito. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula del estroma. En otra realización, el tipo celular de interés es una célula del miotubo. En otra realización, el tipo celular de interés es un osteocito. En otra realización, el tipo celular de interés es un tenocito. En otra realización, el tipo celular de interés es cualquier otro tipo celular descendiente conocido en la técnica.

En otra realización, un método de la presente invención comprende además la etapa de incubar las células madre mesenquimales en un medio de inducción. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de osteoblastos. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre hematopoyéticas. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de adipocitos. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células progenitoras endoteliales. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre neurales. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células progenitoras residentes en tejido adulto. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células progenitoras pancreáticas residentes en tejido adulto. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de las células progenitoras beta nativas regenerativas. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre gastrointestinales. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre epiteliales hepatopancreáticas. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre epidérmicas. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre epiteliales intestinales. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre retinianas. En otra realización, el medio de inducción es un medio de inducción de células madre epiteliales

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realización, la etapa de cultivo se realiza directamente después de enriquecimiento de la población de células madre mesenquimales en una muestra biológica. “Directamente” se refiere, en otra realización, a una etapa de cultivo en ausencia de cultivo primero en un aparato de cultivo tisular. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

La población de células progenitoras de métodos de la presente invención es, en otra realización, una población de células madre hematopoyéticas. En otra realización, la población de células progenitoras es una población precursora de células endoteliales. En otra realización, la población de células progenitoras es una población de células satélite (por ejemplo precursores de células musculares). En otra realización, la población de células progenitoras es una población de progenitores neurales amplificadores de tránsito de la corriente migratoria rostral. En otra realización, la población de células progenitoras es una población de células del estroma de la médula ósea. En otra realización, la población de células progenitoras es cualquier otra población de células progenitoras conocida en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

"Población de células progenitoras" se refiere, en otra realización, a una población que comprende células progenitoras. En otra realización, la población se enriquece con respecto a células progenitoras. En otra realización, la población es una población celular progenitora parcialmente purificada. En otra realización, las células progenitoras se aíslan de una fuente biológica, seguida de una etapa de purificación o enriquecimiento. En otra realización, el aislamiento de la fuente biológica se sigue de cultivo. En otra realización, el aislamiento de la fuente biológica se sigue de cultivo y una etapa de purificación o enriquecimiento. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

También se describe en el presente documento un método para diferenciar una célula transformada en un tipo celular diferenciado, que comprende la etapa de cultivar la célula transformada en un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención, diferenciando de este modo una célula transformada en un tipo celular diferenciado. En otra realización, el tipo celular diferenciado es una célula progenitora. En otra realización, el tipo celular diferenciado es un tipo celular descendiente. En otra realización, el tipo celular diferenciado es un tipo celular tisular. En otra realización, el tipo celular diferenciado es uno de los tipos celulares anteriores. En otra realización, el tipo celular diferenciado es cualquier otro tipo de tipo celular diferenciado conocido en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta.

En otra realización, una célula o población celular preparada por un método de la presente invención se usa para reemplazar tejidos dañados en un sujeto. En otra realización, una célula o población celular preparada por un método de la presente invención se usa como vehículo para agentes antineoplásicos (Kassem M, Ann N Y Acad Sci. May 2006; 1067: 436-42). Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

Se conocen bien en la técnica métodos para determinar la capacidad proliferativa y potencia de diferenciación de células madre mesenquimales, y se describen, por ejemplo, en Baxter MA et al (Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells. 2004; 22(5): 675-82), Liu L et al (Telomerase deficiency impairs differentiation of mesenchymal stem cells. Exp Cell Res. 10 mar 2004; 294 (1): 1 -8), y Bonab MM et al (Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 10 mar 2006; 7: 14). Cada posibilidad representa otra realización de la presente invención.

En otra realización, una ventaja de los métodos de la presente invención es la falta de inmortalización de células madre mesenquimales. En otra realización, una ventaja es la falta de evolución de células cancerosas de una población de células madre mesenquimales. En otra realización una ventaja es la conservación de la capacidad de las células diana para diferenciarse en múltiples tipos celulares. En otra realización, una ventaja es la conservación de la capacidad proliferativa de las células. En otra realización, una ventaja es la conservación de la capacidad de las células para apoyar el crecimiento de células hematopoyéticas. En otra realización, una ventaja es la capacidad de las células diana para diferenciarse sin un requisito de inhibición de contacto. En otra realización, la diferenciación es una consecuencia de la inhibición de proliferación. Cada posibilidad representa otra realización de la presente invención.

En una realización, se proporcionan en el presente documento métodos para inducir la proliferación de una célula madre somática inactiva. Se ha descubierto que poniendo en contacto una célula madre con un material que es menos elástico que la elasticidad del microambiente in vivo de origen natural del mismo tipo de célula madre es eficaz para inducir proliferación de la célula madre. Las realizaciones de la presente invención incluyen por lo tanto poner en contacto la célula madre somática con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas en la superficie de la membrana celular y que tienen elasticidad aparente para la célula madre menor que la elasticidad del material predominante en el microambiente biológico de una célula madre somática in vivo del mismo tipo que la célula madre somática. Por ejemplo, la proliferación de células madre inactivas puede inducirse colocándolas en un portaobjetos de vidrio, que tiene una rigidez de más de 1 gigaPascal (una fracción pequeña de la elasticidad de la mayoría de los tipos tisulares humanos o animales) y que se recubre con un material que entra en contacto con las integrinas en la célula. En otras realizaciones, puede inducirse proliferación de una célula madre poniendo en contacto la célula con un material aparente para la célula que tiene una elasticidad de menos de 0,1 de la elasticidad del microambiente in vivo natural de la célula madre. En otras realizaciones, puede inducirse

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proliferación poniendo en contacto la célula madre con un material que tiene una elasticidad aparente para la célula madre de menos de aproximadamente 0,5 veces (por ejemplo, de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,5 veces) la elasticidad del microambiente in vivo natural de la célula madre.

En realizaciones, la célula también puede estar provista de material de crecimiento de nutrientes, por ejemplo, incluyendo factores de crecimiento y suero, para promover la proliferación y mantener la actividad biológica de la célula madre y su descendencia ex vivo. La formulación del material de crecimiento de nutrientes para tipos celulares particulares se conoce por los expertos en la materia, y no debería ser necesaria ninguna variación de materiales de crecimiento de nutrientes conocidos para tipos particulares de células madre para la práctica de este aspecto de la presente invención.

Como con otro aspecto de la presente invención, pueden practicarse realizaciones de este aspecto inductor de proliferación con células madre, incluyendo MSC. Las MSC pueden recogerse de tejido vivo, como se describe en esta memoria descriptiva, o derivarse de otras fuentes tales como cultivos in vitro y células madre congeladas de forma criogénica. Dichas células pueden estar en un estado inactivo de origen natural o un estado inactivo inducido artificialmente y pueden incluir por ejemplo células en las que se ha inducido o mantenido inactividad usando métodos de la presente invención. En consecuencia, las células en las que puede inducirse proliferación de acuerdo con métodos de la presente invención pueden incluir células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC), células madre renales, células madre hepáticas, células madre derivadas de músculo esquelético, células madre derivadas de hueso, MSC de pulpa dental, MSC derivadas de músculo cardiaco, MSC derivadas de líquido sinovial, MSC de cordón umbilical y otros tipos de células que pueden identificarse por un experto en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva.

La proliferación de células madre de acuerdo con la presente invención es reversible, permitiendo que se induzcan estados alternos de inactividad y proliferación en una célula. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden usarse para inducir y mantener la inactividad en una célula madre, por ejemplo poniendo en contacto la célula madre con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas en la superficie celular y que tienen elasticidad aparente para la célula aproximadamente igual que la elasticidad del microambiente in vivo de la célula. Entonces puede inducirse proliferación en la célula poniendo en contacto la célula con un material que comprende compuestos que se unen con integrinas y que tienen elasticidad aparente para la célula sustancialmente menor que la elasticidad del microambiente in vivo de la célula. Entonces puede inducirse inactividad y mantenerse poniendo el contacto las células descendientes resultantes con un material que incluye compuestos de unión a integrina y que tiene elasticidad aparente para las células aproximadamente igual que el microambiente in vivo de las células.

En otra realización, se induce proliferación de células madre en un estado inactivo de acuerdo con un método de la presente invención. Después puede inducirse que estas células inactivas proliferen, como se ha descrito anteriormente.

La presente invención proporciona además métodos para inducir diferenciación de una célula madre somática en la que la actividad biológica se está manteniendo y se ha inducido inactividad o se mantiene de acuerdo con los métodos de la presente invención. Las realizaciones de este aspecto de la presente invención incluyen la etapa de poner en contacto dichas células con un material de diferenciación que comprende estímulos químicos seleccionados para estimular la diferenciación de las células a un tipo celular predeterminado y proporcionar a las células un material nutriente de células diferenciadas para mantener la actividad biológica de las células con diferenciación estimulada. En algunas realizaciones, la etapa de contacto puede precederse de una etapa que comprende inducir (o permitir) la proliferación, por ejemplo ex vivo de la célula madre somática poniendo en contacto la célula madre con un material que tienen elasticidad menor que la elasticidad del microambiente natural de la célula diana de diferenciación pretendida.

Puede inducirse diferenciación en células madre inactivas o proliferativas mantenidas en actividad biológica de acuerdo con la presente invención, usando métodos conocidos o evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, si la célula madre es una célula madre mesenquimal derivada de médula ósea humana, puede efectuarse diferenciación de la célula en adipocitos poniendo en contacto la célula con un medio adipogénico (como se realiza en el Ejemplo 1) en un sustrato con una elasticidad de aproximadamente 250 Pa, como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva. Usando información que puede obtenerse de o como se describe en la presente memoria descriptiva con respecto a la reología de diversos tipos tisulares así como el medio de diferenciación para usar para inducir que las células madre se diferencien en diversos tipos de células, resultaría evidente para los expertos en la materia que pueden usarse métodos de la presente invención para inducir que una célula madre mesenquimal derivada de médula ósea humana se diferencie en uno o más de al menos los siguientes tipos celulares: osteoblastos, condrocitos, miocitos, adipocitos, células de islotes beta pancreáticos y células neuronales. Más en general, usando información sobre reología de diversos tipos tisulares y medios de diferenciación usados para inducir diferenciación de diversos tipos de células madre en diversos tipos de células, resultaría fácilmente evidente para los expertos en la materia inducir diferenciación, en cualquiera de los tipos de células madre identificados en la presente memoria descriptiva, en uno o más de un osteoblasto, un condrocito, un miocito, un adipocito, una célula de islote beta pancreático, una célula neuronal u otro tipo celular.

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En realizaciones de este aspecto de la invención, las células diferenciadas se ponen en contacto con un medio que incluye nutrientes para mantener la actividad biológica de las células. Por ejemplo, si se usa un método de la presente invención para inducir que una célula madre mesenquimal derivada de médula ósea humana se diferencie en adipocitos, los adipocitos resultantes pueden ponerse en contacto con un medio nutriente para mantener su actividad biológica. El medio nutriente puede comprender DMEM (glucosa baja), suero bovino fetal e insulina. Otros medios nutrientes, y métodos para poner en contacto células diferenciadas con ellos, resultarán evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente memoria descriptiva.

También se describe en el presente documento un sistema artificial para inducir o mantener la inactividad y la integridad biológica sostenible de una célula madre somática. En realizaciones, el sistema incluye una sustancia de ligando de material extracelular (ECM) para poner en contacto una célula madre, un material sustrato unido a la sustancia de ligando de ECM y un medio para proporcionar nutrientes a la célula madre y mantener su actividad biológica. La sustancia de ligando de ECM, cuando se une al material de sustrato, tiene elasticidad similar a la elasticidad del material predominante in vivo en el microambiente biológico de una célula madre in vivo del mismo tipo. Las realizaciones del sistema pueden adaptarse para inducir inactividad en cualquiera de los tipos celulares en los que puede inducirse inactividad de acuerdo con los métodos de la invención descritos en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, pueden adaptarse realizaciones del sistema para inducir inactividad en una célula madre somática o una célula madre embrionaria, una célula madre humana o una célula madre animal, una célula madre somática mesenquimal, (MSC), una MSC derivada de médula ósea, una célula madre renal, una célula madre derivada hepática, una MSC derivada de músculo esquelético, una MSC derivada de hueso, una MSC de pulpa dental, una MSC derivada de músculo cardiaco, una MSC derivada de líquido sinovial o una MSC del cordón umbilical.

En realizaciones, cuando la sustancia de ligando de ECM se une con el sustrato y entra en contacto con una célula madre, el material ECM se une con integrinas en la superficie de la célula madre de manera que induzca que la célula madre entre en inactividad, como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva.

En las realizaciones de dicho sistema, puede haber un material de enlace que una el material de ligando de ECM con el material sustrato. Por ejemplo, cuando el material sustrato comprende un gel de poliacrilamida y el ECM comprende una mezcla de colágeno-fibronectina, el material de enlace puede ser NHS, incluyendo específicamente N-hidroxisuccinimida éster de ácido acrílico. Dependiendo de la naturaleza del material sustrato y el material extracelular, los expertos en la materia pueden determinar fácilmente materiales de enlace, que también puede caracterizarse como agentes de reticulación, para usar para enlazar el material sustrato y el ECM en diversas realizaciones de sistemas de la presente divulgación.

En realizaciones, cuando la capa de ligando de ECM se acopla al sustrato, la capa de ligando de ECM tiene elasticidad evidente para la célula madre sustancialmente similar a la elasticidad del material predominante en el microambiente biológico de una célula madre in vivo del mismo tipo que la célula madre que entra en contacto con la capa de ligando de ECM. Esta elasticidad aparente de la capa de ligando de ECM puede ser independiente de, casi independiente de o dependiente de la elasticidad del sustrato. En realizaciones, la elasticidad del sustrato es sustancialmente similar a la elasticidad del material predominante en el microambiente biológico de una célula madre in vivo del mismo tipo que la célula madre que entra en contacto con la capa de ligando de ECM, y la capa de ligando de ECM presenta a la célula madre sustancialmente la misma elasticidad que la elasticidad del sustrato con el que se acopla.

El sistema artificial descrito en el presente documento puede implementarse usando una diversidad de estructuras. En realizaciones, el material del sustrato forma una matriz, y el ECM se dispersa en la matriz. En realizaciones, un material de enlace también puede dispersarse en la matriz del sustrato para enlazar el material de la matriz de sustrato con el ECM. Por ejemplo, de acuerdo con una realización, una mezcla 5:1 de colágeno derivado de colas de rata (0,5 mg/ml) y fibronectina derivada de seres humanos (0,1 mg/ml), y un reticulador de N-hidroxisuccinimida éster de ácido acrílico (NHS), se dispersan en un gel de poliacrilamida. El gel se formula de modo que la elasticidad de la estructura sea de aproximadamente 250 Pa. Cuando se ponen en contacto MSC derivadas de médula ósea con la estructura de poliacrilamida-NHS-fibronectina-colágeno, se induce que entren en inactividad. Cuando las MSC que entran en contacto con la estructura también están provistas de material nutriente adecuado, su actividad biológica en un estado inactivo se mantiene.

En realizaciones, el material sustrato forma una capa, y el ECM forma una capa unida, directa o indirectamente, con la capa de sustrato. En otras realizaciones, el material de enlace forma una capa de enlace que enlaza la capa de ligando de ECM con la capa de sustrato. La capa de enlace puede actuar para presentar la elasticidad del sustrato a la capa de ligando de ECM de manera que permita que la capa de ligando de ECM presente esa elasticidad a la célula madre en la que se va a inducir inactividad. En una realización, la capa de enlace incluye composiciones de reticulación apropiadas y otros materiales que cumplen estas funciones. Por ejemplo, la capa de acoplamiento puede comprender NHS o, en realizaciones específicas, N-hidroxisuccinimida éster de ácido acrílico. En realizaciones, el material de sustrato es un gel de poliacrilamida. Como se conoce en la técnica, la elasticidad de geles de poliacrilamida puede ajustarse cambiando las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida en el gel. Resultaría evidente para los expertos en la materia, a la luz de la presente memoria descriptiva, cómo preparar

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poliacrilamida u otros geles o materiales de sustrato para su uso en los sistemas de la presente invención.

Como resulta evidente adicionalmente a la luz de la presente memoria descriptiva, las realizaciones pueden utilizar otras estructuras. Por ejemplo, puede crearse una estructura casi tridimensional sembrando células madre en una capa de ECM como se ha descrito anteriormente, dejando las células reposar sobre la capa de ECM sumergiendo el sistema con células en medio, y colocando en las células otra capa de ECM con elasticidad aparente apropiada, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1.

En otra realización, una ventaja de los métodos de la presente invención es la resistencia de la matriz de gel o gel a degradación proteolítica. En otra realización, una ventaja es la resistencia a la remodelación activa por las células. En otra realización, una ventaja es la resistencia de la fibrina heterotérmica (por ejemplo salmón) a proteasas secretadas por neuronas de mamífero en comparación con fibrina de mamífero (por ejemplo humana o bovina). En otra realización, una ventaja es la menor incidencia de transferencia de enfermedad infecciosa de fibrina heterotérmica (por ejemplo, salmón) en comparación con fibrina de mamífero (por ejemplo humana o bovina). Cada posibilidad representa otra realización de la presente invención.

En otra realización, la célula diana de métodos de la presente invención es una MSC inmortalizada.

También se describe en el presente documento un método para inducir la detención de crecimiento de una MSC inmortalizada, que comprende la etapa de cultivar la MSC inmortalizada en un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención, induciendo de este modo la detención del crecimiento de una MSC inmortalizada. En otra realización, se proporciona en el presente documento un método para inhibir el crecimiento de una población de MSC inmortalizada, que comprende la etapa de cultivar la MSC inmortalizada en un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención, inhibiendo de este modo el crecimiento de una población de MSC inmortalizada Cada posibilidad representa una realización distinta.

En otra realización, la célula diana de métodos de la presente invención es una célula transformada. En otra realización, la célula transformada es una célula de melanoma. En otra realización, la célula transformada es cualquier otro tipo de célula transformada conocida en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

Como se proporciona en el presente documento, las células M2 mostraron un mayor tamaño y poblaciones celulares mayores en sustratos más rígidos. En otra realización, una población celular aumentada es un resultado del crecimiento aumentado de las células en sustratos rígidos. En otra realización, una población aumentada se debe a la muerte aumentada de células en sustratos blandos. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

También se describe en el presente documento un método para inducir la detención del crecimiento de una célula transformada, que comprende la etapa de cultivar la célula transformada en un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención, induciendo de este modo la detención del crecimiento de una célula transformada. En otra realización, se proporciona en el presente documento un método para inhibir el crecimiento de una población de células transformadas, que comprende la etapa de cultivar la célula transformada en un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención, inhibiendo de este modo el crecimiento de una población de células transformadas. Cada posibilidad representa una realización distinta.

En otra realización, un sustrato blando de métodos de la presente invención da como resultado un aumento en la forma unida a GDP inactiva de una proteína GTP en las células diana. En otra realización, la proteína GTP es Rho. En otra realización, la proteína GTP es Rac. En otra realización, la proteína GTP es Cdc42. En otra realización, la proteína GTP es cualquier otra proteína GTP conocida en la técnica. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, el miembro de la familia Rho señaliza mediante la formación de adhesiones focales. En otra realización, la activación de Rho inhibe la expresión de p21WAF1/c1p1. En otra realización, la inhibición de p21 activa las quinasas dependientes de ciclina (CDK). En otra realización, la activación de Rho induce la regulación negativa y degradación de p27K1p1, otro inhibidor de CDK. En otra realización, la activación de Rho induce ROCK, dando como resultado la activación de la ruta Ras-Raf-MEK-ERK. En otra realización, esta ruta induce trascripción de ciclina D1 mediada por Ras. En otra realización, esto induce la progresión de fase G1. En conjunto, se mostró que la activación de Rho conducía a progresión de fase G1. En otra realización, la activación de Rac o Cdc42 regula positivamente ciclina E1 y ciclina D1, dando como resultado progresión de fase G1. En otra realización, la activación de una proteína de unión a GTP pequeña de familia Rho da como resultado la transducción de señal para potenciar la progresión del ciclo celular. Cada posibilidad representa una realización distinta de la presente invención.

En otra realización, un sustrato blando de métodos de la presente invención reduce la contractilidad del sistema de actomiosina de la célula diana. En otra realización, esto induce que las células diana cesen la proliferación. En otra realización, esto induce que las células diana se hagan competentes para estímulos adicionales para reiniciar la proliferación. En otra realización, esto induce que las células diana sean competentes para estímulos adicionales

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(d) materiales para preparar una capa de ligando de ECM, incluyendo los materiales identificados en el Ejemplo 1, para preparar un material extracelular de fibronectina-colágeno 1:5.

En una realización, un kit de la presente divulgación comprende un gel de poliacrilamida formulado con una elasticidad para inducir inactividad en células madre de un tipo específico; una solución que incluye composiciones de reticulación para aplicación al gel; material extracelular formulado para unirse con integrinas en la superficie del tipo de células especificado; y, opcionalmente, material nutriente adecuado (que también puede prepararse por los usuarios) para inducir inactividad en las células.

En algunas realizaciones del kit, el kit comprende una capa de material que proporciona tanto elasticidad como ligando de ECM. En otra realización, el kit puede comprender las siguientes tres capas de materiales:

a) un sustrato de gel que confiere elasticidad al sistema;

b) ligandos de ECM; y

c) reticuladores que conectan ligandos de ECM con el sustrato.

En las realizaciones de kits de la presente divulgación, los componentes del kit se colocan en un receptáculo tal como una bolsa o envase de plástico que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas realizaciones, el receptáculo también puede contener conservantes tales como azida sódica. Los componentes pueden hidratarse en el kit, por ejemplo, durante el almacenamiento. En algunas realizaciones, el receptáculo se sella y/o se protege con armazones apropiados para evitar el daño al sistema. El kit puede enviarse a baja temperatura, tal como aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C.

En las realizaciones de kits de la presente divulgación, los usuarios pueden abrir el receptáculo y colocar los componentes del kit en un material apropiado, tal como una placa de cultivo tisular. Los usuarios también pueden retirar cualquier material duro sobre los componentes para exponer los ligandos de ECM y lavar los componentes con un tampón tal como PBS. Los usuarios pueden después sembrar células en el sistema poniendo una suspensión celular que comprende células, medio y suero, según sea necesario.

Los métodos de la presente invención pueden practicarse in vivo así como ex vivo. Dichos sistemas pueden incluir, por ejemplo, estructuras porosas para inserción en tejidos específicos o el sistema circulatorio para mantener una célula madre en inactividad dentro del cuerpo. Por ejemplo, pueden dispersarse células madre, ECM correspondientes y, opcionalmente, material de enlace, en una matriz polimérica que tiene elasticidad apropiada evidente para las células madre para inducir o mantener la inactividad, y que también tiene suficiente porosidad para permitir que los nutrientes in vivo alcancen la célula y permitir que las proteínas y otros factores expresados por la célula dejen la matriz. Otras realizaciones pueden incluir casetes u otros dispositivos que inducen o mantienen inactividad de células madre, y que pueden implantarse en un hospedador.

También se describe en el presente documento una célula madre inactiva mantenida en actividad biológica ex vivo. Los ejemplos de dicha célula madre incluyen una célula madre somática o una célula madre embrionaria, una célula madre humana o una célula madre animal, una célula madre mesenquimal (MSC), MSC derivadas de médula ósea, una célula madre renal, una célula madre derivada hepática, una MSC derivada de músculo esquelético, una MSC derivada de hueso, una MSC de pulpa dental, una MSC derivada de músculo cardiaco, una MSC derivada de líquido sinovial o una MSC de cordón umbilical. En realizaciones, los métodos de la presente invención se usan para inducir

o mantener una célula madre en un estado inactivo, y para mantener la actividad biológica de dichas células madre inactivas.

En consecuencia, también se describe en el presente documento un aparato para modular el crecimiento de una célula madre mesenquimal que comprende: una matriz de gel que tiene una rigidez en el intervalo de 150-750 Pa; y un medio de inducción de adipocitos, en el que dicho gel o dicha matriz de gel se recubre con un colágeno de tipo 1, una fibronectina o una combinación de los mismos.

En otras realizaciones, los geles y matrices de gel de cualquiera de los métodos descritos anteriormente tienen cualquiera de las características de un gel o una matriz de gel de métodos de la presente invención. Cada característica representa una realización distinta de la presente invención.

Sección de detalles experimentales

Ejemplo 1: Medición de la rigidez de diversos tejidos y preparación de geles de poliacrilamida que se aproximan a las rigideces de los tejidos

Materiales y métodos experimentales

Preparación de geles de poliacrilamida

Se prepararon soluciones de acrilamida y bisacrilamida (Fisher Biotech, Loughborough, Leicestershire, Reino Unido) para contener una masa polimérica constante de 7,5 % y concentraciones de bisacrilamida de 0,01 %, 0,03 % o 0,3 % para alterar la rigidez. Se prepararon acrilamida, bisacrilamida, persulfato de amonio y N,N,N’,N’tetrametiletilendiamina usados como un ejemplo de “geles blandos” y referidos como tales o 7500 Pa (en el presente documento usado como un ejemplo de “geles rígidos” y referidos como tales); los geles blandos imitan la rigidez de la médula ósea y tejidos grasos.

Tabla 1. Rigidez de tejidos, se obtuvieron tejidos de ratas de tres ratas Sprague-Dawley.

Tejido

Rigidez (Pa)

Médula ósea bovina

225 ± 25

Grasa subcutánea de rata

157 ± 36

Grasa visceral de rata

130 ± 40

Hígado de rata

403 ± 28

Músculo esquelético de rata

2251 ± 166

10 Por lo tanto, se prepararon geles de poliacrilamida que imitan la rigidez del tejido biológico.

Ejemplo 2: Forma celular y estructura de F-actina de hMSC en geles blandos y rígidos

Materiales y métodos experimentales

15 Se sembraron de forma dispersa hMSC en geles rígidos o geles blandos recubiertos con colágeno de tipo 1 y fibronectina. Las células se incubaron durante 24 horas en DMEM + suero de ternero fetal al 10 %, se fijaron y se tiñeron con faloidina Alexa Fluor 488.

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Se investigó el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la forma y la estructura de F-actina de hMSC (células madre mesenquimales humanas). Las células se incubaron en presencia de suero en matrices con diversas rigideces durante 24 horas para permitir la adherencia y proliferación. Las hMSC sembradas en geles rígidos o vidrio

25 adoptaron una forma de huso y mostraron fibras de tensión y F-actina cortical (como se muestra por tinción con faloidina Alexa Fluor 488), mientras que las células sembradas en geles blandos mostraron una apariencia redondeada, carecían de fibras de tensión y contenían agregados de F-actina (Figura 1B-C).

Por lo tanto, las hMSC detectan la rigidez de la matriz extracelular, lo que influye en su forma y estructura de F30 actina.

Ejemplo 3: Inhibición de la proliferación de hMSC en geles blandos.

Materiales y métodos experimentales

35 Se incubaron hMSC con BrdU (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante una noche en presencia de suero. Las células se fijaron y se inmunotiñeron para BrdU (Invitrogen). Se contaron más de 50 células tres veces en campos elegidos aleatoriamente.

40 Resultados

Se midió la incorporación de 5-bromo-2’-desoxiuridina 5’-trifosfato (BrdU) en hMSC como un marcador de la progresión del ciclo celular (Figura 2). Se sembraron células de forma dispersa en geles blandos, geles rígidos o superficies de vidrio, todos las cuales se recubrieron con colágeno de tipo 1 y fibronectina. Como control, también se 45 prepararon células confluyentes en superficie de vidrio. Como se esperaba, hMSC sembradas de forma dispersa en superficies de vidrio incorporaron eficazmente BrdU, lo que indicaba un alto nivel de proliferación. Cuando las células fueron confluyentes en superficie de vidrio, muy pocas hMSC incorporaron BrdU debido a una inhibición de contacto. El 42 % de hMSC en geles rígidos incorporaron BrdU, lo que indicaba que estaba proliferando una gran población de células, aunque significativamente menos que la de células sembradas de forma dispersa en una

50 superficie de vidrio. Por otro lado, ninguna hMSC en geles blandos incorporó BrdU, incluso aunque las células eran viables como se evaluó por falta de tinción de azul de tripano. Además, la incubación continuada de hMSC sembradas de forma dispersa en matrices produjo una densidad celular diferente dependiendo de la rigidez de matrices con mayor densidad en matrices más rígidas.

55 Por lo tanto, las matrices blandas inhiben la proliferación de hMSC incluso en presencia de suero.

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descongelan hMSC reservadas en vapor de nitrógeno líquido para generar una suspensión celular.

Resultados

Para determinar la viabilidad de hMSC sometidas a conservación a largo plazo en un estado inactivo en geles blandos, se almacenan hMSC en geles blandos hasta que las hMSC mantenidas en placas de cultivo tisular alcanzan el pase 10. La viabilidad de estas células se compara con células reservadas en vapor de nitrógeno líquido. Las células adheridas a geles blandos o placas de cultivo tisular se tripsinizan, mientras que las células almacenadas en nitrógeno líquido se descongelan, para generar una suspensión celular. La viabilidad se determina por tinción con azul de tripano de las suspensiones celulares. Por lo tanto, el almacenamiento en gel blando es un medio eficaz para mantener la viabilidad de las hMSC.

Para medir la potencia de proliferación de hMSC almacenadas en incubación a largo plazo en geles blandos, se preparan células que se han mantenido en geles blandos, en placas de cultivo tisular o se han mantenido congeladas en vapor de nitrógeno líquido, y se realiza un ensayo de incorporación de BrdU volviendo a sembrar células de cada fuente en placas de cultivo tisular recubiertas con colágeno de tipo 1 más fibronectina e incubando en presencia de suero y BrdU durante 12 horas. Las células se fijan y se inmunotiñen con respecto a BrdU incubando células con anticuerpos anti-BrdU (Invitrogen).

Ejemplo 10: Uso de geles blandos para conservación a largo plazo de hMSC sin atenuar la diferenciación

Materiales y métodos experimentales

Ensayos de diferenciación de osteoblastos

Se siembran suspensiones de hMSC de pase 10 en placas de cultivo tisular de 96 pocillos recubiertas con colágeno de tipo 1 más fibronectina a una densidad de 103 células/pocillo. Después de incubar células en GM durante 24 horas, se induce la diferenciación de las células en osteoblastos cambiando el medio a medio de inducción osteogénico (OIM) (GM, ácido ascórbico-2-fosfato 50 µM, p-glicerofosfato 10 mM, y dexametasona 100 nM), cambiando el medio cada 3 días durante 3 semanas. Se evalúa la diferenciación de osteoblastos fijando las células con acetona/citrato y tiñendo con respecto a actividad fosfatasa alcalina con Fast Blue RR/naftol (Sigma-Aldorich, Kit n.º 85).

Resultados

A continuación, se mide la potencia de diferenciación de hMSC sometidas a conservación a largo plazo en un estado inactivo en geles blandos. Se tripsinizan hMSC almacenadas en geles blandos o placas de cultivo tisular para realizar suspensiones generadas; en paralelo, se preparan suspensiones celulares descongelando hMSC mantenidas congeladas en nitrógeno líquido. Se evalúa la diferenciación de adipocitos como se ha descrito para el Ejemplo 4.

En estudios adicionales, se mide la producción de adipocitos después de incubar hMSC directamente en el gel blando, sin sembrar previamente en placas de cultivo tisular y tripsinización.

En estudios adicionales, se mide la producción de osteoclastos en suspensiones celulares preparadas a partir de geles blandos, placas de cultivo tisular o almacenamiento congelado.

En estudios adicionales, se mide la producción de osteoclastos después de incubar hMSC directamente en el gel blando, sin sembrar previamente en placas de cultivo tisular y tripsinización.

Ejemplo 11: Implicación de proteínas de unión a GTP pequeñas de la familia Rho y sistema de actomiosina en la regulación del crecimiento de células madre por rigidez de la matriz

Materiales y métodos experimentales

Ensayos de la familia de Rho

Se preparan geles de poliacrilamida con G’ de aproximadamente 200 Pa (geles blandos) y con G’ de aproximadamente 7500 Pa (geles rígidos) en cubreobjetos de vidrio, y se recubren geles y cubreobjetos con una mezcla de colágeno de tipo 1 y fibronectina. Se colocan geles de poliacrilamida o cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos cubiertas con gel de agarosa al 1 % para evitar la adhesión celular fuera de los geles de poliacrilamida

o cubreobjetos de vidrio. Se siembran 5 x 104 hMSC en un gel de poliacrilamida o un cubreobjetos de vidrio, después se incuban en presencia de suero durante 24 horas. Las células se someten a un ensayo de precipitación para investigar el nivel de carga de GTP de Rho, Rac y Cdc42 usando su kit de ensayo de activación (Upstate Biotech, Charlottesville, VA).

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mg/ml de colágeno de tipo 1 de cola de rata y fibronectina humana 0,02 mg/ml. Los geles se lavaron después 3 veces con PBS y se dejaron en PBS hasta que las células se sembraron en un periodo de 24 horas. Los cubreobjetos de vidrio se sumergieron en solución de colágeno de tipo 1 de cola de rata más fibronectina humana durante 1 hora para recubrir su superficie con ligandos de matriz extracelular.

Mediciones de reología. Para medir el módulo de cizalla dinámico (G’) de geles de poliacrilamida, se polimerizaron 500 μl de solución monomérica entre dos placas paralelas de acero de 25 mm en una cámara de hidratación. El módulo de cizalla se calculó a partir de la tensión de cizalla en fase en un reómetro espectrómero de fluidos RFS III controlado por presión (Rheometrics, Piscataway, NJ) usando una tensión de cizalla oscilatoria del 2 % a una frecuencia de 10 radianes por segundo. El módulo de cizalla dinámico (G’) se midió para tejidos animales relevantes. Los tejidos de rata se disecaron del animal y se mantuvieron hidratados en PBS durante no más de 1 hora antes de las mediciones. Se obtuvieron tejidos bovinos de un matadero comercial, se transportaron en hielo, se hidrataron y se calentaron a 37 ºC antes de realizarse las mediciones. Se midieron los módulos de cizalla dinámicos (G’) de muestras hidratadas de 8 mm de diámetro, 2 mm de grosor de tejido de rata y muestras hidratadas de 25 mm de diámetro, 2 mm de grosor de tejido bovino a 37 ºC usando placas paralelas con geometrías que coincidían con las muestras y una tensión de cizalla oscilatoria del 2 % a una frecuencia de 10 radianes por segundo. Se midieron tres muestras de cada tejido.

Sistema de gel casi tridimensional. Se crearon sándwiches de sustrato que se diseñaron para imitar un ambiente tridimensional de células usando métodos descritos en Beningo, et al., modificados para cambiar la elasticidad del sustrato, la composición de la capa de ECM y el peso usado para aproximar las células de forma estrecha al cubreobjetos, como se describe posteriormente (Beningo KA, Dembo M, Wang YL, “Responses of fibroblasts to anchorage of dorsal extracellular matrix receptors”, Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 18024-18029). Las células se sembraron en un gel de 25 mm y se permitió que reposaran durante 48 horas. Se retiró el exceso de medio y se colocó un segundo cubreobjetos (con y sin gel de poliacrilamida de 250 Pa en la parte inferior) sobre el gel sembrado. La parte inferior del segundo cubreobjetos se recubrió con la mezcla de colágeno de tipo 1 y fibronectina descrita anteriormente. Para aproximar estrechamente las células a un segundo cubreobjetos, se colocó un peso de 35 gramos esterilizado sobre el sándwich durante 30 segundos. Después de retirarse el peso, el medio se reintrodujo, y las células se mantuvieron en los sándwiches durante 2 días. Se capturaron imágenes de las células inmediatamente antes de aplicar el cubreobjetos superior y también 2 días después.

Captura de imágenes. Se realizó inmunotinción usando procedimientos conocidos en la técnica (Funaki M, Randhawa P, Janmey PA, "Separation of insulin signaling into distinct GLUT4 translocation and activation steps", Mol Cell Biol. 2004; 24: 7567-7577). Se tiñeron vesículas ricas en ácidos grasos con ORO después de 2 ciclos de inducción adipogénica u 8 días en medio de cultivo, como se describe en Shao y Lazar. (Shao D, Lazar MA, "Peroxisome proliferator activated receptor gamma, CCAAT/enhancer-binding protein alpha, and cell cycle status regulate the commitment to adipocyte differentiation," J Biol Chem. 1997; 272: 21473-21478). Se tiñó la matriz extracelular rica en calcio con Alizarin Red S después de 24 días en medio de inducción de osteoblastos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la incorporación de BrdU incubando las células en medio que contenía BrdU durante una noche. Las células se fijaron y se tiñeron con respecto a BrdU y DAPI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En todos los casos, se capturaron imágenes de las células en un microscopio Leica DM-IRBE (Wetzlar, Alemania) con una cámara ORCA de Hamamatsu (Hamamatsu, Japón).

El área celular proyectada se midió usando imágenes de tinción con faloidina. Las imágenes se convirtieron a 8 bit y se determinaron umbrales. El tamaño de las partículas se analizó usando software Image J (NIH, Bethesda, MD). Las células también se tiñeron con DAPI para verificar que las células no se solapaban. Se contaron solamente células aisladas.

Resultados

Se realizó ensayo reológico en médula ósea para determinar la elasticidad del gel apropiada para estudiar el papel de conformidad del sustrato en el mantenimiento de un depósito de MSC humanas en reposo. Como se muestra en la Tabla 3 posterior, la médula ósea bovina mostró un módulo de almacenamiento oscilatorio (G’) de 220 Pa. El G’ de tejidos grasos también se midió para investigar el papel de la rigidez del sustrato en la adipogénesis de MSC humana. Los tejidos adiposos de rata mostraron un G’ ligeramente menor de aproximadamente 150 Pa. No hubo ninguna diferencia estadística entre el G’ para grasa visceral y subcutánea en ratas. Se adoptó una solución de sustrato de poliacrilamida de acrilamida 3,0 % y bisacrilamida 0,1 % para imitar la elasticidad del ambiente natural de las células. Esta solución de poliacrilamida tiene un G’ polimerizado de 250 ± 25 Pa, que es similar a los valores de G’ medidos de los tejidos de rata y bovinos. En algunos experimentos un segundo sustrato con un módulo de almacenamiento de 7500 ± 250 Pa (similares a los del tejido muscular) actuó como un control (Engler AJ, Griffin MA, Sen S, et al., "Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments", J Cell Biol. 2004; 166: 877-887).

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Tabla 3

Especie

Bovina Rata Rata

Tejido

Médula Ósea Grasa Visceral Grasa Subcutánea

Elasticidad (media ± DT)

220 ± 50 Pa 130 ± 70 Pa 160 ± 70 Pa

Las Figuras 9A-9I muestran imágenes de MSC humanas a una densidad de siembra inicial de 2000 células/cm2 en sustratos de 250 Pa (Figuras 9A, 9D y 9H), 7500 Pa (Figura 9B, 9E y 9I) y vidrio (Figura 9C, 9F y 9J). Como se muestra en las Figuras 9A-9C, las células se sembraron en placas en sustratos recubiertos con colágeno de tipo I y fibronectina y se capturaron imágenes en modo de contraste de fases después de 24 horas de incubación en medio de cultivo (GM). Las flechas indican la localización de las células. Las Figuras 9D-1F muestran imágenes en las mismas localizaciones después de 7 días de incubación en GM. Las células se mantuvieron a 37 ºC durante la captura de imágenes. Se muestran imágenes representativas de 2 experimentos independientes. Como se muestra en las Figuras 9H-9J, la F-actina en MSC humana se marcó con faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) dos días después de la siembra. También se presenta el área proyectada media ± desviación típica. Se contaron al menos 40 células en siete campos elegidos aleatoriamente para cada condición. Las barras de escala en las Figuras 9A-9F son 900 μm, y las barras de escala en las Figuras 9G-9I son de 20 μm.

Después de dos días en geles de 250 Pa recubiertos con una mezcla de fibronectina y colágeno I, las MSC humanas tenían morfologías relativamente pequeñas, redondeadas con un citoesqueleto de F-actina desorganizado, como se muestra en las Figuras 9A y 9G. Las MSC humanas tuvieron un área celular proyectada promedio de solamente 650 ± 250 μm2, que es significativamente menor que un área de proliferación de 3500 ± 1100 μm2 como se mide en vidrio recubierto con las mismas proteínas de adhesión. Se ha observado un fenotipo similar en fibroblastos, células endoteliales y astrocitos en geles de 250 Pa. (Yeung T, Georges PC, Flanagan LA, et al., "Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion," Cell Motil Cytoskeleton. 2005;60:24-34; Pelham RJ, Jr., Wang Y, "Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility," Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:13661-13665; Georges PC, Miller WJ, Meaney DF, et al., "Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures," Biophysical Journal. 2006; 90: 3012-3018). Cuando el tiempo de cultivo se extendió a siete días, algunas de las células reforzaron su adhesión a la matriz conforme y comenzaron a proliferar. Sin embargo, como se muestra en la Figura 1D, el número de células no aumentó de forma apreciable. En consecuencia, los geles blandos indujeron una forma redonda, F-actina desorganizada y detención del ciclo celular en MSC humanas derivadas de médula ósea.

En comparación, las MSC humanas mantenidas en geles de 7500 Pa durante dos días proliferaron parcialmente con un área celular proyectada de 2600 ± 1500 μm2. Como se muestra en las Figuras 9B y 9E, las MSC humanas mostraron algo de organización de actina pero menos fibras de tensión. Después de siete días, las MSC humanas aparentemente aumentaron su número. Como se muestra en la Figura 9H, también proliferaron crecientemente tras el contacto entre células. Como se muestra en las Figuras 9C, 9F y 9I, las MSC humanas en vidrio mostraron una morfología de proliferación, tuvieron fibras de tensión abundantes y proliferaron rápidamente.

Para investigar si la elasticidad de la matriz puede cambiar el comportamiento proliferativo de MSC humanas, se realizó un ensayo de incorporación de 5-bromo-2’-desoxiuridina 5’-trifosfato (BrdU) en células cultivadas en diversos sustratos, como se muestra en la Figura 10. La Figura 10 muestra el porcentaje de células que tuvieron resultados positivos para captación de BrdU, lo que indica células que proliferaron durante el periodo de incubación con BrdU, en sustratos de diversa conformidad. Las células se sembraron en placas en sustratos durante 48 horas antes de incubar las células en medio que contenía BrdU durante una noche. Las células se mantuvieron en medio que contenía suero durante todo el periodo, excepto para las confluyentes en vidrio, que se privaron de suero durante 24 horas antes de añadirse el BrdU en medio sin suero. Los núcleos de las células se tiñeron con anti BrdU y los núcleos se contratiñeron con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se comprobaron al menos 50 células positivas para DAPI con respecto a tinción con BrdU en cada sustrato, y los datos se expresan como media ± ET (error típico) de tres experimentos independientes, con *p<0,01, lo que confirma la significación estadística.

Después de una incubación durante una noche con BrdU, prácticamente ninguna MSC humana adherida a geles de 250 Pa incorporó BrdU. Por lo tanto, la replicación de ADN se suprimió a pesar de la presencia de suero (la replicación de ADN es una etapa necesaria en la división celular de MSC humanas). En geles de 7500 Pa, aproximadamente la mitad de las células replicó su ADN en 24 horas. Cuando se sembraron de forma dispersa en vidrio, más del 80 % de las células mostraron tinción con BrdU nuclear. Estos resultados implican que la conformidad del sustrato puede afectar significativamente a la progresión del ciclo celular en MSC humanas.

La viabilidad dañada de MSC humanas en un sustrato blando podría explicar las observaciones de que las células en geles de 250 Pa se redondean y dejan de proliferar a pesar de la presencia de suero. Sin embargo, las MSC humanas en geles de 250 Pa no incorporaron azul de tripano, lo que indica que estas células no estaban muertas. Para determinar si la detención del ciclo celular inducida por gel blando es reversible, las células se pusieron en un

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ambiente casi tridimensional, como se muestra en las Figuras 11A-11D. Las Figuras 11A-11D ilustran el efecto de un ambiente casi tridimensional en la forma y proliferación de células madre. Las células se sembraron en geles de 250 Pa y se capturaron imágenes después de dos días en medio que contenía suero (Figuras 11A y 11B). El día 2 se usó un sustrato superior de otro gel de 250 Pa (Figura 11C) o un cubreobjetos de vidrio (Figura 11D) para intercalar las células en un ambiente casi tridimensional. Dos días después se tomaron de nuevo imágenes de las células en las mismas localizaciones. En las Figuras 11A-11D, la barra de escala es de 100 μm.

Se colocó un gel de 250 Pa o un cubreobjetos de vidrio, cada uno recubierto con el mismo ligando de matriz que los geles inferiores, sobre MSC humanas no proliferativas redondas en geles de 250 Pa. Las células intercaladas entre los dos geles de 250 Pa permanecieron redondas o proliferaron en un pequeño grado. Como se muestra en la Figura 11C, no se observó ningún aumento evidente en el número de estas células. Por otro lado, como se muestra en la Figura 11D, las células frente a cubreobjetos de vidrio en la parte superior proliferaron y se hicieron de forma de huso. Una vez que las MSC humanas se adhirieron firmemente a la superficie de vidrio superior, se desprendieron del sustrato blando. En consecuencia, las MSC humanas en geles de 250 Pa eran competentes para reanudar la proliferación tras recibir una señal mecánica de un sustrato más rígido.

La detención del crecimiento temporal de MSC humanas en geles de 250 Pa plantea la cuestión de si estas células son competentes para diferenciarse. Se consigue diferenciación mediante un conjunto de acontecimientos altamente coordinado, incluyendo detención del crecimiento y expresión de fenotipos restringidos a linaje celular. Se ha indicado que la elasticidad del sustrato especifica el linaje en el que se diferencian las MSC humanas. (Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE, "Matrix elasticity directs stem cell lineage specification", Cell. 25 Ago 2006; 126(4): 677-89). Se ensayó la diferenciación de adipocitos de MSC humanas en geles que tenían una elasticidad de 250 Pa, que es comparable con la elasticidad de tejidos grasos.

Cuando las células en matrices con diversas rigideces se trataron con un medio de diferenciación adipogénico, hubo una relación inversa entre el porcentaje de células que incorporaban BrdU en sus núcleos y el porcentaje de células que se acumulaban gotas de lípidos detectadas por tinción con ORO.

Las Figuras 12A y 12B muestran la respuesta de MSC humanas a medio de inducción adipogénica. La Figura 12A muestra tinción con Oil Red O (ORO) para acumulación de lípidos en MSC humanas. Las células se sembraron en sustratos de 250 Pa, 7500 Pa o de vidrio y se sometieron a 8 días de medio de cultivo (-), o dos ciclos de inducción adipogénica (+). La Figura 12B muestra la respuesta a dosis de MSC humana a factores de diferenciación químicos en geles de 250 Pa (•) o vidrio (■). Las células se sembraron a densidades de 2000 células/cm2 en geles y 20000 células/cm2 en vidrio. Se contaron al menos 50 células en cada sustrato. Los datos de las Figuras 12A y 12B se expresan como media ± ET de tres experimentos independientes y son estadísticamente significativos (*p<0,02). Los experimentos A y B se llevaron a cabo con diferentes lotes de MSC humanas.

Como se muestra en la Figura 12A, aproximadamente el 75 % de las células sembradas de forma dispersa en geles de 250 Pa acumularon gotas lipídicas, mientras que solamente aproximadamente el 20 % de las células sembradas de forma dispersa en geles de 7500 Pa y el 2 % de las células sembradas de forma dispersa en cubreobjetos de vidrio respondieron a medio de diferenciación adipogénica acumulando gotas lipídicas. Notablemente, las MSC humanas en geles de 250 Pa no acumularon gotas lipídicas sin incubación en un medio de diferenciación adipogénica. Estos resultados indican que una matriz blanda facilita la diferenciación adipogénica de MSC humanas.

La diferenciación adipogénica de MSC humanas se consigue típicamente induciendo un cultivo monocapa confluyente en vidrio. Sin embargo, después de 8 días en medio de inducción, se observó un mayor porcentaje de diferenciación en células dispersas inducidas en geles blandos que en células confluyentes en vidrio. Para determinar adicionalmente cómo las señales mecánicas de un gel blando potencian la adipogénesis inducida químicamente, la sensibilidad de MSC humanas en geles de 250 Pa a un medio de diferenciación adipogénico se ensayó induciendo la detención del crecimiento en dos ambientes: (1) sembrar de forma dispersa en geles de 250 Pa y (2) sembradas de forma densa en cubreobjetos de vidrio. La tasa de diferenciación adipogénica se comparó entre estas dos condiciones en respuesta a concentraciones decrecientes de factores de inducción químicos. Como se muestra en la Figura 12B, a medida que se redujo la concentración de los factores adipogénicos, las MSC humanas en geles de 250 Pa mostraron una respuesta similar a la de MSC humanas en cubreobjetos de vidrio. Aunque el cultivo en geles de 250 Pa produjo MSC humanas sembradas de forma dispersa competentes para la diferenciación adipogénica, este ambiente no afectó a la sensibilidad de MSC humanas a su medio de diferenciación adipogénica.

La diferenciación adipogénica eficaz de MSC humanas con crecimiento detenido en geles de 250 Pa plantea la posibilidad de que estas células no proliferativas puedan haberse diferenciado en preadipocitos y haberse comprometido a un linaje adipogénico en lugar de permanecer células madre inactivas. Para determinar si estas células son células madre inactivas o preadipocitos diferenciados, se sembraron de forma dispersa MSC humanas en un gel blando durante dos días, se transfirieron a un cubreobjetos de vidrio usando el método casi tridimensional analizado anteriormente, y finalmente se cultivaron en medio de inducción de osteoblastos durante 24 días (como se ha analizado anteriormente, las células en geles de 250 Pa que se transfirieron a un sustrato rígido tras el contacto reanudaron la proliferación y adquirieron un fenotipo en huso típico de MSC humanas en plástico de cultivo tisular).

Las Figuras 13A y 13B ilustran la deposición de calcio visualizada con Alizarin Red S después de estimulación con medios de osteoinducción. Como se muestra en la Figura 13A, las células se cultivaron en un gel blando durante dos días y después se transfirieron a un cubreobjetos de vidrio usando el método casi tridimensional y después se incubaron con medio de osteoinducción durante 24 días. Como se muestra en la Figura 13B, las MSC humanas se

5 cultivaron en un cubreobjetos de vidrio durante 24 días en medio de osteoinducción. En las Figuras 13A y 13B, la barra de escala es de 200 μm.

Después de 24 días en medio de inducción de osteoblastos, la matriz extracelular rica en calcio era claramente visible en la placa de cultivo y tenía tinción positiva con Alizarin Red S, como se muestra en la Figura 13A. La

10 mineralización de matriz es un marcador de estadio tardío de diferenciación de osteoblastos. (Kundu AK, Putnam AJ, “Vitronectin and collagen I differentially regulate osteogenesis in mesenchymal stem cells”, Biochem Biophys Res Commun. 2006; 347: 347-357).

Para comparación, se sembraron células que no se habían cultivado nunca en un gel blando en un cubreobjetos de

15 vidrio y se trataron con medio de inducción de osteoblastos durante el mismo periodo de tiempo. Como se esperaba, estos sustratos también tuvieron tinción positiva para deposición de calcio, como se muestra en la Figura 13B. Sin estimulación por medio de inducción de osteoblastos, ninguna de las condiciones produjeron matriz extracelular que se tiñera con Alizarin Red S. Estos resultados demuestran que las MSC humanas en geles de 250 Pa mantienen su potencial multilinaje. En consecuencia, estos resultados verifican que las MSC humanas sembradas en geles

20 blandos no se diferencian sino que permanecen inactivas como células madre.

Claims (1)

1. imagen1