DE60312525T2

DE60312525T2 - Biosynthetische matrix und deren verwendung

Info

Publication number: DE60312525T2
Application number: DE60312525T
Authority: DE
Inventors: May Carp GRIFFITH; David J. Ottawa CARLSSON; Fengfu Ottawa LI
Original assignee: National Research Council of Canada; Ottawa Health Research Institute
Current assignee: Forskarpatent 1 Linkoeping Se AB; National Research Council Of Canada Ca
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2023-08-12
Also published as: HK1078886A1; ES2283849T3; US20150071871A1; DE60312525D1; BR0313726A; ATE356838T1; JP2006516038A; EP1741457A1; CN1688622A; KR101053792B1; US20060134050A1; EP1530600B1; MXPA05001570A; EP1530600A1; KR20050083626A; WO2004014969A1; JP2008093451A; CN100491424C; US20060246113A1; AU2003254674A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gewebezüchtung und insbesondere eine biosynthetische Matrix, die ein Hydrogel umfasst, das für eine in vivo-Verwendung geeignet ist.
Die Gewebezüchtung ist ein schnell wachsendes Gebiet, das eine Anzahl von Technologien umfasst, die auf das Ersetzen oder Wiederherstellen von Gewebe- und Organfunktionen abzielten. Das Hauptziel bei der Gewebezüchtung ist die Regeneration eines geschädigten Gewebes durch die Verwendung von Materialien, die in das vorhandene Gewebe integriert werden können, so dass die normale Gewebefunktion wiederhergestellt wird. Die Gewebezüchtung erfordert deshalb Materialien, die ein Überwachsen von Zellen, ein Einwachsen in Zellen oder ein Einkapseln von Zellen und in vielen Fällen eine Nervenregeneration unterstützen können.
Polymerzusammensetzungen werden bei der Gewebezüchtung verbreitet verwendet. Natürliche Biopolymere, wie z.B. Kollagene, Fibrin, Alginate und Agarose sind dafür bekannt, nicht cytotoxisch zu sein und ein Überwachsen lebender Zellen, ein Einwachsen in lebende Zellen und ein Einkapseln lebender Zellen zu unterstützen. Matrizen, die von natürlichen Polymeren abgeleitet sind, sind jedoch für eine Transplantation im Allgemeinen nicht ausreichend widerstandsfähig. Im Gegensatz dazu können Matrizen, die aus synthetischen Polymeren hergestellt sind, so formuliert werden, dass sie vorgegebene physikalische Eigenschaften, wie z.B. eine Gelfestigkeit, sowie biologische Eigenschaften, wie z.B. eine Abbaubarkeit, aufweisen. Berichte, dass synthetische Analoga natürlicher Polymere, wie z.B. Polylysin, Poly(ethylenimin) und dergleichen, cytotoxische Effekte aufweisen können [Lynn & Langer, J. Amer. Chem. Soc., 122, 10761–10768 (2000)], haben zur Entwicklung alternativer synthetischer Polymere für Gewebezüchtungsanwendungen geführt.
Hydrogele sind vernetzte, wasserunlösliche wasserhaltige Polymere, die eine gute biologische Verträglichkeit bieten und eine verminderte Tendenz aufweisen, eine Thrombose, Verkrustungen und Entzündungen zu verursachen, und sie sind als solche ideale Kandidaten für Gewebezüchtungszwecke. Die Verwendung von Hydrogelen in der Zellbiologie ist bekannt [vgl. z.B. A. Atala und R.P. Lanza, Hrsg., „Methods in Tissue Engineering", Academic Press, San Diego, 2002]. Viele verschiedene Hydrogele für in vivo-Anwendungen sind beschrieben worden [vgl. z.B. den Übersichtsartikel von Jeong et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54, 37–51 (2002)]. Beispielsweise sind Hydrogele auf der Basis von N-Isopropylacrylamid (NiPAAm) und bestimmte Copolymere davon nicht toxisch und können das Wachstum eingekapselter Zellen in vitro unterstützen [Vernon et al., Macromol. Symp., 109, 155–167 (1996); Stile et al., Macromolecules, 32, 7370-9 (1999); Stile et al., Biomacromolecules 3, 591–600 (2002), Stile et al., Biomacromolecules 2, 185–194 (2001); Webb et al., MUSC Orthopaedic J., 3, 18–21 (2000); An et al., US-Patent 6,103,528]. Es wurden auch temperaturempfindliche NiPAAm-Polymere zur Verwendung in Immuntests beschrieben [US-Patent 4,780,409]. Trotz der Veränderungen von Synthesebedingungen und Verbesserungen zur Erhöhung der biologischen Verträglichkeit ist es nach wie vor schwierig, eine nahtlose Empfänger-Implantat-Grenzfläche und eine vollständige Integration des Hydrogelimplantats im Empfänger zu erhalten [Hicks et al., Surv. Ophthalmol. 42, 175–189 (1997); Trinkaus-Randall und Nugent, J. Controlled Release 53, 205–214 (1998)].
Modifizierungen synthetischer Polymergele mit einem zweiten, natürlich abgeleiteten Polymer zur Erzeugung einer interpenetrierenden Polymernetzwerk-Struktur („IPN"-Struktur) wurden beschrieben [vgl. z.B. Gutowska et al., Macromolecules, 27, 4167 (1994); Yoshida et al., Nature, 374, 240 (1995); Wu & Jiang, US-Patent 6,030,634; Park et al., US-Patent 6,271,278]. Diese Strukturen werden jedoch häufig durch die Extraktion der natürlich abgeleiteten Komponente durch Kulturmedien und durch physiologische Fluide destabilisiert. Natürlich abgeleitete Polymere neigen auch zu einem schnellen biologischen Abbau innerhalb des Körpers, was zu einer Destabilisierung von in vivo-Implantaten führt.
Widerstandsfähigere Hydrogele, die vernetzte Polymerzusammensetzungen umfassen, wurden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 6,388,047 eine Zusammensetzung, die aus einem hydrophoben Makromer und einem hydrophilen Polymer besteht, die unter Bildung eines Hydrogels durch eine radikalische Polymerisation vernetzt worden sind. Das US-Patent 6,323,278 beschreibt eine vernetzte Polymerzusammensetzung, die sich in situ bilden kann und zwei synthetische Polymere umfasst, enthaltend mehrere elektrophile Gruppen, wobei das andere mehrere nukleophile Gruppen enthält. Beide US-Patente 6,388,047 und 6,384,105 beschreiben Systeme, die durch eine Radikalchemie vernetzt werden müssen, welche die Verwendung von Initiatoren erfordert, von denen bekannt ist, dass sie cytotoxisch sind (Azoverbindungen, Persulfate), was zu möglichen Nebenwirkungen führt, wenn das Hydrogel in einem Gewebe oder mit eingekapselten Zellen verwendet werden soll.
Das US-Patent 6,384,105 beschreibt injizierbare, biologisch abbaubare Polymerverbundmaterialien, die Poly(propylenfumarat) und Poly(ethylenglykol)dimethacrylat, die in situ vernetzt werden können, umfassen. Die in diesem Patent beschriebenen Hydrogele basieren größ tenteils auf Polymeren mit einem Polyethylenoxidgrundgerüstpolymer. Obwohl diese Polymere bekanntermaßen biologisch verträglich sind, ist deren Vermögen zur Unterstützung des Zellwachstums ungewiss.
Das US-Patent 6,566,406 beschreibt biologisch verträgliche, vernetzte Hydrogele, die aus wasserlöslichen Vorstufen mit elektrophilen und nukleophilen Gruppen gebildet werden, die in situ reagieren und vernetzen können. Die Vorstufen werden so beschrieben, dass es sich um ein Polyalkylenoxidpolymer und einen Vernetzer handelt. Wie es vorstehend angegeben worden ist, ist das Vermögen von Polyalkylenoxidgrundgerüstpolymeren, das Zellwachstum zu unterstützen, ungewiss.
Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf für eine verbesserte Matrix, die biologisch verträglich ist, ausreichend widerstandfähig ist, um als Implantat dienen zu können, und die das Zellwachstum in vivo unterstützen kann.
Diese Hintergrundinformationen werden bereitgestellt, um bekannte Informationen anzugeben, von denen der Anmelder annimmt, dass sie für die vorliegende Erfindung möglicherweise relevant sind. Damit ist kein Zugeständnis dahingehend verbunden, dass jedwede der vorstehenden Informationen einen Stand der Technik gegen die vorliegende Erfindung darstellt, noch sollte ein solches abgeleitet werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer biosynthetischen Matrix und von Verwendungen davon. Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Copolymer bereitgestellt, das für die Herstellung einer biosynthetischen Matrix geeignet ist und das ein oder mehrere N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte(s) Acrylamid-Comonomer(e), ein oder mehrere hydrophile(s) Comonomer(e) und ein oder mehrere Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer(e) umfasst, das bzw. die so derivatisiert ist bzw. sind, dass es bzw. sie einen gebundenen reaktiven Rest enthält bzw. enthalten, der bioaktive Moleküle vernetzen kann, wobei das synthetische Polymer ein Zahlenmittel der Molekularmasse zwischen etwa 2000 und etwa 1000000 aufweist, wobei das synthetische Copolymer mit primären Aminen mittels des gebundenen vernetzbaren Rests reaktiv ist.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird eine biosynthetische Matrix bereitgestellt, die das synthetische Copolymer, ein Biopolymer und ein wässriges Lösungsmittel umfasst, wobei das synthetische Copolymer und das Biopolymer unter Bildung eines Hydrogels vernetzt sind.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung werden Anwendungen für die biosynthetische Matrix als ein Gerüst für die Geweberegeneration, zum Ersetzen von geschädigtem oder entferntem Gewebe in einem Tier oder zum Beschichten chirurgischer Implantate bereitgestellt.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel oder eine Mehrzahl von Zellen, ein erfindungsgemäßes synthetisches Copolymer, ein Biopolymer und ein wässriges Lösungsmittel umfassen.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird ein Implantat zur Verwendung bei der Gewebezüchtung bereitgestellt, das eine im Vorhinein gebildete biosynthetische Matrix umfasst, wobei die Matrix ein wässriges Lösungsmittel und ein Biopolymer, das mit einem erfindungsgemäßen synthetischen Copolymer vernetzt ist, umfasst.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird eine Verwendung des Implantats als eine künstliche Hornhaut bereitgestellt.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung werden ein Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Copolymers, umfassend: (a) Dispergieren von einem oder mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte(n) Acrylamid-Comonomer(en), einem oder mehreren hydrophilen Comonomer(en) und einem oder mehreren Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer(en), das bzw. die so derivatisiert ist bzw. sind, dass es bzw. sie einen gebundenen vernetzbaren Rest umfasst bzw. umfassen, in einem Lösungsmittel in der Gegenwart eines Initiators; (b) Polymerisierenlassen des einen oder der mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierten Acrylamid-Comonomers bzw. -Comonomere, des einen oder der mehreren hydrophilen Comonomers bzw. -Comonomere und des einen oder der mehreren Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomers bzw. -Comonomere, zur Bildung eines synthetischen Copolymers und (c) gegebenenfalls Reinigen des synthetischen Copolymers, und ein Verfahren zur Herstellung einer biosynthetischen Matrix, umfassend das Herstellen eines synthetischen Copolymers, Dispergieren des synthetischen Copolymers und eines Biopolymers in einem wässrigen Medium und Vernetzenlassen des synthetischen Copolymers und des Biopolymers zur Bereitstellung der biosynthetischen Matrix, bereitgestellt.
Die 1 zeigt die allgemeine Struktur eines Terpolymers gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, das N-Isopropylacrylamid (NiPAAm), Acrylsäure (AAc) und N-Acryloxysuccinimid (ASI) umfasst.
Die 2 zeigt die klinischen Ergebnisse der Transplantation von künstlichen Hornhäuten, die aus einer biosynthetischen Matrix gemäß einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt worden sind, in Schweine.
Die 3 zeigt die Ergebnisse einer in vivo-Konfokalmikroskopie von künstlichen Hornhäuten, die aus einer biosynthetischen Matrix gemäß einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt und in Schweine transplantiert worden sind, 6 Wochen nach der Operation.
Die 4 zeigt das in vivo-Testen bezüglich der Hornhautempfindlichkeit von künstlichen Hornhäuten, die aus einer biosynthetischen Matrix gemäß einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt und in Schweine transplantiert worden sind.
Die 5, 6 und 7 zeigen die Ergebnisse einer morphologischen und biochemischen Bewertung von künstlichen Hornhäuten, die aus einer biosynthetischen Matrix gemäß einer Ausführungsform der Erfindung hergestellt und in Schweine transplantiert worden sind.
Die 8 zeigt (A) die Struktur eines Terpolymers, das ein vernetztes bioaktives Mittel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält, (B) ein Hornhautgerüst, das aus vernetztem Kollagen und dem in (A) gezeigten Terpolymer zusammengesetzt ist, und (C) ein Hornhautgerüst, das nur aus wärmegeliertem Kollagen zusammengesetzt ist.
Die 9 und 10 zeigen die Ergebnisse der Abgabe eines Kollagen-enthaltenden Hydrogels und eines bioaktiven Terpolymermittels gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in Mäuse- und Rattengehirnen.
Die 11 zeigt den Modul (A) und die Belastung beim Versagen (B) von Messungen des Herausziehens einer Wundnaht als Funktion der Konzentrationsverhältnisse von N-Acryloxysuccinimid- zu Kollagenamingruppen für Hydrogelmatrizen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Die 12 zeigt die Durchlässigkeit (A) und die Rückstreuung (B) von Licht im sichtbaren Bereich als Funktion der Konzentrationsverhältnisse von N-Acryloxysuccinimid- zu Kollagenamingruppen für Hydrogelmatrizen gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
Die 13 zeigt die Durchlässigkeit (A) und die Rückstreuung (B) von Licht im sichtbaren Bereich als Funktion der Konzentrationsverhältnisse von N-Acryloxysuccinimid- zu Kollagenamingruppen für eine Hydrogelmatrix gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
Die 14 zeigt die Wiederherstellung der Berührungsempfindlichkeit für ein Schweinehornhautimplantat, das ein Hydrogel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst.
Die 15 zeigt ein Hornhautimplantierungsverfahren durch eine lamelläre Keratoplastie in Schweinen und klinische konfokalmikroskopische in vivo-Bilder von 6 Wochen alten Implantaten, die ein Hydrogel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfassen. Balken = 25 μm für D–F, 15 μm für G–O.
Die 16 zeigt die Hornhautregeneration nach der Chirurgie in Schweinen, die Hornhautimplantate erhalten haben, die ein Hydrogel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfassen. Balken = 100 μm für A–F, 40 μm für G-I, 200 nm für J–L, 20 μm für M–O, 30 μm für P–R.
Die 17 zeigt die postchirurgische Implantat-Empfänger-Integration 6 Wochen nach der Chirurgie in Schweinen, die Hornhautimplantate erhalten haben, die ein Hydrogel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfassen. Balken = 100 μm in allen Fällen.
Die 18 zeigt die Hornhautberührungsempfindlichkeit für Implantate in Schweinen, die Hornhautimplantate erhalten haben, die ein Hydrogel gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfassen.
Die 19 zeigt die Ergebnisse eines Innervierungskompatibilitätstests mit verschiedenen Hydrogelmatrizen.
Die 20 zeigt das Epithelzellenwachstum und die Epithelzellenschichtung auf verschiedenen Hydrogelen. (A) Ansichten des Epithelwachstums auf den Hydrogelen bei geringer Vergrößerung (der Kasten zeigt eine stärkere Vergrößerung) und (B) Zählungen der Zellendicke des Epithels, das über den Hydrogelen gewachsen ist.
Definitionen
Falls nichts anderes definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise vom Fachmann des Gebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden.
Der Begriff „Hydrogel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein vernetztes Polymermaterial, welches das Vermögen aufweist, in Wasser oder einer wässrigen Lösung zu quellen, ohne sich zu lösen, und einen signifikanten Anteil an Wasser oder einer wässrigen Lösung innerhalb dessen Struktur zurückzuhalten.
Der Begriff „Polymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das aus einzelnen Monomeren besteht, die miteinander verbunden sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Polymer Monomere umfassen, die „Ende-mit-Ende" verbunden sind, so dass ein lineares Molekül gebildet wird, oder es kann Monomere umfassen, die so miteinander verbunden sind, dass eine verzweigte Struktur gebildet wird.
Der Begriff „Monomer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein einfaches organisches Molekül, das eine lange Kette entweder allein oder in einer Kombination mit anderen ähnlichen organischen Molekülen bilden kann, so dass ein Polymer erhalten wird.
Der Begriff „Copolymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer, das zwei oder mehr verschiedene Monomere umfasst. Copolymere können regelmäßig sein, statistisch sein, als Blockcopolymere vorliegen oder gepfropft sein. Ein regelmäßiges Copolymer ist ein Copolymer, bei dem sich die Monomere in einer regelmäßigen Struktur wiederholen (z.B. kann für die Monomere A und B ein regelmäßiges Copolymer die Sequenz ABABABAB aufweisen). Ein statistisches Copolymer ist ein Copolymer, bei dem die verschiedenen Monomere zufällig oder statistisch in jedem einzelnen Polymermolekül angeordnet sind (z.B. kann für die Monomere A und B ein statistisches Copolymer die Sequenz AABABBABBBAAB aufweisen). Im Gegensatz dazu ist ein Blockcopolymer ein Copolymer, bei dem die unterschiedlichen Monomere innerhalb jedes einzelnen Polymermoleküls in getrennte Bereiche aufgeteilt sind (z.B. kann für die Monomere A und B ein Blockcopolymer die Sequenz AAABBBAAABBB aufweisen). Ein Propfcopolymer ist ein Copolymer, das durch Verknüpfen eines Polymers oder von Polymeren eines Typs mit einem anderen Polymermolekül einer anderen Zusammensetzung hergestellt wird.
Der Begriff „Terpolymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Copolymer, das drei verschiedene Monomere umfasst.
Der Begriff „Biopolymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes Polymer. Natürlich vorkommende Polymere umfassen Proteine und Kohlenhydrate. Der Begriff „Biopolymer" umfasst auch derivatisierte Formen der natürlich vorkommenden Polymere, die modifiziert worden sind, um ein Vernetzen an ein erfindungsgemäßes synthetisches Polymer zu erleichtern.
Der Ausdruck „synthetisches Polymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer, das nicht natürlich vorkommt und das durch eine chemische oder rekombinante Synthese hergestellt wird.
Die Begriffe „Alkyl" und „Niederalkyl" werden hier austauschbar verwendet, um eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen zu bezeichnen. Beispiele für diese Begriffe sind Gruppen wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, 1-Butyl (oder 2-Methylpropyl), i-Amyl, n-Amyl, Hexyl, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und dergleichen.
Der Ausdruck „bioaktives Mittel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül oder eine Verbindung, das bzw. die in vivo einen physiologischen, therapeutischen oder diagnostischen Effekt ausübt. Bioaktive Mittel können organisch oder anorganisch sein. Repräsentative Beispiele umfassen Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und Fragmente davon, Antitumorverbindungen und antineoplastische Verbindungen, antivirale Verbindungen, entzündungshemmende Verbindungen, antibiotische Verbindungen, wie z.B. fungizide und antibakterielle Verbindungen, Cholesterin-senkende Arzneistoffe, Analgetika, Kontrastmittel für die medizinische diagnostische Bildgebung, Enzyme, Cytokine, Lokalanästhetika, Hormone, antiangiogene Mittel, Neurotransmitter, therapeutische Oligonukleotide, virale Teilchen, Vektoren, Wachstumsfaktoren, Retinoide, Zelladhäsionsfaktoren, extrazelluläre Matrixglykoproteine (wie z.B. Laminin), Hormone, osteogene Faktoren, Antikörper und Antigene.
Der Begriff „biologisch verträglich", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das Vermögen, in ein biologisches System einbezogen zu werden, wie z.B. in ein Organ oder ein Gewebe eines Tiers, ohne eine Immunreaktion und/oder eine Entzündungsreaktion, eine Fibrose oder eine andere nachteilige Gewebereaktion zu stimulieren.
Der Begriff „etwa", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Variation vom Nennwert um ± 10 %. Es sollte beachtet werden, dass eine solche Variation in jedwedem hier angegebenen Wert immer enthalten ist, und zwar unabhängig davon, ob spezifisch darauf hingewiesen wird oder nicht.
1. Biosynthetische Matrix
Die vorliegende Erfindung stellt eine biosynthetische Matrix bereit, die ein Hydrogel umfasst, das durch Vernetzen eines synthetischen Polymers und eines Biopolymers gebildet wird. Das Biopolymer kann in seiner natürlich vorkommenden Form vorliegen oder es kann derivatisiert werden, um die Vernetzung an das synthetische Polymer zu erleichtern. Die Matrix ist widerstandsfähig, biologisch verträglich und nicht cytotoxisch. Die Matrix kann in wässriger Lösung bei einem neutralen pH-Wert gebildet und so maßgeschneidert werden, dass sie ferner ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Retinoide, Zelladhäsionsfaktoren, Enzyme, Peptide, Proteine, Nukleotide, Arzneistoffe und dergleichen umfasst. Das bioaktive Mittel kann kovalent an das synthetische Polymer gebunden werden oder es kann innerhalb der fertiggestellten Matrix eingekapselt und dispergiert sein, und zwar abhängig von den Anforderungen an die Matrix bezüglich der Endanwendung. Die Matrix kann auch Zellen umfassen, die darin eingekapselt und dispergiert sind, und sich bei der Anordnung der Matrix in vivo vermehren und/oder diversifizieren können.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unterstützt die biosynthetische Matrix das Zellenwachstum. Ein solches Zellenwachstum kann eine Epithel- und/oder Endotheloberflächenbedeckung (d.h. ein zweidimensionales, 2D, Wachstum) und/oder ein dreidimensionales (3D) Zellenwachstum sein, welches das Wachsen in die Matrix selbst umfasst.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung unterstützt die biosynthetische Matrix das Einwachsen von Nerven. Es ist bekannt, dass das Nervenwachstum in transplantiertes Gewebe über einen längeren Zeitraum stattfindet, typischerweise in der Größenordnung von Monaten oder Jahren. Das Wachstum von Nerven in die Matrix kann schneller stattfinden als das Wachstum von Nerven in transplantiertes Gewebe, was zu einer schnelleren Regeneration von funktionellem Gewebe führt, wobei z.B. das Einwachsen von Nerven innerhalb von Wochen stattfinden kann.
Die biosynthetische Matrix kann für spezifische Anwendungen maßgeschneidert werden. Beispielsweise kann die Matrix bei Gewebezüchtungsanwendungen eingesetzt werden und kann für diesen Zweck in eine spezifische Form vorgeformt werden. Die Matrix kann auch als Arzneistoffabgabevehikel zur Bereitstellung einer verlängerten Freisetzung einer therapeutischen oder diagnostischen Verbindung an einer bestimmten Stelle innerhalb des Körpers eines Tiers verwendet werden.
Um für eine in vivo-Implantierung für Gewebezüchtungszwecke geeignet zu sein, muss die biosynthetische Matrix ihre Form bei physiologischen Temperaturen beibehalten, in Wasser im Wesentlichen unlöslich sein, ausreichend widerstandsfähig sein und das Wachstum von Zellen unterstützen. Es kann auch bevorzugt sein, dass die Matrix das Wachstum der Nerven unterstützt.
1.1 Synthetisches Polymer
Erfindungsgemäß ist das synthetische Polymer, das in die biosynthetische Matrix einbezogen ist, ein Copolymer, das ein oder mehrere Acrylamidderivat(e), ein oder mehrere hydrophile(s) Comonomer(e) und ein oder mehrere derivatisierte Carbonsäure-Comonomer(e) umfasst, das bzw. die gebundene vernetzbare Reste enthält bzw. enthalten.
„Acrylamidderivat" bezieht sich hier auf ein N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituiertes Acrylamid oder Methacrylamid. Beispiele für Acrylamidderivate, die zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen synthetischen Polymer geeignet sind, umfassen N-Methylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-Isopropylacrylamid (NiPAAm), N-Octylacrylamid, N-Cyclohexylacrylamid, N-Methyl-N-ethylacrylamid, N-Methylmethacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, N,N-Dicyclohexylacrylamid, N-Methyl-N-cyclohexylacrylamid, N-Acryloylpyrrolidin, N-Methacryloylpyrrolidin und Kombinationen davon.
Ein „hydrophiles Comonomer" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf ein hydrophiles Monomer, das mit dem Acrylamidderivat und den derivatisierten Carbonsäurekomponenten des synthetischen Polymers copolymerisieren kann. Das hydrophile Comonomer wird so ausgewählt, dass es eine angemessene Löslichkeit für eine Polymerisation, eine wässrige Löslichkeit des Copolymers und keinen Phasenübergang des fertiggestellten Copolymers und des Hydrogels bereitstellt. Beispiele für geeignete hydrophile Comonomere sind hydrophile Acryl- oder Methacrylverbindungen, wie z.B. Carbonsäuren, einschließlich Acrylsäure, Methacrylsäure und Derivate davon, Acrylamid, Methacrylamid, hydrophile Acrylamidderivate, hydrophile Methacrylamidderivate, hydrophile Acrylsäureester, hydrophile Methacrylsäureester, Vinylethanol und deren Derivate, und Ethylenglykole. Die Carbonsäuren und Derivate können z.B. Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) oder eine Kombination davon sein. Beispiele für hydrophile Acrylamidderivate umfassen N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylacrylamid, 2-[N,N-Diethylamino]ethylacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, 2-(N,N-Dimethylamino]ethylmethacrylamid, 2-[N,N-Diethylamino]ethylmethacrylamid, N-Vinyl-2-pyrrolidinon oder Kombinationen davon. Beispiele für hydrophile Acrylester umfas sen 2-[N,N-Diethylamino]ethylacrylat, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylacrylat, 2-[N,N-Diethylamino]ethylmethacrylat, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylmethacrylat oder Kombinationen davon.
„Derivatisiertes Carbonsäure-Comonomer" bezieht sich hier auf eine hydrophile Acryl- oder Methacrylcarbonsäure, wie z.B. Acrylsäure, Methacrylsäure oder eine substituierte Version davon, die chemisch so derivatisiert worden ist, dass sie einen vernetzenden Rest enthält, wie z.B. Succinimidylgruppen, Imidazole, Benzotriazole und p-Nitrophenole. Der Begriff „Succinimidylgruppe" soll Variationen der generischen Succinimidylgruppe umfassen, wie z.B. Sulfosuccinimidylgruppen. Andere entsprechende Strukturen, wie z.B. 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, sind dem Fachmann ebenfalls geläufig. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wirkt die Gruppe, die als vernetzender Rest ausgewählt worden ist, dahingehend, dass sie die Reaktivität der Carbonsäuregruppe, an die sie gebunden ist, bezüglich primärer Amine (d.h. -NH₂-Gruppen) und Thiole (d.h. -SH-Gruppen) erhöht. Beispiele für geeignete Gruppen zur Derivatisierung der Carbonsäure-Comonomere zur Verwendung in dem synthetischen Polymer umfassen N-Succinimid, N-Succinimid-3-sulfonsäure, N-Benzotriazol, N-Imidazol und p-Nitrophenol.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das synthetische Polymer

(a) ein oder mehrere Acrylamidderivat(e) der allgemeinen Formel I:
worin: R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig aus der Gruppe von H und Niederalkyl ausgewählt sind;
(b) ein oder mehrere hydrophile Comonomer(e) (das bzw. die mit (a) identisch oder davon verschieden sein kann bzw. können) der allgemeinen Formel II:
worin: Y O ist oder nicht vorliegt; R₆ und R₇ unabhängig aus der Gruppe von H und Niederalkyl ausgewählt sind; R₈ H, Niederalkyl oder -OR' ist, wobei R' H oder Niederalkyl ist; und R₉ H, Niederalkyl oder -C(O)R₁₀ ist, und R₁₀ -NR₄R₅ oder -OR'' ist, wobei R'' H oder CH₂CH₂OH ist;
und (c) eine oder mehrere derivatisierte Carbonsäure(n) der allgemeinen Formel III:
worin: R₁₁, R₁₂ und R₁₃ unabhängig aus der Gruppe von H und Niederalkyl ausgewählt sind, und Q N-Succinimido, 3-Sulfosuccinimido (Natriumsalz), N-Benzotriazolyl, N-Imidazolyl oder p-Nitrophenyl ist.

In einer Ausführungsform umfasst das synthetische Polymer ein oder mehrere Acrylamidderivat(e) der allgemeinen Formel (I), ein oder mehrere hydrophile Comonomer(e) der allgemeinen Formel II und eine oder mehrere derivatisierte Carbonsäure(n) der allgemeinen Formel III, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, wobei sich der Ausdruck „Niederalkyl" auf eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bezieht.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das synthetische Polymer ein oder mehrere Acrylamidderivat(e) der allgemeinen Formel (I), ein oder mehrere hydrophile Comonomer(e) der allgemeinen Formel II und eine oder mehrere derivatisierte Carbonsäure(n) der allgemeinen Formel III, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, wobei sich der Ausdruck „Niederalkyl" auf eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl bezieht.
Das Copolymer kann linear oder verzweigt, regelmäßig, statistisch oder blockartig sein. Erfindungsgemäß umfasst das fertiggestellte synthetische Polymer eine Mehrzahl gebundener reaktiver Reste, die für ein Vernetzen oder Pfropfen geeigneter Biomoleküle zur Verfügung stehen.
Dem Fachmann ist geläufig, dass sich die Gruppe von Verbindungen, die von dem Begriff „Acrylamidderivat" umfasst ist, und die Gruppe von Verbindungen, die von dem Begriff „hydrophiles Comonomer" umfasst ist, wesentlich überlappen und dass ein einzelnes Monomer ausgewählt werden könnte, das die Funktionen dieser beiden Komponenten in dem Copolymer erfüllt. Folglich kann z.B. dann, wenn ein Acrylamidderivat ausgewählt wird, das ausreichend hydrophil ist, um dem synthetischen Polymer die gewünschten Eigenschaften zu verleihen, eine hydrophile Comonomerkomponente ausgewählt werden, die mit dem ausgewählten Acrylamidderivat identisch ist, was zu einem Copolymer führt, das nur zwei verschiedene Monomere umfasst (d.h. das Acrylamidderivat/hydrophile Comonomer und das derivatisierte Carbonsäure-Comonomer). Wenn andererseits eine erhöhte Hydrophilie über diejenige hinaus erwünscht ist, die durch das ausgewählte Acrylamidderivat bereitgestellt wird, dann kann bzw. können ein oder mehrere verschiedene hydrophile Comonomer(e) ausgewählt werden, was zu einem Copolymer führt, das mindestens drei verschiedene Monomere umfasst.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Acrylamidderivat und das hydrophile Comonomer, die bei der Herstellung des synthetischen Polymers verwendet werden, identisch. In einer anderen Ausführungsform sind das Acrylamidderivat und das hydrophile Comonomer, die bei der Herstellung des synthetischen Polymers verwendet werden, verschieden.
Die Gesamthydrophilie des Copolymers wird so eingestellt, dass bei 0°C bis zu physiologischen Temperaturen eine Wasserlöslichkeit bereitgestellt wird, ohne dass eine Ausfällung oder ein Phasenübergang stattfindet. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Copolymer zwischen etwa 0°C und etwa 37°C wasserlöslich.
Das Copolymer sollte in einer wässrigen Lösung ausreichend löslich sein, so dass eine Hydrogelbildung erleichtert wird. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung soll sich daher der Begriff „wasserlöslich" auf eine wässrige Löslichkeit des Copolymers von mindestens etwa 0,5 Gewicht/Volumen (w/v) % beziehen. In einer anderen Ausführungsform weist das Copolymer eine wässrige Löslichkeit zwischen etwa 1,0 w/v % und etwa 50 w/v % auf. In weiteren Ausführungsformen weist das Copolymer eine wässrige Löslichkeit zwischen etwa 5 w/v % und etwa 45 w/v % und zwischen etwa 10 w/v % und etwa 35 w/v % auf.
Es ist bekannt, dass die meisten synthetischen Polymere eine Verteilung der Molekularmasse aufweisen und dass häufig verschiedene Durchschnittswerte der Molekularmasse unterschieden werden, wie z.B. das Zahlenmittel der Molekularmasse (M_n) und das Gewichtsmittel der Molekularmasse (M_w). Das Molekulargewicht eines synthetischen Polymers wird üblicherweise als dessen Zahlenmittel der Molekularmasse (M_n) definiert, das wiederum als die Summe von n_iM_i dividiert durch die Summe von n_i definiert ist, wobei n_i die Anzahl von Molekülen in der Verteilung mit der Masse M_i ist. Das synthetische Polymer zur Verwendung in der Matrix der vorliegenden Erfindung weist ein Zahlenmittel der Molekularmasse (M_n) zwischen 2000 und 1000000 auf. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das M_n des Polymers zwischen etwa 5000 und etwa 90000. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das M_n des Polymers zwischen etwa 25000 und etwa 80000. In einer anderen Ausführungsform liegt das M_n des Polymers zwischen etwa 30000 und etwa 50000. In einer anderen Ausführungsform liegt das M_n des Polymers zwischen etwa 50000 und etwa 60000.
Es ist auch bekannt, dass bestimmte wasserlösliche Polymere eine(n) niedrigere(n) kritische(n) Lösungstemperatur (LCST) oder „Trübungspunkt" aufweisen. Die LCST eines Polymers ist die Temperatur, bei der eine Phasentrennung stattfindet (d.h. das Polymer sich von dem umgebenden wässrigen Medium zu trennen beginnt). Typischerweise entspricht für diejenigen Polymere oder Hydrogele, die klar sind, die LCST auch dem Punkt, an dem die Klarheit beginnt, verloren zu gehen. Es ist ersichtlich, dass für bestimmte Gewebezüchtungsanwendungen die Gegenwart oder das Fehlen einer Phasentrennung in dem fertiggestellten Hydrogel nicht relevant ist, mit der Maßgabe, dass das Hydrogel nach wie vor das Zellwachstum unterstützt. Für andere Anwendungen kann jedoch ein Fehlen einer Phasentrennung in dem fertiggestellten Hydrogel kritisch sein. Beispielsweise ist für optische Anwendungen eine Klarheit (und daher das Fehlen jedweder Phasentrennung) wichtig.
Folglich werden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Copolymere mit einer LCST zwischen etwa 35°C und etwa 60°C zur Verwendung in den Hydrogelen ausgewählt. In einer anderen Ausführungsform werden Copolymere mit einer LCST zwischen etwa 42°C und etwa 60°C zur Verwendung in den Hydrogelen ausgewählt. Es ist auch bekannt, dass die LCST eines Polymers durch die Gegenwart verschiedener gelöster Stoffe, wie z.B. Ionen oder Proteine, und durch die Natur von Verbindungen, die mit dem Polymer verknüpft oder an dieses gebunden sind, beeinflusst werden kann. Solche Effekte können empirisch unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden und die Auswahl eines synthetischen Polymers mit einer geeigneten LCST für eine bestimmte Anwendung kann vom Durchschnittsfachmann vorgenommen werden.
Wenn ein synthetisches Polymer zweckmäßig widerstandsfähig und wärmestabil sein soll, ist es wichtig, dass das Verhältnis von Acrylamidderivat(en) zu hydrophilem bzw. hydrophilen Comonomer(en) optimiert wird, wenn für diese Komponenten verschiedene Monomere verwendet werden. Demgemäß liegt das bzw. liegen die Acrylamidderivat(e) in dem synthetischen Polymer in dem höchsten molaren Anteil vor. Darüber hinaus wird die Anzahl von derivatisierten Carbonsäure-Comonomeren, die in dem fertiggestellten Polymer vorliegen, das Vermögen des synthetischen Gels bestimmen, Vernetzungen mit dem Biopolymer in der biosynthetischen Matrix zu bilden. Die Auswahl geeigneter molarer Anteile jeder Komponente, um ein fertiggestelltes synthetisches Polymer mit den gewünschten Eigenschaften auszustatten, kann vom Durchschnittsfachmann vorgenommen werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfidung liegt dann, wenn verschiedene Monomere als das Acrylamidderivat und die hydrophilen Comonomerkomponenten verwendet werden, die Menge an Acrylamidderivat in dem Polymer zwischen 50 % und 90 %, die Menge des hydrophilen Comonomers liegt zwischen 5 % und 50 % und die Menge des derivatisierten Carbonsäure-Comonomers liegt zwischen 0,1 % und 15 %, wobei die Summe der Mengen an Acrylamidderivat, an hydrophilem Comonomer und an derivatisiertem Carbonsäure-Comonomer 100 % beträgt, wobei der %-Wert den molaren Anteil darstellt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das synthetische Polymer unter Verwendung des gleichen Monomers für das Acrylamidderivat und das hydrophile Comonomer hergestellt und der molare Anteil von Acrylamidderivat/hydrophiles Comonomer liegt zwischen 50 % und etwa 99,5 % und der molare Anteil des derivatisierten Carbonsäure-Comonomers liegt zwischen etwa 0,5 % und etwa 50 %.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegt der kombinierte molare Anteil des Acrylamidderivats und des hydrophilen Comonomers zwischen etwa 80 % und etwa 99 % und der molare Anteil des derivatisierten Carbonsäure-Comonomers liegt zwischen etwa 1 % und etwa 20 %.
Dem Fachmann ist klar, dass die Auswahl und der Anteil der Komponenten in dem synthetischen Polymer in unterschiedlichem Ausmaß von der Endanwendung für die biosynthetische Matrix abhängen werden. Beispielsweise ist es für ophthalmische Anwendungen wichtig, dass die fertiggestellte Matrix klar ist, wohingegen für andere Gewebezüchtungsanwendungen die Klarheit der Matrix gegebenenfalls kein wichtiger Faktor ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das synthetische Polymer ein statistisches Copolymer oder ein Blockcopolymer, das ein Acrylamidderivat, ein hydrophiles Comonomer und ein derivatisiertes Carbonsäure-Comonomer umfasst (ein „Terpolymer"). In einer anderen Ausführungsform ist das synthetische Polymer ein Terpolymer, das ein NiPAAm-Monomer, ein Acrylsäuremonomer (AAc-Monomer) und ein derivatisiertes Acrylsäuremonomer umfasst. In einer weiteren Ausführungsform ist das synthetische Polymer ein Terpolymer, das ein NiPAAm-Monomer, ein Acrylamidmonomer (AAm-Monomer) und ein derivatisiertes Acrylsäuremonomer umfasst. In einer weiteren Ausführungsform ist das derivatisierte Acrylsäuremonomer N-Acryloxysuccinimid. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Terpolymer mit einem Beschickungsverhältnis hergestellt, das NiPAAm-Monomer, AAc-Monomer und N-Acryloxysuccinimid in einem Verhältnis von etwa 85:10:5 mol-% umfasst.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist das synthetische Polymer ein statistisches Copolymer oder ein Blockcopolymer, das ein Acrylamidderivat/hydrophiles Comonomer und ein Carbonsäure-Comonomer umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst das synthetische Polymer ein DMAA-Monomer und ein derivatisiertes Acrylsäuremonomer. In einer weiteren Ausführungsform ist das derivatisierte Acrylsäuremonomer N-Acryloxysuccinimid. In einer anderen Ausführungsform wird ein synthetisches Polymer mit einem Beschickungsverhältnis hergestellt, das DMAA-Monomer und N-Acryloxysuccinimid in einem Verhältnis von etwa 95:5 mol-% umfasst.
1.2 Biopolymer
Biopolymere sind natürlich vorkommende Polymere, wie z.B. Proteine und Kohlenhydrate. Erfindungsgemäß umfasst die biosynthetische Matrix ein Biopolymer oder eine derivatisierte Version davon, das bzw. die mit dem synthetischen Polymer mittels der gebundenen Vernetzungsreste in dem synthetischen Polymer vernetzt ist. Folglich enthält das Biopolymer für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere Gruppe(n), die mit dem Vernetzungsrest reagieren kann bzw. können (z.B. ein primäres Amin oder ein Thiol), oder es kann so derivatisiert werden, dass es eine solche Gruppe enthält. Beispiele für geeignete Biopolymere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen unter anderem Kollagene (einschließlich die Typen I, II, III, IV und V), denaturierte Kollagene (oder Gelatine), rekombinante Kollagene, Fibrin-Fibrinogen, Elastin, Glykoproteine, Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfate und Glykosaminoglykane (oder Proteoglykane). Dem Fachmann ist geläufig, dass einige dieser Biopolymere gegebenenfalls derivatisiert werden müssen, so das sie eine geeignete reaktive Gruppe, wie sie vorstehend angegeben worden ist, enthalten, wobei z.B. Glukosaminoglykane deacetyliert oder desulfatiert werden müssen, um eine primäre Aminogruppe aufzuweisen. Eine solche Derivatisierung kann mittels Standardtechniken erreicht werden und ist dem Fachmann geläufig.
Geeignete Biopolymere zur Verwendung in der Erfindung können von verschiedenen kommerziellen Quellen erworben werden oder aus natürlichen Quellen mittels Standardtechniken hergestellt werden.
1.3 Bioaktive Mittel
Wie es vorstehend beschrieben worden ist, enthält das synthetische Polymer, das in die biosynthetische Matrix der vorliegenden Efindung einbezogen wird, eine Mehrzahl gebundener vernetzender Reste. Es ist offensichtlich, dass eine ausreichende Vernetzung des synthetischen Polymers und von Biopolymeren zum Erreichen einer zweckmäßig widerstandfähigen Matrix erreicht werden kann, ohne dass alle freien vernetzenden Gruppen reagieren. Überschüssige Gruppen können daher gegebenenfalls verwendet werden, um gewünschte bioaktive Mittel an die Matrix zu binden. Nicht-beschränkende Beispiele bioaktiver Mittel, die in die Matrix durch Vernetzen einbezogen werden können, umfassen z.B. Wachstumsfaktoren, Retinoide, Enzyme, Zelladhäsionsfaktoren, extrazelluläre Matrixglykoproteine (wie z.B. Laminin, Fibronektin, Tenascin und dergleichen), Hormone, osteogene Faktoren, Cytokine, Antikörper, Antigene und andere bioaktive Proteine, bestimmte pharmazeutische Verbindungen, sowie Peptide, Fragmente oder Motive, die von bioaktiven Proteinen abgeleitet sind.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die vernetzenden Gruppen Succinimidylgruppen und geeignete bioaktive Mittel zum Pfropfen an das Polymer sind diejenigen, die entweder primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen enthalten, oder die leicht derivatisiert werden können, so dass sie diese Gruppen enthalten.
2. Verfahren zur Herstellung der biosynthetischen Matrix
2.1 Herstellung des synthetischen Polymers
Eine Copolymerisation der Komponenten für das synthetische Polymer kann unter Verwendung bekannter Standardverfahren erreicht werden [vgl. z.B. A. Ravve, „Principles of Polymer Chemistry", Kapitel 3, Plenum Press, New York, 1995]. Typischerweise geeignete Mengen jedes der Monomere werden in einem geeigneten Lösungsmittel in der Gegenwart eines Initiators dispergiert. Das Gemisch wird bei einer geeigneten Temperatur gehalten und die Copolymerisationsreaktion wird für einen vorgegebenen Zeitraum ablaufen gelassen. Das resultierende Polymer kann dann aus dem Gemisch mit herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, wie z.B. durch Ausfällung.
Das Lösungsmittel für die Copolymerisationsreaktion kann ein nicht-wässriges Lösungsmittel sein, wenn ein oder mehrere Monomer(e) bezüglich einer Hydrolyse empfindlich ist bzw. sind, oder es kann sich um ein wässriges Lösungsmittel handeln. Geeignete wässrige Lösungsmittel umfassen unter anderem Wasser, Puffer und Salzlösungen. Geeignete nichtwässrige Lösungsmittel sind typischerweise cyclische Ether (wie z.B. Dioxan), chlorierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Chloroform) oder aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Benzol). Das Lösungsmittel kann gegebenenfalls vor der Verwendung mit Stickstoff gespült werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Lösungsmittel ein nicht-wässriges Lösungsmittel. In einer anderen Ausführungsform ist das Lösungsmittel Dioxan.
Geeignete Polymerisationsinitiatoren sind bekannt und es handelt sich dabei üblicherweise um radikalische Initiatoren. Beispiele für geeignete Initiatoren umfassen unter anderem 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN), andere Azoverbindungen, wie z.B. 2,2'-Azobis-2-ethylpropionitril, 2,2'-Azobis-2-cyclopropylpropionitril, 2,2'-Azobiscyclohexannitril, 2,2'-Azobiscyclooctannitril, und Peroxidverbindungen, wie z.B. Dibenzoylperoxid und dessen substituierte Analoga, und Persulfate, wie z.B. Natrium, Kalium und dergleichen.
Sobald das Polymer hergestellt und gegebenenfalls gereinigt worden ist, kann es durch verschiedene Standardtechniken charakterisiert werden. Beispielsweise kann die molare Anteilszusammensetzung des Polymers mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (Proton und/oder Kohlenstoff-13) bestimmt werden und die Bindungsstruktur kann durch Infrarotspektroskopie bestimmt werden. Die Molekularmasse kann durch Gelpermeationschromatographie und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt werden. Die thermische Charakterisierung des Polymers kann gegebenenfalls auch durch Bestimmen des Schmelzpunkts und der Glasübergangstemperaturen unter Verwendung einer differentialscanningkalorimetrischen Analyse durchgeführt werden. Die Eigenschaften einer wässrigen Lösung, wie z.B. eine Mizellen- und Gelbildung sowie die LCST können mittels visueller Untersuchung, Fluoreszenzspektroskopie, UV-VIS-Spektroskopie und Laserlichtstreuungsgeräten bestimmt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das synthetische Polymer durch Dispergieren der Monomere in mit Stickstoff gespültem Dioxan in der Gegenwart des Initiators AIBN und Durchführen der Polymerisation bei einer Temperatur von etwa 60°C bis 70°C hergestellt. Das resultierende Polymer wird durch wiederholte Ausfällung gereinigt.
2.2 Herstellung des Hydrogels
Das Vernetzen des synthetischen Polymers und des Biopolymers kann einfach durch Mischen geeigneter Mengen jedes Polymers bei Raumtemperatur in einem geeigneten Lösungsmittel erreicht werden. Typischerweise ist das Lösungsmittel ein wässriges Lösungsmittel, wie z.B. eine Salzlösung, eine Pufferlösung, ein Zellkulturmedium oder eine verdünnte oder modifizierte Version davon. Dem Fachmann ist geläufig, dass zur Bewahrung der Tripelhelixstruktur von Polymeren, wie z.B. Kollagen, und zur Verhinderung einer Fibrillogenese und/oder Trübung des Hydrogels die Vernetzungsreaktion in wässrigen Medien mit einer genauen Kontrolle des pH-Werts und der Temperatur durchgeführt werden sollte. Die signifikanten Konzentrationen von Aminosäuren in Nährmedien, die normalerweise für eine Zellkultur verwendet werden, können Nebenreaktionen mit den Vernetzungsresten des synthetischen Polymers verursachen, die zu einem Ausschluss dieser Gruppen von der Vernetzungsreaktion führen können. Die Verwendung eines Mediums, das frei von Aminosäuren und anderen proteinartigen Materialien ist, kann dabei unterstützen, diese Nebenreaktionen zu verhindern, und daher die Anzahl der Vernetzungen zu erhöhen, die sich zwischen dem synthetischen Polymer und dem Biopolymer bilden. Die Durchführung der Vernetzungsreaktion in einer wässrigen Lösung bei Raumtemperatur oder physiologischen Temperaturen ermöglicht sowohl das Stattfinden einer Vernetzung als auch der viel langsameren Hydrolyse jedweder restlichen Vernetzungsgruppen.
Alternativ kann ein Terminierungsschritt einbezogen werden, um jedwede restlichen Vernetzungsgruppen in der Matrix umzusetzen. Beispielsweise wird bzw. werden ein oder mehrere Waschschritte in einem geeigneten, Glycin-enthaltenden Puffer jedwede restlichen Vernetzungsgruppen terminieren sowie jedwede Nebenprodukte entfernen, die während der Vernetzungsreaktion erzeugt worden sind. Nicht umgesetzte Vernetzungsgruppen können auch mit einem polyfunktionellen Amin, wie z.B. Lysin oder Triethylentetraamin, terminiert werden, was zur Bildung zusätzlicher kurzer, in der Kette vorliegender Vernetzungen führt. Waschschritte, bei denen nur Puffer verwendet wird, können gegebenenfalls ebenfalls durchgeführt werden, um jedwede Nebenprodukte aus der Vernetzungsreaktion zu entfernen. Gegebenenfalls kann nach dem Vernetzungsschritt die Temperatur der Suspension des vernetzten Polymers erhöht werden, um die vollständige Bildung des Hydrogels zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß werden die Komponenten des Hydrogels chemisch vernetzt, so dass sie im Wesentlichen nicht extrahierbar sind, d.h. das Biopolymer und das synthetische Polymer treten unter physiologischen Bedingungen nicht stark aus dem Gel aus. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Menge an Biopolymer oder synthetischem Polymer, die aus der Matrix in wässrige Medien unter physiologischen Bedingungen während eines Zeitraums von 24 Stunden extrahiert werden kann, weniger als 5 Gew.-% von jeder Komponente. In einer anderen Ausführungsform beträgt die Menge an Biopolymer oder synthetischem Polymer, die aus der Matrix in wässrige Medien unter physiologischen Bedingungen während eines Zeitraums von 24 Stunden extrahiert werden kann, weniger als 2 Gew.-% von jeder Komponente. In weiteren Ausführungsformen beträgt die Menge, die während eines Zeitraums von 24 Stunden extrahiert werden kann, weniger als 1 Gew.-%, weniger als 0,5 Gew.-% und weniger als 0,2 Gew.-%.
Die Menge an Biopolymer und/oder synthetischem Polymer, die aus der Matrix in wässrige Medien extrahiert werden kann, kann in vitro unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden (z.B. dem USP-Korbverfahren). Typischerweise wird die Matrix in einer wässrigen Lösung mit einem vorgegebenen pH-Wert angeordnet, wie z.B. bei etwa pH 7,4, um physiologische Bedingungen zu simulieren. Die Suspension kann gerührt werden oder nicht. Proben der wässrigen Lösung werden bei vorgegebenen Zeitintervallen entfernt und bezüglich des Polymergehalts mittels analytischer Standardtechniken getestet.
Dem Fachmann ist geläufig, dass die Menge jedes Polymers, das in das Hydrogel einbezogen werden soll, von der Auswahl der Polymere und der vorgesehenen Anwendung für das Hydrogel abhängt. Im Allgemeinen wird die Verwendung höherer Ausgangsmengen jedes Polymers zur Bildung eines widerstandfähigeren Gels führen, und zwar aufgrund eines niedrigeren Wassergehalts und der Gegenwart einer größeren Menge an vernetztem Polymer. Höhere Mengen von Wasser oder eines wässrigen Lösungsmittels werden ein weiches Hydrogel erzeugen. Erfindungsgemäß umfasst das fertiggestellte Hydrogel zwischen etwa 20 und 99,6 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel, zwischen etwa 0,1 und 30 Gew.-% synthetisches Polymer und zwischen etwa 0,3 und 50 Gew.-% Biopolymer.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das fertiggestellte Hydrogel zwischen etwa 40 und 99,6 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel, zwischen etwa 0,1 und 30 Gew.-% synthetisches Polymer und zwischen etwa 0,3 und 30 Gew.-% Biopolymer. In einer anderen Ausführungsform umfasst das fertiggestellte Hydrogel zwischen etwa 60 und 99,6 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel, zwischen etwa 0,1 und 10 Gew.-% synthetisches Polymer und zwischen etwa 0,3 und 30 Gew.-% Biopolymer. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das fertiggestellte Hydrogel zwischen etwa 80 und 98,5 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel, zwischen etwa 0,5 und 5 Gew.-% synthetisches Polymer und zwischen etwa 1 und 15 Gew.-% Biopolymer. In anderen Ausführungsformen enthält das fertiggestellte Hydrogel etwa 95 bis 97 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel und etwa 1 bis 2 Gew.-% synthetisches Polymer und etwa 2 bis 3 Gew.-% Biopo lymer, und etwa 94 bis 98 Gew.-% Wasser oder wässriges Lösungsmittel und etwa 1 bis 3 Gew.-% synthetisches Polymer und etwa 1 bis 3 Gew.-% Biopolymer.
Entsprechend werden die relativen Mengen jedes Polymers, das in das Hydrogel einbezogen werden soll, von der Art des synthetischen Polymers und des Biopolymers, die verwendet werden, und von der vorgesehenen Anwendung für das Hydrogel abhängen. Dem Fachmann ist klar, dass die relativen Mengen des Biopolymers und des synthetischen Polymers die Eigenschaften des fertiggestellten Gels auf verschiedene Weise beeinflussen werden; so werden z.B. große Mengen an Biopolymer ein sehr steifes Hydrogel erzeugen. Dem Fachmann ist klar, dass die relativen Mengen jedes Polymers in der fertiggestellten Matrix als Gewicht:Gewicht-Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer oder als Äquivalente von reaktiven Gruppen beschrieben werden können. Erfindungsgemäß liegt das Gewicht:Gewicht-Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer zwischen etwa 1:0,07 und etwa 1:14. In einer Ausführungsform liegt das w/w-Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer zwischen 1:1,3 und 1:7. In einer anderen Ausführungsform liegt das w/w-Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer zwischen 1:1 und 1:3. In einer weiteren Ausführungsform liegt das w/w-Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer zwischen 1:0,7 und 1:2.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Matrix ein proteinartiges Biopolymer und ein synthetisches Polymer, das gebundene N-Acryloxysuccinimidgruppen umfasst. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird das Verhältnis von Biopolymer:synthetisches Polymer als Moläquivalente von freien Amingruppen in dem Biopolymer zu N-Acryloxysuccinimidgruppen beschrieben und liegt zwischen 1:0,5 und 1:20. In einer anderen Ausführungsform liegt dieses Verhältnis zwischen 1:1,8 und 1:10. In weiteren Ausführungsformen liegt das Verhältnis zwischen 1:1 und 1:5, und zwischen 1:1 und 1:3.
2.3 Einbeziehen von bioaktiven Mitteln in die biosynthetische Matrix
Bioaktive Mittel können in die Matrix gegebenenfalls entweder durch kovalentes Binden (oder „Pfropfen") an das synthetische Polymer durch die gebundenen Vernetzungsgruppen oder durch Einkapseln innerhalb der Matrix einbezogen werden. Beispiele für bioaktive Mittel, die kovalent an die synthetische Polymerkomponente der Matrix gebunden werden können, sind vorstehend angegeben. Gegebenenfalls kann das bioaktive Mittel zuerst mittels Standardverfahren derivatisiert werden, um geeignete reaktive Gruppen zur Reaktion mit den Vernetzungsgruppen bereitzustellen. Zum kovalenten Binden eines bioaktiven Mittels wird das synthetische Polymer zuerst mit dem bioaktiven Mittel umgesetzt und dann wird dieses modifi zierte synthetische Polymer anschließend mit dem Biopolymer vernetzt, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Die Reaktion des bioaktiven Mittels mit dem synthetischen Polymer kann unter Standardbedingungen durchgeführt werden, z.B. durch Mischen des bioaktiven Mittels und des synthetischen Polymers in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Dimethylformamid, Dioxan, Dimethylsulfoxid und N,N-Dimethylacrylamid. Die Verwendung eines nicht-wässrigen Lösungsmittels vermeidet eine Hydrolyse der reaktiven Gruppen während des Einbeziehens des bioaktiven Mittels. Alternativ kann die Reaktion in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt werden, wie es vorstehend bezüglich der Vernetzungsreaktion beschrieben worden ist.
Bioaktive Mittel, die nicht zum Pfropfen an das Polymer geeignet sind, wie z.B. diejenigen, die keine primären Aminogruppen oder freien Thiolgruppen für die Reaktion mit den Vernetzungsgruppen in dem synthetischen Polymer enthalten, oder die nicht derivatisiert werden können, so dass sie solche Gruppen bereitstellen, können in der fertiggestellten Matrix eingeschlossen werden. Beispiele für bioaktive Mittel, die in der Matrix eingeschlossen werden können, umfassen unter anderem pharmazeutische Arzneistoffe, diagnostische Mittel, virale Vektoren, Nukleinsäuren und dergleichen. Für den Einschluss wird das bioaktive Mittel einer Lösung des synthetischen Polymers in einem geeigneten Lösungsmittel vor dem Mischen des synthetischen Polymers und des Biopolymers zur Bildung eines vernetzten Hydrogels zugesetzt. Alternativ kann das bioaktive Mittel einer Lösung, die sowohl das synthetische Polymer als auch das Biopolymer enthält, vor dem Vernetzungsschritt zugesetzt werden. Das bioaktive Mittel wird in die Polymerlösung derart eingemischt, dass es im Wesentlichen einheitlich darin dispergiert ist, und das Hydrogel wird anschließend gebildet, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung mit dem bioaktiven Mittel hängen von den Eigenschaften des Mittels ab und können vom Fachmann einfach ermittelt werden.
2.4 Einschluss von Zellen in der biosynthetischen Matrix
Die erfindungsgemäße biosynthetische Matrix kann auch darin eingeschlossene Zellen umfassen und somit die Abgabe von Zellen an ein Gewebe oder ein Organ in vivo ermöglichen. Unter Verwendung der biosynthetischen Matrix können viele verschiedene Zelltypen abgegeben werden, wie z.B. Myocyten, Augenzellen (z.B. von den verschiedenen Hornhautschichten), Adipozyten, Fibromyoblasten, Ektodermzellen, Muskelzellen, Osteoblasten (d.h. Knochenzellen), Chondrozyten (d.h. Knorpelzellen), Endothelzellen, Fibroblasten, Pankreaszellen, Hepatozyten, Gallengangzellen, Knochenmarkszellen, Nervenzellen, Zellen des Urogenitaltrakts (einschließlich Nierenzellen) oder Kombinationen davon. Die Matrix kann auch zur Abgabe totipotenter Stammzellen, pluripotenter oder festgelegter Vorläuferzellen oder umprogrammierter (dedifferenzierter) Zellen an eine in vivo-Stelle verwendet werden, so dass Zellen des gleichen Typs wie das Gewebe erzeugt werden können. Beispielsweise können in der Matrix mesenchymale Stammzellen, die undifferenziert sind, abgegeben werden. Beispiele für mesenchymale Stammzellen umfassen diejenigen, die sich diversifizieren können, um Osteoblasten (zur Erzeugung von neuem Knochengewebe), Chondrozyten (zur Erzeugung von neuem Knorpelgewebe) und Fibroblasten (zur Erzeugung von neuem Bindegewebe) zu erzeugen. Alternativ können festgelegte Vorläuferzellen, die proliferieren können, um Zellen des gleichen Typs wie diejenigen zu erzeugen, die an der in vivo-Stelle vorliegen, verwendet werden, wie z.B. Myoblasten, Osteoblasten, Fibroblasten und dergleichen.
Zellen können einfach durch Zugeben der Zellen zu einer Lösung des synthetischen Polymers vor dem Mischen mit dem Biopolymer zur Bildung eines vernetzten Hydrogels in der fertiggestellten Matrix eingeschlossen werden. Alternativ können die Zellen einer Lösung, die sowohl das synthetische als auch das Biopolymer enthält, vor dem Vernetzungsschritt zugesetzt werden. Das synthetische Polymer kann vor dem Mischen mit den Zellen gegebenenfalls mit einem bioaktiven Mittel umgesetzt werden. Typischerweise werden zum Einkapseln von Zellen in der Matrix die verschiedenen Komponenten (Zellen, synthetisches Polymer und Biopolymer) in einem wässrigen Medium, wie z.B. einem Zellkulturmedium oder einer verdünnten oder modifizierten Version davon, dispergiert. Die Zellensuspension wird vorsichtig in die Polymerlösung eingemischt, bis die Zellen im Wesentlichen einheitlich in der Lösung dispergiert sind, und dann wird das Hydrogel in der vorstehend beschriebenen Weise gebildet.
2.5 Andere Elemente
Die vorliegende Erfindung sieht auch das optionale Einbeziehen von einem oder mehreren Verstärkungsmaterial(ien) in die biosynthetische Matrix vor, um die mechanischen Eigenschaften der Matrix, wie z.B. die Festigkeit, die Elastizität, die Flexibilität und/oder die Reißfestigkeit, zu verbessern. Demgemäß kann die Matrix mit flexiblen oder starren Fasern, einem Fasergeflecht, einem Fasergewebe und dergleichen verstärkt werden. Die Verwendung solcher Verstärkungsmaterialien ist bekannt, wobei z.B. die Verwendung von Fasern, Geweben oder Blättern, die aus Kollagenfibrillen, oxidierter Cellulose oder Polymeren, wie z.B. Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder Polytetrafluorethylen, hergestellt sind, in implantierbaren medizinischen Anwendungen bekannt ist.
Das Verstärkungsmaterial kann in die Matrix unter Verwendung von Standardvorschriften einbezogen werden. Beispielsweise kann eine wässrige Lösung eines synthetischen Polymers und eines Biopolymers in einem geeigneten Puffer einem Fasergewebe oder -netz, wie z.B. Interceed (Ethicon Inc., New Brunswick, N.J.), zugesetzt werden. Die wässrige Lösung wird in die Zwischenräume des Gewebes oder des Netzes vor der Vernetzung fließen und so ein Hydrogel mit dem darin eingebetteten Gewebe oder Netz bilden. Gegebenenfalls können geeignete Formen verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Fasern oder das Fasernetz vollständig innerhalb des Hydrogels enthalten sind bzw. ist. Die Verbundstruktur kann anschließend gewaschen werden, um jedwede Nebenprodukte zu entfernen, die während der Vernetzungsreaktion erzeugt worden sind. Typischerweise sind die verwendeten Fasern hydrophil, um eine vollständige Benetzung durch die wässrige Lösung von Polymeren sicherzustellen.
Dem Fachmann ist klar, dass für Anwendungen, die eine hohe optische Klarheit erfordern, die Struktur der Verstärkung so ausgewählt werden sollte, dass eine Lichtstreuung von der fertiggestellten Verbundmatrix verhindert wird, z.B. durch die Verwendung von Nanofasern und/oder durch sorgfältiges Herbeiführen einer Übereinstimmung des Brechungsindex von Verstärkung und Hydrogel.
3. Testen der biosynthetischen Matrix
Erfindungsgemäß umfasst die biosynthetische Matrix ein Hydrogel mit oder ohne zugesetzte bioaktive Mittel und/oder eingekapselte Zellen. Um für eine in vivo-Implantierung für Gewebezüchtungszwecke geeignet zu sein, muss die biosynthetische Matrix ihre Form bei physiologischen Temperaturen beibehalten, sie muss angemessen wiederstandfähig sein, im Wesentlichen in Wasser unlöslich sein und das Wachstum von Zellen unterstützen. Es kann auch bevorzugt sein, dass die Matrix das Wachstum von Nerven unterstützt. Es ist klar, dass für bestimmte, spezielle Anwendungen die Matrix andere Eigenschaften erfordern kann. Beispielsweise kann es für chirurgische Zwecke erforderlich sein, dass die Matrix relativ flexibel sowie fest genug ist, um einem chirurgischen Vorgang mit einem Nahtfaden und einer Nadel zu widerstehen, und für ophthalmische Anwendungen, wie z.B. einer Hornhautreparatur oder einem Hornhautersatz, wird die optische Klarheit der Matrix wichtig sein.
3.1 Physikalisches/chemisches Testen
Wenn die biosynthetische Matrix für Gewebezüchtungsanwendungen eingesetzt wird, muss sie die mechanischen Parameter aufweisen, die erforderlich sind, um ein Reißen oder Zer reißen der Matrix zu verhindern, wenn sie chirurgischen Vorgängen unterzogen wird, und um eine angemessene Unterstützung für das Zellwachstum bereitzustellen, sobald sie sich an Ort und Stelle befindet. Das Vermögen der Matrix, einem Reißen zu widerstehen, hängt mit deren intrinsischer mechanischer Festigkeit, der Form und der Dicke der Matrix und der ausgeübten Spannung zusammen.
Das Vermögen der biosynthetischen Matrix, Scherkräften oder einem Reißen zu widerstehen, kann durch Ausüben von Kräften in entgegengesetzten Richtungen auf den Prüfkörper unter Verwendung von zwei Zangenpaaren grob bestimmt werden. Alternativ kann eine geeignete Vorrichtung zur quantitativen Messung des Vermögens der Matrix, Scherkräften zu widerstehen, verwendet werden. Tensiometer für diesen Zweck sind z.B. von MTS, Instron und Cole Parmer erhältlich.
Zum Testen kann die Matrix zu Blättern ausgebildet werden und dann in Streifen mit geeigneter Größe geschnitten werden. Alternativ kann die Matrix in die gewünschte Form für Gewebezüchtungszwecke geformt werden und die gesamte geformte Matrix kann getestet werden. Zur Berechnung der Zugfestigkeit wird die Kraft beim Reißen oder „Versagen" der Matrix durch die Querschnittsfläche der Testprobe dividiert, was zu einem Wert führt, der als Kraft (N) pro Einheitsfläche ausgedrückt werden kann. Die Steifigkeit (Modul) der Matrix wird aus der Steigung des linearen Abschnitts der Spannung/Dehnung-Kurve berechnet. Die Dehnung ist die Änderung der Länge während des Tests in Echtzeit dividiert durch die ursprüngliche Länge der Testprobe vor dem Beginn des Tests. Die Reißfestigkeit ist die Endlänge der Testprobe, wenn sie reißt, minus die Länge der ursprünglichen Testprobe, dividiert durch deren ursprüngliche Länge.
Dem Fachmann ist klar, dass aufgrund der Weichheit der Hydrogele und des Austretens der wässrigen Komponente beim Klemmen sinnvolle Zugdaten von Hydrogelen nur schwer erhalten werden können. Die quantitative Charakterisierung der Zugfestigkeit in Hydrogelen kann z.B. durch die Verwendung von Naht-Herausziehmessungen mit geformten Matrixproben erreicht werden. Typischerweise wird eine Naht etwa 2 mm von der Kante einer Testprobe angeordnet und die maximale Kraft, die ausgeübt werden muss, um die Naht durch die Probe zu reißen, wird gemessen. Beispielsweise können bei einer Testprobe einer Matrix, die für ophthalmische Anwendungen vorgesehen ist und in der Form und der Dicke einer menschlichen Hornhaut geformt worden ist, zwei gegenüber liegende Nähte in die Matrix eingesetzt werden, wie sie für den ersten Schritt einer Augenimplantation erforderlich wären. Die zwei Nähte können dann mit einem geeigneten Gerät, wie z.B. einem Zugtestgerät von Instron, mit etwa 10 mm/min auseinander gezogen werden. Die Reißfestigkeit der Matrix wird zusammen mit der Reißdehnung und dem Elastizitätsmodul [vgl. z.B. Zeng et al., J. Biomech. 34, 533–537 (2001)] berechnet. Dem Fachmann ist klar, dass für diejenigen biosynthetischen Matrizen, die für chirurgische Anwendungen vorgesehen sind, die Matrizen nicht so fest wie Säugergewebe sein müssen (d.h. das gleiche Vermögen aufweisen müssen, einem Reißen zu widerstehen). Der bestimmende Faktor für die Festigkeit der Matrix in solchen Anwendungen besteht darin, ob sie durch einen sorgfältigen und erfahrenen Chirurgen an Ort und Stelle vernäht werden kann oder nicht.
Gegebenenfalls kann die LCST der biosynthetischen Hydrogelmatrix unter Verwendung von Standardtechniken gemessen werden. Beispielsweise kann die LCST durch das Erwärmen von Proben der Matrix mit etwa 0,2°C pro Minute und visuelles Untersuchen des Trübungspunkts berechnet werden (vgl. z.B. H. Uludag et al., J. App. Polym. Sci. 75, 583–592 (2000)).
Die Durchlässigkeit der biosynthetischen Matrix kann durch Bewerten des Glukosepermeabilitätskoeffizienten und/oder der durchschnittlichen Porengröße für die Matrix unter Verwendung von Standardtechniken, wie z.B. einer PBS-Permeabilitätsbewertung unter Verwendung einer Permeabilitätszelle und/oder von Rasterkraftmikroskopie bestimmt werden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die biosynthetische Matrix eine durchschnittliche Porengröße zwischen etwa 90 nm und etwa 500 nm auf. In einer anderen Ausführungsform weist die Matrix eine durchschnittliche Porengröße zwischen etwa 100 nm und etwa 300 nm auf.
Die optische Durchlässigkeit und die Lichtstreuung können für Matrizen, die für ophthalmische Anwendungen vorgesehen sind, unter Verwendung eines speziell gefertigten Geräts gemessen werden, das sowohl die Durchlässigkeit als auch die Streuung misst [vgl. z.B. Priest und Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, S352 (1998)].
3.2 In vitro-Testen
Es ist klar, dass die biosynthetische Matrix nicht-cytotoxisch und biologisch verträglich sein muss, um für eine in vivo-Anwendung geeignet zu sein. Die Cytotoxizität der biosynthetischen Matrix kann unter Verwendung von Standardtechniken, wie z.B. dem Ames-Test zum Screenen bezüglich einer Mutageneseaktivität, dem Maus-Lymphomtest zum Screenen bezüglich des Vermögens der Matrix, eine Genmutation in einer Säugerzelllinie zu induzieren, oder in vitro-Chromosomenabberationstests unter Verwendung von Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO) zum Screenen bezüglich jedweder DNA-Umlagerungen oder -Schädigungen, die durch die Matrix induziert werden, bewertet werden. Andere Tests umfassen den Schwester-Chromatidtest, der jedweden Austausch zwischen den Armen eines Chromosoms bestimmt, der durch die Matrix induziert wird, und in vitro-Mausmikronukleasetests zum Bestimmen jedweder Schädigung von Chromosomen oder der Mitosespindel. Vorschriften für diese und andere Standardtests sind bekannt, vgl. z.B. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, und Vorschriften, die von der ISO entwickelt worden sind.
Das Vermögen der Matrix, das Zellwachstum zu unterstützen, kann auch in vitro unter Verwendung von Standardtechniken bewertet werden. Beispielsweise können Zellen von einer geeigneten Zelllinie, wie z.B. menschliche Epithelzellen, entweder direkt auf die Matrix oder auf ein geeignetes Material, das die Matrix umgibt, aufgebracht werden. Nach dem Wachstum in der Gegenwart eines geeigneten Kulturmediums für einen geeigneten Zeitraum, können eine Konfokalmikroskopie und eine histologische Untersuchung der Matrix durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Zellen über der Oberfläche der Matrix und/oder in die Matrix gewachsen sind.
Das Vermögen der Matrix, das Einwachsen von Nervenzellen zu unterstützen, kann ebenfalls in vitro bewertet werden. Beispielsweise kann eine Nervenquelle, wie z.B. Spinalganglien, in ein geeignetes Material eingebettet werden, das die Matrix umgibt, oder direkt in die Matrix eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Material ist ein weiches Gel auf Kollagenbasis. Zellen von einer geeigneten Zelllinie können dann entweder direkt auf die Matrix oder auf ein geeignetes Material, das die Matrix umgibt, aufgebracht werden, und die Matrix kann in der Gegenwart eines geeigneten Kulturmediums für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert werden. Die Untersuchung der Matrix, und zwar direkt und/oder in der Gegenwart eines Nerven-spezifischen Markers, z.B. mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Nerven-spezifischen Fluoreszenzmarkers und einer Konfokalmikroskopie, bezüglich eines Nervenwachstums wird das Vermögen der Matrix zum Unterstützen des Einwachsens von Nerven anzeigen.
Wachstumsergänzungsmittel können dem Kulturmedium, der Matrix oder beiden in Experimenten zur Bewertung des Vermögens der Matrix, das Zellenwachstum zu unterstützen, zugesetzt werden. Die speziellen eingesetzten Wachstumsergänzungsmittel werden von der Art der Zellen, die bewertet werden, abhängen, und können vom Fachmann einfach ermittelt werden. Geeignete Ergänzungsmittel für Nervenzellen umfassen z.B. Laminin, Retinylacetat, Retinsäure und Nervenwachstumsfaktoren für Nervenzellen.
3.3 In vivo-Testen
Zur Bewertung der biologischen Verträglichkeit der biosynthetischen Matrix und deren Vermögen zum Unterstützen des Zellwachstums in vivo, kann die Matrix in ein geeignetes Tiermodell für Immunogenitäts-, Entzündungs-, Freisetzungs- und Abbau-Studien sowie für die Bestimmung des Zellwachstums implantiert werden. Geeignete Kontrolltiere können in diese Bewertung einbezogen werden. Beispiele für geeignete Kontrollen umfassen z.B. nicht-operierte Tiere, Tiere, die Allotransplantate mit ähnlichen Abmessungen von einem Spendertier erhalten haben und/oder Tiere, die Implantate mit ähnlichen Abmessungen eines anerkannten Standard-Implantatmaterials erhalten haben.
Bei verschiedenen Stufen nach der Implantierung können Biopsien genommen werden, um das Zellwachstum über der Oberfläche und/oder in das Implantat zu bewerten, und eine histologische Untersuchung und Immunhistochemietechniken können verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Einwachsen von Nerven stattgefunden hat und ob Entzündungs- oder Immunzellen am Ort des Implantats vorliegen. Beispielsweise können verschiedene zellspezifische Färbungen, die bekannt sind, verwendet werden, um die Typen von vorliegenden Zellen zu bewerten, und es können auch verschiedene zellspezifische Antikörper verwendet werden, wie z.B. anti-Neurofilament-Antikörper, die zum Anzeigen der Gegenwart oder des Fehlens von Nervenzellen verwendet werden können. Darüber hinaus wird die Messung der Nervenaktionspotenziale unter Verwendung von Standardtechniken einen Hinweis darauf bereitstellen, ob die Nerven funktionsfähig sind oder nicht. Eine konfokalmikroskopische Untersuchung in vivo kann zur Überwachung des Zell- und Nervenwachstums in dem Tier zu ausgewählten Zeiten nach der Operation verwendet werden. Gegebenenfalls kann eine Berührungsempfindlichkeit mit bekannten Techniken gemessen werden, wie z.B. unter Verwendung eines Ästhesiometers. Die Wiederherstellung der Berührungsempfindlichkeit zeigt die Regeneration funktioneller Nerven an.
4. Anwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt eine biosynthetische Matrix bereit, die widerstandsfähig, biologisch verträglich und nicht cytotoxisch ist, und daher zur Verwendung als Gerüst zum Ermöglichen einer Geweberegeneration in vivo geeignet ist. Beispielsweise kann die biosynthetische Matrix zum Implantieren in einen Patienten zum Ersetzen von Gewebe, das geschädigt oder entfernt worden ist, zur Wundbedeckung, als Gewebeversiegelungsmittel oder -kleber, als Hautersatz oder Hornhautersatz oder als Hornhautbeschichtung verwendet werden. Die Matrix kann vor der Implantierung in eine geeignete Form geformt werden. Beispielsweise kann sie vorgeformt werden, so dass sie den Raum füllt, der aufgrund des geschädigten oder entfernten Gewebes verblieben ist. Alternativ kann die Matrix, wenn sie als Implantat verwendet wird, in situ bilden gelassen werden, und zwar durch Injizieren der Komponenten in das geschädigte Gewebe und Vernetzen und Gelieren lassen der Polymere bei physiologischer Temperatur.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Matrix in eine geeignete Form für Gewebezüchtungszwecke vorgeformt. In einer anderen Ausführungsform wird die Matrix als künstliche Hornhaut mit voller Dicke oder als Matrix mit einer Teildicke, die für eine Hornhautbeschichtung geeignet ist, vorgeformt.
Die biosynthetische Matrix kann allein verwendet werden und wird als solche das Einwachsen neuer Zellen in situ unterstützen. Alternativ kann die Matrix vor der Implantierung mit Zellen versetzt werden und das Auswachsen dieser Zellen in vivo unterstützen, um das umgebende Gewebe zu reparieren und/oder zu ersetzen. Es ist vorgesehen, dass die Zellen von dem Patienten stammen, oder sie können allogener oder xenogener Herkunft sein. Beispielsweise können Zellen von einem Patienten (vor oder während der Chirurgie zur Reparatur des Gewebes) gewonnen und unter sterilen Bedingungen verarbeitet werden, um einen spezifischen Zelltyp bereitzustellen, wie z.B. pluripotente Zellen, Stammzellen oder Vorläuferzellen. Diese Zellen können dann in die Matrix eingebracht werden, wie es vorstehend beschrieben ist, und die Matrix kann anschließend in den Patienten implantiert werden.
Die Matrix kann auch zum Beschichten chirurgischer Implantate verwendet werden, um bei der Versiegelung von Geweben zu unterstützen oder beim Anhaften lassen von Implantaten an Gewebeoberflächen zu unterstützen, z.B. durch die Bildung von Vernetzungen zwischen nicht umgesetzten Vernetzungsgruppen an der synthetischen Polymerkomponente des Hydrogels und primären Amino- oder Thiolgruppen, die in dem Gewebe vorliegen. Beispielsweise kann eine Schicht der Matrix verwendet werden, um Perforationen in Hornhäuten abzudecken, oder sie kann auf Katheter oder Brustimplantate zur Verminderung einer Fibrose aufgebracht werden. Die Matrix kann auch auf Gefäßtransplantate oder Stents, um das Austreten von Blut oder serösem Fluid zu minimieren, auf künstliche Pflaster oder Netze zur Minimierung einer Fibrose und zum Unterstützen einer Haftung der Implantate an Gewebeoberflächen angewandt werden.
Die Matrix kann auch als Abgabesystem zur Abgabe eines bioaktiven Mittels an einen bestimmten Bereich in einem Patienten verwendet werden. Das bioaktive Mittel kann als eine Lösung zusammen mit dem synthetischen Polymer und dem Biopolymer abgegeben werden, so dass die Matrix, die das bioaktive Mittel enthält, sich in situ bilden kann, oder die Matrix, die das bioaktive Mittel umfasst, kann vorgeformt und implantiert werden. Sobald es sich innerhalb des Körpers befindet, kann das bioaktive Mittel aus der Matrix freigesetzt werden, beispielsweise durch diffusionskontrollierte Vorgänge, oder, wenn das bioaktive Mittel kovalent an die Matrix gebunden ist, durch enzymatische Spaltung von der Matrix und eine anschließende Freisetzung durch diffusionskontrollierte Vorgänge. Alternativ kann das bioaktive Mittel dessen Effekte von innerhalb der Matrix ausüben.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die biosynthetische Matrix als eine künstliche Hornhaut verwendet. Für diese Anwendung wird die Matrix als künstliche Hornhaut mit voller Dicke oder als Matrix mit einer Teildicke, die für eine Hornhautbeschichtung geeignet ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird das Hydrogel so gestaltet, dass es eine hohe optische Durchlässigkeit und eine geringe Lichtstreuung aufweist. Beispielsweise weisen Hydrogele, die ein synthetisches p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-Terpolymer oder ein p(DMAA-co-ASI)-Copolymer, das mit Kollagen vernetzt ist, umfassen, eine hohe optische Durchlässigkeit und eine sehr geringe Lichtstreuung auf und können bis 55°C klar bleiben.
5. Kits
Die vorliegende Erfindung sieht auch Kits vor, welche die biosynthetische Matrix umfassen. Die Kits können eine „gebrauchsfertige" Form der Matrix umfassen oder sie können die einzelnen Komponenten, die zur Herstellung der Matrix erforderlich sind, in geeigneten Anteilen enthalten (d.h. das synthetische Polymer und das Biopolymer). Der Kit kann gegebenenfalls ferner ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel umfassen, das bzw. die entweder im Vorhinein an das synthetische Polymer gebunden worden ist bzw. sind, oder als einzelne Komponenten, die während der Herstellung der Matrix an das synthetische Polymer gebunden werden können. Die Kits können ferner Gebrauchsanweisungen, ein oder mehrere geeignete(s) Lösungsmittel, ein oder mehrere Gerät(e) zur Unterstützung bei der Injektion oder dem Anordnen der fertiggestellten Matrixzusammensetzung innerhalb des Körpers eines Tiers (wie z.B. eine Spritze, eine Pipette, Zangen, Augentropfvorrichtungen oder entsprechende, medizinisch zugelassene Abgabevorrichtungen) oder eine Kombination davon umfassen. Die einzelnen Komponenten des Kits können in separaten Behältern verpackt werden. Der Kit kann ferner einen Hinweis in der Form, die durch eine staatliche Stelle, welche die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf biologischer Produkte regelt, vorgeschrieben ist, umfassen, wobei der Hinweis eine Zulassung der Stelle für die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf für Anwendungen beim Menschen oder beim Tier wiedergibt.
Um ein besseres Verständnis der hier beschriebenen Erfindung zu erlangen, werden die folgenden Beispiele angegeben.
Beispiele
Abkürzungen

RTT:

Rattenschwanzsehne

ddH₂O:

destilliertes, entionisiertes Wasser

PBS:

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

D-PBS:

Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

AIBN:

Azobisisobutyronitril

NiPAAm:

N-Isopropylacrylamid

pNiPAAm:

Poly(N-isopropylacrylamid)

AAc:

Acrylsäure

DMAA:

N,N-Dimethylacrylamid

ASI:

N-Acryloxysuccinimid

pNIPAAm-co-AAc:

Copolymer aus NiPAAm und AAc

Poly(NiPAAm-co-AAc-co-ASI):

Terpolymer aus NIPAAM, AAc und ASI

Poly(DMAA-co-ASI):

Copolymer aus DMAA und ASI

GPC:

Gelpermeationschromatographie

NMR:

Kernmagnetische Resonanz

YIGSR:

Pentapeptid mit Amidendgruppen (Tyrosin- Isoleucin-Glycin-Serin-Arginin)

In allen Gelmatrizen, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, wird steriles Kollagen I, wie z.B. Telokollagen (Rattenschwanzsehne, RTT) oder Atelokollagen (vom Rind und Schwein), verwendet, das im Labor hergestellt werden kann oder bequemer käuflich erworben wird (z.B. von Becton Dickinson in einer Konzentration von 3,0 bis 3,5 mg/ml in 0,02 N Essigsäure und in 0,012 N Chlorwasserstoffsäure für Rinder- oder Schweinekollagen). Solche Kollagene können bei 4°C für viele Monate gelagert werden. Darüber hinaus können solche Kollagenlösungen sorgfältig konzentriert werden, so dass optisch klare, sehr viskose Lösungen von 3 bis 30 Gew./Vol.-% Kollagen erhalten werden, die zur Herstellung widerstandsfähigerer Matrizen geeignet sind.
Kollagenlösungen werden unter Verwendung von wässrigem Natriumhydroxid in der Gegenwart Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf physiologische Bedingungen, d.h. eine Salzlösungsionenstärke und einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4, eingestellt. PBS, das frei von Aminosäuren und anderen Nährstoffen ist, wurde verwendet, um eine Verminderung der Vernetzungsreaktivität durch Nebenreaktionen mit -NH₂-enthaltenden Molekülen zu vermeiden, so dass die Verwendung der minimalen Konzentration von Vernetzungsgruppen und die Minimierung jedweden Risikos einer Zelltoxizität ermöglicht wurden.
pNiPAAm-Homopolymerpulver ist käuflich (z.B. von Polyscience). Alle anderen Polymere wurden in der nachstehend angegebenen Weise synthetisiert.
Beispiel 1: Herstellung eines pNiPAAm-Kollagenhydrogels
Ein pNiPAAm-Kollagenhydrogel wurde hergestellt, um ein alternatives Hydrogel herzustellen, mit dem die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hydrogele verglichen werden konnten.
Eine 1 Gew./Vol.-% Lösung von pNiPAAm-Homopolymer in ddH₂O wurde durch Autoklavieren sterilisiert. Diese Lösung wurde mit einer sterilen RTT-Kollagenlösung [3,0 bis 3,5 mg/ml (w/v) in Essigsäure (0,02 N in Wasser)] (1:1 Vol/Vol.) in einem sterilen Reagenzglas bei 4°C durch Pumpen mit einer Spritze gemischt, so dass ein vollständiges Mischen ohne Blasenbildung erhalten wurde. Ein Mischen im kalten Zustand vermeidet jedwede vorzeitige Gelierung oder Fibrillogenese des Kollagens. Das Kollagen-pNiPAAm wurde dann über eine Kunststoffschale (unbehandelte Kulturschale) oder eine Form (z.B. eine Kontaktlinsenform) gegossen und unter sterilen Bedingungen in einem Abzug mit laminarer Strömung mindestens 2 bis 3 Tage lufttrocknen gelassen. Nach dem Trocknen bis zur Gewichtskonstanz (etwa 7 % Wasserrückstand) wurde die gebildete Matrix aus der Form entfernt. Die Entfernung der Matrix aus der Form wird durch Eintauchen der Form in eine sterile PBS bei Raumtemperatur erleichtert. Das fortgesetzte Eintauchen der freien Probe in diese Lösung ergibt bei physiologischer Temperatur, physiologischem pH-Wert und physiologischer Ionenstärke ein Gel, das anschließend einem Test bezüglich des Zellwachstums und einem in vivo-Testen in einem Tier unterzogen wurde (vgl. die Beispiele 6 und 7).
Beispiel 2: Herstellung eines synthetischen Terpolymers
Ein mit Kollagen reaktives Terpolymer, Poly(NiPAAm-co-AAc-co-ASI) (1) wurde durch Copolymerisieren der drei Monomere N-Isopropylacrylamid (NiPAAm, 0,85 mol), Acrylsäure (AAc, 0,10 mol) und N-Acryloxysuccinimid (ASI, 0,05 mol) synthetisiert. Das Beschickungsmolverhältnis betrug 85:10:5 (NiPAAm:AAc:ASI), es wurde der Radikalinitiator AIBN (0,007 mol/mol der gesamten Monomere) eingesetzt und das Lösungsmittel Dioxan (100 ml) wurde vor der Zugabe von AIBN mit Stickstoff gespült. Die Reaktion lief 24 Stunden bei 65°C ab.
Nach dem Reinigen durch wiederholtes Ausfällen zur Entfernen von Spuren des Homopolymers wurde mittels Protonen-NMR in THF-D₈ gefunden, dass die Zusammensetzung des synthetisierten Terpolymers (82 % Ausbeute) 84,2:9,8:6,0 (Molverhältnis) betrug. Das M_n und das M_w des Terpolymers betrugen 5,6 × 10⁴ Da bzw. 9,0 × 10⁴ Da, bestimmt mittels wässriger GPC.
Eine Lösung von 2 mg/ml des Terpolymers in D-PBS blieb selbst bis 55°C klar, was mit einer hohen LCST konsistent ist. Eine Lösung von 10 mg/ml in D-PBS wurde bei 43°C nur geringfügig trübe. Wenn das Homopolymer, das in der Chargenpolymerisationsreaktion gebildet worden ist (weil der NiPAAm-Reaktivitätskoeffizient höher ist als derjenige von AAc oder ASI), nicht von dem Terpolymer entfernt werden konnte, wurden wässrige Lösungen und Hydrogele enthalten, die bei etwa 32°C und darüber trübe werden.
Beispiel 3: Herstellung eines synthetischen Polymers, das ein bioaktives Mittel umfasst
Ein Terpolymer, welches das Pentapeptid YIGSR (ein Nervenzellenbindungsmotiv) enthielt, wurde durch Mischen des im Beispiel 2 hergestellten Terpolymers (1,0 g) mit 2,8 μg Laminin-Pentapeptid (YIGSR, von Novabiochem) in N,N-Dimethylformamid synthetisiert. Nach 48 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur (21 °C) wurde das Polymerprodukt aus Diethylether ausgefällt und dann im Vakuum getrocknet. ASI-Gruppen, die nach der Reaktion mit dem Pentapeptid zurückbleiben, stehen für eine anschließende Reaktion mit Kollagen zur Verfügung. Die Struktur dieses Polymers ist in der 8A gezeigt.
Beispiel 4: Herstellung eines Kollagen-Terpolymer-Hydrogels
Ein vernetztes Terpolymer-Kollagen-Hydrogel wurde durch Mischen von neutralisiertem 4 %igem Rinder-Atelokollagen (1,2 ml) mit dem im Beispiel 2 hergestellten Terpolymer [0,34 ml (100 mg/ml in D-PBS)] mit einer Spritze bei 4°C (Kollagen: Terpolymer 1,4:1 w/w) hergestellt. Nach vorsichtigen Pumpen mit der Spritze zur Herstellung einer homogenen, blasenfreien Lösung wurden Aliquots in Kunststoff-Kontaktlinsenformen injiziert und 24 Stunden bei Raumtemperatur (21 °C) inkubiert, um eine Reaktion der -NH₂-Gruppen des Kollagens mit ASI-Gruppen sowie die langsamere Hydrolyse restlicher ASI-Gruppen zu AAc-Gruppen zu ermöglichen. Die geformten Proben wurden dann 24 Stunden bei 37°C in einer Umgebung von 100 % Feuchtigkeit inkubiert, so dass ein fertiggestelltes Hydrogel erhalten wurde. Das Hydrogel enthielt 95,4 ± 0,1 % Wasser, 2,3 % Kollagen und 1,6 % Terpolymer. Matrizen wurden so geformt, dass sie eine Enddicke zwischen entweder 150 bis 200 μm oder 500 bis 600 μm aufwiesen. Jede resultierende Hydrogelmatrix wurde unter einer PBS-Lösung aus ihrer Form entfernt und anschließend in PBS eingetaucht, die 1 % Chloroform und 0,5 % Glycin enthielt. Dieser Waschschritt entfernte N-Hydroxysuccinimid, das bei der Vernetzungsreaktion erzeugt wird, beseitigte jedwede nicht umgesetzte ASI-Gruppen in der Matrix durch Umwandeln in Acrylsäuregruppen und sterilisierte die Hydrogelmatrix. Als Alternative können geformte Gele mit wässrigem Glycin behandelt werden, um sicherzustellen, dass das gesamte ASI vor dem Zellkontakt beseitigt ist.
Succinimidrückstände, die in den Gelen, die aus Kollagen und Terpolymer hergestellt worden sind, zurückgeblieben waren, lagen nach dem Waschen unterhalb der IR-Nachweisgrenze.
Beispiel 5: Herstellung eines Hydrogels, das ein bioaktives Mittel umfasst
Vernetzte Hydrogele aus Kollagen-Terpolymer, die einen YIGSR-Zelladhäsionsfaktor umfassten, wurden durch sorgfältiges Mischen von viskosem, neutralisierten 4 %igen Rinderkollagen (1,2 ml) mit einem Terpolymer, an das Laminin-Pentapeptid (YIGSR) kovalent gebunden war (von Beispiel 3, 0,34 ml, 100 mg/ml), bei 4°C gemäß dem Verfahren, das im Beispiel 4 beschrieben ist, hergestellt.
Der YIGSR-Gehalt von gründlich gewaschenen Gelen betrug 4,3 × 10^–11 mol/ml (2,6 × 10^–8 g/ml) hydratisiertes Gel, das durch Markieren der Tyrosingruppen (weisen primäres Amin auf) mit ¹²⁵I unter Verwendung des Iodogen-Verfahrens und Messen der Radioaktivität mit einem standardisierten Gamma-Zähler (Beckman, Gamma 5500) quantifiziert wurde. Die Endgesamtpolymerkonzentration in jedem hydratisierten, mit PBS äquilibrierten Hydrogel betrug 3,4 w/v % (umfassend Kollagen und YIGSR-Terpolymer in einer Konzentration von 2,0 bzw. 1,4 w/v %).
Beispiel 6: Vergleich der physikalischen Eigenschaften von Hydrogelmatrizen
Kollagen-Thermogele sind fragil, fallen leicht zusammen und brechen leicht und sind offensichtlich durchscheinend bzw. lichtundurchlässig (vgl. die 8C). Kollagen-Thermogele wurden durch Neutralisieren von Kollagen und Gießen in die gleichen Formen, wie es vorstehend in den Beispielen 4 und 5 beschrieben worden ist, hergestellt. Das geformte Kollagen wurde dann zuerst 24 Stunden bei 21 °C, dann bei 37°C, inkubiert, so dass durchscheinende Thermogele spontan gebildet wurden (durch Selbstassoziierung von Kollagen-Tripelhelices zu Mikrofibrillen erzeugt).
Der Permeabilitätskoeffizient von Glukose in PBS (pH 7,4) von Hydrogelen, die so hergestellt worden sind, wie es im Beispiel 5 beschrieben worden ist, wurde aus Messungen in einer Permeationszelle durch periodisches Entnehmen von Aliquots von Permeat, Zusetzen von Adenosintriphosphat und Umwandeln von Glukose in Glukose-6-phosphat mit dem Enzym Hexokinase berechnet. Letzteres wurde mit Nicotinamidadenindinukleotid in der Gegenwart von Dehydrogenase umgesetzt und das resultierende reduzierte Dinukleotid wurde durch dessen UV-Absorption bei 340 nm in Lösung quantifiziert (R.J. Bondar & D.C. Mead (1974), Clin. Chem. 20, 586-90). Topographien von Hydrogeloberflächen, die vollständig in PBS-Lösung eingetaucht waren, wurden mittels Rasterkraftmikroskopie (Molecular Image Co., USA) im „Kontakt"-Modus untersucht. Die durch diese Technik resultierenden Porengrößen wurden mit durchschnittlichen Porendurchmessern verglichen, die aus der PBS-Permeabilität der Hydrogele berechnet worden sind, wie es vorstehend beschrieben worden ist (R. Bellamkonda, J.P. Ranieri & P. Aebischer (1995), J. Neurosci. Res. 41, 501-9). Die Hydrogele wiesen Brechungsindizes auf (1,343 ± 0,003), die mit denjenigen des Tränenfilms (1,336 bis 1,357) im menschlichen Auge vergleichbar sind (S. Patel, J. Marshall & F.W. Fitzke, 3. (1995), J. Refract. Surg. 11, 100-5). Sie zeigten verglichen mit Matrizen, die nur Kollagen enthalten, eine hohe optische Klarheit (8B und C). Die Hydrogele wiesen Porendurchmesser von 140 bis 190 nm (die sich sowohl aus der Rasterkraftmikroskopie als auch aus der PBS-Permeabilität ergaben) und einen Glukose-Diffusionspermeabilitätskoeffizienten von 2,7 × 10^–6 cm²/s auf, der höher ist als der Wert von natürlichem Stroma (etwa 0,7 × 10^–6 cm²/s, berechnet aus den veröffentlichten Diffussions- (2,4 × 10^–6 cm²/s) und Löslichkeitskoeffizienten (0,3) (B.E. McCarey & F.H.Schmidt (1990), Curr. Eye Res. 9, 1025-39)).
Die folgenden Eigenschaften der Hydrogele, die so hergestellt worden sind, wie es in den Beispielen 4 und 5 beschrieben ist, zeigen, dass sie vernetzt sind:

• Wasserunlöslich,
• ausreichend fest, um chirurgischen Vorgängen mit einem Nahtfaden und einer Nadel und einem Anbringen an einen menschlichen Hornhautring zu widerstehen, eine relativ flexible Handhabung,
• sie zeigen eine Zunahme der Reißfestigkeit und des scheinbaren Moduls während des Zugtests um mehr als das Zweifache, wenn von einem ASI/-NH₂-Äquivalentverhältnis von 0,5 zu 1,5 gegangen wird.

Matrizen, die in der vorstehend beschriebenen Weise, jedoch mit variierenden Verhältnissen von Kollagen-Amingruppen zu ASI-Gruppen in dem synthetischen Polymer, hergestellt worden sind, wiesen eine hohe optische Durchlässigkeit und eine niedrige Streuung im sichtba ren Bereich auf (8B, 12 und 13). Im Gegensatz dazu wies das Kollagen-Thermogel, das in der vorstehend beschriebenen Weise aus Kollagen hergestellt worden ist, eine niedrige Durchlässigkeit und eine hohe Streuung auf, die mit dessen lichtundurchlässigem Aussehen im Einklang stand (8C, 12). Solche Thermogelmatrizen mit bis zu 3 Gew./Vol. Kollagen waren zu schwach, um für einen Naht-Herausziehtest angebracht zu werden.
Eine quantitative Charakterisierung der Hydrogele wurde durch die Verwendung von Naht-Herausziehmessungen mit Proben erhalten, die in der Form und der Dicke einer menschlichen Hornhaut ausgebildet waren. Diese umfassten das Einsetzen von zwei gegenüber liegenden Nähten, wie es für den ersten Schritt bei einer Augenimplantation erforderlich ist, und Auseinanderziehen dieser zwei Nähte mit 10 mm/min auf einem Zugtestgerät von Instron, wobei es sich um ein Verfahren handelt, das für die Bewertung von Herzklappenkomponenten gut etabliert ist. Die eingesetzten Nähte waren 10-0-Nylonnähte. Die Reißfestigkeit des Gels wird zusammen mit der Reißdehnung und dem Elastizitätsmodul berechnet. Der Modul und die Reißbelastung aus den Naht-Herausziehmessungen zeigten, dass Maxima bei spezifischen Verhältnissen von Kollagenamin zu ASI-Gruppen erreicht wurden (11).
Die Hydrogele, die so hergestellt worden sind, wie es in den Beispielen 4 und 5 beschrieben ist, weisen eine hohe optische Durchlässigkeit und eine sehr niedrige Lichtstreuung auf, die mit denjenigen der menschlichen Hornhaut vergleichbar sind, und zwar gemessen mit einem speziell gefertigten Gerät, das die Durchlässigkeit und die Streuung misst [Priest und Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, S352-S361 (1998)]. Die Rückstreuung und die Durchlässigkeit für Licht im sichtbaren Bereich für Hydrogele, die gemäß Beispiel 4 hergestellt worden sind, zeigen hervorragende Leistungswerte, mit Ausnahme von hohen Terpolymerkonzentrationen (hohe Verhältnisse von Kollagenamin zu Terpolymer ASI, 12). Entsprechend wies ein Thermogel (frei von vernetzendem synthetischen Polymer) eine sehr niedrige Durchlässigkeit und eine hohe Rückstreuung auf (12). Die im Beispiel 5 beschriebenen Hydrogele zeigten in dieser Analyse auch eine hervorragende Leistung, wie es in der 12 gezeigt ist (das 1:1-Verhältnis von Kollagen zu Terpolymer-Pentapeptid ist durch die ausgefüllten Quadrate dargestellt).
Im Gegensatz dazu waren Kollagen-pNiPAAm-Homopolymergele (wie sie im Beispiel 1 beschrieben worden sind, 1,0:0,7 bis 1,0:2,0 Gew./Gew.) bei 37°C durchscheinend bzw. lichtundurchlässig. Darüber hinaus wurden aus diesem Hydrogel sowohl Kollagen als auch pNiPAAm in PBS extrahiert (Gewichtsverlust von über 50 % in 48 Stunden).
Beispiel 7: In vivo-Testen verschiedener biosynthetischer Matrizen
Hydrogele, die so gebildet worden sind, wie es in den Beispielen 1, 4 und 5 beschrieben wurde, wurden zur Bildung von künstlichen Hornhäuten geformt und in die Augen von Schweinen implantiert (2).
Wie in vivo-Hornhautimplantate geben die Gele von Beispiel 1 5 bis 6 Tage nach der Implantierung in Schweineaugen einen weißen Rückstand ab.
Das Hydrogel, das so aus 4 % Kollagen und Pentapeptid-Terpolymer hergestellt worden ist, wie es im Beispiel 5 beschrieben wurde, zeigte wie das Kollagen-Terpolymer-Hydrogel, das so hergestellt worden ist, wie es im Beispiel 4 beschrieben ist, eine gute biologische Verträglichkeit. Ein schnelleres, vollständiges Überwachsen von Epithelzellen und eine Bildung von mehreren Schichten fanden statt, wenn das erstgenannte Hydrogel verwendet wurde, und zwar verglichen mit dem Kollagen-Terpolymer-Hydrogel, das ein langsameres, weniger zusammenhängendes Epithelzellenwachstum ohne Bildung mehrerer Schichten zeigte.
In vivo zeigten konfokalmikroskopische Bilder eines Hydrogels mit voller Dicke, das aus Kollagen und dem Pentapeptid-Terpolymer hergestellt (von Beispiel 5; Endkonzentration: Kollagen 2,3 Gew.-%, Terpolymer + Pentapeptid 1,6 Gew.-%) und in ein Schweineauge implantiert worden ist, dass Epithelzellen über diese Matrix gewachsen waren und schichtartig vorlagen. Eine Basismembran wurde regeneriert und Hemidesmosomen, die ein stabil verankertes Epithel anzeigen, lagen vor. Es wurde gefunden, dass sich Stromazellen nach nur 3 Wochen innerhalb der Matrix ausbreiteten. Die Implantate wurden innerhalb von 3 Wochen nach der Implantierung berührungsempfindlich (Cochet-Bonnet-Ästhesiometer), was ein Einwachsen funktioneller Nerven zeigt (4 und 14). Das Einwachsen von Nerven wurde auch direkt durch eine Konfokalmikroskopie und eine Histologie festgestellt. Während eines Zeitraums von 8 Wochen nach der Implantierung wurden keine klinischen Anzeichen einer nachteiligen Entzündung oder Immunreaktion festgestellt, vgl. die 2, 3 und 5 bis 7.
Detaillierter:
Die 5 zeigt die morphologische und biochemische Bewertung eines Schnitts durch die Schweinehornhaut 3 Wochen nach der Implantierung mit (A) einer Picro-Sirius-Färbung für Kollagen und (B) einer H & E-Färbung für Zellen. Die 7 zeigt (A) einen Schnitt durch die Schweinehornhaut 3 Wochen nach der Implantierung, gefärbt mit Picro-Sirius-Rot, der die Stroma-Implantat-Grenzfläche (Pfeilspitzen) zeigt. Die Implantatoberfläche war von einem geschichteten Epithel bedeckt. (B) Ein entsprechender Schnitt 8 Wochen nach der Implantie rung. Stromazellen waren in das Implantat gewandert und das Implantat scheint subepithelial durch Gewebe ersetzt worden zu sein (Pfeile). (C) Eine stärkere Vergrößerung des Epithels (H & E gefärbt) zeigt die regenerierte Basismembran (Pfeil). (D) Ein entsprechender Schnitt, der mit einem anti-Typ VII-Kollagenantikörper gefärbt worden ist, der Hemidesmosome erkennt, die an die Basismembran gebunden sind (Pfeil). (E) Die Hemidesmosome (Pfeile), die an die darunter liegenden Basismembranen gebunden sind, werden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) klar visualisiert. (F) Ein Flachpräparat der Schweinehornhaut, das Nerven (Pfeilspitzen) innerhalb des Implantats zeigt, gefärbt mit einem anti-Neurofilament-Antikörper.
Die 3 zeigt konfokalmikroskopische Bilder eines Ganzpräparats von Schweinehornhäuten 6 Wochen nach der Operation, die ein regeneriertes Hornhautepithel und eine Basismembran auf der Oberfläche des Implantats zeigen. In vitro-Nervenwachstumsstrukturen innerhalb des Kollagen-Terpolymer-Verbunds und innerhalb des darunter liegenden Empfängerstromas sind ebenso gezeigt wie einwachsende Stromazellen.
Die Wiederherstellung der Berührungsempfindlichkeit (< 14 Tage nach der Operation) war im Vergleich zu einer minimalen Wiederherstellung in dem transplantierten Allotransplantat während des gleichen Zeitraums für zusätzliche sechs Tiere, die Allotransplantate von Spenderschweinehornhäuten mit ähnlichen Abmessungen erhielten, rasch (14).
Beispiel 8: Abscheidung von Kollagen-Terpolymer-Matrizen in Nagergehirnen
Nach der Tötung wurde das gesamte Gehirn jeder verwendeten Maus oder Ratte herausgeschnitten und in einem sterotaxischen Rahmen angeordnet. Entweder zwei Mikroliter (2 ml) oder drei Mikroliter (3 ml) eines Hydrogels, das Kollagen, Terpolymer-Pentapeptid bei entweder 0,33 % Kollagen-0,23 % Terpolymer oder 0,63 % Kollagen-0,44 % Terpolymer enthielt, wurden während eines Zeitraums von 6 bis 10 min in jedes einzelne Mäusegehirn bei den folgenden Koordinaten injiziert: 0,3 mm von Bregma, 3,0 mm tief und 2,0 mm von der Mittellinie. Bei Ratten wurden vier bis sechs Mikroliter Hydrogel während 10 min in jedes Gehirn bei 0,7 bis 0,8 mm von Bregma, 6 mm tief und 4 mm von der Mittellinie injiziert. Die Hydrogelproben wurden mit Coomassieblau-Farbstoff zur Visualisierung gemischt.
Die Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche, direkte und präzise Abgabe einer kleinen Menge des Hydrogels in das Stratum des Gehirns in diesen Proben (9 und 10). Dies legt nahe, dass es möglich ist, das Hydrogel als Abgabesystem für Zellen oder Arzneistoffe in spezifische Stellen mit sehr kleinen Volumina zu verwenden.
Beispiel 9: In vivo-Testen eines Hydrogels, das ein bioaktives Mittel umfasst
Sterile Hydrogele, die so hergestellt worden sind, wie es im Beispiel 5 beschrieben worden ist, wurden vor der Implantierung sorgfältig in PBS gespült. Gemäß der Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren wurde jede mittels Gewebezüchtung hergestellte (TE) Hornhautmatrix (5,5 mm Durchmesser und 200 ± 50 μm dick) in die rechte Hornhaut eines Yucatan-Mikroschweins (Charles River Wiga, Sulzbach, Deutschland) implantiert (vgl. die 15A bis C). Kontralateral unoperierte Hornhäute dienten als Kontrollen. Unter einer allgemeinen Anästhesie wurde ein kreisförmiger Einschnitt mit einem Durchmesser von 5,0 mm in einer Teildicke unter Verwendung eines Barraquer-Trepans (Geuder, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Das Hornhautgewebe des Empfängers wurde entfernt und durch ein Implantat mit einem um 0,50 mm größeren Durchmesser ersetzt, um eine angemessene Wundapposition zwischen dem Transplantat und dem Empfängergewebe zu ermöglichen. Nach der Chirurgie wurde eine amniotische Membran über der gesamten Hornhautoberfläche vernäht und eine Woche dort belassen, um die Implantate an Ort und Stelle zu halten. In vernähten Proben wurden die Implantate unter Verwendung von 8 unterbrochenen 10-0-Nylonnähten in das Empfängergewebe genäht. Die postoperative Medikation bestand aus Dexamethason (qid) und Gentamycin (qid) für 21 Tage. n = 3 Schweine mit Nähten und 3 Schweine ohne Nähte.
Eine Nachsorge wurde täglich bei jedem Schwein bis zu 7 Tage nach der Operation und dann wöchentlich durchgeführt. Die Untersuchungen umfassten eine Schlitzlampenuntersuchung, um sicherzustellen, dass die Hornhäute optisch klar waren, eine Natriumfluoresceinfärbung, um die Epithelintegrität und die Barrierefunktion zu bewerten (J.E. Josephson & B.E. Caffery (1988), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29, 1096-9), Messungen des Augeninnendrucks, um sicherzustellen, dass die Hornhäute nicht den Fluss des Kammerwassers blockieren, und eine konfokalmikroskopische in vivo-Untersuchung (ConfoScan3, Nidek, Erlangen, Deutschland) zur Bewertung des Einwachsens von Zellen und Nerven. Die Berührungsempfindlichkeit der Hornhaut wurde unter Verwendung eines Cochet-Bonnet-Ästhesiometers (Handaya Co., Tokio, Japan) an fünf Punkten innerhalb des Implantatbereichs jeder Hornhaut (vier periphere, ein zentraler) gemessen, wie es bereits beschrieben worden ist (M. Millodot (1984), Ophthalmic Physiol. Opt. 4, 305-18). Tiere, die Allotransplantate von Spenderschweinehornhäuten erhielten, wurden auch entsprechend bewertet.
Für eine Immunhistochemie und eine histopathologische Untersuchung wurden Gewebe und Konstrukte in 4 % PFA in 0,1 M PBS fixiert. Für eine Nervenimmunlokalisierung wurden Flachpräparate mit einem Detergenzcocktail permeabilisiert (J.S. Brugge & R.L. Erikson (1977), Nature 269, 346-8) (150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 50 mM Tris, 1 % Nonidet P-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat), mit 4 % fetalem Kälberserum in PBS für ein nicht-spezifisches Färben blockiert und in anti-Neurofilament 200-Antikörper (Sigma, Oakville, Kanada) inkubiert. Diese wurden dann mit FITC oder Cy3-konjugierten sekundären Antikörpern (Sigma, Amersham bzw. Baie D'Urfé, Kanada) inkubiert und mittels Konfokalmikroskopie visualisiert.
Für eine Histologie und eine weitere Immunhistochemie wurden Proben verarbeitet, in Paraffin eingebettet und geschnitten. Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) für eine histopathologische Untersuchung gefärbt (M.M. Jumblatt & A.H. Neufeld (1983), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24, 1139-43). Eine Immunfluoreszenz wurde in der vorstehend beschriebenen Weise mit deparaffinierten Schnitten bezüglich der Expression von Typ VII-Kollagen (Sigma, München, Deutschland), einem Hemidesmosom-Marker, durchgeführt (I.K. Gipson, S.J. Spurr-Michaud & A.S. Tisdale (1988), Dev. Biol. 126, 253-62). Eine immunhistochemische Färbung unter Verwendung einer Peroxidase-Diaminobenzidin (DAB)-Visualisierung wurde mit dem Folgenden durchgeführt: Mit AE1/AE3-Antikörper (Chemicon, Temecula, CA, USA) für Epithelmarker, anti-Vimentin-Antikörper (Roche, Laval, Canada) für Stromafibroblasten, anti-glatte Muskulatur-Actin-Antikörper 1A4 (Celle Marque, Austin, TX) für aktivierte Stromafibroblasten (Myofibroblasten) und SP1-D8-Antikörper (DHSB, lowa, USA) für die Prokollagen 1-Synthese (zur Lokalisierung von Stellen der de novo-Kollagensynthese). Eine CD15- und CD45-Färbung für Immunzellen (Becton-Dickinson, Oakville, Canada) wurde unter Verwendung des ARK-Peroxidasekits (DAKO, Mississauga, Kanada) durchgeführt, um die primären Antikörper an ihre jeweiligen sekundären Antikörper und Peroxidase zur Visualisierung vorzukonjugieren. Für anti-Vimentin-, anti-glatte Muskulatur-Actin- und SP8-D1-Antikörper wurde die Antigenrückgewinnung durch Vorbehandeln mit Proteinase-K (2 mg/ml) für 30 min bei 37°C vor der Inkubation in primäre Antikörper durchgeführt. Eine Ulex europaeus agglutinin (UEA)-Lectinfärbung wurde verwendet, um eine Tränenfilm-Mucinabscheidung zu visualisieren (M.A. Shatos, J.D. Rios, V. Tepavcevic, H. Kano, R. Hodges & D.A. Dartt (2001), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 1455-64). Proben wurden mit biotinyliertem UEA (Sigma) inkubiert, dann mit Avidin-Meerrettichperoxidase umgesetzt und mit DAB visualisiert. Für eine Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden alle Proben in einem herkömmlichen Fixierungsmittel, Färbemittel und Einbettungsharz behandelt (Karnovsky's, OsO₄, Uranylacetat, Epoxy).
Keine nachteilige Entzündungs- oder Immunreaktion wurde bei einer klinischen Untersuchung nach der Implantierung entweder biosynthetischer Matrizen oder Schweinehornhäuten festgestellt. Das Einwachsen von Epithelzellen über dem Implantat war 4 Tage nach der Operation vollständig. Nach einer Woche zeigte das regenerierte Epithel den Ausschluss eines Natriumfluoresceinfarbstoffs, was zeigt, dass das Epithel intakt war und dessen Barriereeigenschaften wiederhergestellt worden sind. Die Augeninnendrücke lagen zwischen 10 und 14 mm Quecksilber (Hg) vor der Operation und bei 10 bis 16 mm Hg nach der Operation während des Untersuchungszeitraums von bis zu 6 Wochen, was zeigt, dass die Implantate nicht das Fließen von Kammerwasser innerhalb des Auges blockierten. 3 Wochen nach der Chirurgie waren die Implantate optisch klar geblieben (Schlitzlampen-Biomikroskopie) und eine erneute Schichtbildung des Epithels wurde in allen Tieren festgestellt. Eine klinische in vivo-Konfokalmikroskopie der implantierten Stromamatrizen 3 Wochen nach der Chirurgie zeigte ein regeneriertes Epithel (15D), neu eingewachsene Nerven (15G) und Stroma (15J) und Endothelzellen (15M) mit einer zellulären Morphologie, welche diejenige der nicht-operierten Kontrollen nachahmte (15F, I, L, O). Die Epithel- und Endothelzellenmorphologie in den Allotransplantaten (15E, N) war derjenigen der Kontrollen ähnlich. Subepithelnerven und Stromanerven wurden in den Allotransplantaten 3 Wochen nach der Chirurgie nicht festgestellt (15H, K).
Insbesondere zeigt die 15:
(A–C) Ein lamelläres Keratoplastie (LPK)-Verfahren mit einem Yucatan-Mikroschwein. (A): Ein Trepan wird zum Schneiden eines kreisförmigen Einschnitts mit einer vorgegebenen Tiefe (250 μm) in die Hornhaut verwendet. Die bestehenden Hornhautschichten werden entfernt und (B) durch ein biosynthetisches Matriximplantat (Pfeil, Dicke 250 μm) ersetzt, das an Ort und Stelle vernäht wird (C). Nähte sind durch Pfeile angegeben.
(D–O) In vivo-Konfokalmikroskopie einer implantierten biosynthetischen Matrix. (D): Ein Konfokalbild, das ein regeneriertes Hornhautepithel auf der Oberfläche des Implantats zeigt. Die entsprechende Allotransplantatkontrolle (E) enthält Spenderepithel, während die nicht-operierte Kontrolle (F) ein intaktes Epithel aufweist. (G): Regenerierte Nerven (Pfeilspitzen) liegen an der Grenzfläche zwischen dem Implantat und darüber liegendem regenerierten Epithel vor. Dies entspricht den Subepithelnerven in der nicht-operierten Kontrolle (I). In dem Allotransplantat (H) fehlen jedoch die Subepithelnerven. (J-L): Stromazellen und ein sich verzweigendes Nervenbündel (Pfeilspitze) tiefer innerhalb des darunter liegenden Stromas von Hornhäuten mit Implantat (J), Allotransplantat (K) und in einem entsprechenden Bereich in der Kontrolle (L). (M-O): Das Endothel in Hornhäuten mit Implantat (M), Allotransplantat (N) und nicht-operierten Kontrollen (O) ist intakt und zeigt eine ähnliche Morphologie.
Histologische Schnitte durch Hornhäute mit Implantaten zeigten eine deutliche, jedoch glatte Implantat-Empfänger-Gewebegrenzfläche (16A), die derjenigen von Kontrollhornhäuten ähnlich war, die Allotransplantate erhielten (16B). In beiden Hornhäuten mit Implantaten oder Allotransplantaten war das regenerierte Epithel schichtartig. Eine detaillierte Untersuchung zeigte ein vollständig differenziertes Epithel, das durch AE1/AE3-Antikörpermarker positiv gefärbt wurde (16D, E), das über einer regenerierten Basismembran vorlag, die bezüglich Typ VII-Kollagen, einem Marker für Hemidesmosomen an der Basismembran-Epithel-Grenzfläche, positiv war (16G, H). TEM-Untersuchungen zeigten eine Morphologie, die mit der Gegenwart von Hemidesmosomen konsistent war (16J, K). In den Implantaten hatten Neurofilament-positive einwachsende Nerven damit begonnen, ein subepitheliales Netzwerk wiederherzustellen und zeigten eine Ausdehnung in die Epithelzellen (16M). Es fanden sich jedoch keine subepithelialen Nerven in den Hornhäuten mit Allotransplantaten (16N). Der Tränenfilm wurde in Hornhäuten mit Implantaten wie in dem Allotransplantat (16Q) wiederhergestellt (16P) Insbesondere zeigt die 16: Eine Hornhautregeneration nach der Chirurgie.
(A-F) Es sind H & E-gefärbte Schnitte gezeigt. Stromazellen liegen in dem Implantat (A) und der Allotransplantatkontrolle (B) vor und beide scheinen nahtlos in den Empfänger integriert zu sein. (Die Symbole sind wie folgt: e, Epithel; i, Implantat; g, Allotransplantat; s, Stroma). (C): Nicht operierte Kontrolle. Das regenerierte Epithel des Implantats (D) und das Spenderepithel der Allotransplantatkontrolle (E) exprimierte Cytokeratindifferenzierungsmarker, ähnlich der nicht operierten Kontrolle (F).
(G-I): Eine Immunlokalisierung von Typ VII-Kollagen, einem Marker für Hemidesmosomen, an der Epithel-Implantat-Grenzfläche (Pfeile) in dem Implantat (G), dem Allotransplantat (H) und der Kontrolle (I).
(J-L): Eine TEM der Epithel-Implantat-Grenzfläche. Hemidesmosomenplaques (Pfeilspitzen) und Verankerungsfibrillen (Pfeile) haben sich innerhalb der biosynthetischen Matrix zwischen den Epithelzellen und dem darunter liegenden Implantat gebildet (J), wodurch die Struktur nachgeahmt wird, die normalerweise an der Epithel-Stroma-Grenzfläche gefunden wird, wie es sich in dem Allotransplantat (K) und der Kontrolle (L) zeigt.
Ein Flachpräparat von Hornhaut, die Nervenfasern (Pfeile) innerhalb des Implantats zeigt (M), und nicht-operierte Kontrolle (O), jedoch abwesend in dem Allotransplantat (N), gefärbt mit einem anti-Neurofilament-Antikörper. Das UEA-Binden (Pfeilspitzen) an die Epithel- oberfläche auf dem Implantat (P) und dem Allotransplantat (Q) zeigt in allen Fällen eine Wiederherstellung des Tränenfilms. Nicht-operierte Kontrolle (R).
Immunhistochemie-Ergebnisse zeigen, dass Zellen innerhalb sowohl des Implantats als auch des Allotransplantats Prokollagen I synthetisieren. Eine stärkere Prokollagensynthese fand jedoch in den Allotransplantaten statt, wie es durch die intensivere Färbung in Allotransplantaten im Vergleich zu Implantaten angezeigt wird (17G, H). Sowohl Allotransplantate als auch Implantate wiesen Stromazellen auf, die Vimentin-positiv waren (17A, B), was einen Fibroblasten-Phänotyp anzeigt. Beide zeigten auch eine glatte Muskulatur-Actin-Färbung und daher die Gegenwart aktivierter Stroma-Fibroblasten an, obwohl die Implantate weniger positive Zellen zeigten als die Allotransplantate (17D, E).
Insbesondere zeigt die 17: Eine Implantat-Empfänger-Integration 6 Wochen nach der Chirurgie.
(A-C): Färbung bezüglich Prokollagen Typ I. Eine positive Färbung, die Stellen einer neuen Kollagenabscheidung anzeigt, wird in der Matrix sowohl der implantierten biosynthetischen Matrix (A) als auch der Allotransplantat-Kontrolle (B) festgestellt. Die nicht-operierte Kontrolle (C) weist keine neue Kollagensynthese auf.
(D-F): Eine Färbung bezüglich Vimentin im gesamten Stroma identifiziert Stroma-Fibroblasten. Eine Färbung in der gesamten implantierten biosynthetischen Matrix (D) zeigt eine Zellinvasion. Zellen können auch innerhalb des implantierten Allotransplantats (E) und innerhalb der gesamten nicht-operierten Kontrolle vorliegen (F).
(G-I): Eine glatte Muskulatur-Actin-Färbung zeigt aktivierte Myofibroblasten und das Potenzial für eine Narbenbildung an. In dem biosynthetischen Matriximplantat (G) liegt eine Färbung gelegentlich in der biosynthetischen Matrix vor, wird jedoch weder in dem Empfängerstroma noch in der Übergangszone zwischen Empfänger und Implantat gefunden. Ein positives Färben in der implantierten Allotransplantat-Hornhaut (H) wird sowohl in dem Allotransplantat als auch in der Übergangszone, jedoch nicht in intaktem Empfängerstroma identifiziert. (I): Nicht-operierte Kontrolle.
Die Hornhaut-Berührungsempfindlichkeit an 5 Punkten auf dem Hornhautimplantat in 3 Schweinen vor und nach der Operation unter Verwendung eines Cochet-Bonnet-Ästhesiometers zeigte einen dramatischen Abfall der Berührungsempfindlichkeit nach der Chirurgie. Eine Wiederherstellung trat jedoch zwischen 7 und 14 Tagen auf und 21 Tage nach der Operation war die Empfindlichkeit auf ein Niveau von vor der Operation zurückgekehrt (18, alle Gruppen, n = 3. *P < 0,01 durch wiederholte Messungen ANOVA mit Tukey 2-Wege-Vergleichen). Die Berührungsempfindlichkeit kehrte bei allen peripheren und zentralen Punkten, die auf dem Implantat getestet worden sind, mit der gleichen Geschwindigkeit und auf das gleiche Plateauniveau zurück. In Kontrolltieren, die Empfängerhornhaut-Allotransplantate erhielten, blieben die Hornhäute während des Zeitraums von 6 Wochen jedoch anästhetisch (18).
Implantate, die nach 6 Wochen in vivo wiedergewonnen wurden, wurden mittels Infrarotspektroskopie (Midac M, FTIR-Spektrometer, ZnSe-Strahlkondensor und Diamantzelle) untersucht und zeigten deutlich die Gegenwart des Terpolymers.
Beispiel 10: Herstellung eines synthetischen Copolymers
Ein Poly(DMAA-co-ASI)-Copolymer wurde durch Copolymerisation der Monomere N,N-Dimethylacrylamid (DMAA) und N-Acryloxysuccinimid (ASI) synthetisiert. Das Beschickungsmolverhältnis betrug 95:5 (DMAA:ASI). Der Radikalinitiator AIBN und das Lösungsmittel Dioxan wurden vor der Verwendung mit Stickstoff gespült und die Polymerisationsreaktion lief bei 70°C 24 Stunden ab.
Nach der Reinigung durch wiederholtes Fällen zur Entfernung von Spuren von Homopolymer wurde mittels Protonen-NMR gefunden, dass die Zusammensetzung des synthetisierten Copolymers (70 % Ausbeute) 94,8:5,2 (Molverhältnis) betrug. Die Molekularmasse (M_n) wurde mittels wässriger GPC zu 4,3 × 10⁴ bestimmt. Die Polydispersität (PD; M_w/M_n) = 1,70 wurde ebenfalls mittels GPC bestimmt.
Beispiel 11: Herstellung eines Kollagen-Copolymer-Hydrogels
Ein vernetztes Kollagen-Copolymer-Hydrogel wurde durch Mischen von neutralisiertem Rinderkollagen (1,0 ml) mit dem im Beispiel 9 hergestellten synthetischen Copolymer [0,2 ml (200 mg/ml in D-PBS)] durch Mischen mit einer Spritze hergestellt. Nach dem sorgfältigen Pumpen mit der Spritze zur Erzeugung einer homogenen, blasenfreien Lösung wurden Aliquots in Kunststoff-Kontaktlinsenformen injiziert und 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Reaktion der Kollagen-NH₂-Gruppen mit ASI-Gruppen in dem Copolymer sowie die langsamere Hydrolyse restlicher ASI-Gruppen zu AAc-Gruppen zu ermöglichen.
Die geformten Proben wurden dann 24 Stunden bei 37°C in einer Umgebung mit 100 % Feuchtigkeit inkubiert, um das fertiggestellte Hydrogel bereitzustellen. Bei der Gelierung enthielt das Hydrogel 94,8 % Wasser, 2,9 % Kollagen und 2,3 % synthetisches Copolymer. Matrizen wurden so geformt, dass sie eine Enddicke zwischen entweder 150 bis 200 μm oder 500 bis 600 μm aufwiesen. Jede resultierende Hydrogelmatrix wurde unter einer PBS-Lösung aus ihrer Form entfernt und anschließend in PBS eingetaucht, die 1 % Chloroform und 0,5 % Glycin enthielt. Dieser Waschschritt entfernte N-Hydroxysuccinimid, das bei der Vernetzungsreaktion erzeugt wird, und beseitigte jedwede nicht umgesetzte ASI-Gruppe in der Matrix durch Umwandeln in Acrylsäuregruppen.
Succinimidrückstände, die in den Gelen, die aus Kollagen und Copolymer hergestellt worden sind, zurückgeblieben waren, lagen nach dem Waschen unterhalb der IR-Nachweisgrenze.
Beispiel 12: Physikalische Eigenschaften des Kollagen-Copolymer-Hydrogels
Die Lichtrückstreuung und die Lichtdurchlässigkeit im sichtbaren Bereich und mit weißem Licht für Hydrogele, die gemäß Beispiel 10 hergestellt worden sind, als Funktion des Verhältnisses von Kollagenamin zu Copolymer-ASI sind in den 13A und B gezeigt.
Das Copolymer von Beispiel 10 und dessen Hydrogele wiesen bis 60°C keinen erfassbaren Trübungspunkt (LCST) auf.
Beispiel 13: Biologische Eigenschaften verschiedener Hydrogele
11.1 Biologische Verträglichkeit
Drei Scheiben mit einem Durchmesser von 12 mm und einer Dicke von 650 μm jeweils aus Kollagen-Poly(DMAA-co-ASI)-, Kollagen-Poly(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapeptid- und 3 % Kollagen-Hydrogelen wurden 30 min in PBS eingetaucht. Sie wurden jeweils auf einen 12 mm-Membraneinsatz gelegt, der für eine Kulturschale erhältlich ist, und mit einer dünnen Beschichtung aus Gelatine an der Membran angebracht. Nach 10 min Trocknen wurden 1 × 10⁴ menschliche Hornhautepithelzellen (HCEC), die in einem serumfreien Medium suspendiert waren, das epidermalen Wachstumsfaktor enthielt (Keratinozytenserum-freies Medium (KSFM, Life Technologies, Burlington, Canada)), auf die Gele aufgebracht, und KSFM ohne Zellen wurde dem darunter liegenden Well zugesetzt. Die Kulturen wurden bei 37°C mit 5 % CO₂ inkubiert.
Innerhalb von 12 Stunden hafteten die Zellen in allen Proben an der Oberfläche der Matrix. Das Medium wurde jeden zweiten Tag geändert, wobei KSFM den Einsätzen und den außerhalb befindlichen Wells hinzugefügt wurde. HCEC wurden bis zur Konfluenz auf den Gelen wachsen gelassen und erreichten am gleichen Tag die Konfluenz (5 Tage). Das Medium in den Einsätzen und den umgebenden Wells wurde durch ein Serum-enthaltendes Medium ersetzt (modifiziertes SHEM-Medium (M.M. Jumblatt & A.H. Neufeld (1983), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24, 1139-43)). Nach 2 weiteren Tagen wurde das Medium aus den Einsätzen entfernt und das Volumen von SHEM in den darunter liegenden Wells wurde auf 0,5 ml vermindert. Das Epithel wurde weitere 7 Tage Schichten bilden gelassen und die Schicht von Zellen wurde visualisiert.
Nach 7 Tagen wurden die Membranen in 4 % para-Formaldehyd in PBS für 30 min bei 4°C fixiert. Proben wurden durch Kryoschneiden durch Äquilibrieren in 30 %iger Saccharose in PBS und anschließend Schnellgefrieren in einem 1:1-Gemisch aus 30 %iger Saccharose in PBS und OCT hergestellt. Diese Proben wurden zu 13 μm kryogeschnitten und die Struktur wurde mittels HandE-Färbung visualisiert. Die Anzahl der Zellschichten in dem geschichteten Epithel wurde durch Zählen der Kerne und Identifizieren der Zellgrenzen bestimmt. Das Kollagen-Thermogel erreichte eine Epitheldicke von etwa 2 Zellen, was einen schlechten Wert im Vergleich zu dem menschlichen Hornhautepithel darstellt, das zwischen etwa 5 und 7 Zellschichten enthält. HCEC, die kultiviert und bezüglich einer Schichtbildung auf Kollagen-p(DMAA-co-ASI) und Kollagen-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapeptid induziert wurden, führten jedoch zu einem Epithel mit einer Dicke von etwa 4,5 Zellschichten, das offensichtlich keratinisierte äußere Schichten umfasste, was eine geeignete Differenzierung des Epithels nahe legte (20).
11.2 Innervierung des Hydrogels
Scheiben mit einem Durchmesser von 12 mm und einer Dicke von 650 μm jeweils aus Kollagen-p(DMAA-co-ASI), Kollagen-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapeptid und 3 % Kollagen-Thermogel wurden 30 min in PBS eingetaucht. Die Scheiben wurden in eine 6 cm-Kulturschale gelegt und durch jede Scheibe wurden vier 1 mm-Löcher gebohrt. Die Löcher wurden zu einem Drittel mit einer Lage aus 0,3 % Kollagen, das mit Glutaraldehyd vernetzt und mit Glycin gequencht war, gefüllt. Nach 10 min wurden Spinalganglien von E8-Hühnern in das gleiche Kollagengemisch getaucht und in den Löchern angeordnet. Der restliche Teil der Löcher wurde mit vernetztem Kollagen gefüllt und 30 min bei 37°C härten gelassen. Kulturen wurden 4 Tage in KSFM, das mit B27, N2 und 1 nM Retinsäure ergänzt war, gezüchtet, und die Neuritenausdehnung wurde durch eine Hellfeld-Mikroskopie überwacht. Die inner vierten Scheiben wurden in 4 %igem Paraformaldehyd in PBS 30 min bei Raumtemperatur fixiert, bezüglich einer NF200-Immunreaktivität gefärbt und mittels Immunfluoreszenz visualisiert. Die Lokalisierung wurde auf der Oberfläche und in der Mitte der Polymerscheibe visualisiert. Während eine gewisse Neuritenausdehnung über der Oberfläche des Kollagen-Thermogels vorlag, war keine ersichtlich, die sich bis in das Thermogel selbst erstreckte. In den Hydrogelen waren Neuriten sichtbar, die sich in die Matrix erstreckten. In beiden Hydrogelen konnte auch eine ausgedehnte Innervierung über der Oberfläche der Matrix festgestellt werden, was eine bessere Oberflächeninnervierung nahe legt, als sie mit dem Kollagen-Thermogel stattfand (19, A zeigt das Kollagen-Thermogel, B zeigt das Kollagen-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapeptid-Hydrogel und C zeigt das Kollagen-p(DMAA-co-ASI)-Hydrogel). Die linke Spalte stellt Immunfluoreszenz-Visualisierungen der Mitte der Polymere dar, die bezüglich des Nerven-Neurofilamentmarkers NF200 gefärbt worden sind. Die mittlere Spalte zeigt eine Hellfeldansicht der Oberfläche des Polymers, wobei sich die Neuriten von der Ganglionquelle erstrecken. Die rechte Spalte stellt eine Immunfluoreszenz-Visualisierung der gleichen Oberflächenansicht des Polymers dar, das bezüglich der NF200-Immunreaktivität gefärbt worden ist. Die Pfeile zeigen Neuriten an, die sich in die Mitte des Polymers erstrecken. Die intakte menschliche Hornhaut zeigt sowohl Subepitheloberfläche-Nerven als auch tiefe Nerven, was nahe legt, dass diese Matrizen sowohl bezüglich Nerven biologisch verträglich sind als auch das Hornhautstroma nachahmen können.

Claims

Synthetisches Copolymer, das ein oder mehrere N-Alkyl- oder N,N-Dialkylsubstituierte(s) Acrylamid-Comonomer(e), ein oder mehrere hydrophile(s) Comonomer(e) und ein oder mehrere Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer(e) umfasst, das bzw. die so derivatisiert ist bzw. sind, dass es bzw. sie einen gebundenen vernetzbaren Rest enthält bzw. enthalten, wobei das synthetische Copolymer ein Zahlenmittel der Molekularmasse zwischen etwa 2000 und etwa 1000000 aufweist, wobei das synthetische Copolymer mit primären Aminen mittels des gebundenen vernetzbaren Rests reaktiv ist.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 1, bei dem (a) das N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte Acrylamid-Comonomer eine Struktur der Formel I
aufweist, worin: R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig aus der Gruppe von N und Niederalkyl ausgewählt sind („Niederalkyl" bezieht sich auf eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit einem bis acht Kohlenstoftatom(en) oder auf Cycloalkylgruppen mit drei bis acht Kohlenstoffatomen); (b) das hydrophile Comonomer eine Struktur der Formel II
aufweist, worin: Y O ist oder nicht vorliegt; R₆ und R₇ unabhängig aus der Gruppe von H und Niederalkyl ausgewählt sind; R₈ H, Niederalkyl oder -OR' ist, wobei R' H oder Niederalkyl ist; und R₉ H, Niederalkyl oder -C(O)R₁₀ ist, und R₁₀ -NR₄R₅ oder -OR'' ist, wobei R'' H oder CH₂CH₂OH ist; und (c) das Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer eine Struktur der Formel III
aufweist, worin: R₁₁, R₁₂ und R₁₃ unabhängig aus der Gruppe von N und Niederalkyl ausgewählt sind, und Q N-Succinimido, 3-Sulfosuccinimido (Natriumsalz), N-Benzotriazolyl, N-Imidazolyl und p-Nitrophenyl ist.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das eine oder die mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte(n) Acrylamid-Comonomer(e) und das eine oder die mehreren hydrophile(n) Comonomer(e) gleich oder verschieden sind.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 2, bei dem der kombinierte molare Anteil von N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituiertem Acrylamid-Comonomer und hydrophilem Comonomer zwischen etwa 50 % und etwa 99,5 % liegt und der molare Anteil des derivatisierten Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomers zwischen etwa 0,5 % und etwa 50 % liegt, wobei die Summe der molaren Anteile 100 % beträgt.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 3, bei dem der molare Anteil des N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituiertem Acrylamid-Comonomers zwischen etwa 50 % und etwa 90 % liegt, der molare Anteil des hydrophilen Comonomers zwischen etwa 5 % und etwa 50 liegt und der molare Anteil des derivatisierten Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomers zwischen etwa 0,1 % und etwa 15 % liegt, wobei die Summe der molaren Anteile 100 % beträgt.
Synthetisches Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das eine oder die mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte(n) Acrylamid-Comonomer(e) aus der Gruppe von N-Methylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-Isopropylacrylamid (NiPAAm), N-Octylacrylamid, N-Cyclohexylacrylamid, N-Methyl-N-ethylacrylamid, N-Methylmethacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, N,N-Dicyclohexylacrylamid, N-Methyl-N-cyclohexylacrylamid, N-Acryloylpyrrolidin, N-Methacryloylpyrrolidin und Kombinationen davon ausgewählt ist bzw. sind.
Synthetisches Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das eine oder die mehreren hydrophile(n) Comonomer(e) aus der Gruppe von Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Diethylacrylamid, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylacrylamid, 2-(N,N-Diethylamino]ethylacrylamid, N,N-Diethylmethacrylamid, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylmethacrylamid, 2-[N,N-Diethylamino]ethylmethacrylamid, 2-Vinyl-N-pyrrolidon, 2-[N,N-Diethylamino]ethylacrylat, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylacrylat, 2-[N,N-Diethylamino]ethylmethacrylat, 2-[N,N-Dimethylamino]ethylmethacrylat und Kombinationen davon ausgewählt ist bzw. sind.
Synthetisches Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das eine oder die mehreren Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer(e) aus der Gruppe von Acrylsäure, Methacrylsäure und substituierten Versionen davon ausgewählt sind und der vernetzbare Rest eine Succinimidylgruppe, ein Imidazol, ein Benzotriazol, ein p-Nitrophenol oder eine 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure ist.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 2, das N,N-Dimethylacrylamid und N-Acryloxysuccinimid umfasst.
Synthetisches Copolymer nach Anspruch 3, das N-Isopropylacrylamid, Acrylsäure und N-Acryloxysuccinimid umfasst.
Biosynthetische Matrix, umfassend: (a) das synthetische Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 10; (b) ein Biopolymer; und (c) ein wässriges Lösungsmittel, wobei das synthetische Copolymer und das Biopolymer mittels des vernetzbaren Rests unter Bildung eines Hydrogels vernetzt sind.
Biosynthetische Matrix nach Anspruch 11, bei der die Menge an synthetischem Copolymer zwischen etwa 0,1 und etwa 30 Gew.-% liegt, die Menge des Biopolymers zwischen etwa 0,3 und etwa 50 Gew.-% liegt und die Menge an wässrigem Lösungsmittel zwischen etwa 20 und etwa 99,6 Gew.-% liegt.
Biosynthetische Matrix nach Anspruch 11 oder 12, bei der das Biopolymer aus der Gruppe von Kollagenen, denaturierten Kollagenen, rekombinanten Kollagenen, Gelatine, Fibrin-Fibrinogen, Elastin, Glykoprotein, Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Glykosaminoglykan (Proteoglykan) und Derivaten davon ausgewählt ist.
Biosynthetische Matrix nach einem der Ansprüche 11 bis 13, die weiter ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel umfasst.
Biosynthetische Matrix nach Anspruch 14, bei der das eine oder die mehreren bioaktive(n) Mittel mittels des gebundenen vernetzbaren Rests kovalent an das synthetische Copolymer gebunden ist bzw. sind.
Biosynthetische Matrix nach Anspruch 15, bei der das bioaktive Mittel das Pentapeptid mit der Sequenz YIGSR umfasst.
Biosynthetische Matrix nach Anspruch 14, bei der das eine oder die mehreren bioaktive(n) Mittel in der Matrix dispergiert ist bzw. sind.
Biosynthetische Matrix nach einem der Ansprüche 11 bis 17, die weiter eine Mehrzahl von Zellen umfasst, die in der Matrix dispergiert sind.
Verwendung der biosynthetischen Matrix nach einem der Ansprüche 11 bis 18 als Gerüst für die Geweberegeneration in einem Tier, das einer solchen bedarf, oder zum Ersetzen von beschädigtem oder entferntem Gewebe in einem Tier, das einem solchen bedarf.
Verwendung nach Anspruch 19, bei der die biosynthetische Matrix zum Ersetzen von beschädigtem oder entferntem Gewebe in einem Tier verwendet wird, das einem solchen Bedarf, und bei der das Gewebe Haut, ein Teil eines Organs, eine Hornhaut oder ein Teil einer Hornhaut ist.
Verwendung der biosynthetischen Matrix nach einem der Ansprüche 11 bis 18 zur Beschichtung von chirurgischen Implantaten.
Zusammensetzung, umfassend: (a) ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel; (b) das synthetische Copolymer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10; (c) ein Biopolymer und (d) ein wässriges Lösungsmittel.
Zusammensetzung, umfassend: (a) eine Mehrzahl von Zellen; (b) das synthetische Copolymer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10; (c) ein Biopolymer und (d) ein wässriges Lösungsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, bei der die Menge des synthetischen Polymers zwischen etwa 0,1 und etwa 30 Gew.-% liegt, die Menge des Biopolymers zwischen etwa 0,3 und etwa 50 Gew.-% liegt und die Menge des wässrigen Lösungsmittels zwischen etwa 20 und etwa 99,6 Gew.-% liegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, bei der das Biopolymer aus der Gruppe von Kollagenen, denaturierten Kollagenen, rekombinanten Kollagenen, Gelatine, Fibrin-Fibrinogen, Elastin, Glykoprotein, Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Glykosaminoglykan (Proteoglykan) und Derivaten davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, bei der das synthetische Copolymer und das Biopolymer vernetzt sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, bei der das bioaktive Mittel mittels des gebundenen vernetzbaren Rests kovalent an das synthetische Copolymer gebunden ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 25 oder 27, die als injizierbare Lösung formuliert ist, wobei das synthetische Copolymer und das Biopolymer in vivo unter Bildung eines Hydrogels vernetzen können.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, bei der es sich um ein im Vorhinein gebildetes Hydrogel handelt.
Implantat zur Verwendung bei der Gewebezüchtung, das eine im Vorhinein gebildete biosynthetische Matrix umfasst, wobei die Matrix ein wässriges Lösungsmittel und ein Biopolymer, das mit dem synthetischen Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 10 vernetzt ist, umfasst.
Implantat nach Anspruch 30, bei dem das Biopolymer aus der Gruppe von Kollagenen, denaturierten Kollagenen, rekombinanten Kollagenen, Gelatine, Fibrin-Fibrinogen, Elastin, Glykoprotein, Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Glykosaminoglykan (Proteoglykan) und Derivaten davon ausgewählt ist.
Implantat nach Anspruch 30 oder 31, bei dem die Menge des synthetischen Polymers zwischen etwa 0,1 und 30 Gew.-% liegt, die Menge des Biopolymers zwischen etwa 0,3 und 50 Gew.-% liegt und die Menge des wässrigen Lösungsmittels zwischen etwa 20 und 99,6 Gew.-% liegt.
Implantat nach einem der Ansprüche 30 bis 32, bei dem die biosynthetische Matrix das Einwachsen von Nerven unterstützt.
Implantat nach einem der Ansprüche 30 bis 33, das ferner ein oder mehrere bioaktive(s) Mittel umfasst.
Implantat nach Anspruch 34, bei dem das bioaktive Mittel mittels des gebundenen vernetzbaren Rests kovalent an das Copolymer gebunden ist.
Implantat nach einem der Ansprüche 30 bis 35, das weiter eine Mehrzahl von Zellen umfasst, die in der Matrix dispergiert sind.
Implantat nach Anspruch 36, bei dem die Zellen Stammzellen oder Vorläuferzellen sind.
Verwendung des Implantats nach einem der Ansprüche 30 bis 35 als künstliche Hornhaut.
Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Copolymers, umfassend: (a) Dispergieren von einem oder mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkyl-substituierte(n) Acrylamid-Comonomer(en), einem oder mehreren hydrophilen Comonomer(en) und einem oder mehreren Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomer(en), das bzw. die so derivatisiert ist bzw. sind, dass es bzw. sie einen gebundenen vernetzbaren Rest umfasst bzw. umfassen, in einem Lösungsmittel in der Gegenwart eines Initiators; (b) Polymerisierenlassen des einen oder der mehreren N-Alkyl- oder N,N-Dialkylsubstituierten Acrylamid-Comonomers bzw. -Comonomere, des einen oder der mehreren hydrophilen Comonomers bzw. -Comonomere und des einen oder der mehreren Acryl- oder Methacrylcarbonsäure-Comonomers bzw. -Comonomere, zur Bildung eines synthetischen Copolymers und (c) gegebenenfalls Reinigen des synthetischen Copolymers.
Verfahren zur Herstellung einer biosynthetischen Matrix, umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines synthetischen Copolymers mit dem Verfahren nach Anspruch 39; (b) Dispergieren des synthetischen Copolymers und eines Biopolymers in einem wässrigen Medium und (c) Vernetzenlassen des synthetischen Copolymers und des Biopolymers zur Bereitstellung der biosynthetischen Matrix.
Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, bei dem das N-Alkyl- oder N,N-Dialkylsubstituierte Acrylamid-Comonomer und das hydrophile Comonomer gleich oder verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 40, weiter umfassend: (i) Mischen des synthetischen Copolymers mit einem oder mehreren bioaktiven Mittel(n) vor dem Schritt (b) und Vernetzenlassen des bioaktiven Mittels mittels des gebundenen vernetzbaren Rests mit dem synthetischen Copolymer; oder (ii) Mischen des synthetischen Copolymers und des Biopolymers mit einer Mehrzahl von Zellen im Schritt (b).
Synthetisches Copolymer, das mit dem Verfahren nach Anspruch 39 hergestellt worden ist.
Biosynthetische Matrix, die mit dem Verfahren nach Anspruch 40 hergestellt worden ist.
Augenimplantat, welches das synthetische Copolymer nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst.