ES2283849T3 - Matriz biosintetica y utilizaciones de la misma. - Google Patents

Abstract

Un copolímero sintético formado por uno o más comonómeros N-alquil- o N, N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico del que se han obtenido derivados que contengan una parte colgante que se pueda entrecruzar, teniendo dicho copolímero sintético un número de masa molecular promedio de entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 1.000.000, donde dicho copolímero sintético es reactivo con aminas primarias a través de la parte colgante entrecruzable.

Description

Matriz biosintética y utilizaciones de la misma.

La presente invención pertenece a la especialidad de la ingeniería de tejidos y, concretamente, a una matriz biosintética que incluye un hidrogel apto para su utilización in vivo.

La ingeniería de tejidos es un campo en rápido crecimiento que abarca diversas tecnologías cuyo objetivo es sustituir o restablecer los tejidos y la función orgánica. El objetivo primordial en la ingeniería de tejidos es la regeneración de un tejido defectuoso mediante el uso de materiales que puedan integrarse en el tejido existente de modo que se restablezca la función tisular normal. La ingeniería de tejidos, por lo tanto, exige materiales que puedan soportar el crecimiento en la superficie, el crecimiento hacia el interior o la encapsulación de las células y, en muchos casos la regeneración de nervios.

Las composiciones poliméricas están encontrando una aplicación muy difundida en la ingeniería de tejidos. Los biopolímeros naturales, como los colágenos, la fibrina, los alginatos y la agarosa son no-citotóxicos y soportan el crecimiento en su superficie, el crecimiento hacia el interior y la encapsulación de células vivas. Sin embargo, las matrices obtenidas de polímeros naturales, por lo general no son lo suficientemente resistentes para un trasplante. En cambio, las matrices preparadas a partir de polímeros sintéticos se pueden formular de forma que presenten características físicas, como es la resistencia del gel, y biológicas, como la degradabilidad, predeterminadas. Se han publicado datos de que análogos sintéticos de polímeros naturales como la polilisina, la poli(etilenimina) y otros por el estilo pueden tener efectos citotóxicos [Lynn y Langer, J. Amer. Chem. Soc., 122:10761-10768(2000)], lo cual ha conducido al desarrollo de polímeros sintéticos alternativos para aplicaciones en la ingeniería de tejidos.

Los hidrogeles son polímeros entrecruzados, insolubles en agua y que contienen agua, que ofrecen una buena biocompatibilidad y tienen una tendencia menor a inducir trombosis, incrustación e inflamación y, como tales, son candidatos ideales para los fines de la ingeniería de tejidos. El uso de hidrogeles en biología celular es bien conocido [véase, por ejemplo, A].

Atala y R.P. Lanza, eds., "Methods in Tissue Engineering" Academia Press, San Diego, 2002]. Se ha descrito una gran variedad de hidrogeles para aplicaciones in vivo [véase, por ejemplo, la revisión de Jeong, et al., Adv. Drug Deliv. Rev, 54:37-51 (2002)]. Los hidrogeles basados en N-isopropilacrilamida (NiPAAm) y algunos copolímeros de ésta, por ejemplo, son no-tóxicos y capaces de soportar el crecimiento de células encapsuladas in vitro [Vernon, et al., Macromol. Symp., 109:155-167 (1996); Stile, et al., Macromolecules, 32:7370-9 (1999); Stile, et al., Biomacromolecules 3:591-600 (2002); Stile, et al., Biomacromolecules 2:185-194 (2001); Webb, et al., MUSC Orthopaedic J., 3:18-21 (2000); An et al., Patente de EE.UU. nº 6.103.528]. También se han descrito polímeros de NiPAAm sensibles a temperatura para su uso en inmunoensayos [Patente de EE.UU. nº 4.780.409]. Sin embargo, a pesar de las manipulaciones de las condiciones de síntesis y de las mejoras para potenciar la biocompatibilidad, es difícil todavía obtener una interfase huésped-implante sin discontinuidades y la integración completa del implante de hidrogel en el huésped [Hicks, et al. Surv. Ophthalmol. 42:175-189 (1997); Trinkaus-Randall y Nugent, J. Controlled Release 53:205-214
(1998)].

Se han descrito modificaciones de geles de polímeros sintéticos con un segundo polímero obtenido por medios naturales para generar una estructura de red de polímeros con interpenetración ("IPN") [Por ejemplo, véase Gutowska et al., Macromolecules, 27:4167 (1994); Yoshida et al., Nature, 374:240 (1995): Wu y Jiang, Patente de EE.UU. nº 6.030.634; Park et al., Patente de EE.UU. nº 6.271.278]. Sin embargo, estas estructuras se desestabilizan con frecuencia por extracción del componente obtenido de forma natural por los medios de cultivo y por los fluidos fisiológicos. Los polímeros obtenidos de forma natural tienden también a biodegradarse rápidamente dentro del cuerpo, dando lugar a la desestabilización de los implantes in vivo.

También se han descrito hidrogeles más resistentes que incluyen compuestos de polímeros entrecruzados. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.388.047 describe un compuesto formado por un macrómero hidrófobo y un polímero hidrófilo que son entrecruzados para formar un hidrogel por polimerización con radicales libres. La patente de EE.UU. nº 6.323.278 describe un compuesto de polímeros entrecruzados que se puede formar in situ y que comprende dos polímeros sintéticos, uno que contiene múltiples grupos electrofílicos y el otro con múltiples grupos nucleofílicos. En las dos patentes de EE.UU., nº 6.388.047 y 6.384.105, se describen sistemas que deben ser entrecruzados mediante la química de radicales libres, lo que requiere el uso de iniciadores con citotoxicidad bien conocida (azocompuestos, persulfatos), conduciendo así a posibles efectos secundarios si el hidrogel tuviera que utilizarse en el tejido o con células encapsuladas.

La patente de EE.UU. nº 6.384.105 describe compuestos de polímeros inyectables biodegradables que incluyen poli(fumarato de propileno) y poli(etilenglicol)-dimetacrilato que se pueden entrecruzar in situ. Los hidrogeles descritos en esta patente se basan en gran parte en polímeros con un entramado de óxido de polietileno. Aunque es sabido que estos polímeros son biocompatibles, es dudosa su capacidad para soportar el crecimiento celular.

La patente de EE.UU. nº 6.566.406 describe hidrogeles entrecruzados biocompatibles formados a partir de precursores solubles en agua que tienen grupos electrofílicos y nucleofílicos capaces de reaccionar y entrecruzarse in situ. Los precursores descritos son un polímero de óxido de polialquileno y un agente de entrecruzamiento. Como ya se indicó arriba, es dudosa la capacidad de los polímeros con entramado de óxido de polialquileno para soportar el crecimiento celular.

Se mantiene por lo tanto la necesidad de una matriz mejorada que sea biocompatible, suficientemente resistente para funcionar como un implante y que pueda soportar el crecimiento celular in vivo.

Esta información preliminar se ofrece con el fin de dar a conocer la información considerada por el solicitante como de posible interés para la presente invención. No se pretende necesariamente el reconocimiento, ni debe interpretarse, que algo de la información precedente constituya una técnica previa en contra de la presente invención.

Uno de los propósitos de la presente invención es suministrar una matriz biosintética y los usos de la misma. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un copolímero sintético apto para la preparación de una matriz biosintética, que incluye uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos, uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico que se han transformado para obtener derivados que contengan una parte colgante reactiva capaz de entrecruzarse con moléculas bioactivas, teniendo dicho polímero sintético un valor aproximado de masa molecular comprendido entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 1.000.000, donde dicho copolímero sintético es reactivo con aminas primarias a través de la parte colgante capaz de entrecruzarse.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una matriz biosintética que comprende el copolímero sintético, un biopolímero y un solvente acuoso, donde el copolímero sintético y el biopolímero están entrecruzados para formar un hidrogel.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan los usos de la matriz biosintética como un soporte para la regeneración tisular, para la sustitución de tejido dañado o eliminado en un animal o para recubrir implantes quirúrgicos.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan compuestos que comprenden: uno o más agentes bioactivos o una diversidad de células; un copolímero sintético de la invención; un biopolímero, y un solvente acuoso.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un implante para uso en ingeniería de tejidos que comprende una matriz biosintética preformada, comprendiendo dicha matriz un solvente acuoso y un biopolímero entrecruzado con un copolímero sintético de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso del implante como córnea artificial.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar un copolímero sintético que incluye: (a) la dispersión de uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico que se han transformado para obtener derivados que contengan una parte colgante capaz de entrecruzarse, en un solvente en presencia de un iniciador; (b) dejar que el comonómero de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, el comonómero hidrófilo y el comonómero de acril- o metacril- ácido carboxílico se polimericen para formar un copolímero sintético, y (c) opcionalmente la purificación del copolímero sintético y un procedimiento para preparar una matriz biosintética que incluye la preparación de un copolímero sintético, la dispersión del copolímero sintético y un biopolímero en un medio acuoso y dejar que el copolímero sintético y el biopolímero se entrecrucen para dar lugar a la matriz biosintética.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 describe la estructura general de un terpolímero acorde con un modo de realización de la invención que incluye N-isopropilacrilamida, (NiPAAm), ácido acrílico (AAc) y N-acriloxisuccinimida (ASI).

La Figura 2 presenta los resultados clínicos del trasplante en cerdos de córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de acuerdo con un modo de realización de la invención.

La Figura 3 presenta los resultados de microscopia confocal in vivo 6 semanas después de la operación quirúrgica de córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de acuerdo con un modo de realización de la invención y trasplantadas a cerdos.

La Figura 4 describe las pruebas in vivo de la sensibilidad corneal de córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de acuerdo con un modo de realización de la invención y trasplantadas a cerdos.

Las Figuras 5, 6 y 7 presentan los resultados de la evaluación morfológica y bioquímica de córneas artificiales preparadas a partir de una matriz biosintética de acuerdo con un modo de realización de la invención y trasplantadas a cerdos.

La Figura 8 muestra (A) la estructura de un terpolímero que contiene un elemento bioactivo entrecruzado de acuerdo con un modo de realización de la invención, (B) un soporte corneal compuesto de colágeno y el terpolímero que se muestra en (A) entrecruzados y (C) muestra un soporte corneal compuesto de colágeno termogelificado solo.

Las Figuras 9 y 10 describen los resultados del suministro de un hidrogel que contiene colágeno y un agente terpolímero bioactivo de acuerdo con un modo de realización de la invención en cerebros de ratón y rata.

La Figura 11 muestra el módulo (A) y la presión en el fallo (B) a partir de medidas de estirón de la sutura en función de las proporciones de concentración de N-acriloxisuccinimida con respecto a grupos amina del colágeno para matrices de hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención.

La Figura 12 describe la transmisión (A) y la retrodispersión (B) de luz a través de la región visible en función de las proporciones de concentración de N-acriloxisuccinimida con respecto a grupos amina del colágeno para matrices de hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención.

La Figura 13 describe la transmisión (A) y la retrodispersión (B) de luz a través de la región visible en función de las proporciones de concentración de N-acriloxisuccinimida con respecto a grupos amina del colágeno para una matriz de hidrogel de acuerdo con otro modo de realización de la invención.

La Figura 14 describe el restablecimiento de la sensibilidad al tacto para un implante de córnea en cerdo que comprende un hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención.

La Figura 15 describe el procedimiento de implante de córnea por queratoplastia lamelar en cerdos y las imágenes clínicas in vivo por microscopia confocal de implantes de 6 semanas que incluyen un hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención. Bar = 25 \mum para D-F, 15 \mum para G-O.

La Figura 16 describe la regeneración postoperatoria de la córnea en cerdos que recibieron implantes de córnea que comprenden un hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención. Bar = 100 \mum para A-F, 40 \mum para G-I, 200 nm para J-L, 20 \mum para M-O, 30 \mum para P-R

La Figura 17 describe la integración implante-huésped postoperatoria 6 semanas después de la operación en cerdos que recibieron implante de córnea que incluía un hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención.
Bar =100 \mum en todos los casos.

La Figura 18 describe la sensibilidad de la córnea al tacto en implantes realizados en cerdos que recibieron implante de córnea que incluían un hidrogel de acuerdo con un modo de realización de la invención.

La Figura 19 describe el resultado de las pruebas de compatibilidad de la inervación en varias matrices de hidrogel.

La Figura 20 describe el crecimiento y la estratificación de células epiteliales en varios hidrogeles. (A) Vistas con pocos aumentos del crecimiento epitelial sobre los hidrogeles (el recuadro tiene mayor aumento) y (B) recuentos del espesor de células del epitelio crecido sobre los hidrogeles.

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el entendido normalmente por los expertos en la materia de la que trata esta invención.

El término "hidrogel", tal como se utiliza aquí, se refiere a un material polimérico entrecruzado que exhibe la capacidad de hincharse en agua o en una solución acuosa sin disolverse y de retener una cantidad significativa de agua o de solución acuosa dentro de su estructura.

El término "polímero", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula formada por monómeros individuales unidos. En el contexto de la presente invención, un polímero puede incluir monómeros que están unidos "extremo con extremo" para formar una molécula lineal o puede incluir monómeros que se unen para formar una estructura ramificada.

El término "monómero", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula orgánica simple que es capaz de formar una cadena larga, ya sea sola o en combinación con otras moléculas orgánicas similares para dar lugar a un polímero.

El término "copolímero", tal como se utiliza aquí, se refiere a un polímero que comprende dos o más monómeros distintos. Los copolímeros pueden ser regulares, aleatorios, en bloque o injertados. Un copolímero regular se refiere a un copolímero en el que los monómeros se repiten siguiendo un patrón regular (por ejemplo, para los monómeros A y B, un copolímero regular puede tener una secuencia: ABABABAB). Un copolímero aleatorio es un copolímero en el que los diferentes monómeros se distribuyen al azar o estadísticamente en cada molécula de polímero individual (por ejemplo, para los monómeros A y B, un copolímero aleatorio puede tener una secuencia: AABABBABB-BAAB). En cambio, un copolímero en bloque es un copolímero en el que los distintos monómeros están separados en regiones discretas dentro de cada molécula de polímero individual (por ejemplo, para los monómeros A y B, un copolímero en bloque puede tener una secuencia: AAABBBAAABBB). Un copolímero injertado se refiere a un copolímero elaborado mediante la unión de un polímero o polímeros de un tipo a otra molécula polimérica de diferente composi-
ción.

El término "terpolímero", tal como se utiliza aquí, se refiere a un copolímero que comprende tres monómeros diferentes.

El término "biopolímero", tal como se utiliza aquí, se refiere a un polímero que se genera de forma natural. Los polímeros originados en la naturaleza incluyen las proteínas y los carbohidratos. El término "biopolímero" también incluye formas derivadas de los polímeros naturales que han sido modificadas para facilitar el entrecruzamiento con un polímero sintético de la invención.

El término "polímero sintético", tal como se utiliza aquí, se refiere a un polímero que no existe de modo natural y que se genera por síntesis química o recombinante.

Los términos "alquilo" y "alquilo inferior" se utilizan aquí de modo intercambiable para referirse a un grupo alquilo de cadena sencilla o ramificada con uno a ocho átomos de carbono o un grupo cicloalquilo de tres a ocho átomos de carbono. Estos términos se ilustran mejor por grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, 1-butilo (o 2-metilpropilo), i-amilo, n-amilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y otros por el estilo.

El término "agente bioactivo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula o compuesto que ejerce un efecto fisiológico, terapéutico o diagnóstico in vivo. Los agentes bioactivos pueden ser orgánicos o inorgánicos. Son ejemplos representativos las proteínas, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, compuestos antitumorales y antineoplásicos, compuestos antivirales, compuestos antiinflamatorios, compuestos antibióticos como los compuestos fungicidas y antibacterianos, fármacos reductores de colesterol, analgésicos, agentes de contraste para obtención de imágenes para diagnóstico, enzimas, citoquinas, anestésicos locales, hormonas, agentes antiangiogénicos, neurotransmisores, oligonucleótidos terapéuticos, partículas virales, vectores, factores de crecimiento, retinoides, factores de adhesión celular, glucoproteínas de matriz extracelular (como la laminina), hormonas, factores osteogénicos, anticuerpos y antígenos.

El término "biocompatible", tal como se utiliza aquí, se refiere la capacidad de ser incorporado a un sistema biológico, tal como un órgano o un tejido de un animal, sin estimular una respuesta inmunitaria y/o inflamatoria, fibrosis u otra respuesta tisular adversa.

Tal como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" se refiere a una variación de +/-10% con respecto al valor nominal. Debe entenderse, que dicha variación se incluye siempre en cualquier valor dado que se facilite aquí, se haga o no mención específica a la misma.

1. Matriz biosintética

La presente invención proporciona una matriz biosintética que incluye un hidrogel que se ha formado entrecruzando un polímero sintético y un biopolímero. El biopolímero puede encontrarse en su forma natural o puede ser tratado para obtener un derivado que facilite el entrecruzamiento con el polímero sintético. La matriz es resistente, biocompatible y no citotóxica. La matriz puede formarse en solución acuosa a pH neutro y puede ser adaptada para incluir luego uno o más agentes bioactivos tales como factores de crecimiento, retinoides, factores de adhesión celular, enzimas, péptidos, proteínas, nucleótidos, fármacos y otros por el estilo. El agente bioactivo puede unirse mediante enlaces covalentes al polímero sintético, o puede encapsularse y dispersarse dentro de la matriz final dependiendo de los requerimientos para el uso final de la matriz. La matriz también puede incluir células encapsuladas y dispersas en su interior, que sean capaces de proliferar y/o diversificarse una vez depositada la matriz in vivo.

En un modo de realización de la presente invención, la matriz biosintética soporta el crecimiento celular. Dicho crecimiento celular puede ser de recubrimiento de superficies epiteliales y/o endoteliales (es decir, crecimiento en dos dimensiones, 2D), y/o crecimiento celular en tres dimensiones (3D) implicando el crecimiento en la propia matriz.

En otro modo de realización de la invención, la matriz biosintética soporta el crecimiento de nervios hacia el interior. Como ya se sabe en esta técnica, el crecimiento de nervios en los tejidos trasplantados tiene lugar a lo largo de un período de tiempo prolongado, normalmente, del orden de meses o años. El crecimiento de los nervios en la matriz puede producirse más rápidamente que el crecimiento de los nervios en tejido trasplantado produciendo de ese modo una regeneración más rápida del tejido funcional, por ejemplo, el crecimiento de nervios hacia el interior puede producirse en semanas.

La matriz biosintética se puede adaptar para aplicaciones específicas. Por ejemplo, la matriz se puede usar en aplicaciones de ingeniería tisular y puede ser preformada con una forma específica para este fin. La matriz también se puede emplear como un vehículo de liberación de fármacos para proporcionar la liberación continua de un compuesto terapéutico o diagnóstico en un punto determinado dentro del cuerpo de un animal.

Para que sea apropiada para la implantación in vivo para fines de ingeniería tisular, la matriz biosintética debe mantener su forma a temperaturas fisiológicas, ser prácticamente insoluble en agua, ser suficientemente resistente y soportar el crecimiento de las células.

También podría ser deseable que la matriz soportase el crecimiento de nervios.

1.1 Polímero sintético

De acuerdo con la presente invención, el polímero sintético que se incorpora en la matriz biosintética es un copolímero que comprende uno o más derivados de acrilamida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de ácido carboxílico derivado que incluyen partes colgantes que se pueden entrecruzar.

Tal como se utiliza aquí, un "derivado de acrilamida" se refiere a N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida o metacrilamida sustituida. Son ejemplos de derivados de acrilamida apropiados para su uso en el polímero sintético de la presente invención la N-metilacrilamida, N-etilacrilamida, N-isopropilacrilamida (NiPAAm), N-ortilacrilamida, N-ciclohexilacrilamida, N-metil-N-etilacrilamida, N-metilmetacrilamida, N-etilmetacrilamida, N-isopropilmetacrilamida, N, N-dimetilacrilamida, N,N-dietilacrilamida, N,N-dimetilmetacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, N,N-diciclohexilacrilamida, N-metil-N-ciclohexilacrilamida, N-acriloilpirrolidina, N-metacriloilpirrolidina, y combinaciones de los mismos.

Un "comonómero hidrófilo" en el contexto de la presente invención es un monómero hidrófilo que sea capaz de copolimerización con el derivado de acrilamida y los componentes de ácido carboxílico derivados del polímero sintético. El comonómero hidrófilo se selecciona de forma que proporcione una solubilidad suficiente para la polimerización, la solubilidad acuosa del copolímero y libertad de transición de fase del copolímero final y el hidrogel. Son ejemplos de comonómeros hidrófilos adecuados los compuestos acrilo- o metacrilo- hidrófilos tales como los ácidos carboxílicos, incluido el ácido acrílico, ácido metacrílico y derivados de los mismos, acrilamida, metacrilamida, derivados hidrófilos de acrilamida, derivados hidrófilos de metacrilamida, ésteres hidrófilos del ácido acrílico, ésteres hidrófilos del ácido metacrílico, vinil etanol y sus derivados y etilenglicoles. Los ácidos carboxílicos y los derivados pueden ser, por ejemplo, ácido acrílico, ácido metacrílico, 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), o una combinación de los mismos. Entre los ejemplos de derivados hidrófilos de acrilamida se incluyen N,N-dimetil-acrilamida, N,N-dietilacrilamida, 2-[N,N-dimetilamino]etilacrilamida, 2-[N,N-dietilamino]etilacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, 2-[N,N-dimetilamino]etilmetacrilamida, 2-[N, N-dietilamino]etilmetacrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de ésteres acrílicos hidrófilos incluyen 2-[N,N-dietilamino]etilacrilato, 2-[N,N-dimetilamino]etilacrilato, 2-[N,N-dietilamino]etilmetacrilato, 2-[N,N-dimetilamino]etilmetacrilato, o combinaciones de los
mismos.

Tal como se utiliza aquí, un "comonómero de ácido carboxílico derivado" se refiere a un acril- o metacril- ácido carboxílico hidrófilo, por ejemplo, ácido acrílico, ácido metacrílico, o una versión sustituida de los mismos, que haya sido tratada químicamente para obtener derivados que contengan una parte que se pueda entrecruzar, tal como grupos succinimidilo, imidazoles, benzotriazoles y p-nitrofenoles. El término "grupo succinimidilo" se pretende que abarque las variaciones del grupo sucinimidilo genérico, tales como los grupos sulfosuccinimidilo. Otras estructuras similares, tal como el ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico también resultará evidente para los expertos en la materia. En el contexto de la presente invención, el grupo seleccionado como parte para el entrecruzamiento actúa aumentando la reactividad del grupo ácido carboxílico al que está unido por aminas primarias (es decir, grupos -NH_{2}) y tioles (es decir, grupos -SH). Son ejemplos de grupos apropiados para la obtención de derivados de comonómeros del ácido carboxílico para su uso en el polímero sintético la N-succinimida, ácido N-succinimida-3-sulfónico, N-benzotriazol, N-imidazol y p-nitrofenol.

En un modo de realización de la presente invención, el polímero sintético comprende:

(a) uno o más derivados de acrilamida de fórmula general I:

\vskip1.000000\baselineskip

1

donde:

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo de: H y alquilo inferior;

\newpage

(b) uno o más comonómeros hidrófilos (que pueden ser el mismo o diferentes de (a)) con la fórmula general II:

2

donde:

Y es O, o no existe;

R_{6} y R_{7} se seleccionan independientemente del grupo de: H y alquilo inferior;

R_{8} es H, alquilo inferior, o -OR', donde R' es H o alquilo inferior; y

R_{9} es H, alquilo inferior, o -C(O)R_{10}, y

R_{10} es -NR_{4}R_{5} o -OR'', donde R'' es H o CH_{2}CH_{2}OH;

y

(c) uno o más ácidos carboxílicos derivados que tengan la fórmula general III:

3

donde:

R_{11}, R_{12} y R_{13} se seleccionan independientemente del grupo de: H y alquilo inferior y

Q es N-succinimido, 3-sulfo-succinimido (sal sódica), N-benzotriazolilo, N-imidazolilo o p-nitrofenilo.

En un modo de realización, el polímero sintético comprende uno o más derivados de acrilamida de fórmula general I, uno o más comonómeros hidrófilos de fórmula general II y uno o más ácidos carboxílicos derivados de fórmula general III, como las anteriormente descritas, en donde el término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo de cadena ramificada o simple que tiene 1 a 8 átomos de carbono.

En otro modo de realización, el polímero sintético comprende uno o más derivados de acrilamida de fórmula general I, uno o más comonómeros hidrófilos de fórmula general II y uno o más ácidos carboxílicos derivados de fórmula general III, como las anteriormente descritas, en donde el término "alquilo inferior" se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene 3 a 8 átomos de carbono, tal como el ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

El copolímero puede ser lineal o ramificado, regular, aleatorio o en bloque. De acuerdo con la presente invención, el polímero sintético final comprende varias partes colgantes reactivas disponibles para el entrecruzamiento, o el injerto, de las biomoléculas que convenga.

Un experto en la materia observará que el grupo de compuestos que abarca el término "derivado de acrilamida" y el grupo de compuestos que abarca el término "comonómero hidrófilo" se superponen en gran parte y que se podría seleccionar un monómero simple que cumpliera las funciones de estos dos componentes en el copolímero. Así, por ejemplo, cuando se selecciona un derivado de acrilamida que es suficientemente hidrófilo como para conferir al polímero sintético las propiedades deseadas, se puede elegir un componente comonómero hidrófilo que sea idéntico al derivado de acrilamida seleccionado dando lugar a un copolímero que contiene solamente dos monómeros diferentes (es decir, el derivado de acrilamida/comonómero hidrófilo y el comonómero de ácido carboxílico derivado). Por otra parte, cuando se desea una capacidad hidrófila mayor que la proporcionada por el derivado de acrilamida, se pueden elegir uno o más comonómeros hidrófilos distintos dando lugar a un copolímero formado por tres monómeros diferentes como mínimo.

En un modo de realización de la presente invención, el derivado de acrilamida y el comonómero hidrófilo utilizados en la preparación del polímero sintético son el mismo. En otro modo de realización, el derivado de acrilamida y el comonómero hidrófilo utilizados en la preparación del polímero sintético son diferentes.

La capacidad hidrófila global del copolímero está controlada para conferirle solubilidad en agua a temperaturas comprendidas entre 0°C y temperaturas fisiológicas sin que se produzca precipitación ni transición de fases. En un modo de realización de la presente invención, el copolímero es soluble en agua entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 37°C.

El copolímero debe ser suficientemente soluble en solución acuosa como para facilitar la formación del hidrogel. Por consiguiente, de acuerdo con un modo de realización de la presente invención, el término "soluble en agua" se usa para referirse a una solubilidad acuosa del copolímero de aproximadamente 0,5% peso/volumen (p/v) como mínimo. En otro modo de realización, el copolímero tiene una solubilidad acuosa comprendida entre aproximadamente 1,0% p/v y aproximadamente 50% p/v. En otras realizaciones el copolímero tiene una solubilidad acuosa de aproximadamente 5% p/v y aproximadamente 45% p/v y entre aproximadamente 10% p/v y aproximadamente 35% p/v.

Como es sabido en la técnica, la mayoría de los polímeros sintéticos tienen una distribución de la masa molecular y a menudo se distinguen varios promedios diferentes de masa molecular, por ejemplo, la masa molecular promedio en número (M_{n}) y la masa molecular promedio en peso (M_{w}). El peso molecular de un polímero sintético se define normalmente en términos de su masa molecular promedio en número (M_{n}), que, a su vez, se define como la suma de n_{i}M_{i} dividido por la suma de n_{i}, donde n_{i} es el número de moléculas en la distribución con masa M_{i}. El polímero sintético para usar en la matriz de la presente invención tiene una masa molecular promedio en número (M_{n}) comprendida entre 2.000 y 1.000.000. En un modo de realización de la presente invención, la M_{n} del polímero está comprendida entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 90.000. En otro modo de realización de la presente invención, la M_{n} del polímero está comprendida entre aproximadamente 25.000 y aproximadamente 80.000. En otro modo de realización más, la M_{n} del polímero está comprendida entre aproximadamente 30.000 y aproximadamente 50.000. En otro modo de realización, la M_{n} del polímero está comprendida entre aproximadamente 50.000 y aproximadamente 60.000.

También es bien conocido en la técnica que algunos polímeros solubles en agua exhiben una temperatura crítica de disolución (LCST) o "punto de turbidez" más bajo. La LCST de un polímero es la temperatura a la que se produce la separación en fases (es decir, el polímero empieza a separarse del medio acuoso circundante). Normalmente, para los polímeros o hidrogeles transparentes, la LCST coincide también con el punto en que empieza a perderse la transparencia. Resultará muy evidente que para determinadas aplicaciones de ingeniería tisular, puede no ser importante la presencia o ausencia de la separación en fases en el hidrogel final siempre que el hidrogel soporte todavía el crecimiento celular. Para otras aplicaciones, sin embargo, la ausencia de separación en fases en el hidrogel final puede ser decisiva. Por ejemplo, para aplicaciones ópticas, la transparencia (y, por lo tanto, la ausencia de transición de fases) será importante.

Así pues, de acuerdo con un modo de realización de la presente invención, se seleccionan copolímeros con una LCST comprendida entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 60°C para usar en los hidrogeles. En otro modo de realización, se seleccionan copolímeros con una LCST comprendida entre aproximadamente 42°C y aproximadamente 60°C para usar en los hidrogeles. También es conocido en la técnica el hecho de que la LCST de un polímero puede resultar afectada por la presencia de varios solutos, como iones o proteínas y por la naturaleza de los compuestos entrecruzados o unidos al polímero. Dichos efectos se pueden determinar empíricamente mediante técnicas estándar y se considera que la selección de un polímero sintético con una LCST apropiada para una aplicación determinada queda dentro de los conocimientos habituales de los que trabajan en la técnica.

Para que el polímero sintético tenga una resistencia y una estabilidad térmica adecuadas, es importante optimizar la proporción entre derivado(s) de acrilamida y comonómero(s) hidrófilos cuando se utilizan diferentes monómeros para estos compuestos. Según esto, los derivados de acrilamida se encuentran en el polímero sintético en la razón molar más elevada. Por otra parte, el número de comonómeros de ácido carboxílico derivado presente en el polímero final determinará la capacidad del gel sintético para formar entrecruzamientos con el biopolímero en la matriz biosintética. La selección de razones molares adecuadas de cada componente para obtener un polímero sintético final con las propiedades deseadas queda dentro de las habilidades normales de un trabajador en la técnica.

De acuerdo con un modo de realización de la presente invención, cuando se están empleando diferentes monómeros como componentes derivados de acrilamida y y comonómeros hidrófilos, la cantidad de derivado de acrilamida en el polímero está comprendida entre el 50% y el 90%, la cantidad de comonómero hidrófilo está entre el 5% y el 50% y la cantidad de comonómero ácido carboxílico derivado está entre el 0,1% y el 15%, donde la suma de las cantidades de derivado de acrilamida, comonómero hidrófilo y comonómero de ácido carboxílico derivado es del 100%, donde el valor en % representa la razón molar.

De acuerdo con otra realización de la invención, el polímero sintético se prepara utilizando el mismo monómero tanto de derivado de acrilamida como de comonómero hidrófilo y la razón molar de derivado de acrilamida/comonómero hidrófilo está comprendida entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 99,5% y la razón molar del comonómero ácido carboxílico derivado está entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 50%.

De acuerdo con otro modo de realización más, la razón molar combinada del derivado de acrilamida y el comonómero hidrófilo está comprendida entre aproximadamente el 80% y aproximadamente el 99% y la razón molar del comonómero de ácido carboxílico derivado está entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 20%.

Un experto en la materia comprenderá que la selección y la proporción de los componentes del polímero sintético dependerá en grados diversos de la aplicación final de la matriz biosintética. Por ejemplo, para aplicaciones oftálmicas, es importante que la matriz final sea transparente, mientras que para otras aplicaciones de ingeniería tisular, la transparencia de la matriz puede no ser un factor importante.

En un modo de realización de la presente invención, el polímero sintético es un copolímero aleatorio o en bloque que comprende un derivado de acrilamida, un comonómero hidrófilo y un comonómero ácido carboxílico derivado (un "terpolímero"). En otro modo de realización, el polímero sintético es un terpolímero que comprende monómero NiPAAm, monómero ácido acrílico (AAc) y un monómero ácido acrílico derivado. En otro modo de realización más, el polímero sintético es un terpolímero que comprende monómero NiPAAm, monómero acrilamida (AAm) y monómero ácido acrílico derivado. En otro modo de realización, el monómero ácido acrílico derivado es N-acriloxisuccinimida. En otro modo de realización, se prepara un terpolímero con una relación de alimentación que comprende monómero NiPAAm, monómero AAc y N-acriloxisuccinimida en una proporción de aproximadamente 85:10:5 molar %.

En un modo de realización alternativo de la invención, el polímero sintético es un copolímero aleatorio o en bloque que comprende un derivado de acrilamida/comonómero hidrófilo y un comonómero ácido carboxílico. En otro modo de realización, el polímero sintético comprende monómero DMAA y un monómero ácido acrílico derivado. En otro modo de realización más, el monómero ácido acrílico derivado es N-acriloxisuccinimida. En otro modo de realización, se prepara un polímero sintético con una relación de alimentación que comprende monómero DMAA y N-acriloxisuccinimida en una proporción de aproximadamente 95:5 molar %.

1.2 Biopolímero

Los biopolímeros son polímeros presentes en la naturaleza, tales como las proteínas y los carbohidratos. De acuerdo con la presente invención, la matriz biosintética contiene un biopolímero o una versión derivada del mismo, entrecruzado con el polímero sintético mediante las partes colgantes para entrecruzamiento de este último. Así pues, para los fines de la presente invención, el biopolímero contiene uno o más grupos que son capaces de reaccionar con la parte para entrecruzamiento (por ejemplo, una amina primaria o un tiol), o se pueden obtener derivados del mismo que contengan un grupo de esa naturaleza. Son ejemplos de biopolímeros adecuados para su uso en la presente invención, aunque sin limitarse a ellos, los colágenos (incluidos los tipos I, II, III, IV y V), colágenos desnaturalizados (o gelatinas), colágenos recombinantes, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteínas, alginato, quitosano, ácido hialurónico, sulfatos de condroitina y glucosaminoglucanos (o proteoglucanos). Los expertos en la materia observarán que algunos de estos biopolímeros deberán ser transformados en derivados de modo que contengan un grupo reactivo apropiado como se indicó arriba, por ejemplo, los glucosaminoglucanos tienen que ser desacetilados o desulfatados para que posean un grupo amino primario. La obtención de estos derivados se puede conseguir mediante técnicas normales que se consideran dentro de los conocimientos habituales de los trabajadores en la técnica.

Los biopolímeros adecuados para usar en la invención se pueden adquirir de varias fuentes comerciales o se pueden preparar a partir de productos naturales mediante técnicas normales.

1.3 Agentes bioactivos

Tal como se indicó anteriormente, el polímero sintético a incluir en la matriz biosintética de la presente invención contiene varias partes colgantes para el entrecruzamiento. Resultará evidente que se puede conseguir un entrecruzamiento suficiente de la parte biosintética y los biopolímeros para obtener una matriz suficientemente resistente sin la reacción de todos los grupos libres para entrecruzamiento. Por lo tanto, los grupos sobrantes se pueden usar opcionalmente para realizar la unión covalente de los agentes bioactivos deseados a la matriz. Ejemplos no limitantes de agentes bioactivos que se pueden incorporar a la matriz por entrecruzamiento, incluyen, por ejemplo, factores de crecimiento, retinoides, enzimas, factores de adhesión celular, glucoproteínas de la matriz extracelular (tal como laminina, fibronectina, tenascina y otros por el estilo), hormonas, factores osteogénicos, citoquinas, anticuerpos, antígenos y otras proteínas biológicamente activas, algunos compuestos farmacéuticos, así como péptidos, fragmentos o motivos obtenidos de proteínas biológicamente activas.

En un modo de realización de la presente invención, los grupos de entrecruzamiento son grupos succinimidilo y los agentes bioactivos apropiados para injertarse en el polímero son aquellos que contienen grupos amino primario o tiol, o bien que se pueden obtener derivados de ellos fácilmente para que contengan esos grupos.

2. Método de preparación de la matriz biosintética 2.1 Preparación del polímero sintético

La copolimerización de los componentes del polímero sintético se puede conseguir mediante métodos normales conocidos en la técnica [por ejemplo, véase A. Ravve "Principles of Polymer Chemistry", Chapter 3. Plenum Press, New York 1995]. Normalmente se dispersan las cantidades convenientes de cada uno de los monómeros en un solvente adecuado en presencia de un iniciador. La mezcla se mantiene a una temperatura apropiada y se deja proseguir la reacción de copolimerización durante un período de tiempo predeterminado. El polímero resultante se puede purificar luego de la mezcla por métodos convencionales, por ejemplo, por precipitación.

El solvente para la reacción de copolimerización puede ser un solvente no acuoso si uno o más monómeros son sensibles a la hidrólisis o puede ser un solvente acuoso. Los solventes acuosos apropiados incluyen, sin limitarse a ellos, agua, tampones y soluciones salinas. Son solventes no acuosos apropiados normalmente éteres cíclicos (como el dioxano), hidrocarburos clorados (por ejemplo, cloroformo) o hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, benceno). El solvente se puede purgar con nitrógeno antes de usarlo si se desea. En un modo de realización de la presente invención, el solvente es un solvente no acuoso. En otro modo de realización, el solvente es dioxano.

Los iniciadores de la polimerización adecuados son conocidos en la técnica y generalmente son iniciadores de radicales libres. Ejemplos de iniciadores adecuados incluyen, sin limitarse a ellos, 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN), otros azocompuestos, tal como 2,2'-azobis-2-etilpropionitrilo; 2,2'-azobis-2-ciclopropilpropionitrilo; 2,2'-azobisciclohexanonitrilo; 2,2'-azobisciclooctanonitrilo, y compuestos de peróxido, tales como peróxido de dibenzoílo y sus análogos sustituidos, y persulfatos, tales como los de sodio, potasio y otros por el estilo.

Una vez que el polímero ha sido preparado, y purificado si fuera necesario, se puede caracterizar mediante varias técnicas normales. Por ejemplo, la composición de la razón molar del polímero se puede determinar por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (protón y/o carbono-13) y la estructura de los enlaces se puede determinar por espectroscopia infrarroja. La masa molecular se puede determinar por cromatografía de permeación en gel y/o cromatografía líquida de alta presión. También se puede hacer, si se desea, la caracterización térmica del polímero, por ejemplo, determinando las temperaturas del punto de fusión y de transición vítrea mediante análisis calorimétrico diferencial de barrido. Las propiedades de la solución acuosa, como la formación de micelas y de gel, y la LCST se pueden determinar por observación visual, por espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia UV-visible y con instrumentos de dispersión de luz láser.

En un modo de realización de la presente invención, el polímero sintético se prepara dispersando los monómeros en dioxano purgado con nitrógeno en presencia del iniciador AIBN y dejando proseguir la polimerización a una temperatura de aproximadamente 60°C a 70°C. El polímero resultante se purifica mediante precipitaciones repetidas.

2.2 Preparación del hidrogel

El entrecruzamiento del polímero sintético y el biopolímero se puede conseguir fácilmente mezclando las cantidades convenientes de cada polímero a temperatura ambiente en un solvente apropiado. Normalmente el solvente es un solvente acuoso, tal como solución salina, solución tampón, medio de cultivo de células o una versión diluida o modificada de los mismos. Los expertos en la materia apreciarán que para preservar la estructura de triple hélice de polímeros como el colágeno y para evitar la fibrilogénesis y/o la opacificación del hidrogel, la reacción de entrecruzamiento debe realizarse en medios acuosos con un riguroso control del pH y la temperatura. Los importantes niveles de aminoácidos de los medios nutrientes que se usan normalmente para el cultivo de células pueden provocar reacciones secundarias con las partes que se entrecruzan del polímero sintético, lo que puede dar lugar a la desviación de estos grupos desde la reacción de entrecruzamiento. La utilización de un medio que no contenga aminoácidos ni otros materiales proteicos puede ayudar a evitar estas reacciones secundarias y, por lo tanto, a aumentar el número de entrecruzamientos que se formen entre los polímeros sintéticos y los biopolímeros. Realizando la reacción de entrecruzamiento en solución acuosa a temperatura ambiente o fisiológica se hace que tengan lugar tanto el entrecruzamiento como una hidrólisis mucho más lenta de los posibles grupos residuales de entrecruzamiento.

Otra posibilidad es incluir un paso de finalización para hacer reaccionar los posibles grupos residuales de entrecruzamiento en la matriz. Por ejemplo, uno o más pasos de lavado en un tampón adecuado que contenga glicina, acabará con los grupos de entrecruzamiento residuales al tiempo que eliminará los productos secundarios que se hubieran generado durante la reacción de entrecruzamiento. Los grupos de entrecruzamiento que no hayan reaccionado también se pueden solucionar con una amina polifuncional tal como lisina o trietilentetraamina dando lugar a la formación de entrecruzamientos adicionales cortos entre cadenas. También se pueden realizar, si se desea, pasos de lavado que utilicen tampón solo para eliminar los posibles productos secundarios de la reacción de entrecruzamiento. Si es necesario, después del paso de entrecruzamiento, se puede elevar la temperatura de la suspensión del polímero entrecruzado para dejar que el hidrogel se forme totalmente.

De acuerdo con la presente invención, los componentes del hidrogel se entrecruzan químicamente de modo que prácticamente no sean extraíbles, es decir, el biopolímero y el polímero sintético no rezuman mucho del gel en condiciones fisiológicas. De acuerdo con un modo de realización de la presente invención, la cantidad de biopolímero o de polímero sintético que se puede extraer de la matriz en medios acuosos en condiciones fisiológicas a lo largo de un período de 24 horas es inferior al 5% en peso de cada componente. En otro modo de realización, la cantidad de biopolímero o de polímero sintético que se puede extraer de la matriz en medios acuosos en condiciones fisiológicas a lo largo de un período de 24 horas es inferior al 2% en peso de cada componente. En otros modos más de realización la cantidad que se puede extraer a lo largo de un período de 24 horas es inferior al 1% en peso, inferior al 0,5% en peso e inferior al 0,2% en peso.

La cantidad de biopolímero y/o polímero sintético que se puede extraer de la matriz en medios acuosos se puede determinar in vitro mediante técnicas normales (por ejemplo, el método Basket de la USP). Normalmente, se coloca la matriz en una solución acuosa de un pH predeterminado, por ejemplo, un pH de aproximadamente 7,4 para simular las condiciones fisiológicas. La suspensión se puede agitar o no. Se retiran muestras de la solución acuosa a intervalos de tiempo predeterminados y se analizan para comprobar el contenido de polímero mediante técnicas analíticas estándar.

Los expertos en la materia comprenderán que la cantidad de cada polímero a incluir en el hidrogel dependerá de la elección de los polímeros y de la aplicación prevista para el hidrogel. En general, utilizando cantidades iniciales mayores de cada polímero se obtendrá la formación de un gel más resistente debido al menor contenido de agua y a la presencia de una mayor cantidad de polímero entrecruzado. Mayores cantidades de agua o de solvente acuoso producirán un hidrogel débil. De acuerdo con la presente invención, el hidrogel final contiene entre aproximadamente un 20 y un 99,6% en peso de agua o de solvente acuoso, entre aproximadamente 0,1 y 30% en peso de polímero sintético y entre aproximadamente 0,3 y 50% en peso de biopolímero.

En un modo de realización de la presente invención, el hidrogel final contiene entre aproximadamente un 40 y un 99,6% en peso de agua o de solvente acuoso, entre aproximadamente 0,1 y 30% en peso de polímero sintético y entre aproximadamente 0,3 y 30% en peso de biopolímero. En otro modo de realización el hidrogel final contiene entre aproximadamente un 60 y un 99,6% en peso de agua o de solvente acuoso, entre aproximadamente 0,1 y 10% en peso de polímero sintético y entre aproximadamente 0,3 y 30% en peso de biopolímero. En otro modo más de realización, el hidrogel final contiene entre aproximadamente un 80 y un 98,5% en peso de agua o de solvente acuoso, entre aproximadamente 0,5 y 5% en peso de polímero sintético y entre aproximadamente 1 y 15% en peso de biopolímero. En otros modos de realización, el hidrogel final contiene aproximadamente 95 a 97% en peso de agua o de solvente acuoso y entre aproximadamente 1-2% en peso de polímero sintético y aproximadamente 2-3% e peso de biopolímero; y aproximadamente 94 a 98% en peso de agua o de solvente acuoso y entre aproximadamente 1-3% en peso de polímero sintético y aproximadamente 1-3% en peso de biopolímero.

Asimismo, las cantidades relativas de cada polímero a incluir en el hidrogel dependerán del tipo de polímero sintético y de biopolímero que se utilice y de la aplicación prevista para el hidrogel. Los expertos en la materia apreciarán que las cantidades relativas de biopolímero y de polímero sintético influirán en las, propiedades finales del gel de varios modos, por ejemplo, cantidades elevadas de biopolímero producirán un hidrogel muy rígido. Los expertos en la materia apreciarán que las cantidades relativas de cada polímero en la matriz final se pueden describir en términos de relación peso:peso de biopolímero:polímero sintético o en términos de equivalentes de grupos reactivos. De acuerdo con la presente invención, la razón peso:peso de biopolímero:polímero sintético está comprendida entre aproximadamente 1:0,07 y aproximadamente 1:14. En un modo de realización, la relación p/p de biopolímero:polímero sintético está entre 1:1,3 y 1:7. En otro modo de realización, la relación p/p de biopolímero:polímero sintético está entre 1:1 y 1:3. En otro modo más de realización, la relación p/p de biopolímero:polímero sintético está entre 1:0,7 y 1:2.

En un modo de realización alternativo de la presente invención, la matriz se compone de un biopolímero proteico y un polímero sintético que contiene grupos colgantes N-acriloxisuccinimida. En este modo de realización de la invención, la relación de biopolímero:polímero sintético se describe en términos de equivalentes molares de grupos amina libres en el biopolímero con respecto a los grupos N-acriloxisuccinimida y está entre 1:0,5 y 1:20. En otro modo de realización, esta relación está entre 1:1,8 y 1:10. En otros modos de realización, la relación está entre 1:1 y 1:5, y entre 1:1 y 1:3.

2.3 Incorporación de agentes bioactivos en la matriz biosintética

Se pueden incorporar agentes bioactivos a la matriz si se desea, bien por uniones covalentes (o "injerto") con el polímero sintético por medio de las partes colgantes de entrecruzamiento, o bien por encapsulación dentro de la matriz. Arriba se han citado ejemplos de agentes bioactivos que se pueden unir por enlaces covalentes al componente de polímero sintético de la matriz. Si es necesario, se pueden obtener primero derivados del agente bioactivo por procedimientos estándar para dotarlo de los grupos reactivos apropiados para la reacción con los grupos de entrecruzamiento. Para la unión covalente de un agente bioactivo, se hace reaccionar primero el polímero sintético con el agente bioactivo y luego se entrecruza posteriormente este polímero sintético modificado con el biopolímero como se describió anteriormente. La reacción del agente bioactivo con el polímero sintético se puede realizar en condiciones normales, por ejemplo, mezclando el agente bioactivo y el polímero sintético en un solvente no acuoso, tal como N,N-dimetilformamida, dioxano, dimetilsulfóxido y N,N-dimetilacrilamida. El uso de un solvente no acuoso evita la hidrólisis de los grupos reactivos durante la incorporación del agente bioactivo. Si no, se puede realizar la reacción en un solvente acuoso como se describió anteriormente para la reacción de entrecruzamiento.

Los agentes bioactivos que no sean aptos para injertarse en el polímero, por ejemplo, los que no contengan grupos amino primarios o tioles libres para la reacción con los grupos de entrecruzamiento del polímero sintético, o que no se puedan tratar para obtener derivados que contengan tales grupos, se pueden atrapar en la matriz final. Entre los ejemplos de agentes bioactivos que se pueden atrapar en la matriz se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, productos farmacéuticos, agentes para diagnóstico, vectores virales, ácidos nucleicos y otros por el estilo. Para la introducción en la matriz, se añade el agente bioactivo a una solución del polímero sintético en un solvente apropiado antes de la mezcla del polímero sintético y el biopolímero para formar un hidrogel entrecruzado. Otra posibilidad es añadir el agente bioactivo a una solución que contenga el polímero sintético y también el biopolímero antes del paso del entrecruzamiento. El agente bioactivo se mezcla en la solución de polímeros de modo que quede disperso de forma prácticamente uniforme en la misma y después se forma el hidrogel como se describió anteriormente. Los agentes adecuados para usar con el agente bioactivo dependerán de las propiedades del agente y son fáciles de determinar para los expertos en la materia.

2.4 Introducción de células en la matriz biosintética

La matriz biosintética acorde con la presente invención también puede incluir células atrapadas en su interior y permitir de ese modo la liberación de las células a un tejido u órgano in vivo. Por medio de la matriz biosintética se pueden suministrar diversos tipos de células diferentes, por ejemplo, miocitos, células oculares (por ejemplo, de las distintas capas de la córnea), adipocitos, fibromioblastos, células ectodérmicas, células musculares, osteoblastos (o células del hueso), condrocitos (o células del cartílago), células endoteliales, fibroblastos, células pancreáticas, hepatocitos, células del conducto biliar, células de médula ósea, células neurales, células genitourinarias (incluidas células nefríticas), o combinaciones de las mismas. La matriz se puede utilizar también para suministrar células madre totipotenciales, células progenitoras pluripotenciales o comprometidas o células reprogramadas (desdiferenciadas) a un lugar in vivo de modo que se puedan producir células del mismo tipo que las del tejido. Por ejemplo, se pueden liberar en la matriz células madre mesenquimales que son indiferenciadas. Entre los ejemplos de células madre mesenquimales se incluyen aquellas que se pueden diversificar para producir osteoblastos (para generar tejido óseo nuevo), condrocitos (para generar tejido cartilaginoso nuevo) y fibroblastos (para producir tejido conectivo nuevo). Como alternativa se pueden utilizar células progenitoras comprometidas capaces de proliferar para dar lugar a células del mismo tipo que las que se encuentran presentes en el sitio in vivo, por ejemplo, mioblastos, osteoblastos, fibroblastos y otras por el estilo.

Las células se pueden atrapar fácilmente en la matriz añadiendo las células a una solución del polímero sintético antes de la mezcla con el biopolímero para formar un hidrogel entrecruzado. Si no, se pueden añadir las células a una solución que contenga tanto el polímero sintético como el biopolímero antes del paso de entrecruzamiento. El polímero sintético se puede hacer reaccionar con un agente bioactivo antes de la mezcla con las células si se desea. Normalmente, para la encapsulación de células en la matriz, se dispersan los diversos componentes (células, polímero sintético y biopolímero) en un medio acuoso, tal como un medio de cultivo de células o una versión diluida o modificada del mismo. La suspensión de células se mezcla suavemente con la solución de polímero hasta que las células se encuentren dispersas de modo uniforme en la solución, luego se forma el hidrogel como se describió antes.

2.5 Otros elementos

La presente invención contempla también la inclusión opcional de uno o más materiales de refuerzo en la matriz biosintética para mejorar las propiedades mecánicas de la matriz, tales como la resistencia, elasticidad, flexibilidad y/o resistencia al desgarro. Así pues, la matriz se puede reforzar con fibras flexibles o rígidas, malla de fibra, tejido de fibra y otros por el estilo. En la técnica es conocido el uso de tales materiales de refuerzo, por ejemplo, es conocido el uso de fibras, tejidos o láminas hechos de fibrillas de colágeno, celulosa oxidada o polímeros tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico o politetrafluoroetileno en aplicaciones de implantes médicos.

El material de refuerzo se puede incorporar a la matriz mediante protocolos estándar. Por ejemplo, se puede añadir una solución acuosa de los polímeros, el sintético y el biopolímero, en un tampón apropiado a un tejido o malla de fibras, tal como Interceed (Ethicon Inc., New Brunswick, N.J.). La solución acuosa fluirá al interior de los intersticios del tejido o malla antes de que tenga lugar el entrecruzamiento y así se formará un hidrogel con el tejido o malla incrustado en el mismo. Si se desea, se pueden usar los moldes convenientes para asegurar que las fibras o la malla de fibras queden totalmente contenidas en el interior del hidrogel. La estructura del compuesto se puede lavar luego para eliminar los posibles productos secundarios generados durante la reacción de entrecruzamiento. Normalmente las fibras utilizadas son de naturaleza hidrófila para garantizar que los polímeros se mojen totalmente en la solución acuosa.

Los expertos en la materia comprenderán que, para aplicaciones que necesiten una elevada transparencia óptica, la estructura de refuerzo deberá seleccionarse de modo que se evite la dispersión de luz desde el compuesto final de la matriz, por ejemplo, utilizando nanofibras y/o cuidando de que coincida el índice de refracción del refuerzo y el hidrogel.

3. Comprobación de la matriz biosintética

Según la presente invención, la matriz biosintética comprende un hidrogel con o sin agentes bioactivos y/o células encapsuladas añadidos. Para que sea apropiada para la implantación in vivo para fines de ingeniería tisular, la matriz biosintética debe conservar su forma a temperaturas fisiológicas, ser suficientemente resistente, prácticamente insoluble en agua y soportar el crecimiento de células. También puede ser deseable que la matriz soporte el crecimiento de nervios. Se apreciará con facilidad que para determinadas aplicaciones especializadas, puede ser necesario que la matriz tenga otras características. Por ejemplo, para fines quirúrgicos, puede que la matriz tenga que ser relativamente flexible así como lo suficientemente resistente para soportar la manipulación quirúrgica con hilo y aguja de sutura y en aplicaciones oftálmicas, como reparación o sustitución de la córnea, será importante la transparencia de la matriz.

3.1 Pruebas físico-químicas

Cuando se emplea en aplicaciones de ingeniería tisular, la matriz biosintética tiene que cumplir con los parámetros mecánicos necesarios para evitar su desgarro o ruptura cuando se someta a procedimientos quirúrgicos y proporcionar un soporte suficiente para el crecimiento celular una vez colocada en su sitio. La capacidad de la matriz para resistir al desgarro está relacionada con su resistencia mecánica intrínseca, la forma y espesor de la matriz y la tensión que se aplica.

La capacidad de la matriz biosintética para aguantar fuerzas de cizalla o desgarros se puede determinar de modo preliminar aplicando fuerzas en direcciones opuestas a la muestra con ayuda de dos pinzas. También se puede emplear un aparato adecuado para medir cuantitativamente la capacidad de la matriz para resistir fuerzas de cizalla. Existen en el mercado tensiómetros para este fin, por ejemplo MTS, Instron, y Cole Parmer.

Para realizar las pruebas, se puede formar la matriz en láminas y luego cortarla en tiras del tamaño conveniente. Si no, se puede moldear la matriz con la forma deseada para fines de ingeniería tisular y se puede comprobar toda la matriz moldeada. Para calcular la resistencia a la tensión, se divide la fuerza aplicada en la ruptura o "fallo" de la matriz, por el área del corte transversal de la muestra de prueba, obteniéndose un valor que se puede expresar en fuerza (N) por unidad de superficie. La consistencia (módulo) de la matriz se calcula a partir de la pendiente de la porción lineal de la curva de fuerza/tensión. La tensión es el cambio de longitud en tiempo real durante la prueba dividido por la longitud inicial de la muestra de prueba antes de comenzar la prueba. La tensión en la ruptura es la longitud final de la muestra de prueba cuando se rompe menos la longitud de la muestra de prueba inicial, dividido por su longitud inicial.

Los expertos en la materia apreciarán que debido a la naturaleza blanda de los hidrogeles y a la exudación del componente acuoso cuando se grapan, puede ser difícil obtener datos significativos de tensión de los hidrogeles. La caracterización cuantitativa de la resistencia a la tensión de los hidrogeles se puede obtener, por ejemplo, mediante medidas de tirones de sutura en muestras de matrices moldeadas. Normalmente se coloca una sutura aproximadamente a 2 mm del borde de una muestra de prueba y se mide la fuerza máxima que hay que aplicar para rasgar la sutura de la muestra. Por ejemplo, para una muestra de prueba de una matriz destinada a aplicaciones oftálmicas, que haya sido moldeada con la forma y el espesor de una córnea humana, se pueden insertar en la matriz dos suturas diametralmente opuestas, tal como sería necesario para el primer paso en la implantación ocular. Luego se puede tirar de las dos suturas independientemente a razón de aproximadamente 10 mm/min utilizando un instrumento apropiado, como un Instron Tensile Tester. Se calcula la fuerza aplicada en la ruptura de la matriz, junto con la elongación en la ruptura y el módulo elástico [véase, por ejemplo, Zeng et al., J. Biomech., 34:533-537 (2001)]. Los expertos en la materia apreciarán que, para las matrices biosintéticas destinadas a aplicaciones quirúrgicas, no es necesario que las matrices sean tan fuertes (es decir, tener la misma capacidad para resistir al desgarro) que el tejido de mamíferos. El factor determinante de la resistencia de la matriz en tales aplicaciones es si un cirujano experto y cuidadoso puede o no hacer una sutura en el lugar de colocación de la matriz.

Si se desea, se puede medir la LCST de la matriz de hidrogel biosintética mediante técnicas estándar. Por ejemplo, la LCST se puede calcular calentando muestras de la matriz a razón de aproximadamente 0,2°C por minuto y observando visualmente el punto de turbidez (véase, por ejemplo, H. Uludag, et al., J. Appl. Polym. Sci. 75:583 - 592 (2000)).

La permeabilidad de la matriz biosintética se puede determinar valorando el coeficiente de permeabilidad de la glucosa y/o el tamaño promedio de los poros de la matriz mediante técnicas estándar tal como la evaluación de la permeabilidad a PBS utilizando una cubeta de permeabilidad y/o microscopia de fuerza atómica. De acuerdo con un modo de realización de la presente invención, la matriz biosintética tiene un tamaño de poro promedio comprendido entre aproximadamente 90 nm y aproximadamente 500 nm. En otro modo de realización, la matriz tiene un tamaño de poro promedio entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 300 nm.

También se puede medir la transmisión óptica y la dispersión de luz para matrices destinadas a aplicaciones oftálmicas empleando un instrumento hecho de encargo que mide tanto la transmisión como la dispersión [véase, por ejemplo, Priest y Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39: S352 (1998)].

3.2 Pruebas in vitro

Se comprenderá fácilmente que la matriz biosintética debe ser no citotóxica y biocompatible para que sea adecuada para su uso in vivo. La citotoxicidad de la matriz biosintética se puede evaluar mediante técnicas estándar como la prueba Ames para descubrir actividad mutagénica, la prueba de linfoma de ratón para investigar la capacidad de la matriz para inducir mutaciones genéticas en una línea de células de mamífero, pruebas de aberraciones cromosómicas in vitro empleando, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) para detectar posibles reorganizaciones o daños del ADN inducidos por la matriz. Otras pruebas son la prueba de cromátides hermanas, que determina posibles intercambios entre los brazos de un cromosoma inducidos por la matriz y pruebas de micronúcleo de ratón in vitro para determinar cualquier daño producido a los cromosomas o al huso mitótico. Los protocolos de estas y otras pruebas estándar son conocidas en la técnica, por ejemplo, véase Directrices de la OCDE para pruebas de productos químicos (OECD Guidelines for the Testing of Chemicals) y los protocolos desarrollados por la ISO.

También se puede evaluar in vitro la capacidad de la matriz para soportar el crecimiento celular mediante técnicas estándar. Por ejemplo, células de una línea celular apropiada, tal como células epiteliales humanas, se pueden sembrar, ya sea directamente sobre la matriz o sobre un material apropiado que circunde la matriz. Después del crecimiento en presencia de un medio de cultivo conveniente, durante un período de tiempo apropiado, se puede realizar un examen por microscopia confocal e histológico de la matriz para determinar si han crecido las células sobre la superficie y/o en la matriz.

También se puede evaluar in vitro la capacidad de la matriz para soportar el crecimiento hacia el interior de células nerviosas. Por ejemplo, se puede incrustar una fuente de nervios, tal como ganglios de la raíz dorsal, en un material apropiado que circunde la matriz o insertarse directamente en la matriz. Un ejemplo de material apropiado sería un gel a base de colágeno blando. Se pueden luego sembrar células de una línea celular apropiada, ya sea directamente sobre la matriz o sobre un material apropiado que circunde la matriz y la matriz se puede incubar en presencia de un medio de cultivo adecuado durante un período de tiempo predeterminado. El examen de la matriz, directamente y/o en presencia de un marcador específico de nervios, por ejemplo, por inmunofluorescencia empleando un marcador fluorescente específico de nervios y microscopia confocal, para observar el crecimiento nervioso, indicará la capacidad de la matriz para soportar el crecimiento neural hacia el interior.

Se pueden añadir suplementos de crecimiento al medio de cultivo, a la matriz o a ambos, en experimentos para evaluar la capacidad de la matriz para soportar el crecimiento celular. Los suplementos de crecimiento concretos empleados dependerán del tipo de células a evaluar y serán fáciles de determinar para los expertos en la materia. Entre los suplementos adecuados para las células nerviosas se incluyen, por ejemplo, la laminina, acetato de retinilo, ácido retinoico y factores de crecimiento de nervios para células nerviosas.

3.3 Pruebas in vivo

Para evaluar la biocompatibilidad de la matriz biosintética y su capacidad para soportar el crecimiento celular in vivo, se puede implantar la matriz en un modelo animal apropiado para realizar estudios de inmunogenicidad, inflamación, liberación y degradación, así como para la determinación del crecimiento celular. En la evaluación se pueden incluir animales de control adecuados. Entre los ejemplos de controles adecuados se incluyen, por ejemplo, animales no operados, animales que han recibido aloinjertos de dimensiones similares de un animal donante y/o animales que hayan recibido implantes de dimensiones similares de un material de implante estándar aceptado.

En varias etapas después de la implantación, se pueden realizar biopsias para evaluar el crecimiento celular sobre la superficie y/o en el implante y se puede utilizar examen histológico y técnicas de inmunohistoquímica para determinar si se ha producido crecimiento de nervios hacia el interior y si se encuentran células inflamatorias o inmunitarias en el lugar del implante. Por ejemplo, se pueden utilizar varios colorantes específicos de células conocidos en la técnica para evaluar los tipos de células presentes, así como varios anticuerpos específicos de células, tales como los anticuerpos anti-neurofilamentos que se pueden usar para indicar la presencia o ausencia de células nerviosas. Por otra parte, la medición de los potenciales de acción de los nervios mediante técnicas estándar, proporcionará un indicio de si los nervios son funcionales. Se puede usar el examen por microscopia confocal in vivo para vigilar el crecimiento de células y nervios en el animal en momentos seleccionados después de la operación. Cuando sea conveniente, se puede medir la sensibilidad táctil mediante técnicas conocidas en este campo, por ejemplo, utilizando un estesiómetro. El restablecimiento de la sensibilidad táctil indica la regeneración de nervios funcionales.

4. Aplicaciones

La presente invención proporciona una matriz biosintética que es resistente, biocompatible y no citotóxica y, por consiguiente, apta para ser utilizada como soporte que permita la regeneración tisular in vivo. Por ejemplo, la matriz biosintética se puede utilizar para implantación en un paciente para sustituir tejido que haya sido dañado o extirpado, para recubrimiento de heridas, como tejido sellador o adhesivo, como sustituto de la piel o sustituto de la córnea, o como una capa corneal. La matriz se puede moldear con una forma adecuada antes de la implantación, por ejemplo, se puede preformar para rellenar el espacio dejado por tejido dañado o extirpado. También se puede, cuando se utiliza como implante, dejar que la matriz se forme in situ inyectando los componentes en el tejido dañado y dejando que los polímeros se entrecrucen y gelifiquen a temperatura fisiológica.

En un modo de realización de la presente invención, la matriz es preformada con una forma conveniente para fines de ingeniería tisular. En otro modo de realización la matriz es preformada como una córnea artificial con todo su espesor o como una matriz de espesor parcial apropiada para una capa corneal.

La matriz biosintética se puede utilizar sola y como tal, soportará el crecimiento de células nuevas hacia el interior in situ. Otra posibilidad consiste en que la matriz se puede sembrar con células antes de la implantación y soportará la expansión de estas células in vivo para reparar y/o sustituir el tejido circundante. Se contempla la posibilidad de que las células puedan ser obtenidas del paciente o que puedan ser de origen alogénico o xenogénico. Por ejemplo, se pueden recoger células de un paciente (antes de o durante una operación para reparar el tejido) y procesarse en condiciones estériles para obtener un tipo de células específico, tal como células pluripotenciales, células madre o células precursoras. Estas células se pueden sembrar luego en la matriz, como se describió antes y posteriormente se puede implantar la matriz en el paciente.

La matriz también se puede emplear para recubrir implantes quirúrgicos ayudando a sellar tejidos o como ayuda para que se adhieran los implantes a las superficies tisulares, por ejemplo, mediante la formación de entrecruzamientos entre los grupos de entrecruzamiento que no han reaccionado del componente de polímero sintético del hidrogel y los grupos amino primarios o tiol presentes en el tejido. Por ejemplo, se puede usar una capa de la matriz para recubrir perforaciones en la córnea o aplicarse a catéteres o implantes mamarios para reducir la fibrosis. La matriz también se puede aplicar a injertos o stents vasculares para minimizar el escape de sangre o de fluidos serosos, a parches o entramados artificiales para minimizar la fibrosis y ayudar a la adhesión de los implantes a las superficies tisulares.

La matriz también se puede emplear como un sistema de liberación para suministrar un agente bioactivo a una zona concreta de un paciente. El agente bioactivo se puede liberar en forma de solución junto con el polímero sintético y el biopolímero de modo que la matriz que incluye el agente bioactivo se puede formar in situ o la matriz que incluye el agente bioactivo se puede preformar e implantar. Una vez dentro del organismo, el agente bioactivo se puede liberar desde la matriz, por ejemplo, mediante procesos controlados por difusión o, si el agente bioactivo está unido a la matriz por enlaces covalentes, por escisión enzimática de la matriz y posterior liberación mediante procesos controlados por difusión. Otra posibilidad es que el agente bioactivo puede ejercer sus efectos desde el interior de la matriz.

En un modo de realización de la presente invención, la matriz biosintética se utiliza como una córnea artificial. Para esta aplicación, la matriz es preformada como una córnea artificial con todo su espesor o como una matriz de espesor parcial adecuada para una capa de córnea. De acuerdo con este modo de realización, el hidrogel está diseñado para tener una elevada transmisión óptica y baja dispersión de luz. Por ejemplo, los hidrogeles que contienen un terpolímero sintético p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI) o copolímero p(DMAA-co-ASI) entrecruzado con colágeno tienen una elevada transmisión óptica, dispersión de luz muy baja y son capaces de seguir siendo transparentes hasta a 55°C.

5. Kits

La presente invención también contempla los kits que incluyen la matriz biosintética. Los kits pueden incluir una forma "preparada" de la matriz o pueden incluir los componentes individuales necesarios para elaborar la matriz en las proporciones adecuadas (esto es, el polímero sintético y el biopolímero). EL kit puede incluir además opcionalmente uno o más agentes bioactivos, bien sea previamente unidos al polímero sintético o como componentes individuales que se pueden unir al polímero sintético durante la preparación de la matriz. Los kits pueden incluir además instrucciones para su uso, uno o más solventes apropiados, uno o más instrumentos para facilitar la inyección o colocación del compuesto de matriz final dentro del cuerpo de un animal (como una jeringa, pipeta, pinzas, cuentagotas o un vehículo similar de suministro médicamente aprobado), o una combinación de todos ellos. Los componentes individuales del kit pueden estar empaquetados en envases independientes. El kit puede contener además una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos biológicos, nota que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para aplicaciones humanas o animales.

Para comprender mejor la invención aquí descrita, se muestran los siguientes ejemplos.

Ejemplos Abreviaturas

RTT:

tendón de cola de rata

ddH_{2}O:

agua destilada desionizada

PBS:

solución salina tamponada con fosfato

D-PBS:

solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco

AIBN:

azobisisobutironitrilo

NiPAAm:

N-isopropilacrilamida

pNIPAAm:

poli(N-isopropilacrilamida)

AAc:

ácido acrílico

DMAA

N,N-dimetilacrilamida

ASI:

N-acriloxisuccinimida

pNIPAAm-co-AAc:

copolímero de NiPAAm y AAc

poli(NiPAAm-co-AAc-co-ASI):

terpolímero de NIPAAM, AAc y ASI

poli(DMAA-co-ASI)

copolímero de DMAA y ASI

GPC:

cromatografía de permeación en gel

NMR

resonancia magnética nuclear

YIGSR:

pentapéptido terminado en amida (tirosina-isoleucina-glicina-serina-arginina)

Todas las matrices de gel descritas en los ejemplos que se exponen a continuación utilizaron colágeno I estéril, tal como telocolágeno (tendón de cola de rata, RTT) o atelocolágeno (bovino o porcino), que se puede preparar en el laboratorio o, más cómodamente, adquirirse en el mercado (por ejemplo, de Becton Dickinson a una concentración de 3,0-3,5 mg/ml en ácido acético 0,02 N y en ácido clorhídrico 0,012 N para colágeno bovino y porcino). Dichos colágenos se pueden almacenar durante muchos meses a 4°C. Además, dichas soluciones de colágeno se pueden concentrar cuidadosamente para obtener soluciones muy viscosas ópticamente transparentes de colágeno al 3 - 30% p/vol, adecuado para preparar matrices más resistentes.

Las soluciones de colágeno se ajustan a las condiciones fisiológicas, esto es, la fuerza iónica salina y el pH de 7,2 - 7,4, mediante el uso de hidróxido sódico acuoso en presencia de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se usó PBS, que está exento de aminoácidos y otros nutrientes, para evitar la reducción de la reactividad de entrecruzamiento por reacciones secundarias con moléculas que contengan -NH_{2}, lo que permite el uso de concentraciones mínimas de los grupos de entrecruzamiento y minimiza el riesgo de toxicidad para las células.

El homopolímero pNiPAAm en polvo existe en el mercado (por ejemplo, de Polyscience). Todos los demás polímeros fueron sintetizados como se indica a más adelante.

Ejemplo 1 Preparación de un hidrogel pNiPAAm-colágeno

Se preparó un hidrogel pNiPAAm-colágeno para disponer de un hidrogel alternativo frente al que se pudieran comparar las propiedades de los hidrogeles de la presente invención.

Se esterilizó en autoclave una solución al 1% p/vol de homopolímero pNiPAAm en ddH_{2}O. Esta solución se mezcló con solución de colágeno RTT estéril [3,0-3,5 mg/ml (p/v) en ácido acético (0,02 N en agua] (1:1 vol/vol) en un tubo de ensayo estéril a 4°C bombeando con una jeringa para obtener una mezcla completa sin formación de burbujas. La mezcla en frío evita toda gelificación prematura o la fibrilogénesis del colágeno. El colágeno-pNiPAAm se vertió luego sobre una placa (placa de cultivo no tratada) o un molde (por ejemplo, molde de lente de contacto) de plástico y se dejó secar al aire en condiciones estériles en una vitrina de flujo laminar durante 2-3 días como mínimo, a temperatura ambiente. Después de desecar hasta peso constante (\sim7% de residuo de agua), la matriz formada se retiró del molde. La retirada de la matriz del molde se facilita remojando el molde en PBS estéril a temperatura ambiente. Manteniendo a remojo de forma continuada la muestra libre en esta solución se obtiene un gel a temperatura, pH y fuerza iónica fisiológicos que posteriormente se sometió a pruebas de crecimiento celular y pruebas animales in vivo (véanse los Ejemplos 6 y 7).

Ejemplo 2 Preparación de un terpolímero sintético

Se sintetizó un terpolímero reactivo con colágeno, poli(NiPAAm-co-AAc-co-ASI) (Figura 1) copolimerizando los tres monómeros: N-isopropilacrilamida, (NiPAAm, 0,85 moles), ácido acrílico (AAc, 0,10 moles) y N-acriloxisuccinimida (ASI, 0,05 moles). La relación molar de alimentación fue 85:10:5 (NiPAAm:AAc:ASI), el iniciador de radicales libres AIBN (0,007 mol/mol de monómeros totales) y el solvente, dioxano (100 ml), purgado con nitrógeno antes de añadir AIBN. La reacción tuvo lugar durante 24 h a 65°C.

Después de purificación por precipitaciones repetidas para eliminar trazas de homopolímero, la composición del terpolímero sintetizado (rendimiento del 82%) fue de 84,2:9,8:6,0 (razón molar) por NMR de protones en THF-D_{8}. Los valores de M_{n} y M_{w} del terpolímero fueron 5,6 X 10^{4} Da y 9,0 x 10^{4} Da, respectivamente, por GPC acuosa.

Una solución de 2 mg/ml del terpolímero en D-PBS permaneció transparente incluso hasta 55°C, coherente con una LCST alta. Una solución de 10 mg/ml en D-PBS se puso sólo ligeramente turbia a 43°C. La incapacidad para eliminar el homopolímero formado en la reacción de polimerización del lote (debido a que el coeficiente de reactividad de NiPAAm era mayor que el de AAc o ASI) del terpolímero dio soluciones acuosas e hidrogeles con punto de turbidez a \sim32°C y superiores.

Ejemplo 3 Preparación de un polímero sintético que contiene un agente bioactivo

Se sintetizó un terpolímero que contenía el pentapéptido YIGSR (un motivo de unión a células nerviosas), mezclando el terpolímero preparado en el Ejemplo 2 (1,0 g) con 2,8 \mug de pentapéptido de laminina (YIGSR, de Novabiochem) en N,N-dimetil formamida. Después de reacción durante 48 horas a temperatura ambiente (21°C), el producto polimérico se precipitó a partir de dietil éter y se desecó en vacío. Los grupos ASI que quedaban después de la reacción con el pentapéptido están disponibles para su posterior reacción con colágeno. La estructura de este polímero se muestra en la Figura 8A.

Ejemplo 4 Preparación de un hidrogel de colágeno-terpolímero

Se preparó un hidrogel de terpolímero-colágeno entrecruzado mezclando atelocolágeno bovino al 4% neutralizado (1,2 ml) con el terpolímero preparado en el Ejemplo 2 [0,34 ml (100 mg/ml en D-PBS)] mezclándolo con jeringa a 4°C (colágeno:terpolímero 1,4:1 p/p). Después de bombear cuidadosamente con jeringa para producir una solución homogénea sin burbujas, se inyectaron alícuotas en moldes de lentes de contacto de plástico y se incubó a temperatura ambiente (21°C) durante 24 horas para permitir la reacción de los grupos -NH_{2} del colágeno con los grupos ASI y para hacer más lenta la hidrólisis de grupos ASI residuales a grupos AAc. Las muestras moldeadas se incubaron luego a 37°C durante 24 horas en ambiente con 100% de humedad, para dar lugar a un hidrogel final. El hidrogel contenía 95,4 \pm 0,1% de agua, 2,3% de colágeno y 1,6% de terpolímero. Se moldearon la matrices de forma que tuvieran un espesor final de 150 - 200 \mum o bien de 500 - 600 \mum. Se retiraron las matrices de sus moldes correspondientes con ayuda de solución de PBS y posteriormente se sumergieron en PBS que contenía un 1% de cloroformo y un 0,5% de glicina. Este paso de lavado eliminó la N-hidroxisuccinimida producida en la reacción de entrecruzamiento, acabó con los grupos ASI que no hubieran reaccionado en la matriz, por conversión a grupos ácido acrílico y esterilizó la matriz de hidrogel. Como alternativa, los geles moldeados se pueden tratar con glicina acuosa para asegurar que no queden grupos ASI antes del contacto con las células.

Los residuos de succinimida que quedaban en los geles preparados a partir de colágeno y terpolímero estuvieron por debajo del límite de detección por IR después del lavado.

Ejemplo 5 Preparación de un hidrogel que contiene un agente bioactivo

Se prepararon hidrogeles entrecruzados de colágeno-terpolímero que contenían factor de adhesión celular YIGSR mezclando concienzudamente colágeno bovino viscoso neutralizado al 4% (1,2 ml) con terpolímero al que se había unido covalentemente pentapéptido de laminina (YIGSR) (del Ejemplo 3; 0,34 m1, 100 mg/ml) a 4°C, según el procedimiento descrito en el Ejemplo 4.

El contenido de YIGSR de geles lavados exhaustivamente fue de 4,3 x 10^{-11} moles/ml (2,6 x 10^{-8} g/ml) de gel hidratado, cuantificado marcando los grupos de tirosina (que llevan amina primaria) con ^{125}I, utilizando el método de iodogen y midiendo la radiactividad con un contador gamma normalizado (Beckman, Gamma 5500). La concentración final de polímero total en cada hidrogel hidratado, equilibrado con PBS fue del 3,4% p/v (incluyendo el colágeno y el terpolímero YIGSR al 2,0 y 1,4% p/v respectivamente).

Ejemplo 6 Comparación de la propiedades físicas de las matrices de hidrogel

Los termogeles de colágeno son frágiles y fácilmente se pliegan y se rompen y, obviamente, son opacos (véase la Figura 8C). Se prepararon termogeles de colágeno por neutralización del colágeno y moldeado en los mismos moldes que se describieron antes en los Ejemplos 4 y 5. El colágeno moldeado se incubó luego, primero durante 24 horas a 21°C y luego a 37°C, para formar espontáneamente termogeles translúcidos (producidos por autoasociación de hélices triples de colágeno en microfibrillas).

El coeficiente de permeabilidad de la glucosa en PBS (pH 7,4) a través de hidrogeles preparados como se describe en el Ejemplo 5 se calculó a partir de mediciones en una cubeta de permeación retirando periódicamente alícuotas de permeado, añadiendo adenosintrifosfato y convirtiendo la glucosa en glucosa-6-fosfato con la enzima hexoquinasa. Esta última se hizo reaccionar con nicotinamida-adenina-dinucleótido en presencia de deshidrogenasa y el dinucleótido reducido resultante se cuantificó por su absorción UV a 340 nm en solución (Bondar, R. J. y Mead, D.C. (1974) Clin Chem 20, 586-90). Se examinaron topografías de superficies de hidrogeles, totalmente sumergidos en solución de PBS por microscopia de fuerza atómica (Molecular Image Co., EE.UU.) en el modo de "contacto". Los tamaños de los poros según esta técnica se compararon con los diámetros promedio de los poros calculados a partir de la permeabilidad de PBS de los hidrogeles como se describió anteriormente (Bellamkonda, R., Ranieri, J. P. y Aebischer, P. (1995) J Neurosci Res 41, 501-9). Los hidrogeles tenían índices de refracción (1,343 \pm 0,003) similares a los de la película de lágrima (1,336-1,357) del ojo humano (Patel, S., Marshall, J. y Fitzke, F. W., 3rd (1995) J Refract Surg 11, 100-5). Mostraban una buena transparencia óptica en comparación con matrices que contenían sólo colágeno (Fig. 8B y C). Los hidrogeles tenían diámetros de poro de 140 - 190 nm (tanto por microscopia de fuerza atómica como por permeabilidad de PBS) y un coeficiente de permeabilidad de difusión de glucosa de 2,7x10^{-6} cm^{2}/s, que es más elevado que el valor del estroma natural (\sim0,7x10^{-6} cm^{2}/s, calculado a partir de coeficientes de difusión (2,4x10^{-6} cm^{2}/s) y solubilidad (0,3) publicados (McCarey, B. E. y Schmidt, F. H. (1990) Curr Eye Res 9, 1025-39)).

Las siguientes propiedades de los hidrogeles preparados como se describe en los Ejemplos 4 y 5 indican que están entrecruzados:

\bullet

insolubles en agua,

\bullet

con suficiente resistencia para soportar la manipulación quirúrgica con hilo y aguja de sutura y la unión a un anillo corneal humano,

\bullet

relativamente flexibles cuando se manipulan,

\bullet

demuestran un aumento en la tensión en el fallo y módulo aparente durante las pruebas de tensión en más de 2 veces que va desde la relación de equivalencia de ASI/-NH_{2} de 0,5 a 1,5.

Matrices preparadas como se describió antes, pero con proporciones variables de grupos amina de colágeno con respecto a grupos ASI en el polímero sintético tenían una elevada transmisión óptica y baja dispersión en la región visible (Fig. 8B, 12 y 13). En cambio, el termogel de colágeno, preparado a partir de colágeno como se describió antes, tenía baja transmisión y alta dispersión, coherente con su aspecto opaco (Fig. 8C, 12). Dichas matrices de termogel con un contenido de colágeno de hasta 3 p/vol eran demasiado débiles para permitir el montaje en la prueba del tirón de sutura.

La caracterización cuantitativa de los hidrogeles se hizo utilizando medidas de tirón de sutura en muestras moldeadas con la forma y el espesor de la córnea humana. Esto suponía la inserción de dos suturas diametralmente opuestas, tal como exige el primer paso en la implantación ocular, y tirar de estas dos suturas independientemente a 10 mm/min en un Instron Tensile Tester, un procedimiento bien conocido en la evaluación de componentes de las válvulas cardíacas. Las suturas empleadas fueron suturas de nylon 10-0. Se calcula la fuerza aplicada en la ruptura del gel, junto con la elongación en la ruptura y el módulo elástico. El módulo y la tensión en el fallo de las medidas del tirón de sutura mostraron que se alcanzaba el máximo con proporciones específicas de los grupos amino de colágeno con respecto a los ASI (Figura 11).

Los hidrogeles preparados como se describe en los Ejemplos 4 y 5 tenían alta transmisión óptica y muy baja dispersión de luz, semejante a la córnea humana, según las medidas realizadas con un instrumento hecho de encargo que mide la transmisión y la dispersión [Priest y Munger, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39: S352 - S361 (1998)]. La retrodispersión y la transmisión de luz a través de la región visible para hidrogeles preparados como en el Ejemplo 4 mostraron un excelente comportamiento excepto a elevadas concentraciones de terpolímero (elevadas proporciones de amina de colágeno con respecto a ASI de terpolímero, Fig. 12). Asimismo, un termogel (polímero sintético sin entrecruzamiento) tuvo una transmisión muy baja y una elevada retrodispersión (Fig. 12). Los hidrogeles descritos en el Ejemplo 5 también mostraron un excelente comportamiento en este análisis como se muestra en la Fig. 12 (la proporción 1:1 de colágeno a pentapéptido de terpolímero está representada por los cuadrados rellenos).

En cambio, los geles de colágeno-homopolímero de pNiPAAm (como los descritos en el Ejemplo 1; 1,0:0,7 a 1,0:2,0 p/p) eran opacos a 37°C. Además, tanto el colágeno como el pNiPAAm experimentaban extracción de este hidrogel en PBS (más del 50% en peso perdido en 48 horas).

Ejemplo 7 Pruebas in vivo de varias matrices biosintéticas

Se moldearon hidrogeles preparados como se describe en los Ejemplos 1, 4 y 5 para formar córneas artificiales y se implantaron en los ojos de cerdos (Figura 2).

Como en los implantes de córnea in vivo, los geles del Ejemplo 1 rezuman un residuo blanco después de 5 a 6 días implantados en los ojos de los cerdos.

El hidrogel preparado con 4% de colágeno y pentapéptido-terpolímero como el descrito en el Ejemplo 5 demostró una buena biocompatibilidad, al igual que lo hizo el hidrogel de colágeno-terpolímero preparado como se describe en el Ejemplo 4. Se produjo un crecimiento en superficie completo más rápido de células epiteliales y se formaron múltiples capas cuando se utilizó el primero de estos hidrogeles en comparación con el hidrogel de colágeno-terpolímero que mostró crecimiento de células epiteliales menos contiguas y más lento sin formación de múltiples capas.

Imágenes de microscopia confocal in vivo de un hidrogel de espesor completo preparado a partir de colágeno y el pentapéptido-terpolímero (del Ejemplo 5; concentración final: colágeno 2,3% en peso; terpolímero + pentapéptido 1,6% en peso) e implantado en el ojo de un cerdo, mostraron que las células epiteliales crecían sobre esta matriz y se estratificaban. Se regeneró una membrana basal y había hemidesmosomas, indicadores de un epitelio fijado de forma estable. Las células estromales se difundieron dentro de la matriz en tan sólo tres semanas. Los implantes se volvieron sensibles al tacto en 3 semanas desde la implantación (estesiómetro (Cochet-Bonnet) indicando el crecimiento hacia el interior de nervios funcionales (Figuras 4 y 14). También se observó el crecimiento hacia el interior de los nervios directamente por microscopia confocal e histología. No se observaron signos clínicos de reacciones adversas inflamato-
rias o inmunitarias a lo largo de un período de 8 semanas después de la implantación. Véanse las Figuras 2, 3 y 5-7.

Más detalladamente:

La Figura 5 muestra la evaluación morfológica y bioquímica de una sección de la córnea del cerdo 3 semanas después de la implantación, (A) tinción picrosirius para colágeno y (B) tinción H y E para células. La Figura 7 muestra (A) una sección de la córnea del cerdo 3 semanas después de la implantación, teñida con rojo picrosirius, que demuestra la interfase estroma-implante (puntas de flecha). La superficie del implante ha sido recubierta por un epitelio estratificado; (B) una sección similar 8 semanas después de la implantación. Se trasladaron células estromales al implante y el implante parece haber sido sustituido por tejido a nivel subepitelial (flechas); (C) una ampliación mayor del epitelio (teñido con H y E) que muestra la membrana basal regenerada (flecha); (D) una sección correspondiente teñida con anticuerpo anti-tipo VII de colágeno que reconoce hemidesmosomas unidos a la membrana basal (flecha); (E) los hemidesmosomas (flechas) unidos a las membranas basales subyacentes se visualizan claramente por microscopia electrónica de transmisión (MET); (F) una preparación lisa de la córnea del cerdo que muestra nervios (cabezas de flecha) dentro del implante, teñidos con un anticuerpo anti-neurofilamentos.

La Figura 3 muestra imágenes de microscopia confocal en montaje completo de córneas de cerdo 6 semanas después de la operación en las que se aprecia un epitelio corneal y membrana basal regenerados sobre la superficie del implante. Se muestran los patrones de crecimiento de nervios in vitro dentro del compuesto de colágeno-terpolímero y dentro del estroma subyacente del huésped, así como células estromales que crecen hacia el interior.

La recuperación de la sensibilidad táctil fue rápida (< 14 días después de la operación) en comparación con una recuperación mínima en el aloinjerto trasplantado en el mismo período de tiempo en otros seis animales que recibieron aloinjertos de córneas de cerdos donantes de dimensiones similares (Figura 14).

Ejemplo 8 Colocación de matrices de colágeno-terpolímero en cerebro de roedores

Después de la eutanasia, se escindió el cerebro entero de cada ratón o rata utilizado y se colocó dentro de una estructura estereotáxica. Se inyectaron dos microlitros o bien tres microlitros de hidrogel que contenía colágeno y terpolímero-pentapéptido a concentraciones de 0,33% colágeno, 0,23% terpolímero o bien 0,63% colágeno, 0,44% terpolímero a lo largo de un período de 6 a 10 min, respectivamente, en cada uno de los cerebros de ratón con las siguientes coordenadas: a 0,3 mm de la bregma, 3,0 mm de profundidad y a 2,0 mm de la línea media. En el caso de las ratas se inyectaron cuatro a seis microlitros de hidrogel a lo largo de 10 min en cada cerebro, a 0,7-0,8 mm de la bregma, 6 mm de profundidad y a 4 mm de la línea media. Las muestras de hidrogel se mezclaron con colorante azul de Coomassie para su visualización.

Los resultados indican un suministro satisfactorio preciso y directo de pequeñas cantidades del hidrogel al estrato del cerebro en estas muestras (Figuras 9 y 10). Esto sugiere que es posible utilizar el hidrogel como un sistema de liberación de células o fármacos en localizaciones específicas en volúmenes muy pequeños.

Ejemplo 9 Pruebas in vivo de un hidrogel que incluye un agente bioactivo

Hidrogeles estériles preparados como se describe en el Ejemplo 5, se enjuagaron profusamente en PBS antes de la implantación. Siguiendo las directrices de la Association for Research in Vision and Ophthalmology para uso animal, se implantó cada una de las matrices corneales obtenidas por ingeniería de tejidos (IT) (5,5 mm de diámetro y 200 \pm 50 \mum de espesor) en la córnea derecha de un mini-cerdo de Yucatán (Yucatan micropig) (Charles River Wiga, Sulzbach, Alemania) (véase la Fig. 15A-C). Las córneas del otro lado no operadas sirvieron como controles. Bajo anestesia general, se hizo una incisión circular de 5,0 mm de diámetro y espesor parcial empleando una trefina Barraquer (Geuder, Heidelberg, Alemania). Se retiró el tejido corneal del huésped y se sustituyó por un implante con un diámetro 0,50 mm mayor para permitir una aposición de la herida suficiente entre el injerto y el tejido del huésped. Después de la operación se suturó una membrana amniótica sobre toda la superficie corneal durante una semana para mantener los implantes en su sitio. En las muestras con sutura, los implantes fueron suturados en el tejido del huésped empleando 8 suturas interrumpidas de nylon 10-0. La medicación postoperatoria consistió en dexametasona (qid) y gentamicina (qid) durante 21 días. N = 3 cerdos con suturas y 3 sin suturas.

Se realizó un seguimiento diario en cada cerdo hasta 7 días después de la operación y luego semanalmente. Los reconocimientos incluían examen con lámpara de rendija para asegurarse de que las córneas eran ópticamente transparentes, tinción con fluoresceína sódica para evaluar la integridad epitelial y la función de la barrera (Josephson, J, E. y Caffery, B.E. (1988) Invest Ophthalmol Vis Sci 29, 1096-9), medida de la presión intraocular para asegurar que las córneas no estaban bloqueando el flujo del humor acuoso y examen de microscopia confocal in vivo (ConfoScan3, Nidek, Erlangen, Alemania) para evaluar el crecimiento hacia el interior de células y nervios. La sensibilidad táctil de la córnea se midió con ayuda de un estesiómetro Cochet-Bonnet (Handaya Co., Tokyo, Japón) en cinco puntos dentro del área del implante de cada córnea (cuatro periféricos, uno central) como se describió anteriormente (Millodot, M. (1984) Ophthalmic Physiol Opt 4, 305-18). Los animales que recibieron aloinjertos de córneas de cerdo donante también se evaluaron de igual modo.

Para el examen de inmunohistoquímica e histopatológico, los tejidos y constructos se fijaron en PFA al 4% en PBS 0,1 M. Para la inmunolocalización de nervios, se permeabilizaron preparaciones lisas con un combinado de detergentes (Brugge, J. S. y Erikson, R. L. (1977) Nature 269, 346-8) (NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM, Tris 50 mM, Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,5%, dodecilsulfato sódico al 0,1%), se bloquearon para tinción no específica con suero bovino fetal al 4% en PBS y se incubaron en anticuerpo anti-neurofilamentos 200 (Sigma, Oakville, Canadá). Luego se incubaron con FITC o anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 (Sigma; Amersham, Baie D'Urfé, Canadá, respectivamente) y se visualizaron con microscopia confocal.

Se procesaron muestras para histología y nuevas pruebas de inmunohistoquímica, se incrustaron en parafina y se cortaron. Los cortes se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) para examen histopatológico (Jumblatt, M. M. y Neufeld, A. H. (1983) Invest Ophthalmol Vis Sci 24, 1139-43). Se realizó la prueba de inmunofluorescencia como se describió anteriormente en cortes desparafinados para expresión del colágeno tipo VII (Sigma, Munich, Alemania), un marcador de hemidesmosomas (Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S. J. y Tisdale, A. S. (1988) Dev Biol 126, 253-62). La tinción inmunohistoquímica con visualización con peroxidasa-diaminobencidina (DAB) se realizó de la manera siguiente: con anticuerpo AE1/AE3 (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) para marcadores epiteliales, anticuerpo antivimentina (Roche, Laval, Canadá) para fibroblastos estromales, anticuerpo anti-músculo liso actina, 1A4 (Cell Marque, Austin, TX) para fibroblastos estromales activados (miofibroblastos) y anticuerpo SP1-D8 (DHSB, Iowa, EE.UU.) para síntesis de procolágeno 1 (para localizar sitios de síntesis de colágeno de novo). Se realizó tinción de CD15 y CD45 para células inmunitarias (Becton-Dickinson, Oakville, Canadá) empleando el kit de peroxidasa ARK (DAKO, Mississauga, Canadá) para pre-conjugar los anticuerpos primarios con sus correspondientes anticuerpos secundarios y peroxidasa para visualización. Para los anticuerpos anti-vimentina, anti-músculo liso actina y SP8-D1, se realizó la recuperación con antígeno por tratamiento previo con proteinasa-K (2 mg/ml) durante 30 min a 37ºC antes de la incubación en el anticuerpo primario. Se empleó tinción Ulex europaeus aggultinin (UEA) lectina para visualizar el depósito de mucina de la película de lágrima (Shatos, M. A., Rios, J. D., Tepavcevic, V., Kano, H., Hodges, R. y Dartt, D. A. (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1455-64). Se incubaron muestras con UEA biotinilado (Sigma), luego se hicieron reaccionar con avidina-peroxidasa de rábano y se visualizó con DAB. Para la microscopia electrónica de transmisión (MET), todas las muestras fueron tratadas con fijador, tinción e incrustación en resina convencionales (Karnovsky's, OsO_{4}, acetato de uranilo, epoxi).

No se observaron reacciones adversas inflamatorias ni inmunitarias en el examen clínico después de la implantación de matrices biosintéticas ni de córneas de cerdo. El crecimiento hacia el interior de células epiteliales sobre el implante se completó en 4 días después de la operación. Después de una semana, el epitelio regenerado mostró exclusión del colorante fluoresceína sódica, lo que indicaba que el epitelio estaba intacto y que se habían restablecido las propiedades de barrera. Las presiones intraoculares estaban entre 10 y 14 mm de mercurio (Hg) antes de la operación y en 10-16 mm Hg después de la operación a lo largo del período de estudio de hasta 6 semanas, demostrando que los implantes no bloqueaban el flujo del humor acuoso dentro del ojo. Los implantes se mantuvieron ópticamente transparentes (biomicroscopia de lámpara de rendija) y se observó reestratificación epitelial en todos los animales 3 semanas después de la operación. La microscopia confocal clínica in vivo de las matrices estromales implantadas mostró a las 3 semanas de la operación un epitelio regenerado (Fig. 15D), nervios con crecimiento hacia el interior reciente (Fig. 15G), y células estromales (Fig. 15J) y endoteliales (Fig. 15M) con una morfología celular que imitaba la de los controles no operados (Fig. 15F, I, L, O). La morfología de células epiteliales y endoteliales en los aloinjertos (Fig. 15E, N) era similar a la de los controles. No se observaron nervios subepiteliales ni estromales en los aloinjertos 3 semanas después de la operación (Fig. 15H, K).

Más detalladamente, la Figura 15 muestra:

(A-C)

procedimiento de queratoplastia lamelar (QPL) en un mini-cerdo Yucatán. (A): Se utiliza una trefina para hacer una incisión circular de profundidad predeterminada (250 \mum) en la córnea. Las capas corneales existentes se retiran y (B) se sustituyen por un implante de matriz biosintética (flecha, 250 \mum de espesor), que se sutura en el mismo sitio (C). Las suturas están indicadas por puntas de flecha.

(D-O)

Microscopia confocal in vivo de la matriz biosintética implantada. (D): imagen confocal mostrando epitelio corneal regenerado sobre la superficie del implante. El correspondiente control de aloinjerto (E) contiene epitelio del donante, mientras que el control sin operar (F) tiene un epitelio intacto. (G): Existen nervios regenerados (puntas de flecha) en la interfase entre el implante y el epitelio regenerado superpuesto. Estos corresponden a los nervios subepiteliales del control no operado (I). Sin embargo, en el aloinjerto (H), no existen nervios subepiteliales. (J-L): Células estromales y haz nervioso ramificado (punta de flecha) más profundo dentro del estroma subyacente de las córneas con implante (J), aloinjerto (K) y una región correspondiente en el control (L). (M-O): El endotelio de las córneas con implante (M), aloinjerto (N) controles no operados (O) está intacto y muestra una morfología similar.

Cortes histológicos de las córneas con implantes mostraron una interfase de implante-tejido del huésped inconfundible pero uniforme (Fig. 16A) que se parecía a la de las córneas de control que recibieron aloinjertos (Fig. 16B). En ambas córneas, con implantes o con aloinjertos, el epitelio regenerado estaba estratificado. Un examen detallado demostró un epitelio totalmente diferenciado que se teñía positivamente con marcadores de anticuerpo AE1/AE3 (Fig. 16D, E), recubriendo una membrana basal regenerada que era positiva para colágeno tipo VII, un marcador de hemidesmosomas en la interfase membrana basal-epitelio (Fig. 16G, H). Las observaciones con MET indicaron una morfología coherente con la presencia de hemidesmosomas (Fig. 16J, K). En los implantes, los nervios que crecían hacia el interior, positivos para neurofilamentos, habían empezado a restablecer una red subepitelial y mostraban extensión hasta la células epiteliales (Fig. 16M). Sin embargo, no se localizaron nervios subepiteliales en las córneas aloinjertadas (Fig. 16N). La película de lágrima se restableció en las córneas con implantes (Fig. 16P) lo mismo que en aloinjerto (Fig. 16Q).

Más detalladamente, la Figura 16 muestra la regeneración de la córnea tras la operación.

(A-F)

Se muestran cortes teñidos con H y E. Se encuentran células estromales en el implante (A) y en el control de aloinjerto (B), y ambos parecen estar integrados sin suturas en el huésped. (Los símbolos significan lo siguiente: e, epitelio; i, implante; g, aloinjerto; s, estroma). (C): Control no operado. El epitelio regenerado del implante (O) y el epitelio de donante del control de aloinjerto (E) expresaron marcadores de diferenciación de citoqueratina, de modo similar al control no operado (F).

(G-I):

Inmunolocalización de colágeno tipo VII, un marcador de hemidesmosomas, en la interfase epitelio-implante (flechas) de implante (G), aloinjerto (H) y control (I).

(J-L):

MET de la interfase epitelio-implante. Se han formado placas de hemidesmosomas (puntas de flecha) y fibrillas de anclaje (flechas) dentro de la matriz biosintética entre las células epiteliales y el implante subyacente (J), emulando las estructuras que se encuentran normalmente en la interfase de epitelio-estroma como la que se muestra en el aloinjerto (K) y el control (L).

Montaje liso de córnea en el que se muestran fibras nerviosas (flechas) dentro del implante (M), y control no operado (O) pero ausentes en el aloinjerto (N), teñido con un anticuerpo anti-neurofilamentos. El UEA uniéndose (puntas de flecha) a la superficie epitelial del implante (P), y el aloinjerto (Q) indica el restablecimiento de la película de lágrima en todos los casos. Control no operado (R).

Los resultados de inmunohistoquímica indicaban que las células, tanto del interior del implante como del aloinjerto estaban sintetizando procolágeno I. Sin embargo, se produjo más síntesis de procolágeno en los aloinjertos como indicaba la tinción más intensa de los aloinjertos en comparación con los implantes (Fig. 17G,H). Tanto los aloinjertos como los implantes tenían células estromales que eran positivas para vimentina (Fig. 17A,B), indicativo de un fenotipo fibroblástico. También los dos mostraban tinción de actina músculo liso y por lo tanto la presencia de fibroblastos estromales activados, si bien los implantes mostraban menos células positivas que los aloinjertos (Fig. 17D,E).

Más detalladamente, la Figura 17 muestra: integración implante-huésped 6 semanas después de la operación.

(A-C):

Tinción para procolágeno tipo I. Se observa tinción positiva en la matriz tanto de la matriz biosintética implantada (A) como en el control de aloinjerto (B) indicando sitios de depósito nuevo de colágeno. El control no operado (C) no tiene síntesis de colágeno nuevo.

(D-F):

La tinción con vimentina en todo el estroma identifica fibroblastos estromales. La tinción por toda la matriz biosintética implantada (D) demuestra la invasión celular. También se pueden ver células dentro del aloinjerto implantado (E) y por todo el control no operado (F).

(G-I):

La tinción de actina músculo liso indica miofibroblastos activados y el potencial para la cicatrización. En el implante de matriz biosintética (G), la tinción se encuentra presente a veces en la matriz biosintética, pero no se encuentra en el estroma del huésped, ni en la zona de transición entre huésped e implante. Se identifica tinción positiva en la córnea de aloinjerto implantada (H) tanto en el aloinjerto como en la zona de transición, pero no en el estroma intacto del huésped. (I): Control no operado.

La sensibilidad táctil de la córnea medida en 5 puntos del implante de córnea en 3 cerdos antes y después de la operación con un estesiómetro Cochet-Bannet, mostró una drástica disminución de la sensibilidad táctil después de la operación. Sin embargo, se produjo la recuperación entre los 7 y 14 días y, 21 días después de la operación, la sensibilidad había vuelto a los niveles preoperatorios (Fig. 18; Todos los grupos, n = 3. *P < 0,01 por ANOVA de medidas repetidas con comparaciones Tukey de 2 dimensiones). La sensibilidad táctil volvió al mismo porcentaje y al mismo nivel de meseta en todos los puntos periféricos y centrales examinados en el implante. En los animales de control que habían recibido aloinjertos de córnea de donante, sin embargo, las córneas se mantuvieron anestésicas durante el período de seis semanas (Fig. 18).

Los implantes recuperados después de 6 semanas in vivo se examinaron por espectroscopia infrarroja (Midac M, espectrómetro FTIR, condensador de haz de ZnSe y cubeta de diamante) lo que indicó con claridad la presencia del terpolímero.

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Ejemplo 10 Preparación de un copolímero sintético

Se sintetizó un copolímero poli(DMAA-co-ASI) por copolimerización de los monómeros: N,N-dimetil acrilamida, (DMAA) y N-acriloxisuccinimida (ASI). La relación molar de alimentación fue 95:5 (DMAA:ASI). El iniciador de radicales libres AIBN y el solvente, dioxano, se purgaron con nitrógeno antes de su uso y la reacción de polimerización se realizó a 70°C durante 24 h.

Después de purificación por precipitaciones repetidas para eliminar trazas de homopolímero, la composición del copolímero sintetizado (rendimiento del 70%) fue 94,8:5,2 (razón molar) por NMR de protones. La masa molecular (M_{n}) se determinó en 4,3 x 10^{4}, por GPC acuosa. La polidispersidad (PD; M_{w}/M_{n}) =1,70 también se determinó por GPC.

Ejemplo 11 Preparación de un hidrogel de colágeno-copolímero

Se preparó un hidrogel entrecruzado de colágeno-copolímero mezclando colágeno bovino neutralizado al 5% (1,0 ml) con el copolímero sintético preparado en el Ejemplo 9 [0,2 ml (200 mg/ml en D-PBS)] mezclando con jeringa. Después de un cuidadoso bombeado con jeringa para producir una solución homogénea sin burbujas, se inyectaron alícuotas en moldes de lentes de contacto de plástico y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas para permitir la reacción de los grupos -NH_{2} del colágeno con los grupos ASI del copolímero así como para reducir la hidrólisis de grupos ASI residuales a grupos AAc.

Las muestras moldeadas se incubaron luego a 37°C durante 24 horas en un ambiente con el 100% de humedad para obtener el hidrogel final. Cuando se produjo la gelificación, el hidrogel contenía 94,8% de agua, 2,9% de colágeno y 2,3% de copolímero sintético. Se moldearon las matrices de modo que tuvieran un espesor de 150 - 200 \mum o bien 500-600 \mum. Cada una de las matrices de hidrogel resultantes se retiró de su molde con ayuda de solución PBS y a continuación se sumergió en PBS que contenía 1% de cloroformo y 0,5% de glicina. Este paso de lavado eliminó la N-hidroxisuccinimida producida en la reacción de entrecruzamiento y acabó con los posibles grupos ASI residuales en la matriz por conversión a grupos ácido acrílico.

Los residuos de succinimida que quedaron en los geles preparados a partir de colágeno y copolímero estaban por debajo del límite de detección por IR después del lavado.

Ejemplo 12 Propiedades físicas del hidrogel de colágeno-copolímero

En la Fig. 13A y B se muestra la retrodispersión de luz y la transmisión de luz en la región visible y con luz blanca para hidrogeles preparados como en el Ejemplo 10 en función de las proporciones de amina de colágeno a ASI de copolímero.

El copolímero del Ejemplo 10 y sus hidrogeles no tenían punto de turbidez (LCST) detectable a temperaturas de hasta 60°C.

Ejemplo 13 Propiedades biológicas de varios hidrogeles 13.1 Biocompatibilidad

Tres discos de 12 mm de diámetro y 650 \mum de espesor, de hidrogel, uno de ellos de colágeno-poli(DMAA-co-ASI), otro de colágeno-poli(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapéptido y otro de 3% de colágeno se empaparon durante 30 minutos en PBS. Se pusieron en una lámina de membrana comercial de 12 mm para placas de cultivo y se adhirieron a la membrana con una fina capa de gelatina. Después de desecar durante 10 minutos, se añadieron 1 x 10^{4} células epiteliales de córnea humana (CECH) suspendidas en un medio exento de suero con factor de crecimiento epidérmico (Keratinocyte Serum-Free Medium [medio de queratinocitos sin suero] (KSFM; Life Technologies, Burlington, Canadá)) a la parte superior de los geles y se añadió KSFM sin células al pocillo subyacente. Los cultivos se incubaron a 37°C con atmósfera de CO_{2} al 5%.

En el término de 12 horas las células se habían adherido a la superficie de la matriz en todas las muestras. Se cambió el medio cada dos días añadiéndose KSFM a las láminas y a los pocillos exteriores. Se hizo crecer a las CECH hasta llegar a la confluencia y alcanzaron la confluencia el mismo día (5 días). El medio de las láminas y los pocillos circundantes se sustituyó por un medio que contenía suero (medio SHEM modificado (Jumblatt, M. M. y Neufeld, A. H. (1983) Invest Ophthalmol Vis Sci 24, 1139-43)). Después de otros 2 días, se retiró el medio de las láminas y el volumen de SHEM en los pocillos subyacentes se redujo a 0,5 ml. Se dejó estratificar el epitelio otros 7 días y se visualizó la capa de células.

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Después de 7 días, las membranas se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos a 4ºC. Se prepararon muestras para criosección mediante equilibrio en sacarosa al 30% en PBS seguido de congelación rápida en una mezcla 1:1 de sacarosa al 30% en PBS y OCT.

Se realizó la criosección de estas muestras a 13 \mum y se visualizó la estructura mediante tinción de H y E. Se determinó el número de capas de células en el epitelio estratificado contando núcleos e identificando células del margen. El termogel de colágeno alcanzó un espesor epitelial de aproximadamente 2 células, lo que contrasta mal con el epitelio de la córnea humana que contiene aproximadamente entre 5 y 7 capas de células. Sin embargo, las CECH cultivadas e inducidas a estratificarse sobre colágeno-p(DMAA-co-ASI) y colágeno-p(NiPAAm-co-AAc-co ASI)-pentapéptido, produjeron un epitelio con un espesor de aproximadamente 4,5 capas de células que incluía capas externas aparentemente queratinizadas sugerentes de una diferenciación adecuada del epitelio (Fig. 20).

13.2. Inervación del hidrogel

Discos de doce milímetros de diámetro y 650 \mum de espesor, uno de termogel de colágeno-p(DMAA-co-ASI), otro de colágeno-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapéptido y otro de colágeno al 3% se empaparon durante 30 minutos en PBS. Los discos se colocaron en una placa de cultivo de 6 cm y se perforaron cuatro orificios de 1 mm a través de cada uno. Los hoyos se llenaron hasta un tercio de la altura con un tapón de colágeno al 0,3% entrecruzado con glutaraldehido y detenido con glicina. Después de 10 minutos, se introdujeron ganglios de la raíz dorsal de polluelos E8 en la misma mezcla de colágeno y se pusieron en los hoyos. Se completó el resto de la cabida de los hoyos con colágeno entrecruzado y se dejó reposar durante 30 minutos a 37ºC. Los cultivos se dejaron crecer durante 4 días en KSFM suplementado con B27, N2 y ácido retinoico 1 nM durante 4 días y se comprobó la extensión de las neuritas por microscopia de campo brillante. Los discos inervados se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, se tiñeron para inmunorreactividad NF200 y se visualizaron por inmunofluorescencia. Se visualizó la localización sobre la superficie y en el centro del disco de polímero. Aunque había cierta extensión de neuritas sobre la superficie del termogel de colágeno, no se pudo ver ninguna extendiéndose por el propio termogel. En los hidrogeles, se pudieron ver neuritas extendiéndose por la matriz. También, en ambos hidrogeles se pudo apreciar una inervación extensa sobre la superficie de la matriz sugerente de una mejor inervación de la superficie que la que se producía con el termogel de colágeno (Fig. 19; A describe el termogel de colágeno, B describe el hidrogel de colágeno-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-pentapéptido y C describe el hidrogel de colágeno-p(DMAA-co-ASI)). La columna de la izquierda representa las visualizaciones inmunofluorescentes del centro de los polímeros teñidos para el marcador de neurofilamentos nerviosos - NF200. La columna central describe una vista en campo brillante de la superficie del polímero con las neuritas extendiéndose desde la fuente de ganglios. La columna de la derecha representa una visualización inmunofluorescente de la misma vista de superficie del polímero teñido para inmuno-reactividad NF-200. Las flechas indican neuritas extendiéndose en el centro del polímero. La córnea humana intacta muestra tanto la superficie subepitelial como los nervios profundos, sugiriendo que estas matrices son biocompatibles para los nervios a la vez que pueden emular el estroma de la córnea.

Claims (45)

1. Un copolímero sintético formado por uno o más comonómeros N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico del que se han obtenido derivados que contengan una parte colgante que se pueda entrecruzar, teniendo dicho copolímero sintético un número de masa molecular promedio de entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 1.000.000, donde dicho copolímero sintético es reactivo con aminas primarias a través de la parte colgante entrecruzable.

2. El copolímero sintético según la reivindicación 1, en donde:

(a)

dicho comonómero de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida tiene una estructura de Fórmula I:

4

donde:

R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo de H y alquilo inferior, ("alquilo inferior" hace referencia a grupos alquilo de cadena sencilla o ramificada de uno a ocho átomos de carbono o grupos cicloalquilo de tres a ocho átomos de carbono)

(b)

dicho comonómero hidrófilo tiene una estructura de Fórmula II:

5

donde:

Y es O, o no existe;

R_{6} y R_{7} se seleccionan independientemente del grupo de H y alquilo inferior;

R_{8} es H, alquilo inferior o -OR', donde R' es H o alquilo inferior; y

R_{9} es H, alquilo inferior o -C(O)R_{10} y

R_{10} es -NR_{4}R_{5} o -OR'', donde R'' es H o CH_{2}CH_{2}OH; y

(c)

dicho comonómero de acril- o metacril- ácido carboxílico tiene una estructura de Fórmula III:

6

donde:

R_{11}, R_{12} y R_{13} se seleccionan independientemente del grupo de: H y alquilo inferior, y

Q es N-succinimido, 3-sulfo-succinimido (sal sódica), N-benzotriazolilo, N-imidazolilo y p-nitrofenilo.

3. El copolímero sintético según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida y dichos uno o más comonómeros hidrófilos son los mismos o distintos.

4. El copolímero sintético según la reivindicación 2, en donde la razón molar combinada de comonómero de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida y el comonómero hidrófilo está entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 99,5% y la razón molar del comonómero de acril- o metacril- ácido carboxílico derivado está entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 50%, donde la suma de dichas razones molares es 100%.

5. El copolímero sintético según la reivindicación 3, en donde la razón molar de comonómero de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida está entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 90%, la razón molar del comonómero hidrófilo está entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 50% y la razón molar del comonómero de acril- o metacril- ácido carboxílico derivado está entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 15%, donde la suma de dichas razones molares es 100%.

6. El copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida se selecciona del grupo de N-metilacrilamida, N-etilacrilamida, N-iso-propilacrilamida (NiPAAm), N-octilacrilamida, N-ciclohexilacrilamida, N-metil-N-etilacrilamida, N-metil-metacrilamida, N-etilmetacrilamida, N-isopropilmetacrilamida, N,N-dimetilacrilamida, N,N-dietilacrilamida, N,N-dimetilmetacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, N,N-diciclohexilacrilamida, N-metil-N-ciclohexilacrilamida, N-acriloilpirrolidina, N-metacriloilpirrolidina y combinaciones de los mismos.

7. El copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho uno o más comonómeros hidrófilos se seleccionan del grupo de: ácido acrílico, ácido metacrílico, 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), N,N-dimetilacrilamida, N,N-dietilacrilamida, 2-[N,N-dimetilamino]etilacrilamida, 2-[N,N-dietilamino]etilacrilamida, N,N-dietilmetacrilamida, 2-[N,N-dimetilamino]etilmetacrilamida, 2-[N, N-dietilamino]etilmetacrilamida, 2-vinil-N-pirrolidona, 2-[N,N-dietilamino]etilacrilato, 2-[N,N-dimetilamino]etilacrilato, 2-[N,N-dietilamino]etilmetacrilato, 2-[N,N-dimetilamino]etilmetacrilato y combinaciones de los mismos.

8. El copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicho uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico se selecciona del grupo de ácido acrílico, ácido metacrílico y las versiones sustituidas de los mismos y dicha parte entrecruzable es un grupo succinimidilo, un imidazol, un benzotriazol, un p-nitrofenol o ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico.

9. El copolímero sintético según la reivindicación 2 que contiene N,N-dimetilacrilamida y N-acriloxisuccinimida.

10. El copolímero sintético según la reivindicación 3 que contiene N-isopropilacrilamida, ácido acrílico y N-acriloxisuccinimida.

11. Una matriz biosintética que comprende:

(a)

el copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(b)

un biopolímero, y

(c)

un solvente acuoso,

en donde dicho copolímero sintético y dicho biopolímero se entrecruzan por medio de dichas partes colgantes entrecruzables para formar un hidrogel.

12. La matriz biosintética según la reivindicación 11, en donde la cantidad de copolímero sintético está comprendida entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 30% en peso, la cantidad de biopolímero está entre aproximadamente el 0,3% y aproximadamente el 50% en peso y la cantidad de solvente acuoso está entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 99,6% en peso.

13. La matriz biosintética según la reivindicación 11 ó 12, en donde dicho biopolímero se selecciona del grupo de colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes, gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglicano) y derivados de los mismos.

14. La matriz biosintética según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, incluyendo además uno o más agentes bioactivos.

15. La matriz biosintética según la reivindicación 14, en donde dicho uno o más agentes bioactivos está unido covalentemente a dicho copolímero sintético por medio de la parte colgante entrecruzable.

16. La matriz biosintética según la reivindicación 15, en donde dicho agente bioactivo incluye el pentapéptido que tiene la secuencia YIGSR.

17. La matriz biosintética según la reivindicación 14, en donde dicho uno o más agentes bioactivos están dispersos en dicha matriz.

18. La matriz biosintética según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, incluyendo además diversas células dispersas en dicha matriz.

19. Uso de la matriz biosintética según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 como un soporte para la regeneración tisular en un animal que lo necesite o para la sustitución de tejido dañado o extirpado en un animal que lo necesite.

20. El uso según la reivindicación 19, en donde dicha matriz biosintética se utiliza para sustitución de tejido dañado o extirpado en un animal que lo necesite, y en donde dicho tejido es piel, parte de un órgano, una córnea o una parte de una córnea.

21. Uso de la matriz biosintética según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 para recubrir implantes quirúrgicos.

22. Un compuesto que incluye:

(a)

uno o más agentes bioactivos;

(b)

el copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(c)

un biopolímero; y

(d)

un solvente acuoso.

23. Un compuesto que incluye:

(a)

células diversas;

(b)

el copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(c)

un biopolímero; y

(d)

un solvente acuoso.

24. El compuesto según la reivindicación 22 o 23, donde la cantidad de polímero sintético está comprendida entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 30% en peso, la cantidad de biopolímero está entre aproximadamente 0,3% y aproximadamente 50% en peso y la cantidad de solvente acuoso está entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 99,6% en peso.

25. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde dicho biopolímero se selecciona del grupo de colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes, gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglicano) y derivados de los mismos.

26. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde dicho copolímero sintético y dicho biopolímero están entrecruzados.

27. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, donde dicho agente bioactivo está unido covalentemente a dicho copolímero sintético por dichas parte colgante entrecruzable.

28. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 ó 27, que está formulado como solución inyectable, donde dicho copolímero sintético y dicho biopolímero son capaces de entrecruzarse para formar un hidrogel in vivo.

29. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, que es un hidrogel preformado.

30. Un implante para uso en ingeniería tisular que incluye una matriz biosintética preformada, dicha matriz formada por un solvente acuoso y un biopolímero entrecruzado con el copolímero sintético según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

31. El implante según la reivindicación 30, donde dicho biopolímero se selecciona del grupo de colágenos, colágenos desnaturalizados, colágenos recombinantes, gelatina, fibrina-fibrinógeno, elastina, glucoproteína, alginato, quitosano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, glucosaminoglucano (proteoglicano) y derivados de los mismos.

32. El implante según la reivindicación 30 ó 31, donde la cantidad de polímero sintético está comprendida entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 30% en peso, la cantidad de biopolímero está entre aproximadamente 0,3% y aproximadamente 50% en peso y la cantidad de solvente acuoso está entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 99,6% en peso.

33. El implante según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, donde dicha matriz biosintética soporta el crecimiento de nervios hacia el interior.

34. El implante según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, que comprende además uno o más agentes bioactivos.

35. El implante según la reivindicación 34, donde dicho agente bioactivo está unido covalentemente al copolímero por dicha parte colgante entrecruzable.

36. El implante según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, que comprende además diversos tipos de células dispersas en dicha matriz.

37. El implante según la reivindicación 36, donde dichas células son células madre o células precursoras.

38. Uso del implante según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35 como una córnea artificial.

39. Un proceso para preparar un copolímero sintético que comprende:

(a)

dispersión de uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico del que se han obtenido derivados que contengan una parte colgante entrecruzable, en un solvente en presencia de un iniciador;

(b)

dejar que dicho uno o más comonómeros de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida, uno o más comonómeros hidrófilos y uno o más comonómeros de acril- o metacril- ácido carboxílico polimericen para formar un copolímero sintético, y

(c)

opcionalmente, purificación de dicho copolímero sintético.

40. Un proceso para preparar una matriz biosintética comprendiendo los pasos de:

(a)

preparar un copolímero sintético según el proceso de la reivindicación 39;

(b)

dispersar dicho copolímero sintético y un biopolímero en un medio acuoso; y

(c)

dejar que dicho copolímero sintético y dicho biopolímero se entrecrucen para dar dicha matriz biosintética.

41. El proceso según la reivindicación 39 ó 40, donde el comonómero de N-alquil- o N,N-dialquil- acrilamida sustituida y el comonómero hidrófilo son los mismos o diferentes.

42. El proceso según la reivindicación 40, que comprende además:

(i)

mezclar dicho copolímero sintético con uno o más agentes bioactivos antes del paso (b) y dejar que dicho agente bioactivo se entrecruce con dicho copolímero sintético por dicha parte colgante entrecruzable; o

(ii)

mezclar dicho copolímero sintético y dicho biopolímero con células diversas en el paso (b).

43. Un copolímero sintético producido por el proceso según la reivindicación 39.

44. Una matriz biosintética producida por el proceso según la reivindicación 40.

45. Un implante ocular que comprenda el copolímero sintético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.