KR102118807B1 - 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 몰드 - Google Patents

3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 몰드 Download PDF

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숭실대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 관한 것으로, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 관한 것이다.

Description

3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 몰드{Shape-changing hydrogel mold composition for manufacturing three-dimensional organoid and mold formed using the same}
본 발명은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 관한 것으로, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 관한 것이다.
인간의 마이크로바이옴 연구에 있어서 동물 모델은 생리학적으로 인간의 장내 환경을 대표 할 수 없을 뿐만 아니라, 동물대체시험 모델 및 가이드라인 개발에 대한 사회의 요구도 크게 증가하고 있다.
최근, 사람의 생명과 무관한 제품 개발에 대한 동물실험 금지로 인해 생체 모사체에 대한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 이러한 실정에 대한 대안으로 최근 인체 장기의 일부 세포와 세포외기질을 조직공학기술로 해당 장기의 특성을 복제하여 기존의 동물시험을 대체 하려는 인체장기칩에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 생체 모사체에 대한 연구에서는 실제 인체의 3차원 구조적 형태가 중요한데, 콜라겐과 같은 생체재료는 기계적 강도가 낮아 구조체를 제조함에 있어 문제점이 있다. 실제 인간 세포외기질(extracellular matrix)의 주성분인 콜라겐 겔은 상대적으로 낮은 강도를 갖기 때문에 일반적인 리소그라피법이나 3D 프린팅으로는 마이크로수준의 3차원 구조체를 만들 수가 없다. 때문에 인간 장(intestine)의 융털구조 등의 3차원 구조를 구현할 수가 없었다.
이에 따라, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 몰드에 대한 개발이 시급한 실정이다.
KR 10-2016-0005037A (공개일: 2016.01.13)
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 5:5 ~ 1:9의 중량비로 포함하는 아크릴계 화합물;을 구비하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 아크릴계 화합물은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 3:7 ~ 1:9의 중량비로 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1아크릴계 화합물은 아크릴아미드(acrylamide), 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 메타크릴 알지네이트(methacrylated alginate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)), 메타아크릴레이트(methacrylate), 소듐폴리아크릴레이트(sodium polyacrylate), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드 공중합체, 스타이렌/아크릴레이트 공중합체, 소듐아크릴레이트(sodium acrylate), 크로스폴리머-2, 메틸아크릴레이트(methyl acrylate), 에틸아크릴레이트(ethyl acrylate) 및 노르말부틸아크릴레이트, 2-하이드록시에틸메타아크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 상기 제2아크릴계 화합물은 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide, NIPAM), 아크릴산(acrylic acid), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리 N-이소프로필아크릴아미드(poly N-isopropylacrylamide, pNIPAM), 폴리 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(poly 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, pDMAEMA), 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 폴리비닐카프로락탐(polyvinylcaprolactame), 폴리비닐메틸에테르(polyvinyl methyl ether), 폴리 N,N-디메틸아크릴아마이드(poly(N,N-dimethylacrylamide)) 메타크릴산-메틸메타크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트 및 폴리 2,2-디메톡시 니트로벤질 메타크릴레이트-r-메틸 메타크릴레이트-r-폴리(에틸렌 글라이콜) 메타크릴레이트(poly(2,2-dimethoxy nitrobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate, PDMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한, N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide), 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(ethylene glycol diacrylate), N,N’-1,2-다이하이드록시에틸렌비스아크릴아마이드(N,N′-(1,2-dihydroxyethylene)bisacrylamide), 1,3-부테인디올 다이아크릴레이트(1,3-butanediol diacrylate), 1,6-헥세인디올 다이아크릴레이트(1,6-hexanediol diacrylate), 1,4-부테인디올 다이아크릴레이트(1,4-butanediol diacrylate), 글리세롤 1,3-다이글리세롤레이트 다이아크릴레이트(glycerol 1,3-diglycerolate diacrylate), 다이에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(di(ethylene glycol) diacrylate), 네오펜틸 글리콜 다이아크릴레이트(neopentyl glycol diacrylate) 및 폴리프로필렌글리콜 다이아크릴레이트(poly(propylene glycol) diacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 가교제; 및 과황산암모늄(ammonium persulfate), 과류산가리(potassium persulfate), 아가큐어2959(irgacure2959, 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 과황산나트륨(sodium persulfate), 나트륨 포름알데히드술폭실산염 (sodium formaldehydesulfoxylate), tert-부틸 히드로퍼옥사이드(tert-butyl hydroperoxide), 과산화벤조일(benzoyl peroxide), 2-부탄온퍼옥사이드(2-butanone peroxide), 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone), 3,4-디메틸벤조페논(3,4-dimethylbenzophenone) 및 3-히드록시벤조페논(3-hydroxybenzophenone)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 개시제;를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 상기 가교제를 0.02 ~ 0.5 중량부 및 상기 개시제를 0.5 ~ 2 중량부 포함할 수 있다.
또한, 상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여, 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine), 아스코르브산(ascorbic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 촉매;를 0.05 ~ 0.5 중량부로 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 60 ~ 95 중량부로 용매;를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물이 5:5 ~ 1:9의 중량비로 공중합된 랜덤 공중합체를 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 하기 측정방법 1로 측정한 직경감소율이 0.5 ~ 35% 이상일 수 있다.
[측정방법 1]
음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 직경을 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 직경에 대한 25℃에서의 직경감소율을 측정함.
또한, 하기 측정방법 2로 측정한 깊이증가율이 0.5 ~ 45% 이상일 수 있다.
[측정방법 2]
음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 깊이를 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 깊이에 대한 25℃에서의 깊이증가율을 측정함.
본 발명의 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드는 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 효과가 있다.
이에 따라, 인간 마이크로바이옴 오가노이드(organoid)의 3차원 융모 구조 제조뿐만 아니라, 인체장기칩 제조, 나아가 약물전달 및 다양한 조직공학 분야에 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 3차원 장내 조직 융모 구조체를 제조하는 모식도,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 형상변화를 나타낸 OCT 촬영 이미지,
도 3는 본 발명의 실시예 1에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 온도에 따른 직경 변화를 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 온도에 따른 거동을 나타낸 그래프,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드 및 융모 구조체 제조를 나타낸 이미지,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드에서 장 뮤신의 발현을 나타낸 이미지,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드에 장내 미생물을 공배양하여 장내 시스템을 모사하여, 미생물과 소장세포간의 대사체 분석을 수행한 히트 맵(heatmap) 이미지, 그리고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 확장비에 따라 적용하는 그래프이다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 포함하는 아크릴계 화합물;을 구비하여 구현된다.
이에 따라, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 온도 변화에 따른 변화율이 크고, 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현할 수 있다.
먼저, 상기 아크릴계 화합물은 후술하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 제조 시, 랜덤 공중합체를 구성하는 것으로, 상기와 같이 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 포함한다.
상기 제1아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 주요 구조체 기능을 하는 것으로, 당업계에서 통상적으로 사용할 수 있는 중합이 가능하고 고분자 사슬 구조를 가지는 제1아크릴계 화합물이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 아크릴아미드(acrylamide), 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 메타크릴 알지네이트(methacrylated alginate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)), 메타아크릴레이트(methacrylate), 소듐폴리아크릴레이트(sodium polyacrylate), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드 공중합체, 스타이렌/아크릴레이트 공중합체, 소듐아크릴레이트(sodium acrylate), 크로스폴리머-2, 메틸아크릴레이트(methyl acrylate), 에틸아크릴레이트(ethyl acrylate) 및 노르말부틸아크릴레이트, 2-하이드록시에틸메타아크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 아크릴아미드를 사용할 수 있다.
또한, 상기 제2아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤한 몰드의 감응성을 발현하는 기능을 하는 것으로, 당업계에서 통상적으로 외부 자극에 의한 감응성을 발현할 수 있는 제2아크릴계 화합물이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide, NIPAM), 아크릴산(acrylic acid), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리 N-이소프로필아크릴아미드(poly N-isopropylacrylamide, pNIPAM), 폴리 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(poly 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, pDMAEMA), 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 폴리비닐카프로락탐(polyvinylcaprolactame), 폴리비닐메틸에테르(polyvinyl methyl ether), 폴리 N,N-디메틸아크릴아마이드(poly(N,N-dimethylacrylamide)) 메타크릴산-메틸메타크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트 및 폴리 2,2-디메톡시 니트로벤질 메타크릴레이트-r-메틸 메타크릴레이트-r-폴리(에틸렌 글라이콜) 메타크릴레이트(poly(2,2-dimethoxy nitrobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate, PDMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 N-이소프로필아크릴아미드를 사용할 수 있다.
이때, 상기 제1아크릴계 화합물로 아크릴아미드를 사용하고, 상기 제2아크릴계 화합물로 N-이소프로필아크릴아미드를 사용하는 경우, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 효과를 모두 동시에 발현하는데 더욱 유리할 수 있다.
한편, 상기 아크릴계 화합물은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 5:5 ~ 1:9의 중량비로 포함하고, 바람직하게는 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 3:7 ~ 1:9의 중량비로 포함할 수 있다. 만일 상기 아크릴계 화합물에 포함되는 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물의 중량비가 5:5 미만이면 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이하지 않음에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하지 않고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 작아지는 문제가 발생할 수 있으며, 중량비가 1:9를 초과하면 급격한 수축 및 팽창으로 인한 형상 제어에 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물은, 가교제, 개시제 및 촉매를 더 포함할 수 있다.
상기 가교제는 후술하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 제조 시, 아크릴계 화합물에 구비되는 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물 간의 가교결합을 통해 랜덤 공중합체를 형성하는 기능을 수행한다.
상기 가교제는 아크릴계 화합물 간 가교결합을 시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 N,N’-메틸렌비스아크릴아미드(N,N’-methylenebisacrylamide), 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(ethylene glycol diacrylate), N,N’-1,2-다이하이드록시에틸렌비스아크릴아마이드(N,N′-(1,2-Dihydroxyethylene)bisacrylamide), 1,3-부테인디올 다이아크릴레이트(1,3-Butanediol diacrylate), 1,6-헥세인디올 다이아크릴레이트(1,6-Hexanediol diacrylate), 1,4-부테인디올 다이아크릴레이트(1,4-Butanediol diacrylate), 글리세롤 1,3-다이글리세롤레이트 다이아크릴레이트(Glycerol 1,3-diglycerolate diacrylate), 다이에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(Di(ethylene glycol) diacrylate), 네오펜틸 글리콜 다이아크릴레이트(Neopentyl glycol diacrylate) 및 폴리프로필렌글리콜 다이아크릴레이트(Poly(propylene glycol) diacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide)을 사용하는 것이 목적하는 수준으로 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 형상변화를 발현하는데 더욱 유리할 수 있다.
이때, 상기 가교제는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물에 구비되는 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.02 ~ 0.5 중량부로, 바람직하게는 0.05 ~ 0.3 중량부로 포함될 수 있다. 만일 상기 가교제가 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.02 중량부 미만이면 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물이 목적하는 수준으로 공중합되지 않음에 따라 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 형상변화를 목적하는 수준으로 발현할 수 없고, 0.5 중량부를 초과하면 높은 강도로 인하여 수축 및 팽창 정도가 줄어들어, 목적하는 수준의 직경감소율 및 깊이증가율을 발현할 수 없으며, 즉, 3차원 오가노이드의 제조에 문제가 발생할 수 있다.
또한, 상기 개시제는 공중합 반응을 개시하는 역할을 수행하는 것으로, 당업계에서 아크릴계 화합물 간의 공중합 반응을 개시하는데 사용할 수 있는 개시제라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 과황산암모늄(ammonium persulfate), 과류산가리(potassium persulfate), 아가큐어2959(irgacure2959, 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 과황산나트륨(sodium persulfate), 나트륨 포름알데히드술폭실산염 (sodium formaldehydesulfoxylate), tert-부틸 히드로퍼옥사이드(tert-butyl hydroperoxide), 과산화벤조일(benzoyl peroxide), 2-부탄온퍼옥사이드(2-butanone peroxide), 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone), 3,4-디메틸벤조페논(3,4-dimethylbenzophenone) 및 3-히드록시벤조페논(3-hydroxybenzophenone) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 과황산암모늄(ammonium persulfate)을 사용할 수 있다.
이때, 상기 개시제는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물에 구비되는 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.5 ~ 2 중량부로, 바람직하게는 0.7 ~ 1.3 중량부로 포함될 수 있다. 만일 상기 개시제가 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.5 중량부 미만이면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 중합 속도가 떨어져 본 형상의 구조를 완전한 상태로 제조하기 어렵고, 2 중량부를 초과하면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 이루는 고분자 사슬의 길이가 짧아져 물리적 특성이 달라지고, 이에 따라 제조되는 3차원 오가노이드의 분리에 용이하지 않을 수 있다.
또한, 상기 촉매는 공중합 반응의 촉매역할을 수행하는 것으로, 당업계에서 아크릴계 화합물 간의 공중합 반응의 촉매로 사용할 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine), 아스코르브산(ascorbic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine)을 사용할 수 있다.
이때, 상기 촉매는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물에 구비되는 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.05 ~ 0.5 중량부로, 바람직하게는 0.07 ~ 0.15 중량부로 포함될 수 있다. 만일 상기 촉매가 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 0.05 중량부 미만이면 목적하는 수준으로 제1아크릴계 화합물과 제2아크릴계 화합물의 공중합이 이루어지지 않을 수 있고, 반응 속도가 현격히 저하될 수 있으며, 0.5 중량부를 초과하면 촉매가 제조된 3차원 오가노이드로 전달되어 독성을 나타낼 수 있는 문제가 발생할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물은 용매를 더 포함할 수 있다.
상기 용매는 물 이외에도, 인산완충식염수(phosphate buffer saline), 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 아세트산(acetic acid), n-부탄올(n-butanol), 아이소프로판올(isopropanol), n-프로판올(n-propanol), 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 포름산(formic acid) 및 묽은 염산(Hydrochloric acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 물을 단독으로 포함할 수 있다.
한편, 상기 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물은 상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 용매를 60 ~ 95 중량부로 더 포함할 수 있다. 만일 상기 용매가 상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 60 중량부 미만이면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 기계적 강도가 과도하게 증가하고, 이를 사용하여 제조한 3차원 오가노이드 분리에 따른 문제가 발생할 수 있고, 95 중량부를 초과하면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 기계적 강도가 과도하게 낮아져 하이드로젤의 몰드의 형태를 유지하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 발명은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물이 5:5 ~ 1:9의 중량비로 공중합된 랜덤 공중합체를 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 제공한다.
이때, 상기 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드는 하기 측정방법 1로 측정한 직경감소율이 0.5 ~ 35% 이상일 수 있고, 바람직하게는 직경감소율이 15 ~ 30% 이상일 수 있다.
[측정방법 1]
음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 직경을 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 직경에 대한 25℃에서의 직경감소율을 측정함.
만일 상기 직경감소율이 0.5% 미만이면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드의 분리성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드는 하기 측정방법 2로 측정한 깊이증가율이 0.5 ~ 45% 이상일 수 있고, 바람직하게는 깊이증가율이 25 ~ 40% 이상일 수 있다.
[측정방법 2]
음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 깊이를 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 깊이에 대한 25℃에서의 깊이증가율을 측정함.
만일 상기 깊이증가율이 0.5% 미만이면 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드의 분리성이 저하될 수 있고, 45%를 초과하면 3차원 오가노이드 구조체의 기울어짐에 의해 형태를 유지하지 못하는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드는 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물로 상술한 군에서 어떠한 물질을 사용하든지 확장비만 안다면, 도 8에 도시된 바와 같이 다양한 크기를 시뮬레이션할 수 있다.
본 발명의 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물 및 이를 통해 제조된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드는 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 효과가 있다.
이에 따라, 인간 마이크로바이옴 오가노이드(organoid)의 3차원 융모 구조 제조뿐만 아니라, 인체장기칩 제조, 나아가 약물전달 및 다양한 조직공학 분야에 응용될 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
< 실시예 1>
먼저, 제1아크릴계 화합물로 아크릴아미드 및 제2아크릴계 화합물로 N-이소프로필아크릴아미드를 2:8의 중량비로 포함하는 아크릴계화합물, 상기 아크릴계화합물 100 중량부에 대하여 가교제로 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide)를 0.1 중량부, 개시제로 과황산암모늄(ammonium persulfate)을 1 중량부, 촉매로 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine)을 0.1 중량부 및 용매로 물을 88.8 중량부 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물을 통해 라디칼 중합 반응 방법으로 단면 평균직경 500㎛ 및 평균깊이가 1400㎛인 복수개의 음각을 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 제조하였다.
< 실시예 2 ~ 4 및 비교예 1>
실시예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 아크릴계 화합물에 포함되는 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물의 중량비를 2:8에서 각각 4:6, 6:4, 8:2 및 10:0으로 변경하여 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 제조하였다.
< 실험예 1: 팽창비 측정>
상기 실시예 1 ~ 4 및 비교예 1에 따라 제조한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 하기 수학식 1에 따른 온도 변화에 따른 팽윤비(swelling ratio, Q) 변화를 계산하는 방법으로 계산한 팽윤비를 통해, 하기 수학식 2에 따라 팽창비(expansion ratio, S)를 측정하여 도 3에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 하이드로젤의 팽창비는 팽윤비를 통해 평가할 수 있다. 팽윤비는 제조된 하이드로젤의 팽윤 정도를 확인하기 위한 지표로서, 팽윤된 하이드로젤의 무게(Ws)와 건조된 하이드로젤의 무게(Wd)를 이용하여 하기 수학식 1과 같이 계산할 수 있다.
[수학식 1]
Figure 112018117804813-pat00001
또한, 하이드로젤을 제조한 직후의 팽윤비(Qi)와 완전 팽윤 후 자극 변화시킨 하이드로젤의 팽윤비(Qf)를 측정하여 하기 수학식 2에 따라 하이드로젤의 팽창비를 계산 할 수 있다. 팽창비는 길이 방향에 대한 하이드로젤의 팽창 정도로, 제조한 직후 하이드로젤의 크기(xi)와 완전 팽윤 후 자극 변화시켜 증가한 하이드로젤의 크기(xf)의 비로 계산할 수 있다. 또한 밀도를 1로 가정한 하이드로젤의 무게를 부피로 변환할 수 있으며, 이는 곧 팽윤비의 비로 팽창비로 나타낼 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112018117804813-pat00002
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물의 중량비 범위를 만족하는 실시예 1 및 실시예 2는, 이를 만족하지 못하는 실시예 3, 실시예 4 및 비교예 1에 비하여 팽창비의 변화가 큰 것을 알 수 있다.
특히, 실시예 1은 25℃에서의 팽창비가 0.04이고, 37℃에서의 팽창비가 0.2로, 팽창비의 변화가 가장 큼에 따라, 몰드의 직경 및 깊이 조절이 용이함에 따라 3차원 구조의 오가노이드 제조 시 형상 및 크기 조절이 용이하고, 몰드의 직경 및 깊이의 변화율이 큼에 따라 강도가 낮은 구조체 제조 시에도 우수한 분리성을 발현하며, 3차원 미세구조를 가지는 오가노이드 제조에 매우 적합한 효과를 모두 동시에 발현할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 2: 온도에 따른 직경변화 측정>
상기 실시예 1에 따라 제조한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 도 2에 도시된 바와 같이 25℃ 및 37℃에서 몰드의 음각 최상부의 직경을 측정하였다.
그 결과, 도 2의 OCT 촬영 이미지에서 볼 수 있듯이. 본 발명에 따른 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물의 중량비 범위를 만족하는 실시예 1은 25℃에서 음각의 직경이 400㎛까지 감소하였고, 37℃에서는 음각의 직경이 550㎛까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4의 시뮬레이션 데이터와 비교해볼 때, 팽창비가 증가할수록 가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 음각 직경이 감소하였고, 본 실험의 결과와 유사한 경향을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 3: 3차원 융모 구조 모사 평가>
상기 실시예 1에 따라 제조한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 도 5a와 같이 37℃에서 직경이 확장된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에, 도 5b와 같이 25℃에서 직경을 감소시켜서 직경이 약 400㎛인 콜라겐 겔을 제조한 후, 콜라겐 겔 1㎠당 500,000개의 소장세포를 도입하여 2주 동안 소장세포를 배양하였다. 그 결과 도 5c와 같이 소장세포가 콜라겐 겔의 융모 부분까지 모두 배양된 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 4: 장 뮤신 발현 실험>
상기 실험예 3과 같이 소장세포를 도입한 3차원 융모 구조체인 오가노이드에서 장 뮤신 발현 실험을 수행하였다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드에서 장 뮤신의 발현을 나타낸 이미지로써, CaCo-2세포에서의 MUC17의 발현을 나타낸 형광뷰(Fluorescence view)이며 도 6에서 파란색은 핵, 녹색은 액틴, 빨간색은 MUC17를 나타낸 것이며, 이때 스케일바는 50㎛이다.
도 6에서 볼 수 있듯이, 상기 실시예 1에 따라 제조한 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 융모 구조체인 오가노이드는 3차원 구조가 매우 잘 형성됨에 따라 장 뮤신이 효과적으로 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 5: 미생물과 소장세포간의 대사체 분석>
상기 실험예 3과 같이 소장세포를 도입한 3차원 융모 구조체인 오가노이드에 장내 미생물(마이크로바이옴)을 공배양하여 장내 시스템을 모사하고 대사체 분석을 수행하였다. 도 7은 실시예 1에 따른 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드를 통해 제조한 3차원 오가노이드에 장내 미생물을 공배양하여 장내 시스템을 모사하여, 미생물과 소장세포간의 대사체 분석을 수행한 히트 맵(heatmap) 이미지이다. 공배양 시 잔토신(Xanthosine)과 젖산(Lactate)이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
본 결과를 통해 젖산균(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)과 소장세포간의 대사 상호작용을 확인하였다. 구체적으로는 젖산균(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG) 단독배양에서 아데노신(adenosine), 시티딘(cytidine)과 같은 핵산전구체(nucleic acid precursor) 등이 많이 분석되었고, 소장세포 단독배양에서는 말산염(malate), 구연산염(citrate)과 같은 카르복시산이 많이 분석되었다. 젖산균(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)과 소장세포를 공배양했을 때는 특이적으로 잔토신(Xanthosine)과 젖산(Lactate)의 발현량이 높은 것을 알 수 있는데, 이는 젖산균(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)이 분비한 핵산들을 소장세포가 흡수하여 잔토신(Xanthosine)과 젖산(Lactate)을 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 결과 값은 각 대사체의 평균값으로 표준화하였다.
이상에서 본 발명의 일 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 5:5 ~ 1:9의 중량비로 포함하는 아크릴계 화합물;을 구비하며,
    상기 제1아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 주요 구조체 기능을 하고,
    상기 제2아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤한 몰드의 감응성을 발현하는 기능을 하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴계 화합물은 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물을 3:7 ~ 1:9의 중량비로 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1아크릴계 화합물은 아크릴아미드(acrylamide), 폴리에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 메타크릴 알지네이트(methacrylated alginate), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol)), 메타아크릴레이트(methacrylate), 소듐폴리아크릴레이트(sodium polyacrylate), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드 공중합체, 스타이렌/아크릴레이트 공중합체, 소듐아크릴레이트(sodium acrylate) 크로스폴리머-2, 메틸아크릴레이트(methyl acrylate), 에틸아크릴레이트(ethyl acrylate), 노르말부틸아크릴레이트 및 2-하이드록시에틸메타아크릴레이트(2-hydroxyethyl methacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 제2아크릴계 화합물은 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide, NIPAM), 아크릴산(acrylic acid), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리 N-이소프로필아크릴아미드(poly N-isopropylacrylamide, pNIPAM), 폴리 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(poly 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate, pDMAEMA), 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 폴리비닐카프로락탐(polyvinylcaprolactame), 폴리비닐메틸에테르(polyvinyl methyl ether), 폴리 N,N-디메틸아크릴아마이드(poly(N,N-dimethylacrylamide)) 메타크릴산-메틸메타크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트 공중합체, 메타크릴산-메틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트 및 폴리 2,2-디메톡시 니트로벤질 메타크릴레이트-r-메틸 메타크릴레이트-r-폴리(에틸렌 글라이콜) 메타크릴레이트(poly(2,2-dimethoxy nitrobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate, PDMP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(N,N'-methylenebisacrylamide), 폴리에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(poly(ethylene glycol)diacrylate), 에틸렌글라이콜다이아크릴레이트(ethylene glycol diacrylate), N,N’-1,2-다이하이드록시에틸렌비스아크릴아마이드(N,N′-(1,2-dihydroxyethylene)bisacrylamide), 1,3-부테인디올 다이아크릴레이트(1,3-butanediol diacrylate), 1,6-헥세인디올 다이아크릴레이트(1,6-hexanediol diacrylate), 1,4-부테인디올 다이아크릴레이트(1,4-butanediol diacrylate), 글리세롤 1,3-다이글리세롤레이트 다이아크릴레이트(glycerol 1,3-diglycerolate diacrylate), 다이에틸렌글리콜 다이아크릴레이트(di(ethylene glycol) diacrylate), 네오펜틸 글리콜 다이아크릴레이트(neopentyl glycol diacrylate) 및 폴리프로필렌글리콜 다이아크릴레이트(poly(propylene glycol) diacrylate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 가교제; 및
    과황산암모늄(ammonium persulfate), 과류산가리(potassium persulfate), 아가큐어2959(irgacure2959, 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone), 과황산나트륨(sodium persulfate), 나트륨 포름알데히드술폭실산염 (sodium formaldehydesulfoxylate), tert-부틸 히드로퍼옥사이드(tert-butyl hydroperoxide), 과산화벤조일(benzoyl peroxide), 2-부탄온퍼옥사이드(2-butanone peroxide), 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropiophenone), 3,4-디메틸벤조페논(3,4-dimethylbenzophenone) 및 3-히드록시벤조페논(3-hydroxybenzophenone)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 개시제;를 더 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 상기 가교제를 0.02 ~ 0.5 중량부 및 상기 개시제를 0.5 ~ 2 중량부 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여, 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine), 아스코르브산(ascorbic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 촉매;를 0.05 ~ 0.5 중량부로 더 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 아크릴계 화합물 100 중량부에 대하여 60 ~ 95 중량부로 용매;를 더 포함하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드 조성물.
  8. 제1아크릴계 화합물 및 제2아크릴계 화합물이 5:5 ~ 1:9의 중량비로 공중합된 랜덤 공중합체를 포함하며,
    상기 제1아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드의 주요 구조체 기능을 하고,
    상기 제2아크릴계 화합물은 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤한 몰드의 감응성을 발현하는 기능을 하는 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드.
  9. 제8항에 있어서,
    하기 측정방법 1로 측정한 직경감소율이 0.5 ~ 35% 이상인 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드:
    [측정방법 1]
    음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 직경을 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 직경에 대한 25℃에서의 직경감소율을 측정함.
  10. 제8항에 있어서,
    하기 측정방법 2로 측정한 깊이증가율이 0.5 ~ 45% 이상인 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드:
    [측정방법 2]
    음각이 형성된 3차원 오가노이드 제조용 형상변화형 하이드로젤 몰드에 대하여, 온도 37℃ 및 온도 25℃ 음각의 깊이를 각각 측정하여, 온도 37℃에서의 음각 깊이에 대한 25℃에서의 깊이증가율을 측정함.
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