JPH06153928A - 初代癌細胞培養用担体およびこれを用いる初代癌細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、
ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、且
つ、該ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液体
状態（ゾル状態）を示すことを特徴とする初代癌細胞お
よび／又は初代癌細胞塊培養用の担体。 【効果】 癌患者から直接採取した初代癌細胞および／
又は初代癌細胞塊の増殖および生存率が、従来の平面培
養、コラーゲンゲル培養法と比較して著しく改善される
と同時に、初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊に全く
損傷を与えずに該細胞および／又は細胞塊の培養、継
代、回収が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は初代癌細胞および／又は
初代癌細胞塊の培養用担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、抗癌剤の薬剤感受性試験ある
いは放射線、温熱などの物理療法の効果判定などの目的
のために、癌細胞をインビトロで培養するという試みが
行われてきた。

【０００３】現状では通常の平面培養で培養、増殖が可
能な癌細胞はほとんど株化された癌細胞である。しかし
ながら大部分の株化癌細胞は株化の過程で癌組織中の他
細胞との接触を失ってしまう為に、初代の癌細胞が有し
ていた多くの特徴を失ってしまう（Fraslin, J. et a
l., ＥＭＢＯ Ｊ（１９８５）４：２４８７）。

【０００４】したがって、抗癌剤などの薬剤感受性試験
においては、癌組織の特徴を失ってしまった株化癌細胞
を用いるよりも、癌組織の性質を有している癌細胞を用
いる必要がある。一方、患者より採取した癌細胞の平面
培養は非常に困難であり、今日までほとんど成功してい
ない。その原因の一つとして、癌組織中に混在している
正常細胞、特に線維芽細胞は平面培養で強い増殖性を示
し、初代癌細胞の増殖を阻害してしまうことが考えられ
ている。また癌細胞を線維芽細胞の混在なしに癌組織か
ら採取する事も非常に困難であると同時に、両細胞の識
別も困難であるという点も上記困難性の大きな原因であ
る。

【０００５】このような問題点を考慮して、平面培養で
も線維芽細胞が増殖しにくいような培養系が開発されて
いる。すなわち線維芽細胞の接触阻止能を有するマウス
由来のＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の単層培養(cell mat)上で
初代癌細胞を培養、増殖させる方法である（三木健二
ら、組織培養研究、（１９９１）９：３５）。またＣ３
Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の単層培養上で、肺癌組織中の正
常細胞の発育を阻止し肺癌細胞のみを特異的に増殖させ
る方法も開発されている（Klein, J.C. et al.,Cancer
Res. （１９８７）４７：３２５１）。

【０００６】一方、上記の方法によって混在する線維芽
細胞の増殖を抑制したとしても、平面培養系は癌細胞の
生体中の環境とは大きく異なっている。癌細胞は生体中
では３次元構築体中に存在しているため、癌細胞の特性
を維持した状態で培養、増殖させるためには３次元培養
系が必要であると考えられている。

【０００７】従来、３次元培養系のマトリックスとして
は、コラーゲンゲルおよび寒天ゲルが最も一般に用いら
れてきた。しかしながら、コラーゲンゲル内培養法では
ある種の株化癌細胞の細胞形態の誘導作用は認められた
ものの（西山敏夫ら、組織培養研究（１９９１），９：
８７）、初代癌細胞の増殖を行うことは非常に困難であ
った。また癌患者から直接、採取した癌組織即ち初代癌
細胞塊の場合はコラーゲンゲル上での増殖は認められた
ものの（A.E. Freeman et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA（１９８６），８３：２６９４）、コラーゲンゲル
内部での増殖は非常に困難であった。

【０００８】一方、寒天ゲルを用いた初代癌細胞の培養
も試みられているが、寒天ゲル中での初代癌細胞の増殖
の目安であるコロニー形成率は極めて低く、０．００１
〜０．１％である（N. Tanigawa, et al., Cancer Res.
（１９８２）４２：２１５９N. Tanigawa, et al., Can
cer Res.（１９８４）４４，２３０９）。

【０００９】上述した困難性に加え、上記した従来のゲ
ル素材には種々の重大な問題点がある。

【００１０】すなわち、従来の素材の一つである寒天は
海藻が生産する多糖類であり、ゾル−ゲル転移温度を有
していて、該転移温度より高い温度では溶解状態即ちゾ
ル状態を示し、該転移温度よりも低い温度でゲル状態に
変化する性質を有している。この性質を利用してゾル状
態で初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊を分散させた
後、温度を該ゾル−ゲル転移温度以下に冷却することに
よってゲル化し、該細胞および／又は細胞塊をゲル内に
包埋し培養する方法が実施されてきたが、寒天には以下
に示すような重大な問題点がある。

【００１１】１）寒天ゲルの融解温度は非常に高く、約
９０℃近辺であるために、初代癌細胞および／又は初代
癌細胞塊との混合時に該細胞および／又は細胞塊が熱的
に損傷を受ける。また培養した初代癌細胞および／又は
初代癌細胞塊を寒天ゲルから回収あるいは継代するため
に該ゲルをゾル状態に変える際にも、該培養細胞および
／又は細胞塊は高温にさらされ非常に大きな熱的損傷を
受ける。したがって、寒天ゲルからの培養物の回収、継
代は実質的に不可能であった。 ２）寒天は天然高分子でありその物性、特に細胞に対す
る毒性がロットによって非常にバラツキが大きい。

【００１２】一方、コラーゲンゲルの主成分であるコラ
ーゲンは、動物組織の主構成成分であり組織の強度保
持、機能発現、維持などの役割を担っている。コラーゲ
ンゲル中に細胞および／又は細胞塊を包埋する方法とし
ては、生体組織から分離した酸性コラーゲンを低温、低
ＰＨ下で培地中に溶解した後、ＰＨを中性に上げ且つ塩
濃度を生理的条件に合わせた後に細胞および／又は細胞
塊を混入し、３７℃に昇温し徐々にコラーゲンをゲル化
させる方法が最も一般的に行われている。該コラーゲン
ゲルの場合は、上記した寒天ゲルの場合と異なって細胞
および／又は細胞塊を包埋する際の傷害は著しく軽減さ
れるものの、以下に記すような問題点がある。

【００１３】１）コラーゲンゲル内で培養した細胞ない
し細胞塊を該ゲルから回収あるいは継代するためには、
コラーゲンゲルを溶解するコラゲナーゼなどの蛋白分解
酵素を使用することが不可欠であり、細胞および／又は
細胞塊の機能障害あるいはコロニーのような再構築され
た構造の破壊など致命的な問題をもたらす。 ２）コラーゲンのゲル化過程は、上述したように厳密に
コントロールされた生理的条件下で緩慢に進行するため
に、造粒などの形態を該ゲルに付与することは非常に困
難である。 ３）コラーゲンゲルも機械的に脆弱であると同時に、コ
ラーゲンは天然高分子であるため、その性質がロット間
で大きくバラつく。

【００１４】上述したように従来、初代癌細胞および／
又は初代癌細胞塊のゲル内培養法に用いられてきたゲル
素材には、ゲル内での該細胞および／又は細胞塊の増殖
が極めて低い、および細胞および／又は細胞塊の包埋お
よび回収（あるいは継代）時に多大の損傷がもたらされ
るという致命的な欠点が未解決のまま残されている。

【００１５】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、初
代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の増殖性に優れ、該
細胞および／又は細胞塊に損傷を与えることなく容易に
包埋が可能で、且つ培養後、該細胞および／又は該細胞
塊に損傷を与えることなく容易に回収あるいは継代する
ことが可能な初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊培養
用担体、およびこれを用いる初代癌細胞および／又は初
代癌細胞塊の培養方法を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、従来のゲル素材とは全く異なった性質、すなわちゾ
ル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可
逆的にゾル状態を示すような高分子化合物を初代癌細胞
および／又は初代癌細胞塊培養用の担体として用いるこ
とが、上述した問題点の解消に極めて効果的なことを見
い出した。

【００１７】本発明の初代癌細胞および／又は初代癌細
胞塊培養用担体は上記知見に基くものであり、より詳し
くは、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、ゾル
−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、且つ、該
ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液体状態
（ゾル状態）を示すことを特徴とするものである。

【００１８】本発明によれば、更に、分子内に疎水性部
分と親水性部分とを有し、ゾル−ゲル転移温度を有する
高分子化合物を含み、且つ、該ゾル−ゲル転移温度より
低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す担体
と、細胞培養用生理活性物質とからなることを特徴とす
る初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊培養用の組成物
が提供される。

【００１９】本発明によれば、更に、分子内に疎水性部
分と親水性部分とを有し、ゾル−ゲル転移温度を有する
高分子化合物を含み、且つ、該ゾル−ゲル転移温度より
低い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す担体
を、該担体のゾル−ゲル転移温度より低い温度で所定の
培地と混合し、該混合物中に初代癌細胞および／又は初
代癌細胞塊を混入し、前記ゾル−ゲル転移温度より高い
温度で上記混合物をゲル状態として、上記初代癌細胞お
よび／又は初代癌細胞塊の培養を行う初代癌細胞および
／又は初代癌細胞塊の培養方法が提供される。

【００２０】本発明によれば、更に、分子内に疎水性部
分と親水性部分とを有し、ゾル−ゲル転移温度を有する
高分子化合物を含み、且つ該ゾル−ゲル転移温度より低
い温度で可逆的に液体状態（ゾル状態）を示す担体を、
該担体のゾル−ゲル転移温度より低い温度で所定の培地
と混合し、該混合物中に初代癌細胞および／又は初代癌
細胞塊と細胞培養用生理活性物質とを混入し、前記ゾル
−ゲル転移温度より高い温度で上記混合物をゲル状態と
して、上記初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の培養
を行う初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の培養方法
が提供される。

【００２１】上述した本発明において、上記高分子化合
物の親水性部分は、上気したゾル−ゲル転移温度より低
い温度で該高分子化合物が水溶性になるために必要であ
り、また疎水性部分は、該高分子がゾル−ゲル転移温度
より高い温度でゲル状態に変化するために必要である。
換言すれば、該疎水性部分間の結合がゲルの架橋点の形
成のために必要である。

【００２２】本発明の担体は、上記高分子化合物中の疎
水性部分間の結合、即ち疎水性結合の以下に記す性質を
利用したものである。

【００２３】疎水性結合は、その結合力が温度の上昇と
共に強くなるという性質を有するために、温度上昇と共
に架橋の強さおよび架橋密度が増大し、本発明において
は、初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊培養時の温度
（ゾル−ゲル転移温度より高い温度）でゲル化状態に変
化することが可能である。また、上記疎水性結合力の温
度依存性が可逆的であるという性質によって、本発明に
おいてはゾル−ゲル転移が可逆的におこる。

【００２４】一方、上記高分子化合物中の親水性部分
は、前述したように、該高分子化合物が初代癌細胞およ
び／又は初代癌細胞塊培養時の温度より低い温度（ゾル
−ゲル転移温度より低い温度）で水溶性に変化するため
に必要であると同時に、上記温度より高い温度で疎水性
結合力が増大しすぎて上記高分子化合物が凝集沈澱して
しまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成するた
めにも必要である。

【００２５】以下、本発明を更に詳細に説明する。 （ゾル−ゲル転移温度）本発明において、「ゾル状態」
「ゲル状態」および「ゾル−ゲル転移温度」は以下のよ
うに定義される。この定義については文献（Polymer Jo
urnal.１８（５），４１１−４１６（１９８６））を参
照することができる。

【００２６】高分子溶液（担体として使用すべき高分子
溶液）１ｍＬを内径１ｃｍの試験管に入れ、所定の温度
（一定温度）とした水浴中で１２時間保持する。この
後、試験管の上下を逆にした場合に、溶液／空気の界面
（メニスカス）が溶液の自重で変形した場合（溶液が流
出した場合を含む）には、上記所定温度において高分子
溶液は「ゾル状態」であると定義する。一方、上記試験
管の上下を逆にしても、上記した溶液／空気の界面（メ
ニスカス）が溶液の自重で変形しない場合には、該溶液
は、上記所定温度において「ゲル状態」であると定義す
る。

【００２７】一方、上記した「所定温度」を徐々に（例
えば１℃きざみで）上昇させて、「ゾル状態」が「ゲル
状態」に転移する温度を求めた場合、これによって求め
られる転移温度を「ゾル−ゲル転移温度」と定義する
（この際、「所定温度」を例えば１℃きざみで下降さ
せ、「ゲル状態」が「ゾル状態」に転移する温度を求め
てもよい。

【００２８】本発明の担体においては、上記ゾル−ゲル
転移温度は０℃より高く、６０℃以下であることが好ま
しく、更には４℃以上５０℃以下（特に４℃以上４０℃
以下）であることが、初代癌細胞および／又は初代癌細
胞塊の熱的損傷を防ぐ点から好ましい。このように好適
なゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物は、後述す
るような具体的な化合物の中から上記したスクリーニン
グ方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選
択することができる。

【００２９】本発明の初代癌細胞および／又は初代癌細
胞塊培養方法においては、上記したゾル−ゲル転移温度
（ａ℃）を、培養時の温度（ｂ℃）と、培養した癌細胞
ないし癌細胞塊を回収あるいは継代する時の温度（ｃ
℃）との間に設定することが必要である。すなわち上記
した３種の温度ａ℃、ｂ℃、およびｃ℃の間にはｂ＞ａ
＞ｃの関係があることが必要である。より具体的には
（ｂ−ａ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であること
が好ましく、また（ａ−ｃ）は１〜４０℃、更には２〜
３０℃であることが好ましい。

【００３０】（高分子化合物）上述したような好適なゾ
ル−ゲル転移温度は、例えば本発明の担体に用いられる
高分子化合物中の疎水性部分と親水性部分の組成、およ
び疎水性度、親水性度、分子量などをそれぞれ調節する
ことによって達成することが可能である。

【００３１】このような疎水性部分と親水性部分とを含
む高分子化合物の具体例としては、例えば、ポリプロピ
レンオキサイドとポリエチレンオキサイドのブロック共
重合体などに代表されるポリアルキレンオキサイドブロ
ック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピル
セルロースなどのエーテル化セルロース；キトサン誘導
体（K.R.Holme. et al. Macromolecules, ２４，３８２
８（１９９１））；プルラン誘導体（出口茂ら、Polyme
r Preprints. Japan. １９．９３６（１９９０））など
の変性多糖類；ポリＮ−置換（メタ）アクリルアミド誘
導体、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメ
チルエーテルなどに代表される温度感応性高分子と水溶
性高分子化合物との結合体（例えば松田武久ら、Polyme
r Preprints. Japan. ３９（８）．２５５９（１９９
０））などがあげられるが、これらに限定されるもので
はない。

【００３２】本発明における上記高分子化合物の濃度
は、設定されるゾル−ゲル転移温度等によっても異なる
が、後述するような所定の培地との混合物中で用いる場
合、一般に０．１〜３０ｗｔ％の濃度、更には１〜２０
ｗｔ％の濃度であることが好ましい。

【００３３】（初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊）
本発明における「初代癌細胞および／又は初代癌細胞
塊」とは、ヒトをはじめとした動物から直接採取した癌
細胞および／又は癌細胞を含む組織をさし、細胞核の偏
在性、大きさおよび濃染性の有無などを指標として癌細
胞かどうかは判定される。

【００３４】（細胞培養用生理活性物質）本発明におけ
る細胞培養用生理活性物質とは、培養中の癌細胞に対
し、何らかの生理活性を付与する作用を有する物質をい
い、細胞増殖・分化因子、細胞接着因子等を包含する意
味で用いる。細胞増殖・分化因子としては腫瘍成長因子
−β（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧ
Ｆ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子
（ＥＧＦ）、インターロイキン群などがあげられる。こ
れらの細胞増殖・分化因子は、上記した高分子（担体）
１００部（重量部、以下同じ）に対して１０^-7〜１０^-3
部（更には１０^-6〜１０^-4部）程度用いることが好まし
い。細胞接着因子としては、コラーゲン、フィブロネク
チン、ビトロネクチン、ラミニン、ブロテオグリカン、
グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスやゼラ
チンなどがあげられる。これらの細胞接着因子は、上記
した高分子（担体）１００部に対して、０．０１〜５０
部（更には０．１〜１０部）程度用いることが好まし
い。

【００３５】（培地）本発明において、上述したような
高分子化合物と組み合わせて用いるべき培地としては、
公知の細胞培養用培地を特に制限なく使用することがで
きる。

【００３６】（初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の
培養方法）上記した高分子化合物（担体）を用いる初代
癌細胞および／又は初代癌細胞塊の培養方法の好ましい
一例を以下に記載する。

【００３７】先づ上記高分子化合物を、所望の培地中に
該高分子化合物のゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で
均一に溶解する。この時に適宜、上記した細胞培養用生
理活性物質も同時に溶解することも可能である。次に該
高分子化合物の培地溶液中に初代癌細胞および／又は初
代癌細胞塊を混合分散させる。次にこの混合物の温度を
上記ゾル−ゲル転移温度より高く上げることによって、
該混合物を速やかに且つ容易にゲル化させることが可能
である。以下に、より具体的に上記方法を記載する。

【００３８】例えば、初代癌細胞および／又は初代癌細
胞塊を含有するゲルを粒子状に成型する方法として、上
記ゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で該細胞および／
又は細胞塊を混合分散した上記高分子化合物の培地溶液
を、マイクロディスペンサーなどを用いて、該ゾル−ゲ
ル転移温度より高い温度に加温された培地中に滴下しゲ
ル化させる方法；あるいは該細胞および／又は細胞塊が
混合分散された該高分子化合物の培地溶液を上記ゾル−
ゲル転移温度よりも低い温度で多量の流動パラフィン中
に添加し攪拌下に懸濁した後に、該懸濁液の温度を該ゾ
ル−ゲル転移温度より高くすることによって該懸濁粒子
をゲル化させ、次に該ゲル粒子懸濁液にゾル−ゲル転移
温度より高く加温された培地を添加し遠心分離する方法
が挙げられる。後者の方法においては、遠心分離によ
り、上層に流動パラフィン層が下層に上記ゲル粒子の培
地懸濁液層が分離され、容易に流動パラフィンから該細
胞および／又は細胞塊含有ゲル粒子を分離することが可
能である。

【００３９】一方、ファイバー状にゲルを成型する場合
には、上記のマイクロディスペンサーなどから連続的
に、高分子化合物の培地溶液をそのゾル−ゲル転移温度
より高く加温された培地中に押し出すことによって実施
できる。

【００４０】またフィルムあるいはシート状にゲルを成
型する場合には、高分子化合物の培地溶液をそのゾル−
ゲル転移温度より高く加温された平面状の支持体上に流
布して、ゲル化させることにより実施することができ
る。

【００４１】以上、初代癌細胞および／又は初代癌細胞
塊が混合分散されたゲルに形態を付与する方法の例につ
いて述べたがこれらに限定されるものではない。

【００４２】一方、上記ゲル中で培養された初代癌細胞
および／又は初代癌細胞塊を回収あるいは継代するため
に該ゲルから分離する方法として最も簡便で容易な方法
は、該ゲルのゾル−ゲル転移温度より低く温度を下げる
ことによって該ゲルをゾル状態にして、該細胞および／
又は細胞塊懸濁液をつくる方法である。この方法によれ
ば、遠心分離などによって該培養癌細胞および／又は癌
細胞塊を該ゲルから全く損傷なく分離することができ
る。

【００４３】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に
説明する。本発明の範囲は特許請求の範囲により限定さ
れるものであり、以下の実施例により限定されるもので
はない。

【００４４】実施例１ 以下に本実施例に用いたＦ−１２７重合体の合成法と滅
菌法を示す。 （Ｆ−１２７重合体合成法）ポリプロピレンオキサイド
とポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体である
プルロニックＦ−１２７（旭電化工業（株）製）１０ｇ
を乾燥クロロホルム３０ｍＬ（ミリリットル）に溶解
し、五酸化リン共存下、ヘキサメチレンジイソシアネー
ト０．１３ｇを加え、沸点還流下に６時間反応させた。
溶媒を減圧除去後、残渣を蒸留水に溶解し、分画分子量
１０万の限外濾過膜を用いて、限外濾過透析を行い高分
子量重合体のみの水溶液を回収した。得られた水溶液を
凍結乾燥して、Ｆ−１２７重合体を得た。

【００４５】上記Ｆ−１２７重合体を、氷冷下、１０ｗ
ｔ％の濃度で蒸留水に溶解した。この水溶液をゆるやか
に加温してゆくと、２１℃から徐々に粘度が上昇し、約
２７℃で固化し、ハイドロゲルとなった。このハイドロ
ゲルを冷却すると、２１℃で水溶液にもどった。この変
化は、可逆的に繰り返し観測された。

【００４６】（Ｆ−１２７重合体滅菌法）１００ｍＬの
メジューム瓶に、上記により得た５ｇのＦ−１２７重合
体を入れ、約４０ｍＬのアセトン（特級）に溶解した。
シリコーン栓に注射針をさし、カヌラに０．２μｍのフ
ィルター（マイショリディスクＨ−１３−５、東ソ−
製）をセットしたものを栓として用いた。上記メジュー
ム瓶にこの栓をしてベルジャーに入れ、アスピレーター
でベルジャー内を減圧してアセトンを除去した。完全に
アセトンを除去するために更に上記ベルジャー内を真空
ポンプで減圧した。この様な処理をしたＦ−１２７重合
体は完全に滅菌されていることを別途確認した。

【００４７】（初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊培
養）胃癌患者（T.K.女、６９才）から無菌的に採取した
腫瘍塊（０．９ｃｍ×０．８ｃｍ×１．０ｃｍ）をペニ
シリン２００Ｕ／ｍＬ、カナマイシン０．２ｍｇ／ｍ
Ｌ、ファンギソン０．５μｇ／ｍＬを含むハンクス液
（日水製薬製）に約３０分間浸漬した後に、該腫瘍塊を
シャーレに入れ、鋏にてできるだけ細く細切し、細胞お
よび細胞塊を作製した。

【００４８】該細胞および細胞塊を１０００r.p.m.で５
分間遠心し、該細胞および細胞塊のペレットを作製し
た。該細胞および細胞塊中の細胞数および生存率は、そ
れぞれ細胞計算盤およびトリパンブルー染色を用いる常
法にしたがって測定した。

【００４９】別に、上述の方法により得た５ｇの滅菌済
みＦ−１２７重合体を、４℃に冷却したＲＰＭＩ−１６
４０培地（日水製薬製、１０％牛胎児血清含有）５０ｍ
Ｌに溶解し、１０％（Ｗ／Ｖ）Ｆ−１２７重合体／ＲＰ
ＭＩ−１６４０溶液を調製し、４℃で保存した。

【００５０】上記細胞および細胞塊ペレットを１ｍＬの
上記４℃の１０％Ｆ−１２７重合体／ＲＰＭＩ−１６４
０溶液に入れ、ピペッティングによって均一に混合し細
胞濃度を２×１０⁵ cells ｍＬに調節し、この１ｍＬを
市販の直径φ３５ｍｍディッシュ（Falcon 3001,日本ベ
クトン製）に分注し、直ちに３７℃のインキュベーター
（５％炭酸ガス／９５％空気）に入れ、１０分間インキ
ュベートした。このディッシュを、予め３７℃に保温し
ておいたプレート（マイクロウォームプレート、北里サ
プライ製）に移し、分注した溶液が完全にゲル化してい
ることを確認した後、予め３７℃に加温したＲＰＭＩ−
１６４０培地１ｍＬをゲルの上に加え３７℃のインキュ
ベーター中で培養した。ゲル上の培地は２〜３日おきに
交換した。上記の条件で１５日間および２１日間培養し
た後のゲル内の癌細胞塊の顕微鏡写真を図１（ａ）およ
び図２（いずれも倍率は１００倍）にそれぞれ示す。図
１（ｂ）のＡで示した円周で囲まれた部分が培養前の癌
細胞塊であり、培養によって明らかに該癌細胞が周囲か
ら増殖していることが観察された。

【００５１】更に図２に示すように２１日間培養後には
該癌細胞塊が更に盛り上がり体積が増加していることが
認められた。また上記の方法で２ケ月間培養した培養癌
細胞の生存率を測定するために、２ケ月間培養したディ
ッシュをインキュベーターから取り出し、ゲルから細胞
を回収するために用意しておいた氷の上にディッシュを
移し、ゲルを溶解した。約５分間の冷却でゲルは完全に
ゾル状態に変化した。該癌細胞を含むゾルを遠心分離す
ることによって癌細胞のみを回収しトリパンブルー染色
によって２ケ月間培養した該癌細胞の生存率を測定した
ところ、４４．４％と非常に高い生存率を示した。

【００５２】実施例２ 直腸癌患者（S.A.，女，４９才）から無菌的に採取した
腫瘍塊（１．０ｃｍ×０．９ｃｍ×１．０ｃｍ）から実
施例１と同様の方法で癌細胞および癌細胞塊を分離し
た。

【００５３】トリパンブルー染色により採取直後の癌細
胞の生存率を測定したところ、５１．９％であった。

【００５４】上記癌細胞および細胞塊を実施例１と同様
の方法でＦ−１２７重合体のゲル中で３日間、および４
２日間培養した後の顕微鏡写真を図３（ａ）および図４
（いずれも倍率は１００倍）にそれぞれ示す。図３
（ｂ）にＢで示す周囲に囲まれた部分が採取直後の癌細
胞塊を示す。３日間の培養によって、採取癌細胞塊の周
囲に旺盛な増殖が認められた。

【００５５】また図４に示すように４２日間の培養で該
細胞塊は更に立体的に盛り上り、体積の増加が観察され
た。

【００５６】２ケ月間培養した上記癌細胞の生存率を実
施例１と同様の方法によって測定した結果、７９．４％
と培養前の生存率５１．９％よりも高く、癌細胞の生存
率は該ゲル内で上昇することが判明した。

【００５７】実施例３ 肺癌患者（H.S.，男，６５才）から無菌的に採取した腫
瘍塊（１．０ｃｍ×０．７ｃｍ×０．５ｃｍ）から実施
例１と同様の方法で癌細胞および癌細胞塊を分離した。

【００５８】トリパンブルー染色により採取直後の癌細
胞の生存率を測定したところ１０％であった。該癌細胞
および細胞塊を、播種濃度１．０×１０⁵ cells ／ｍＬ
で実施例１と同様の方法でＦ−１２７重合体のゲル中で
１５日間培養した。１５日間培養後の細胞塊の顕微鏡写
真を図５（倍率１００倍）に示す。図５からわかるよう
に、肺癌細胞のコロニーが形成されていた。また２７日
間培養した後、実施例１と同様の方法で癌細胞を回収し
その生存率を測定したところ、９６．３％の非常に高い
生存率を示した。

【００５９】比較例１ 実施例３で用いたものと同じ肺癌細胞および癌細胞塊を
細胞濃度が１．０×１０⁵ cells ／ｍＬになるようにＲ
ＰＭＩ−１６４０培地に混合分散し、該懸濁液２ｍＬを
直径φ３５ｍｍディッシュ（Falcon 3001,日本ベクトン
製）に分注し３７℃でインキュベーター（５％炭酸ガス
／９５％空気）中で培養した。培地は２〜３日間毎に交
換した。

【００６０】上記した従来法たる平面培養法で１５日間
培養したディッシュ底面に付着した細胞の顕微鏡写真を
図６（倍率１００倍）に示す。

【００６１】図６の写真からわかるようにディッシュ底
面に付着、増殖した細胞は繊維状を示す線維芽細胞であ
り、該細胞は上記肺腫瘍塊中に混入していた正常の線維
芽細胞が増殖したものである。したがって、通常の平面
培養では上記肺癌細胞および細胞塊の増殖は困難であっ
た。

【００６２】実施例４ 胃癌患者（M.H.，女，５２才）から無菌的に採取した腫
瘍塊（１．０ｃｍ×０．８ｃｍ×０．９ｃｍ）から実施
例１と同様の方法で癌細胞および細胞塊を分離した。採
取直後の癌細胞の生存率をトリパンブルー染色により測
定したところ１８．０％であった。

【００６３】次に実施例１で用いた１０％（Ｗ／Ｖ）Ｆ
−１２７重合体培地溶液に、氷冷下に牛真皮ペプシン可
溶化タイプＩコラーゲン（KOKEN CELLGEN I-PC. （株）
高研製）を添加し、Ｆ−１２７重合体１００部（重量
部）に対して上記コラーゲン５部を含有するＦ−１２７
重合体とコラーゲンの混合培地溶液を調製した。

【００６４】以下、実施例１で用いたＦ−１２７重合体
培地溶液のかわりに上記のＦ−１２７重合体／コラーゲ
ンの混合体の培地溶液を用いた以外は実施例１と同様の
方法で、上記の胃癌細胞および細胞塊を培養した。

【００６５】１４日間培養して培養物の顕微鏡観察をし
たところ、癌細胞コロニーの増殖が認められた。該癌細
胞コロニーの生存率を実施例１と同様の方法で測定した
ところ、３３．３％であり採取直後の生存率よりも向上
していた。

【００６６】比較例２ 実施例４で用いた胃癌細胞および細胞塊を細胞濃度が２
×１０⁵ cells ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ−１６４０
培地に混合分散し、該懸濁液１ｍＬを比較例１と同様の
方法で１４日間平面培養した。

【００６７】１４日間培養した後、ディッシュ底面に付
着した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（トリプシン：
０．０５％，ＥＤＴＡ：０．０２％，ハンクス液）で４
分間処理し回収した後、実施例１と同様の方法で該細胞
の生存率を測定したところ、生存細胞は全く認められな
かった。

【００６８】実施例５ 胃癌患者（K.K.，男，８５才）より無菌的に採取した腫
瘍塊（１．０ｃｍ×０．７ｃｍ×１．２ｃｍ）から実施
例１と同様の方法で癌細胞および細胞塊を分離した。採
取癌細胞の生存率は３３．２％であった。

【００６９】該細胞および細胞塊を初期濃度１．１×１
０⁴ cells ／ｍＬで実施例１と同様の方法で１４日間、
Ｆ−１２７重合体ゲル中で培養した後、実施例１と同様
の方法で培養細胞を回収し培養後の細胞濃度および生存
率を測定したところ、それぞれ２．２×１０⁵ cells ／
ｍＬおよび８２．７％であり、細胞数は培養前の約２０
倍に増殖し、且つ生存率も著しく改善されていた。

【００７０】比較例３ コラーゲンゲルを比較例として用いた。実施例４で用い
たコラーゲンを４℃、ＰＨ３でＲＰＭＩ−１６４０培地
に０．２％の濃度で溶解し、コラーゲンの培地溶液を調
製した。

【００７１】実施例５で用いた胃癌細胞および細胞塊を
播種濃度１．１×１０⁴ cells ／ｍＬでＰＨ７に調整し
た上記コラーゲン溶液１ｍＬに混合分散し、実施例５で
用いたディッシュ中に分注し３７℃のインキュベーター
（５％炭酸ガス／９５％空気）中で１時間、静置するこ
とによってゲル化させた。

【００７２】次に該コラーゲンゲル上に１ｍＬのＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地を添加し、上記インキュベーター中で
１４日間培養した。ゲル上の培地は２〜３日毎に交換し
た。

【００７３】培養後の細胞数および生存率を測定するた
めに、上記ディッシュ中に０．２％コラゲナーゼ（和光
純薬製）／ハンクス液を添加し１０分間処理することに
より、コラーゲンゲルを分解して培養細胞をコラーゲン
ゲルから分離した。

【００７４】コラーゲンゲル中で１４日間培養した時の
培養細胞濃度および生存率は、それぞれ１．３×１０⁴
cells ／ｍＬおよび２０．５％であった。コラーゲンゲ
ル中では上記癌細胞の増殖は、ほとんど認められずまた
生存率も著しく低下した。

【００７５】実施例６ 乳癌患者（H.N.，女，７８才）から無菌的に採取した腫
瘍塊（０．５ｃｍ×０．７ｃｍ×０．８ｃｍ）から実施
例１と同様の方法で癌細胞および細胞塊を分離した。採
取癌細胞の生存率は５０％であった。

【００７６】上記癌細胞および細胞塊を播種濃度１×１
０⁵ cells ／ｍＬで実施例１と同様の方法で１４日間培
養した後、培養細胞濃度および生存率を実施例５と同様
の方法で測定したところ、それぞれ２．１×１０⁵ cell
s ／ｍＬおよび９３．８％であった。癌細胞および細胞
塊をＦ−１２７重合体ゲル中で培養することによって細
胞数は約２倍になり、生存率も著しく改善された。

【００７７】比較例４ 実施例６で用いた乳癌細胞および細胞塊を播種濃度１×
１０⁵ cells ／ｍＬで比較例３と同様の方法でコラーゲ
ンゲル中で１４日間培養したところ、培養細胞濃度およ
び生存率はそれぞれ８×１０⁴ cells ／ｍＬおよび３
３．４％であった。コラーゲンゲル中では細胞数の増殖
は認められず、かえって細胞数が減少したのみならず生
存率も著しく低下した。

【００７８】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、癌患者
から直接採取した初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊
の増殖および生存率が、従来の平面培養、コラーゲンゲ
ル培養法と比較して著しく改善されると同時に、該細胞
および／又は細胞塊のゲル内への包埋および該ゲルから
の培養細胞および／又は細胞塊の分離が生理的温度範囲
内の温度変化によって簡便に実施することができるた
め、初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊に全く損傷を
与えずに該細胞および／又は細胞塊の培養、継代、回収
が可能となる。

【００７９】本発明により得られた癌細胞および／又は
癌細胞塊の初代培養物を用いることにより、当該癌患者
の癌に最も有効な抗癌剤の種類、投与量、投与期間など
の化学療法の条件あるいは放射線、温熱などの物理療法
の条件設定をインビトロで行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において１５日間Ｆ−１２７重合体ゲ
ル中で培養した癌細胞コロニーの顕微鏡写真である（図
１（ａ））。図中のＡ示す周囲に囲まれた部分は採取直
後の癌細胞塊を示す（図１（ｂ））。

【図２】実施例１において２１日間Ｆ−１２７重合体ゲ
ル中で培養した癌細胞コロニーの顕微鏡写真である。

【図３】実施例２において３日間Ｆ−１２７重合体ゲル
中で培養した癌細胞コロニーの顕微鏡写真である（図３
（ａ））。図中のＢで示す周囲に囲まれた部分は採取直
後の癌細胞塊を示す（図３（ｂ））。

【図４】実施例２において４２日間Ｆ−１２７重合体ゲ
ル中で培養した癌細胞コロニーの顕微鏡写真である。

【図５】実施例３において１５日間Ｆ−１２７重合体ゲ
ル中で培養した癌細胞コロニーの顕微鏡写真である。

【図６】比較例１において、１５日間、平面培養した細
胞の顕微鏡写真である。

【符号の説明】

Ａ 採取直後の癌細胞塊 Ｂ 採取直後の癌細胞塊

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 5/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子内に疎水性部分と親水性部分とを有
   し、ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、
   且つ、該ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液
   体状態（ゾル状態）を示すことを特徴とする初代癌細胞
   および／又は初代癌細胞塊培養用の担体。
2. 【請求項２】 前記ゾル−ゲル転移温度が０℃より高く
   ６０℃以下である請求項１に記載の初代癌細胞および／
   又は初代癌細胞塊培養用の担体。
3. 【請求項３】 分子内に疎水性部分と親水性部分とを有
   し、ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、
   且つ、該ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液
   体状態（ゾル状態）を示す担体と、細胞培養用生理活性
   物質とからなることを特徴とする初代癌細胞および／又
   は初代癌細胞塊培養用の組成物。
4. 【請求項４】 分子内に疎水性部分と親水性部分とを有
   し、ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、
   且つ、該ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液
   体状態（ゾル状態）を示す担体を、該担体のゾル−ゲル
   転移温度より低い温度で所定の培地と混合し、 該混合物中に初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊を混
   入し、 前記ゾル−ゲル転移温度より高い温度で上記混合物をゲ
   ル状態として、上記初代癌細胞および／又は初代癌細胞
   塊の培養を行う初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の
   培養方法。
5. 【請求項５】 分子内に疎水性部分と親水性部分とを有
   し、ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物を含み、
   且つ該ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的に液体
   状態（ゾル状態）を示す担体を、該担体のゾル−ゲル転
   移温度より低い温度で所定の培地と混合し、 該混合物中に初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊と細
   胞培養用生理活性物質とを混入し、 前記ゾル−ゲル転移温度より高い温度で上記混合物をゲ
   ル状態として、上記初代癌細胞および／又は初代癌細胞
   塊の培養を行う初代癌細胞および／又は初代癌細胞塊の
   培養方法。
6. 【請求項６】 培養された初代癌細胞および／又は初代
   癌細胞塊を含む前記ゲルを、ゾル−ゲル転移温度より低
   い温度で液体状態（ゾル状態）とし、培養初代癌細胞お
   よび／又は培養初代癌細胞塊の回収および／又は継代を
   行う請求項４に記載の初代癌細胞および／又は初代癌細
   胞塊の培養方法。