WO2020209316A9 - 組織再生能が高い軟骨細胞培養物 - Google Patents

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サミュエル ジェイケー アブラハム
窪田　倭
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有限会社ジーエヌコーポレーション
株式会社Ｊｂｍ
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chondrocyte culture, a chondrocyte culture produced by the method, and a therapeutic method using the chondrocyte culture.
  • Osteoarthritis is characterized by progressive cartilage damage of joint tissue, caused by various factors including aging, joint damage and obesity, and causes loss of joint ability and hardening, especially in the elderly.
  • Articular cartilage tissue consists of thin hyaline cartilage present on the articular surface of the epiphysis.
  • Hyaline cartilage has a tissue structure in which the intercellular spaces of chondrocytes are filled with a chondrocyte extracellular matrix (ECM) that forms a higher-order structure by interaction with a hyaluronic acid-aglycan network and type II collagen fibers. Degradation of such ECM is greatly involved in the cartilage tissue damage process in OA.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM e.g., type II collagen fibers in ECM are destroyed, which causes the excretion of hyaluronic acid and aggrecan.
  • the released hyaluronic acid and aggrecan cause chondrocyte apoptosis and production of the inflammatory cytokine interleukin-1, which promotes the production and secretion of ECM-degrading enzymes such as MMP, ADAMTS and HYBID, and further cartilage.
  • ECM-degrading enzymes such as MMP, ADAMTS and HYBID
  • Treatments for such osteoarthritis include autologous chondrocyte implantation (ACI) using chondrocytes derived from healthy cartilage tissue collected from the unloaded portion of articular cartilage, and matrix-inducible.
  • Matrix-Induced Autologous Chondrocyte Implantation (MACI) has been performed.
  • Such transplantation is effective if there is healthy cartilage tissue around the transplant site, such as traumatic knee cartilage injury, but degenerative sites, such as osteoarthritis, in which the homeostasis of cartilage tissue is disrupted. Although temporary improvement was observed, the chondrocytes in the implant were immediately killed by apoptosis or fibrocartilage was formed, and a sufficient therapeutic effect was not obtained (Non-Patent Document 3). .
  • a treatment that normalizes the degenerated state of cartilage tissue and can be repaired and maintained for a long period of time is required.
  • the present invention relates to the following: [1] A method for producing a chondrocyte culture having high tissue regeneration ability, which comprises a step of culturing a cell population separated from cartilage tissue with a thermoreversible polymer. [2]
  • the tissue regeneration ability is the ability to express one or more genes selected from SOX9, COL2A1, miR140 and miR21 of chondrocyte culture, the ability to retain miRNA, the content of stem cells, or the ability to secrete hyaluronic acid. , [1].
  • the stem cell is a pluripotent stem cell or a somatic stem cell having a high differentiation potential.
  • the content of stem cells is the content of 1-2 fucose or ⁇ 2-6 sialic acid in a chondrocyte culture.
  • the cartilage tissue is derived from a subject with osteoarthritis over 50 years old.
  • the thermoreversible polymer is a thermoreversible polymer to which a growth factor other than serum is not added.
  • [8] A chondrocyte culture produced by the method according to [1] to [7].
  • [9] A method for treating a disease in a subject, comprising applying an effective amount of the chondrocyte culture according to [8] to the subject in need thereof.
  • the treatment method according to [9], wherein the disease is osteoarthritis.
  • a TGP-containing composition for repairing damaged cartilage tissue [2] The composition according to [1], wherein the damaged cartilage tissue is a cartilage tissue damaged by osteoarthritis. [3] The composition according to [1] or [2], wherein the repair is the normalization of the degenerated state of the damaged cartilage tissue. [4] One or more repairs selected from the group consisting of chondrocyte proliferation, hyaluronic secretion promotion or retention, miR140 secretion promotion, CD44-positive cell proliferation, and mesenchymal stem cell (MSCs) proliferation. The composition according to any one of [1] to [3], which is represented by the index of.
  • composition according to any one of [1] to [4], wherein the repair is performed in vitro or in vivo.
  • Composition [7] The composition according to any one of [1] to [6], wherein the chondrocyte or cartilage tissue is an autologous cell or autologous tissue.
  • a method for producing a chondrocyte culture and a cultured secretion which comprises a step of culturing cells derived from cartilage tissue of an elderly person in a TGP-containing composition.
  • [11] A method for proliferating or maintaining undifferentiated cells.
  • the method comprising culturing cells, including cells obtained from cartilage tissue, in a TGP-containing composition.
  • the method of [11], wherein the undifferentiated cells are proliferated or maintained in a chondrocyte culture.
  • the method according to any one of [11] to [13], wherein the undifferentiated cell is MSC.
  • the cartilage tissue is cartilage tissue damaged by osteoarthritis.
  • the cell is a human cell, and the human cell is one or more cells selected from the group consisting of human smooth muscle cells, human cartilage cells, human fibroblasts, human adipocytes, and human synovial cells. , The composition or method according to any one of [17] to [19].
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention is rich in ECM and therefore highly engraftable, and not only has sound cartilage function and tissue structure, but also cartilage tissue characterized by inflammation, decomposition of ECM, and the like. Can normalize the degenerative state of.
  • chondrocyte cultures are rich in stem cells that contribute to cartilage regeneration. Therefore, it has the effect of repairing and maintaining degenerated cartilage tissue such as osteoarthritis for a long period of time.
  • FIG. 1 shows histological images of samples obtained by planar culture (Comparative Example 1) and TGP culture (Example 1).
  • FIG. 2 shows an immunostained image of CD44 of a sample obtained by planar culture (Comparative Example 1) and TGP culture (Example 1).
  • FIG. 3 shows the change in the amount of ⁇ 2-6 sialic acid in response to SNA present on the cell membrane of the TGP culture sample.
  • FIG. 4 shows the change in the amount of ⁇ 2-6 sialic acid in response to SSA present on the cell membrane of the TGP culture sample.
  • FIG. 5 shows the change in the amount of ⁇ 2-6 sialic acid in response to TJA-1 present on the cell membrane of the TGP culture sample.
  • FIG. 6 shows the change in the amount of ⁇ 1-3 fucose in response to UEA-1 present on the cell membrane of the TGP culture sample.
  • the present invention is a method for producing a chondrocyte culture having high tissue regeneration ability, and includes a step of culturing a cell population separated from cartilage tissue with a thermoreversible polymer.
  • Cartilage tissue in the present disclosure refers to cartilage-derived tissue. Cartilage is not limited to articular cartilage, osteochondral plate, costal cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage, sacrococcygeal joint, jaw joint, thoracic chain joint, facet disc, shambone connection, articular meniscus, articular disc, external auditory canal. , Includes ear canal, parotid cartilage, laryngeal cartilage and the like.
  • Cartilage tissue can be derived from any organism. Human cartilage is preferred because there is less rejection when the bone tissue culture is transplanted into human damaged cartilage. It may be an autologous tissue or an allogeneic tissue, but the autologous tissue is preferable because there is little rejection when applied to the subject.
  • the cartilage tissue used in the present invention can form a chondrocyte culture having a tissue structure similar to that of a healthy cartilage tissue regardless of the state of the object from which the cartilage tissue is derived. Therefore, it may be cartilage tissue derived from a subject in any state, for example, articular cartilage collected from a subject having osteoarthritis.
  • the collection site of such articular cartilage may be a loaded portion or a non-loaded portion of the body weight, or may be a cartilage tissue collected from a loaded portion damaged by osteoarthritis.
  • the chondrocyte culture produced by the present invention does not cause abnormalities such as calcification even after long-term culture, it is produced by, for example, collecting from a grade 1 target and culturing until it progresses to grade 3 or later. It is also possible to transplant a chondrocyte culture into a subject. Therefore, the OA grade to be collected may be any of 1 to 4.
  • the age at which the cartilage tissue is collected is not particularly limited. Since the chondrocyte culture produced by the present invention has high regenerative ability, for example, even if it is 0 to 39 years old or 40 years old or older, it is 50 years old or older, 60 years old or older, 70 years old or older, 80 years old or older, 90 years old or older. It may be a cartilage tissue derived from the subject of.
  • the method for collecting cartilage tissue may be a usual method used when collecting biological tissue in the art, and can be collected from cartilage using a scalpel, tweezers, biopsy punch, or the like without limitation. ..
  • the "cell population separated from cartilage tissue” in the method of the present invention means a cell population composed of the same or different types of cells obtained by cartilage tissue separation treatment (for example, enzyme treatment, shredding treatment). ..
  • the cell population is not limited as long as it is a cell population contained in cartilage tissue, and includes cartilage cells, cartilage precursor cells, mesenchymal stem cells (MSCs), pluripotent stem cells, and the like.
  • cartilage tissue separation treatment a method usually used as a biological tissue separation treatment in the technical field, for example, an enzymatic method or a physical method can be used.
  • the enzymatic method is, but is not limited to, incubating the cells constituting the cartilage tissue at a viable temperature (for example, 37 ° C.) using one or more enzymes.
  • a viable temperature for example, 37 ° C.
  • an enzyme usually used in the art when separating cells from cartilage tissue can be used under treatment conditions of corresponding temperature, concentration and time.
  • the enzyme is not limited as long as the cartilage tissue can be separated, and dispase I or II, collagenase I or II, metalloprotease, trypsin, hyaluronidase, pepsin, aminopeptidase, lipase, amylase and the like can be used. From the viewpoint that cartilage tissue can be decomposed in a short time and with minimal invasiveness, preferably, even if any one of dispase I or II, collagenase, metalloprotease, actase or trypsin is used alone as an enzyme, two or more kinds are used. It may be used in combination.
  • trypsin When trypsin is used, it may be, but is not limited to, 0.05% to 2.5%, 0.1% to 1%, 0.15% to 0.3% in the form of trypsin-EDTA, which is low. From the viewpoint of separation by invasiveness, 0.2 to 0.25% is preferable.
  • the separation treatment time with trypsin-EDTA is not limited, and may be 1 minute to 2 hours, 3 minutes to 1 hour, 10 minutes to 40 minutes, and is preferably 30 minutes from the viewpoint of not damaging the stem cells.
  • collagenase II When collagenase II is used, it is not limited to 0.1 to 30 mg / ml, 0.5 to 10 mg / ml, 0.75 to 5 mg / ml, and 0.8 to 2 mg from the viewpoint of minimally invasive separation.
  • the separation treatment time is not limited as long as the living cells are not killed, and may be, for example, 1 to 24 hours, 3 to 20 hours, 7 to 18 hours, 10 to 16 hours, from the viewpoint of minimally invasive separation of stem cells. 12 to 16 hours is preferred.
  • each concentration and treatment time can be arbitrarily combined without limitation.
  • a combination of 12 to 16 hours is preferred.
  • the physical method includes, but is not limited to, a method of chopping or crushing cartilage tissue using a scalpel, ultrasonic waves, a homogenizer, a strainer, or the like.
  • the physical method can be optionally combined with the enzymatic method detailed above.
  • any known method such as a filter or a cell strainer may be used to separate the cells separated by the separation treatment from the tissue pieces or the matrix that cannot be completely separated. Fractionation results in a cell population with a uniform size or function.
  • thermoreversible polymer in the method of the present invention (also referred to as "TGP" in the present specification) is thermally reversibly formed a crosslinked structure or a network structure, and based on the structure, the inside thereof.
  • the hydrogel refers to a gel containing a crosslinked or network structure made of a polymer and water supported or retained in the structure.
  • the thermoreversible polymer can be any polymer as long as it is a thermoreversible polymer because an environment similar to that of cartilage tissue in a living body is formed by a crosslinked structure or a network structure peculiar to the thermoreversible polymer. Can also be used in the method of the present invention.
  • Measuring equipment (trade name): Stress-controlled leometer AR500, TA Instrument's sample solution (or separation solution) concentration (however, as the concentration of "hydrogel-forming polymer with sol-gel transition temperature") : 10 (weight)% Amount of sample solution: Approximately 0.8 g Measurement cell shape / dimensions: Acrylic parallel disk (diameter 4.0 cm), gap 600 ⁇ m Measurement frequency: 1Hz Applied stress: within the linear region
  • the sol-gel transition temperature is preferably higher than 0 ° C. and preferably 37 ° C. or lower, and further preferably higher than 5 ° C. and 35 ° C. or lower (particularly 10 ° C. or higher and 33 ° C. or lower). ..
  • a TGP having such a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from specific compounds as described later according to the above-mentioned screening method (sol-gel transition temperature measurement method).
  • the TGP of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits the thermoreversible sol-gel transition as described above (that is, has a sol-gel transition temperature).
  • a specific example of a polymer in which the aqueous solution has a sol-gel transition temperature and reversibly exhibits a sol state at a temperature lower than the transition temperature is represented by, for example, a block copolymer of polypropylene oxide and polyethylene oxide.
  • Polyalkylene oxide block copolymers; etherified cellulose such as methyl cellulose and hydroxypropyl cellulose; chitosan derivatives (KRHolme.et al. Macromolecules, 24,3828 (1991)) and the like are known.
  • the hydrogel-forming polymer using a hydrophobic bond for cross-linking which can be suitably used as the TGP of the present invention, is a cloud point from the viewpoint that the TGP and the medium do not separate and the surroundings of the cell population can be stably maintained. It is preferable that a plurality of blocks having the above and a hydrophilic block are combined.
  • the hydrophilic block is preferably present because the hydrogel becomes water soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the plurality of blocks having cloud points are such that the hydrogel has a sol-gel transition temperature. It is preferably present because it changes to a gel state at higher temperatures.
  • a block with a cloud point dissolves in water at a temperature lower than the cloud point and becomes insoluble in water at a temperature higher than the cloud point, so that the block is gelled at a temperature higher than the cloud point.
  • It serves as a cross-linking point consisting of hydrophobic bonds for formation. That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond corresponds to the sol-gel transition temperature of the hydrogel.
  • the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily have to coincide with each other. This is because the cloud point of the above-mentioned "block having a cloud point" is generally affected by the binding between the block and the hydrophilic block.
  • the hydrogel used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond not only becomes stronger as the temperature rises, but the change is reversible with respect to temperature.
  • TGP is a "cloud point". It is preferable to have a plurality of "blocks having".
  • the hydrophilic block in the TGP has a function of changing the TGP to water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and has a hydrophobic binding force at a temperature higher than the transition temperature. It has a function of forming a state of a hydrogel while preventing the hydrogel from coagulating and settling due to excessive increase in temperature.
  • the TGP used in the present invention is preferably one that is decomposed and absorbed in vivo from the viewpoint of using the chondrocyte culture of the present invention in cell therapy. That is, it is preferable that the TGP of the present invention is decomposed in a living body by a hydrolysis reaction or an enzymatic reaction to become a low molecular weight substance harmless to the living body, and is absorbed and excreted.
  • the TGP of the present invention is formed by combining a plurality of blocks having cloud points and hydrophilic blocks, at least one of the blocks having cloud points and the hydrophilic blocks, preferably both of them, is in vivo. It is preferable that it is decomposed and absorbed by.
  • the block having a cloud point is preferably a polymer block having a negative solubility in water-temperature coefficient, and more specifically, polypropylene oxide, a copolymer of propylene oxide and another alkylene oxide, A polymer selected from the group consisting of a poly N-substituted acrylamide derivative, a poly N-substituted metaacrylamide derivative, a copolymer of an N-substituted acrylamide derivative and an N-substituted metaacrylamide derivative, a polyvinyl methyl ether, and a polyvinyl alcohol partially vinegared product. Can be preferably used.
  • a poly N-substituted acrylamide derivative is preferable from the viewpoint of stably culturing the cell population or chondrocyte culture of the present invention.
  • a polypeptide composed of a hydrophobic amino acid and a hydrophilic amino acid In order to decompose and absorb a block having a cloud point in a living body, it is effective to make the block having a cloud point a polypeptide composed of a hydrophobic amino acid and a hydrophilic amino acid.
  • a polyester-type biodegradable polymer such as polylactic acid or polyglycolic acid can be used as a block having a cloud point that is decomposed and absorbed in the living body.
  • the cloud point of the above polymer is higher than 4 ° C. and 40 ° C. or less, which is a compound in which a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block are bonded.
  • the sol-gel transition temperature is higher than 0 ° C. and 37 ° C. or lower.
  • the cloud point is measured, for example, by cooling an aqueous solution of about 1% by mass of the above polymer (block having a cloud point) to obtain a transparent uniform solution, and then gradually raising the temperature (heating rate of about 1). It can be carried out by setting the point at which the solution becomes cloudy for the first time as a cloud point at ° C./min).
  • poly-substituted acrylamide derivative and the poly N-substituted meta acrylamide derivative that can be used in the present invention are listed below.
  • Poly-N-isopropylacrylamide is preferable from the viewpoint of stably culturing the cell population or chondrocyte culture of the present invention.
  • the above polymer may be a homopolymer or a copolymer of a monomer constituting the polymer and another monomer.
  • a hydrophilic monomer or a hydrophobic monomer can be used as the other monomer constituting such a copolymer.
  • copolymerization with a hydrophilic monomer raises the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, by selecting these monomers to be copolymerized, it is possible to obtain a polymer having a desired cloud point (for example, a cloud point higher than 4 ° C and 40 ° C or lower).
  • hydrophilic monomer examples include N-vinylpyrrolidone, vinylpyridine, acrylamide, metaacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, and acrylic having an acidic group. Acids, methacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid, etc., and N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, N, N-diethylaminoethyl methacrylate, N, N-dimethylaminopropyl having a basic group. Examples thereof include, but are not limited to, acrylamide and salts thereof.
  • hydrophobic monomer acrylate derivatives and methacrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate and glycidyl methacrylate, N-substituted alkyl metaacrylamide derivatives such as Nn-butyl metaacrylamide, vinyl chloride, acrylonitrile and styrene , Vinyl acetate and the like, but are not limited thereto.
  • hydrophilic block On the other hand, specific examples of the hydrophilic block to be bound to the above-mentioned block having a cloud point include methyl cellulose, dextran, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, poly N-vinylpyrrolidone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, and polymethacrylamide.
  • poly-N-isopropylacrylamide is used as a plurality of blocks having cloud points of a thermoreversible gel, an environment similar to the in vivo environment of cartilage tissue is formed to proliferate the cell population.
  • Polyethylene oxide is preferable as the hydrophilic block that binds to the acrylamide because of its high ability.
  • hydrophilic block is decomposed, metabolized and excreted in the living body, and a hydrophilic biopolymer such as a protein such as albumin and gelatin and a polysaccharide such as hyaluronic acid, heparin, chitin and chitosan is preferably used. ..
  • the method for binding the block having a cloud point and the above hydrophilic block is not particularly limited, but for example, a polymerizable functional group (for example, an acryloyl group) is introduced into any of the above blocks to give the other block. This can be done by copolymerizing the monomers. Further, the conjugate of the block having a cloud point and the above-mentioned hydrophilic block can also be obtained by block copolymerization of a monomer giving a block having a cloud point and a monomer giving a hydrophilic block. It is possible.
  • a polymerizable functional group for example, an acryloyl group
  • a functional group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.
  • a chemical reaction it can also be done by.
  • the bond between the polypropylene oxide having a cloud point and the hydrophilic block is, for example, anionic polymerization or cationic polymerization, in which the propylene oxide and the monomer (for example, ethylene oxide) constituting the "other hydrophilic block" are repeatedly and sequentially obtained.
  • anionic polymerization or cationic polymerization in which the propylene oxide and the monomer (for example, ethylene oxide) constituting the "other hydrophilic block" are repeatedly and sequentially obtained.
  • Such a block copolymer can also be obtained by introducing a polymerizable group (for example, an acryloyl group) at the end of polypropylene oxide and then copolymerizing the monomers constituting the hydrophilic block.
  • the polymer used in the present invention can also be obtained by introducing a functional group capable of binding reaction with a functional group (for example, a hydroxyl group) at the terminal of polypropylene oxide into a hydrophilic block and reacting both of them. ..
  • the TGP used in the present invention can also be obtained by connecting a material such as Pluronic (registered trademark) F-127 (trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) in which polyethylene glycol is bonded to both ends of polypropylene glycol. be able to.
  • Pluronic registered trademark
  • F-127 trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.
  • the above-mentioned "block having a cloud point” existing in the molecule is water-soluble together with the hydrophilic block at a temperature lower than the cloud point. It dissolves completely in water and shows a sol state.
  • the "block having a cloud point” existing in the molecule becomes hydrophobic and associates between separate molecules by hydrophobic interaction. do.
  • the polymer of the present invention is a hydrophobic association between blocks having a cloud point in water.
  • a hydrogel having a three-dimensional network structure with the above as a cross-linking point is produced.
  • the temperature of this hydrogel is cooled again to a temperature lower than the cloud point of the "block having a cloud point" existing in the molecule, the block having the cloud point becomes water-soluble, and the cross-linking point due to the hydrophobic association is released.
  • the hydrogel structure disappears and the TGP of the present invention becomes a complete aqueous solution again.
  • the sol-gel transition of the polymer of the present invention in a preferred embodiment is based on a reversible change in hydrophilicity and hydrophobicity at the cloud point of the block having a cloud point existing in the molecule. Therefore, it has complete reversibility in response to temperature changes. According to the studies by the present inventors, it is considered that the delicate hydrophilic-hydrophobic balance of TGP in water contributes to the stability of cells when they are stored at low temperature in water.
  • the hydrogel-forming polymer of the present invention containing at least a polymer having a sol-gel transition temperature in an aqueous solution is substantially water-insoluble at a temperature (d ° C.) higher than the sol-gel transition temperature. Is reversibly water-soluble at a temperature (e ° C.) lower than the sol-gel transition temperature.
  • the above-mentioned high temperature (d ° C.) is preferably 1 ° C. or higher than the sol-gel transition temperature, and more preferably 2 ° C. or higher (particularly 5 ° C. or higher).
  • the above-mentioned "substantially water-insoluble" means that the amount of the above-mentioned polymer dissolved in 100 ml (liter) of water at the above-mentioned temperature (d ° C.) is 5.0 g or less (further, 0.5 g or less, particularly 0). .1 g or less) is preferable.
  • the above-mentioned low temperature (e ° C.) is preferably 1 ° C. or higher (absolute value) lower than the sol-gel transition temperature, and further preferably 2 ° C. or higher (particularly 5 ° C. or higher) lower. preferable.
  • water-soluble means that the amount of the polymer dissolved in 100 ml (liter) of water at the temperature (e ° C.) is preferably 0.5 g or more (further 1.0 g or more). ..
  • reversibly water-soluble means that even after the above-mentioned TGP aqueous solution is once gelled (at a temperature higher than the sol-gel transition temperature), at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, It means to show the above-mentioned water solubility.
  • the 10% aqueous solution of the polymer exhibits a viscosity of 10 to 3,000 cmpoise (further, 50 to 1,000 cmpoise) at 5 ° C.
  • Viscosity is preferably measured under the following measurement conditions, for example.
  • Viscometer Stress-controlled rheometer (model name: AR500, manufactured by TA Instruments) Rotor diameter: 60 mm Rotor shape: Parallel flat plate
  • the aqueous solution of TGP of the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature and then immersed in a large amount of water, the gel is substantially insoluble.
  • the above-mentioned characteristics of the hydrogel formed by the above-mentioned TGP can be confirmed, for example, as follows. That is, 0.15 g of TGP is dissolved in 1.35 g of distilled water at a temperature lower than the sol-gel transition temperature (for example, under ice cooling) to prepare a 10 wt% aqueous solution, and the aqueous solution is used as a plastic petri dish having a diameter of 35 mm.
  • a gel having a thickness of about 1.5 mm is formed in the petri dish by injecting into the petri dish and heating to 37 ° C., and then the weight (fgram) of the entire petri dish containing the gel is measured. Then, the entire petri dish containing the gel was allowed to stand in water in 250 ml (liter) at 37 ° C. for 10 hours, and then the weight (ggram) of the entire petri dish containing the gel was measured to measure the gel from the gel surface. Evaluate the presence or absence of dissolution.
  • the weight loss rate of the gel that is, (fg) / f is preferably 5.0% or less, and further 1.0%. It is preferably less than or equal to (particularly 0.1% or less).
  • the aqueous solution of TGP of the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then immersed in a large amount of water (about 0.1 to 100 times the gel in terms of volume) for a long period of time.
  • the gel does not dissolve over time.
  • Such properties of the polymer used in the present invention are achieved, for example, by the presence of two or more (plurality) blocks having cloud points in the polymer.
  • Pluronic registered trademark
  • F-127 registered trademark
  • the concentration with respect to water that is, ⁇ (polymer) / (polymer + water) x 100 (%), is 20% or less (further, 15% or less).
  • TGP capable of gelation at a concentration of 10% or less).
  • the molecular weight of the TGP used in the present invention is preferably 30,000 or more and 30 million or less, more preferably 100,000 or more and 10 million or less, and further preferably 500,000 or more and 5 million or less.
  • the step of culturing the cell population with the thermoreversible polymer may be performed by mixing the cell population separated from the cartilage tissue with the thermoreversible polymer by a known method and culturing.
  • the cell population separated from the cartilage tissue is dispersed in a TGP solution at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, the TGP is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then a culture solution or the like is used.
  • a method of adding a medium and culturing can be used. By adding a medium to the gelled TGP, it is possible to provide a stable nutritional supply to the cell population in the gel by periodically exchanging only such a medium.
  • the culture in the present invention can be carried out under the conditions usually used in the art.
  • typical culture conditions include culturing at 37 ° C. and 5% CO2.
  • the culture can be carried out at normal atmospheric pressure (atmospheric pressure).
  • the culture period is not particularly limited because abnormal chondrocyte cultures such as calcification do not occur even if the cell population is cultured for a long period of time.
  • Culturing can be performed in a container of any size and shape.
  • the medium for dissolving TGP and the medium for adding to gelled TGP (sometimes referred to as "liquid medium” in the present specification) are not particularly limited as long as they can maintain cell survival, but are typically limited. , Amino acids, vitamins, and electrolytes as the main components can be used.
  • the medium for dissolving TGP and the medium for adding to gelled TGP may be common or different.
  • the medium for dissolving TGP and the medium for adding to gelled TGP are based on the basal medium for cell culture.
  • basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, CnT. -PR etc. are included.
  • Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used as it has a standard composition (for example, as it is on the market), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. Therefore, the basal medium used in the present invention is not limited to those having a known composition, and includes those in which one or more components are added, removed, increased or decreased.
  • the medium may contain one or more additives such as serum, growth factors (for example, FGF-2, TGF-b1, etc.), steroid agent components, selenium components, and the like.
  • the serum may be a heterologous serum or an allogeneic serum. Allogeneic sera are preferred, and autologous sera are even more preferred among allogeneic sera.
  • the medium does not contain growth factors other than the growth factors contained in the autologous serum. When culturing using TGP lysed by such a medium, the cell population will be cultivated in TGP to which growth factors other than autologous serum have not been added.
  • the concentration of serum is not particularly limited, and 3%, 5%, 10%, and 20% may be contained in the medium added to TGP. It is preferably 10%.
  • the medium for dissolving TGP and the medium for adding to gelled TGP may consist of common components.
  • the "chondrocyte culture” produced by the method of the present invention refers to a cell population containing chondrocytes obtained by culturing a cell population separated from cartilage tissue.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention may have a cartilage tissue-like tissue structure in which the cell gaps of the cell population are filled by ECM.
  • the cartilage cell culture obtained by the method of the present invention is more than a cartilage cell culture (referred to herein as "control culture”) cultured by a method that does not include the step of culturing a cell population with a thermoreversible polymer.
  • High tissue regeneration ability means the tissue regeneration ability of cartilage tissue to which a cell population is applied.
  • the tissue regeneration ability is applied to a cartilage cell culture of interest (implantation), and after a lapse of a predetermined time, the state of the tissue at the application site (transplant destination), for example, the size of the tissue, the fineness of the tissue. It can be quantified by observing the structure, the ratio of damaged tissue to normal tissue, the function of tissue, etc. and scoring these.
  • the tissue regeneration ability may be the expression ability of one or more genes selected from SOX9, COL2A1, miR140 and miR21.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention has higher expression of one or more genes selected from SOX9, COL2A1, miR140 and miR21 than the control culture. Therefore, the present invention may be a method for enhancing the expression ability of one or more genes selected from SOX9, COL2A1, miR140 and miR21 of a cell population isolated from cartilage tissue.
  • SOX9 or COL2A1 is known as a gene expressed during normal cartilage tissue formation.
  • miR140-3p or -5p or miR21-5p derived from miR140 or miR21 is a degenerated state of cartilage tissue characterized by inflammation in cartilage tissue generated in osteoarthritis, decomposition of ECM, and the like. Effective for normalization (Karlsen et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Oct 11; 5 (10), Miyaki et al., Arthritis Rheum. 2009 Sep; 60 (9): 2723-30, Si et al. , Osteoarthritis Cartilage. 2017 Oct; 25 (10): 1698-1707, Miyaki et al., Genes Dev. 2010 Jun 1; 24 (11): 1173-85, Hai et al ,. J Orthop Surg Res. 2019; 14 : See 118 etc.).
  • miR140 in cartilage tissue results in increased miR140-3p or 5p in cartilage tissue, resulting in, but not limited to, expression or secretion of ECM-degrading enzymes such as MMP-13 and ADAMTS-5.
  • ECM-degrading enzymes such as MMP-13 and ADAMTS-5.
  • IL1B IL1B
  • IL6 IL6
  • IL8 proteins involved in ECM synthesis
  • SOX9 proteins involved in ECM synthesis
  • ACAN chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyl transferase 1
  • the chondrocyte culture of the present invention when the chondrocyte culture of the present invention is applied to the cartilage tissue of a subject, particularly a subject having osteoarthritis, not only can the normal cartilage tissue be complemented at the application site, but also the cartilage tissue around the application site can be applied. Since the degenerative state can be normalized, the therapeutic effect can be maintained for a long period of time.
  • miR21-5p is increased in cartilage tissue, and as a result, the expression or secretion of ECM-degrading enzymes such as MMP-13 and ADAMTS-5 is decreased, and ECM such as COL2A1 is not limited. It normalizes the degenerative state of cartilage tissue through increased expression of proteins involved in synthesis. Therefore, the therapeutic effect can be maintained for a long period of time like miR140.
  • high gene expression is not limited to 101% or more, 105% or more, 110% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% or more, based on the control culture. 170% or more, 180% or more, 190% or more or 200% or more, which means that the expression level of a predetermined gene is high.
  • Techniques for measuring gene expression levels are well known in the art, and methods for measuring protein expression levels are not limited, for example, Western using the monoclonal or polyclonal antibodies detailed above. Blotting, EIA, ELISA, RIA, immunoorganization, immunocytochemistry, flow cytometer, mass assay, etc. are not limited as methods for measuring gene expression levels, for example, Northern blotting. Methods, Southern blotting method, DNA microarray analysis, RNase protection assay, RTPCR, PCR method such as real-time PCR (qPCR), in situ hybridization method and the like can be mentioned respectively.
  • qPCR real-time PCR
  • SOX9 (also referred to as CMD1, CMPD1, SRA1, SRXX2, SRXY10) is a gene that coordinates SRY-box transcription factor 9, and the gene sequence of human SOX9 is registered as accession number NM_000346 or the like. The sequence is as shown in SEQ ID NO: 1.
  • COL2A1 (also referred to as ANFH, AOM, COL11A3, SEDC, STL1) is a gene that links collagen type II alpha 1 chain, and the gene sequence of human COL2A1 is registered as accession number NM_001844.5, etc. The sequence is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • microRNA is transcribed as an RNA precursor having a hairpin-like structure, cleaved by a dsRNA cleaving enzyme having RNase III cleaving activity, incorporated into a protein complex called RISC, and suppresses translation of mRNA. 10-25 bases of RNA involved in are intended to be used.
  • the “miRNA” also includes “miRNA” and precursors of the “miRNA” (pre-miRNA, tri-miRNA) and miRNAs having biological functions equivalent to those encoded by these, such as homologues (ie, homologues). , Homolog), variants such as gene polymorphisms, and "miRNAs" encoding derivatives.
  • RNA encoding such a precursor, homologue, mutant or derivative
  • miRBase http://www.mirbase.org/
  • miRBase http://www.mirbase.org/
  • Examples thereof include “miRNA” having a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of.
  • human mir-140 is miRbase ID: Stem-loop sequence hsa-mir-140, miRbase accession number. It is registered as MI0000456 and is as shown in SEQ ID NO: 3.
  • human miR140-3p is miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-3p, miRbase accession number. It is registered as MIMAT0004597 and is as shown in the RNA sequence "uaccacaggguagaaccacgg" shown in SEQ ID NO: 4.
  • human miR140-5p is miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-5p, miRbase accession number. It is registered as MIMAT0000431 and is as shown in the RNA distribution "cagugguuuuacccuaugguag" shown in SEQ ID NO: 5.
  • human mir-21 is referred to as miRbase ID: Stem-loop sequence hsa-mir-21, miRbase accession number. It is registered as MI0000077 and is as shown in SEQ ID NO: 6.
  • human miR21-3p is miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-3p, miRbase accession number. It is registered as MIMAT0004494 and is as shown in the RNA sequence "caacaccagucgaugggcugu" shown in SEQ ID NO: 7.
  • human miR21-5p is miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-5p, miRbase accession number. It is registered as MIMAT0000076 and is as shown in the RNA sequence "uagcuuaucagacugauguuga" shown in SEQ ID NO: 8.
  • the tissue regeneration ability is the ability of the chondrocyte culture to retain miRNA.
  • the retention capacity is the ability of the chondrocyte culture to retain miRNA in the chondrocyte culture.
  • the ability to retain miRNA in a chondrocyte culture may be the ability to retain miRNA in a chondrocyte culture without secreting it during culture.
  • the miRNA is not limited to miR140, miR21, miR-125b, Has-miR-15a, miR-30a, miR-199a, miR-210, miR-221-3p, miR-92a-3p, miR-142. -3p, miR-27a, miR-27b, miR26a-5p, miR-26a, miR-26b, miR-373, miR-127-5p, miR-320, miR-9, miR-634, miR-221-3p , MiR-370miR-145, miR-130A, miR-145, miR-562-5p and other miRNAs capable of normalizing the degenerative state of cartilage tissue (Zhang.et al. J Arthritis.
  • miR140 including miR140-3p and -5p
  • miR21 including miR21-3p and -5p
  • miR140 miR140-3p and-
  • the high retention capacity of miRNA is defined as 101% or more, 105% or more, 110% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% based on the control culture at the time of culturing. As mentioned above, it means that miRNA is present in the chondrocyte culture at the time of culturing at a high concentration of 170% or more, 180% or more, 190% or more, or 200% or more. In one aspect, high miRNA retention capacity is defined as 99% or less, 95% or less, 97%% or less, 95% or less, without limitation, based on the medium (liquid medium) of the control culture at the time of culturing.
  • the high retention capacity of miRNA means that miRNA is present in a high concentration in the chondrocyte culture during culture with reference to the control culture during culture, and the liquid medium of the control culture is used as a reference. As a result, it means that miRNA is present at a low concentration in the medium of the cartilage cell culture at the time of culturing.
  • the tissue regeneration ability may be the content of stem cells in the chondrocyte culture.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention has a higher stem cell content than the control culture. Therefore, the present invention may be a method for maintaining and proliferating stem cells in a cell population isolated from cartilage tissue.
  • the content of stem cells is not limited to, but may be the amount or proportion of stem cells in the cell culture.
  • the stem cells are not limited as long as they have the ability to differentiate into cartilage cells, such as somatic stem cells such as chondrogenic progenitor cells and mesenchymal stem cells, or pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, and ntES cells. Is included.
  • the content of stem cells can be measured by a method for measuring stem cells known in the art, and is not limited to reacting with lectins such as UEA-1 present on the cell membrane of cells contained in cartilage cell cultures. Measuring the amount of ⁇ 1-2 sialic acid that reacts with ⁇ 1-2 fucose or lectins such as SNA, SSA, TJA-I, or changes in the amount of ⁇ 1-2 fucolic acid or ⁇ 2-6 sialic acid. It can be quantified by measuring other cell surface markers or gene expression that correlate with.
  • “Differentiation potential” means that when a certain cell is placed in an appropriate differentiation-inducing state, it has the ability to change into another type of cell such as a progenitor cell or a somatic cell.
  • somatic stem cells In general, long-term culture of somatic stem cells tends to reduce their differentiation potential as well as their proliferative capacity. Since somatic stem cells with reduced differentiation potential have somatic stem cell markers on the cell surface but cannot be transformed into other types of cells such as progenitor cells and somatic cells, such somatic stem cells have the ability to regenerate tissues. do not have.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention has a high content of somatic stem cells having a high differentiation potential.
  • the content of somatic stem cells having a high differentiation potential may be, but is not limited to, the amount or proportion of somatic stem cells having a high differentiation potential in the cell culture per unit amount.
  • the invention may be a method of maintaining or increasing the differentiation potential of somatic stem cells in a cell population isolated from cartilage tissue.
  • the present invention may be a method of maintaining or proliferating somatic stem cells having a high differentiation potential in a cell population separated from cartilage tissue.
  • the somatic stem cell is not limited as long as it is a somatic stem cell capable of differentiating into a chondrocyte, and may be a chondrocyte progenitor cell, a mesenchymal stem cell, or the like.
  • the cartilage cells differentiated from the cells having a high differentiation potential can be constantly supplied to the application site. , Can repair and maintain normal cartilage tissue for a long period of time.
  • the stem cell or somatic stem cell with high differentiation potential is a mesenchymal stem cell, it has the ability to normalize damaged cartilage tissue, such as for protecting chondrocyte apoptosis, for anti-inflammatory of cartilage tissue, and for anti-fibrosis. Since the ability to recover from damage is high, the therapeutic effect can be maintained for a long period of time.
  • the amount of ⁇ 1-2 fucose that reacts with lectins such as UEA-1 present in the cell membrane of cells contained in cartilage cell culture, or ⁇ 2-6 sialic acid that reacts with lectins such as SNA, SSA, and TJA-I Without limitation, flow cytometry, western blots, immunostaining, or antibody overlay lectin microarrays using the lectin or an antibody that specifically reacts with the ⁇ 1-2 fucose or ⁇ 2-6 sialic acid with which the lectin reacts, etc. Can be measured using.
  • the method for measuring other cell surface markers or gene expression that correlates with the change in the amount of ⁇ 1-2 fucolic acid or ⁇ 2-6 sialic acid is the conventional method for measuring cell surface markers or gene expression in the art. Can be used.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention contains more stem cells or somatic stem cells having a higher differentiation potential than the control culture.
  • the term "rich in stem cells or somatic stem cells with high differentiation potential” is not limited to 101% or more, 105% or more, 110% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more based on the control culture. , 160% or more, 170% or more, 180% or more, 190% or more or 200% or more, the content of cells having ⁇ 1-2 fucolic acid or ⁇ 2-6 sialic acid, or cell surface marker or gene expression that correlates with these. Means that is high.
  • the tissue regeneration ability may be the ability to secrete hyaluronic acid from a chondrocyte culture.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention has a higher ability to secrete hyaluronic acid than the control culture. Therefore, the present invention may be a method for enhancing the secretory capacity in a cell population separated from cartilage tissue.
  • Hyaluronic acid is known to act suppressively on the expression of ECM-degrading enzymes, alleviate the matrix and anti-inflammatory factors released from cartilage, and regulate the expression of inflammation-related factors (Ohtsuki.et). al.J Orthoped Res. 2018 Aug 17. doi: 10.1002 / jor.24126).
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention when applied to the target cartilage tissue, not only can the normal cartilage tissue be complemented at the application site, but also ECM decomposition or inflammation around the application site is suppressed. Therefore, the degenerated state of the cartilage tissue around the application site can be normalized, and the normal cartilage tissue can be repaired and maintained for a long period of time.
  • hyaluronic acid in a medium (liquid medium) or TGP may be quantified over time.
  • Hyaluronic acid can be quantified by mass spectrometry, liquid chromatography, MALDI-TOF, etc., as well as commercially available kits, without limitation.
  • High hyaluronic acid secretory capacity is not limited to 101% or more, 105% or more, 110% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% or more, based on the control culture. It means that the secretory capacity of hyaluronic acid is high at 170% or more, 180% or more, 190% or more or 200% or more.
  • the chondrocyte culture produced by the method of the present invention is rich in ECM and therefore easily engrafts at the injured site. Therefore, the chondrocyte culture produced by the method of the present invention can be used for transplantation.
  • the expression levels of miR140 and miR21 are high, the amount of stem cells is high, and the amount of hyaluronic acid secreted is high, it is preferably used for the treatment of grade 2 or higher or elderly osteoarthritis.
  • the present invention further comprises chondrocyte cultures produced by the methods of the present invention.
  • the chondrocyte culture of the present invention is as described above.
  • the present invention includes methods of treating a disease in a subject, comprising applying an effective amount of the chondrocyte culture of the present invention to a subject in need thereof.
  • the disease is not limited to cartilage-related diseases, but is due to osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteosarcoma, femoral head necrosis, acetabular dysplasia, meniscus tear, traumatic arthritis, sports, accidents, etc. Includes physical cartilage loss or damage.
  • the method of application (administration) to the subject may be transplantation of a chondrocyte culture.
  • the transplantation of the chondrocyte culture is not limited to, but the cartilage cell culture is delivered to the affected area by injection into the cartilage tissue, or arthroscopic surgery and incision, and any tissue adhesive such as fibring gel is applied. It can be fixed to the affected area by use or by anastomosis.
  • various additional ingredients such as a pharmaceutically acceptable carrier, an ingredient that enhances engraftment, and a further active ingredient can be contained and applied. Any known additional ingredient can be used as such additional ingredient, and those skilled in the art are familiar with these additional ingredients.
  • the present invention will be described in more detail below with reference to specific aspects of the present invention, but the present invention is not limited to these specific examples.
  • the storage elastic modulus of this aqueous solution was measured at an application frequency of 1 Hz using a stress-controlled rheometer (AR500, manufactured by TA Instruments), and found to be 43 Pa at 10 ° C, 680 Pa at 25 ° C, and 1310 Pa at 37 ° C. This temperature-dependent change in storage modulus was reversibly observed repeatedly.
  • AR500 stress-controlled rheometer
  • ⁇ Separation of cartilage tissue Each piece of tissue was cut into small pieces of 1 mm 2 or less with a scalpel. The slices were treated with Trypsin-EDTA solution (0.25%) at 37 C ° for 30 minutes and then with collagenase II solution (1 mg / ml) at 37 C ° for 12-16 hours. After washing with DMEM solution, the mixture was filtered through a filter (100 ⁇ m) and centrifuged (1800 rpm, 10 minutes). The cell population thus obtained was counted on the cell calculation board. The number of cells was 1 ⁇ 10 4 to 4 ⁇ 10 4 cells / ml.
  • Example 1 ⁇ Culture with TGP gel> 1 g of TGP prepared in Production Example 1 was dissolved in 9 mL of DMEM at 4 ° C. to prepare a 10% TGP solution, and then cells derived from cartilage tissue were dispersed and dispensed into a 6-well plate. After leaving at room temperature to gel, add antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) to DMEM solution containing 10% autologous serum.
  • antibiotics gentamicin (50 ⁇ g / ml)
  • amphotericin (0.25 ⁇ g / ml
  • penicillin 100 Units / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • Example 1 chondrocyte cultures having a size of 200 to 300 ⁇ m were confirmed on the 3rd to 5th days after the start of the culture, and after 21 days, they grew to a size of 0.5 to 1.0 mm in diameter, all of which. Growth was maintained in the sample for a 20-week culture period. In Example 1, no proliferation of fibroblast-like cells was observed.
  • RNAlater registered trademark
  • Stabilization Solution Invitrogen, CatNo.AM7020
  • Small RNA RNA of 200 bases or less
  • NucleoSpin® miRNA kit TeKaRa, U0971
  • primers of SEQ ID NOs: 9 to 12 and mRQ3'Primer U6Forward U6, miR-21 by Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Lite (TP700, TaKaRa) using Primer and U6 Reverse Primer (Mir-X TM miRNA qRT-PCR TB Green Kit (TaKaRa, Z8314N))
  • QPCR of 3p, miR-21-5p, miR-140-3p and miR-140-5p was performed. Quantitative values of each miRNA were normalized with the expression level of U6 as 1.
  • QPCR of GAPDH, SOX9 and COL2A1 was performed by Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Lite. The quantitative value of each gene was normalized with the expression level of GAPDH set to 1.
  • the primers used are shown in Table 2, and the results are shown in Tables 3-5.
  • the expression level of miR-21 and miR-140 was increased in Example 1 cultured in the TGP gel as compared with the sample of Comparative Example 1, and miR21-5p, It was found that miR-140-3p and miR-140-5p were significantly increased.
  • the expression level of SOX9 was significantly increased in the sample of Example 1 as compared with the sample of Comparative Example 1. It was also found that the expression level of 1068, in which COL2A1 was measured, was increased in Example 1 as compared with the sample of Comparative Example 1.
  • the chondrocyte culture produced in Example 1 has a healthy function. It turned out to be cartilage tissue.
  • miR-140 and miR21 are known to improve the microenvironment of osteoarthritis, so the chondrocyte culture produced in Example 1 only promotes the regeneration of the cartilage tissue in the transplanted portion. Instead, it can improve the degenerative conditions around the transplant.
  • RNA of 200 bases or less was purified from some of these samples using the NucleoSpin® miRNA kit (TaKaRa, U0971), and the primers of SEQ ID NO: 3 and mRQ 3'Primer (Mir-X (Mir-X) Using miRNA qRT-PCR TB Green (registered trademark) Kit (TaKaRa, Z8314N)), qPCR of miR-140-3p was performed by Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System Lite (TP700, TaKaRa). The results are shown in Table 6.
  • the average Ct value is the number of cycles until the predetermined Threshold is reached, and the lower the average Ct value, the more miR-140-3p is present in the liquid medium.
  • SNP is collected, centrifuged and filtered, and then stored, and "SNF” is stored without such treatment.
  • a cell membrane protein was extracted from the thawed sample, and the protein concentration was measured by the BCA method (TaKaRa BCA Protein Assay Kit). Based on the measured protein concentration, PBSTx was added to dilute the protein concentration to 10 ⁇ g / mL.
  • a 100 ⁇ L sample (concentration of 10 ⁇ g / mL) was added to a tube containing 100 ⁇ g of Cy3 Mono-reactive Dye Pack (GE healthcare, catalog number: PA23011), mixed with a pipette, and spun down. The tubes were placed in a light-shielding bag and incubated at room temperature (25 ° C.) for 1 hour.
  • the fluorescence pattern of LecChip TM was measured 4 times cumulatively by GlycoLite2200 (TM, Glyco technica), the exposure time, 1996, 2995, 3991, 4992, 6988, 9998 (milliseconds), and the camera gain was measured at a fixed value.
  • the obtained 45-lectin signal was measured by GlycoStaion® ToolsPro Suite 1.5 (GlycoStaion® ToolsPro Suite 1.5.), And A. Kuno et al., J. of Proteomics & Bioinformatics, Vol.1, May 2008. , P.68., Divided by the average intensity of 45 lectins, multiplied by 100 and average normalized. Table 8 and FIGS.
  • 3 to 6 show the results of signal intensities for SNA, SSA, TJA-I, and UEA-1 on the cell surface of the cells constituting the chondrocyte culture obtained by the above method.
  • the numbers 14 to 126 at the top of the table indicate the number of days of culture of the collected sample.
  • ⁇ 2-6 sialic acid-binding lectins such as SNA, SSA and TJA-I and ⁇ 1-2 fucose-binding lectins such as UEA-1 were cultured for the number of days. It can be seen that it increases according to.
  • ⁇ 2-6 sialic acid which reacts with SNA, SSA and TJA-I, is a marker for somatic stem cells such as mesenchymal stem cells (MSCs) or cartilage progenitor cells with high differentiation potential (WO2016 / 006712A1) and UEA-1.
  • ⁇ 1-2 fucose-binding lectins such as ⁇ 1-2 fucose-binding lectin are known to be markers of pluripotent stem cells (Wang et al., Cell Res. 2011 Nov; 21 (11): 1551-63. Doi: 10.1038 / cr. .2011.148. Epub2011 Sep 6.).
  • ⁇ 2-6 sialic acid and ⁇ 1-2 fucose in response to SNA, SSA, TJA-I and UEA-1 increased with the number of culture days. It was found that the tissue culture contained a large amount of somatic stem cells and pluripotent stem cells having high differentiation potential. Therefore, it was clarified that the chondrocyte culture of Example 1 is a tissue culture having high tissue regeneration ability.
  • Hyaluronic acid retention test of TGP gel [Example 2] Hyaluronic acid (Teijin Pharma Co., Ltd. 5 mg to DMEM with antibiotics (gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin (0.25 ⁇ g / ml), penicillin (100 Units / ml) / streptomycin (100 ⁇ g / ml) and L-Ascorbic acid It was dissolved in 2.5 ml of a solution containing (5 mg / ml) to give liquid compositions 1 and 2. 1 g of TGP prepared in Production Example 1 was dissolved in 9 ml of DMEM at ° C.
  • TGP solution hyaluronic acid was added thereto so as to have the same hyaluronic acid concentration as liquid compositions 1 and 2, and hyaluronic acid in the TGP solution was added. Shake to homogenize the acid.
  • the TGP solution was gelled at 37 ° C., and then 1.0 ml of liquid medium (DMEM) was added to make TGP composition 1 and TGP composition 2.
  • DMEM liquid medium
  • the prepared hyaluronic acid-containing liquid composition and TGP composition were placed in a 5% carbon dioxide gas incubator at 37 ° C., and the hyaluronic acid concentration contained in each liquid medium portion was measured by the same method as ⁇ Measurement of hyaluronic acid> described above. .. The results are shown in Table 9.
  • hyaluronic acid was present at about 13000 ng / ml on the 7th day, but decreased to 5.6 ng / ml on the 21st day.
  • TGP compositions 1 and 2 it was 6.1 and 11.4 ng / ml at the 7th day, which corresponds to a low concentration of about 1/1000 with respect to liquid compositions 1 and 2.
  • concentrations were 10.3 and 11.5 ng / ml in the 21st order, and their concentrations hardly changed. Therefore, it is clear that the TGP gel has the ability to stably retain hyaluronic acid for a long period of time without being decomposed. It became.

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Abstract

組織再生能が高い軟骨細胞培養物を提供することを目的とする。軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む方法により解決された。

Description

組織再生能が高い軟骨細胞培養物
　本発明は、軟骨細胞培養物を製造する方法、当該方法によって製造された軟骨細胞培養物、軟骨細胞培養物を使用した治療方法に関する。
　変形性関節症は、関節組織の進行性の軟骨損傷を特徴とし、加齢、関節損傷、肥満を含む様々な因子により引き起こされ、特に高齢者における関節能力の喪失や硬化の原因となる。
　関節軟骨組織は、骨端の関節面に存在する薄い硝子軟骨からなる。硝子軟骨は、ヒアルロン酸-アグリカンネットワークおよびＩＩ型コラーゲン線維等との相互作用により高次構造を形成した軟骨細胞外マトリックス（ＥＣＭ）により軟骨細胞の細胞間隙が充填された組織構造を持つ。ＯＡにおける軟骨組織の損傷過程には、かかるＥＣＭの分解が大きく関与する。
　軟骨組織が損傷するとＥＣＭ中のＩＩ型コラーゲン線維が破壊され、これによりヒアルロン酸やアグリカンの遊出を引き起こす。遊出したヒアルロン酸やアグリカンは、軟骨細胞のアポトーシスや、炎症性サイトカインであるインターロイキン－１の産生を引き起こし、これによりＭＭＰ、ＡＤＡＭＴＳおよびＨＹＢＩＤといったＥＣＭ分解酵素の産生および分泌が促され、さらに軟骨組織中のＥＣＭの分解が加速する。
　このようにＥＣＭが分解された軟骨組織の弾性は、著しく低下し脆くなるため軽い負荷でも容易に損傷するという悪循環をきたす。また関節組織は、通常の組織と異なり、血液供給がなく拡散によって軟骨組織内外と物質交換をしており、細胞の流入もないことから、変形性関節症のように組織の恒常性が一旦破壊されると、その変性状態が維持されるため修復困難となる（非特許文献１、２）。
　このような変形性関節症の治療として、関節軟骨の非荷重部から採取された健全な軟骨組織に由来する軟骨細胞を利用した自家培養軟骨細胞移植(Autologous Chondrocyte Implantation;ＡＣＩ)や、マトリックス誘導性自家培養軟骨細胞移植(Matrix-Induced Autologous Chondrocyte Implantation;ＭＡＣＩ)が行なわれてきた。かかる移植は、外傷性膝軟骨損傷のように移植部位の周囲に健全な軟骨組織が存在していれば有効であるが、変形性関節症のように軟骨組織の恒常性が破壊された変性部位に施しても、一時的な改善は見られるものの、すぐに移植片中の軟骨細胞がアポトーシスによって死滅したり、繊維軟骨が形成され、十分な治療効果は得られていない（非特許文献３）。
　このように変形性関節症の治療において、軟骨組織の変性状態を正常化し、長期間修復、維持可能な治療が求められている。
Chen et al.,Bone Res. 2017 Jan 17;5:16044. doi: 10.1038/boneres.2016.44. eCollection 2017. Zhang et al., Bone Research volume4, Article number: 15040,2016 Niemeyera.et al. The Knee, Volume 23, Issue 3, June 2016, Pages 426-435
　組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法、当該方法によって製造された軟骨細胞培養物、軟骨細胞培養物を使用した治療方法を提供することにある。
　すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］　組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む、前記方法。
［２］　組織再生能が、軟骨細胞培養物のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能、ｍｉＲＮＡの保持能力、幹細胞の含有量、またはヒアルロン酸の分泌能である、［１］に記載の方法。
［３］　ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１４０である、［２］に記載の方法。
［４］　幹細胞が、多能性幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞である、［２］または［３］に記載の方法。
［５］　幹細胞の含有量が、軟骨細胞培養物中の１－２フコースまたはα２－６シアル酸の含有量である、［２］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］　軟骨組織が、５０歳以上の変形性関節症の対象に由来する、［１］～［５］に記載の方法。
［７］　熱可逆性ポリマーが、血清以外の成長因子が添加されていない熱可逆性ポリマーである、［１］～［６］に記載の方法。
［８］　［１］～［７］に記載の方法によって製造された軟骨細胞培養物。
［９］　［８］に記載の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法。
［１０］　疾患が、変形性関節症である［９］に記載の治療方法。
［１］　損傷した軟骨組織を修復するためのＴＧＰ含有組成物。
［２］　損傷した軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１］に記載の組成物。
［３］　修復が、損傷した軟骨組織の変性状態の正常化である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］　修復が、軟骨細胞の増殖、ヒアルロン産の分泌促進または保持、ｍｉＲ１４０の分泌促進、ＣＤ４４陽性細胞の増加、および、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の増殖からなる群から選択される１以上の指標により表わされる、［１］～［３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５］　修復が、in vitroまたはin vivoで行なわれる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の組成物。
［６］　軟骨細胞、軟骨前駆細胞またはＭＳＣｓ、軟骨細胞培養物および軟骨組織からなる群から選択される１以上の組織または細胞を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］　軟骨細胞または軟骨組織が、自家細胞または自家組織である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］　高齢者の軟骨組織に由来する細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、軟骨細胞培養物および培養分泌物の製造方法。
［９］
　軟骨組織が、変形性膝軟骨関節症により損傷した軟骨組織である、［８］に記載の方法。
［１０］　さらに軟骨細胞培養物と培養分泌物とを分離するステップを含む、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］　未分化細胞を増殖または維持させる方法であって、
軟骨組織から得られた細胞を含む細胞をＴＧＰ含有組成物で培養するステップを含む、前記方法。
［１２］　未分化細胞が、軟骨細胞培養物中で増殖または維持される、［１１］に記載の方法。
［１３］　さらに未分化細胞を添加するステップを含む、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］　未分化細胞がＭＳＣである、［１１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］　軟骨組織が、変形性関節症により損傷した軟骨組織である、［１１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］　［１１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法により製造された未分化細胞。
［１７］　細胞から分泌された高分子成分の分解を防ぐためのＴＧＰ含有組成物。
［１８］　細胞から分泌された高分子成分の製造方法であって、細胞をＴＧＰ含有組成物中で培養するステップを含む、前記方法。
［１９］　細胞から分泌された高分子成分がヒアルロン酸である、［１７］または［１８］に記載の組成物または方法。
［２０］　細胞が、ヒト細胞であり、ヒト細胞が、ヒト平滑筋細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト脂肪細胞、ヒト滑膜細胞からなる群から選択される1以上の細胞である、［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の組成物または方法。
　本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、ＥＣＭに富むため生着性が高く、健全な軟骨の機能および組織構造を有するだけでなく、炎症、ＥＣＭの分解等を特徴とする軟骨組織の変性状態を正常化することが出来る。さらに、軟骨細胞培養物には軟骨再生に寄与する幹細胞が多く含まれている。したがって、変形性関節症のような変性状態の軟骨組織を長期わたって修復、維持する効果を奏する。
図１は、平面培養（比較例１）およびＴＧＰ培養（実施例１）により得られたサンプルの組織像を示す。 図２は、平面培養（比較例１）およびＴＧＰ培養（実施例１）により得られたサンプルのＣＤ４４の免疫染色像を示す。 図３は、ＴＧＰ培養サンプルの細胞膜上に存在するＳＮＡに反応するα２－６シアル酸量の変化を示す。 図４は、ＴＧＰ培養サンプルの細胞膜上に存在するＳＳＡに反応するα２－６シアル酸量の変化を示す。 図５は、ＴＧＰ培養サンプルの細胞膜上に存在するＴＪＡ－１に反応するα２－６シアル酸量の変化を示す。 図６は、ＴＧＰ培養サンプルの細胞膜上に存在するＵＥＡ－１に反応するα１－３フコース量の変化を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする
　本発明は、組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む。本開示における「軟骨組織」は、軟骨由来の組織を指す。軟骨は、限定されずに関節軟骨、骨端板、肋軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、仙腸関節、顎関節、胸鎖関節、椎間円板、恥骨結合、関節半月、関節円板、外耳道、耳管、耳介軟骨及び喉頭蓋軟骨等を含む。軟骨組織は、任意の生物に由来し得る。ヒトの損傷した軟骨へ骨組織培養物を移植した際に拒絶反応が少ないことからヒトの軟骨組織が好ましい。自家組織であっても他家組織であってもよいが、対象に適用した際に拒絶反応が少ないことから自家組織が好ましい。
　本発明に使用する軟骨組織は、軟骨組織が由来する対象の状態に関わらず、健全な軟骨組織と同様の組織構造を持つ軟骨細胞培養物を形成できる。したがって、いかなる状態の対象に由来する軟骨組織であってもよく、例えば、変形性関節症を有する対象から採取した関節軟骨であってもよい。かかる関節軟骨の採取部位は、体重の荷重部または非荷重部であってもよく、変形性関節症によって損傷した荷重部から採取した軟骨組織であってもよい。
　本発明によって製造される軟骨細胞培養物は、長期培養しても石灰化などの異常が生じないため、例えばグレード１の対象から採取し、グレード３以降に進行するまでの間培養し、製造された軟骨細胞培養物を対象へ移植することも可能である。したがって、採取する対象のＯＡグレードは、１～４のいずれでもよい。
　軟骨組織を採取する対象の年齢は、特に限定されない。本発明によって製造される軟骨細胞培養物は再生能が高いため、例えば０～３９歳、４０歳以上であっても、５０歳以上、６０歳以上、７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上の対象に由来する軟骨組織であってもよい。
　軟骨組織の採取方法は、当該技術分野において生体組織を採取する際に用いられる通常の方法であってよく、限定されずに、メス、ピンセット、バイオプシーパンチなどを用いて軟骨から採取することができる。
　本発明の方法における「軟骨組織から分離された細胞集団」は、軟骨組織の分離処理（例えば酵素処理、細切処理）によって得られた同一または異なる種類の細胞から構成される細胞集団を意味する。当該細胞集団は、軟骨組織に含まれている細胞集団であれば限定されずに、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）および多能性幹細胞などを含む。
　軟骨組織の分離処理としては、当該技術分野で生体組織の分離処理として通常に用いられている方法、例えば酵素的方法または物理的方法を用いることができる。酵素的方法としては、これに限定されないが、１種または２種以上の酵素を使用して軟骨組織を構成する細胞が生存可能な温度（例えば３７℃）でインキュベートすることである。酵素的な方法による分離処理は、軟骨組織から細胞を分離する際に当該技術分野において通常に用いられる酵素をそれに応じた温度、濃度および時間の処理条件で使用できる。
　酵素としては、軟骨組織が分離できれば限定されずに、ディスパーゼＩまたはＩＩ、コラゲナーゼＩまたはＩＩ、メタロプロテアーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、ペプシン、アミノペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼなどを用いることができる。軟骨組織を短時間に、かつ低侵襲で分解し得る観点から、好ましくは、酵素として、ディスパーゼＩまたはＩＩ、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、アクターゼまたはトリプシンのいずれかを単独で使用しても、２種以上組み合わせて使用してもよい。
　トリプシンを使用する場合、限定されずに、トリプシン－ＥＤＴＡの形態で０．０５％～２．５％、０．１％～１％、０．１５％～０．３％であってよく、低侵襲で分離できる観点から０．２～０．２５％が好ましい。トリプシン－ＥＤＴＡによる分離処理時間は、限定されず、１分～２時間、３分～１時間、１０分～４０分であってよく、幹細胞を損傷しない観点から、好ましくは３０分である。
　コラゲナーゼＩＩを使用する場合、限定されずに、０．１～３０ｍｇ／ｍｌ、０．５～１０ｍｇ／ｍｌ、０．７５～５ｍｇ／ｍｌが好ましく、低侵襲で分離できる観点から０．８～２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。分離処理時間は、生細胞が死滅しない限りは限定されず、例えば１～２４時間、３～２０時間、７～１８時間、１０～１６時間であってよく、幹細胞を低侵襲で分離する観点から１２～１６時間が好ましい。
　トリプシンとコラゲナーゼIIを組み合わせて使用する場合、限定されず、各濃度および処理時間を任意に組み合わせることができる。軟骨細胞の形質を維持しながら、幹細胞を低侵襲で分離する観点からトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％溶液）で３７℃、３０分間の処理およびコラゲナーゼII液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°で１２～１６時間の組み合わせが好ましい。
　物理的方法としては、これに限定されないが、メス、超音波、ホモジナイザーあるいは濾し器等を使用して軟骨組織を細切または破砕する方法が挙げられる。物理的方法は上で詳述した酵素的方法と任意に組み合わせることができる。
分離された細胞は、フィルター、セルストレーナなど公知の任意の方法を使って、分離処理によって分離された細胞と、分離しきらない組織片またはマトリクス等とを分別してもよい。分別することにより、サイズまたは機能が統一された細胞集団が得られる。
　本発明の方法における、熱可逆性ポリマーは、（Thermoreversible Gelation Polymer：本明細書において「ＴＧＰ」ともいう）とは、架橋構造ないし網目構造を熱可逆的に生成し、該構造に基づき、その内部に水等の分離液体を保持するハイドロゲルを熱可逆的に形成可能な性質を有する高分子をいう。またハイドロゲルとは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された水を含むゲルをいう。本発明において、熱可逆性ポリマーは、熱可逆性ポリマー特有の架橋構造ないし網目構造によって、生体中の軟骨組織と類似した環境が形成されるため、熱可逆性ポリマーであればいかなるポリマーであっても、本発明の方法に用いることができる。
（ゾル－ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル－ゲル転移温度の定義および測定は、文献（H. Yoshioka ら、Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113 (19 94)）に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ’、弾性項）が損失弾性率（Ｇ”、粘性項）を上回る点の温度をゾル－ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ”＞Ｇ’の状態がゾルであり、Ｇ”＜Ｇ’の状態がゲルであると定義される。このゾル－ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
　測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター　ＡＲ５００、ＴＡインスツルメント社製
　試料溶液（ないし分離液）の濃度（ただし「ゾル－ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％
　試料溶液の量：約０．８ｇ
　測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ
　測定周波数：１Ｈｚ
　適用ストレス：線形領域内
　本発明においては、上記ゾル－ゲル転移温度は０℃より高く、３７℃以下であることが好ましく、更には、５℃より高く３５℃以下（特に１０℃以上３３℃以下である）ことが好ましい。このような好適なゾル－ゲル転移温度を有するＴＧＰは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル－ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。
　上述したような熱可逆的なゾル－ゲル転移を示す（すなわち、ゾル－ゲル転移温度を有する）限り、本発明のＴＧＰは特に制限されない。その水溶液がゾル－ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（K.R.Holme.et al. Macromolecules,24,3828(1991)）等が知られている。
（好適なハイドロゲル形成性高分子）
　本発明のＴＧＰとして好適に使用可能な、架橋形成に疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、ＴＧＰと媒体が分離せずに細胞集団の周囲を安定的に維持できる観点から、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。
　該親水性のブロックは、ゾル－ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。
　換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル－ゲル転移温度に対応する。
　ただし、該曇点とゾル－ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
　本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成され、可逆的な温度変化に対して軟骨細胞培養物が安定に増殖し得る点からは、ＴＧＰが「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
　一方、上記ＴＧＰ中の親水性ブロックは、前述したように、該ＴＧＰがゾル－ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
　さらに本発明に用いるＴＧＰは、本発明の軟骨細胞培養物を細胞治療で使用する観点から生体内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明のＴＧＰが生体内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、生体に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
　本発明のＴＧＰが曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が生体内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
（曇点を有する複数のブロック）
　曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度－温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ－置換アクリルアミド誘導体とＮ－置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。本発明の細胞集団または軟骨細胞培養物を安定して培養できる観点から、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体が好ましい。
　曇点を有するブロックを生体内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを生体内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
　上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル－ゲル転移温度を０℃より高く３７℃以下とする点から好ましい。
　ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
　本発明に使用可能なポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。ポリ－Ｎ－アクロイルピペリジン；ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－アクリロイルピロリジン；ポリ－Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド；ポリ－Ｎ－シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ－Ｎ－エチルアクリルアミド。本発明の細胞集団または軟骨細胞培養物を安定的に培養できる観点からポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが好ましい。
　上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。したがって、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
（親水性単量体）
　上記親水性単量体としては、Ｎ－ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（疎水性単量体）
　一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ－ｎ－ブチルメタアクリルアミド等のＮ－置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（親水性のブロック）
　一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ－ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ－メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。本発明の一態様において、熱可逆性ゲルの曇点を有する複数のブロックとしてポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドを用いる場合、軟骨組織の生体内環境と類似の環境が形成されることで細胞集団の増殖能が高くなることから、該アクリルアミドに結合する親水性のブロックとしてポリエチレンオキサイドが好ましい。
　また親水性のブロックは生体内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性生体高分子が好ましく用いられる。
　曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。
　この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。
　このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック（登録商標）Ｆ－１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるＴＧＰを得ることができる。
　この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
　一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明のＴＧＰは、再び完全な水溶液となる。
　このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル－ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。本発明者らの検討によれば、上記したＴＧＰの水中における微妙な親水性－疎水性のバランスが、細胞を水中で低温保存する際の細胞の安定性に寄与しているものと考えられる。
（ゲルの溶解性）
　上述したように水溶液中でゾル－ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル－ゲル転移温度より高い温度（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル－ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
　上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
　一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル－ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍｌ（リットル）に溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記ＴＧＰの水溶液が、一旦（ゾル－ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル－ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
　上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０～３，０００センチポイズ（更には５０～１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
　　粘度計：ストレス制御式レオメーター（機種名：AR500、TAインスツルメンツ社製）
　　ローター直径：６０ｍｍ
　　ローター形状：平行平板
　本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記ＴＧＰが形成するハイドロゲルの上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
　すなわち、ＴＧＰ０．１５ｇを、上記ゾル－ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０ｗｔ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ（リットル）中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ－ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
　本発明のＴＧＰの水溶液は、上記ゾル－ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１～１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
　これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニック（登録商標）Ｆ－１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
　非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）ｘ１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なＴＧＰを用いることが好ましい。
　本発明に用いられるＴＧＰの分子量は３万以上３，０００万以下が好ましく、より好ましくは１０万以上１，０００万以下、さらに好ましくは５０万以上５００万以下である。
　本発明の方法における、熱可逆性ポリマー（ＴＧＰ）で細胞集団を培養するステップは、軟骨組織から分離された細胞集団を既知の方法で、熱可逆性ポリマーに混合し培養すればよい。典型的には、軟骨組織から分離された細胞集団をゾル－ゲル転移温度より低い低温でＴＧＰ溶液に分散し、ゾル－ゲル転移温度より高い温度でＴＧＰをゲル化させた後、培養液などの媒体を添加して培養する方法を用いることができる。ゲル化したＴＧＰに媒体を添加することで、かかる媒体だけを定期的に交換することで、ゲル中の細胞集団に安定した栄養供給をすることができる。
　本発明における培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の気圧（大気圧）で行うことができる。本発明の方法は、細胞集団を長期培養しても石灰化等の異常な軟骨細胞培養物が生じることがないため、培養期間は、特に限定されない。例えば、４日以上、８日以上、１６日以上、２１日以上、３２日以上、４８日以上、６４日以上、７２日以上、９０日以上、１０２日以上、１１４日以上、１２６日以上、１４０日以上、１６０日以上、１８０日以上、２５０日以上であってよく、十分なＥＣＭが形成される観点から２１日以上が好ましく、より好ましくは３２日以上、さらに好ましくは７２日以上である。
　培養は、任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体（本明細書で「液体培地」と言うこともある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明において、ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体は、共通のものであっても異なるものであってもよい。
　本発明の一態様において、ＴＧＰを溶解する媒体およびゲル化したＴＧＰに添加する媒体は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７、ＣｎＴ－ＰＲなどが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
　媒体は、上記のほか、血清、成長因子（例えばＦＧＦ－２、ＴＧＦ－ｂ１など）、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。血清としては、異種血清でも同種血清でもよい。同種血清が好ましく、同種血清のなかでも自己血清がさらに好ましい。また、媒体は、自己血清に含まれる成長因子以外の成長因子を媒体中に含まない。このような媒体によって溶解されたＴＧＰを使用して培養する場合、自己血清以外の成長因子が添加されていないＴＧＰで細胞集団を培養することになる。血清の濃度は特に限定されず、ＴＧＰに添加する媒体中に３％、５％、１０％、２０％含んでよい。好ましくは１０％である。本発明の一態様において、ＴＧＰを溶解する媒体とゲル化したＴＧＰに添加する媒体は共通の成分からなってもよい。
　本発明の方法により製造される「軟骨細胞培養物」とは、軟骨組織から分離された細胞集団を培養することにより得られた軟骨細胞を含む細胞集団を指す。
　一態様において、本発明の方法により製造される軟骨細胞培養物は、ＥＣＭにより細胞集団の細胞間隙が充填された軟骨組織様の組織構造を持っていてよい。
　本発明の方法により得られる軟骨細胞培養物は、熱可逆性ポリマーで細胞集団を培養するステップを含まない方法により培養された軟骨細胞培養物（本明細書において「対照培養物」という）よりも組織再生能が高い。
　組織再生能は、細胞集団が適用された軟骨組織の組織再生能を意味する。
　一態様において、組織再生能は、軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用（移植）し、所定時間経過後に、適用部位（移植先）の組織の状態、例えば、組織のサイズ、組織の微細構造、損傷組織と正常組織との割合、組織の機能などを観察し、これらをスコア化することなどにより定量化できる。
　一態様において組織再生能は、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりもＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能を高めるための方法であってもよい。
　ＳＯＸ９またはＣＯＬ２Ａ１は、正常な軟骨の組織形成時に発現する遺伝子として知られている。また、ｍｉＲ１４０またはｍｉＲ２１に由来する、ｍｉＲ１４０－３ｐもしくは－５ｐ、または、ｍｉＲ２１―５ｐは、変形性関節症で発生する軟骨組織中の炎症、ＥＣＭの分解等を特徴とする軟骨組織の変性状態の正常化に有効である（Karlsen et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2016 Oct 11;5(10)、Miyaki et al., Arthritis Rheum. 2009 Sep;60(9):2723-30、Si et al., Osteoarthritis Cartilage. 2017 Oct;25(10):1698-1707、Miyaki et al., Genes Dev. 2010 Jun 1;24(11):1173-85、Hai et al,. J Orthop Surg Res. 2019; 14: 118など参照）。
　具体的には、軟骨組織においてｍｉＲ１４０が高発現すると、ｍｉＲ１４０－３ｐまたは５ｐが軟骨組織中で増加する結果、限定されずに、ＭＭＰ－１３およびＡＤＡＭＴＳ－５などのＥＣＭ分解酵素の発現または分泌の低下、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６およびＩＬ８などの炎症メディエーターの発現または分泌の低下、ＳＯＸ９、ＡＣＡＮおよびコンドロイチン硫酸Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ１（ＣＳＧＡＬＮＡＣＴ１）などＥＣＭ合成に関与するタンパク等の発現の増加を介して軟骨組織の変性状態を正常化する。したがって、本発明の軟骨細胞培養物を対象、特に変形性関節症を有する対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に正常な軟骨組織を補完し得るだけでなく、適用箇所の周囲の軟骨組織の変性状態を正常化することができるため、長期にわたって、治療効果を維持することが出来る。
　また、軟骨組織においてｍｉＲ２１が高発現すると、ｍｉ２１－５ｐが軟骨組織中で増加する結果、限定されずに、ＭＭＰ－１３およびＡＤＡＭＴＳ－５などのＥＣＭ分解酵素の発現または分泌の低下、ＣＯＬ２Ａ１などＥＣＭ合成に関与するタンパク等の発現の増加を介して軟骨組織の変性状態を正常化する。したがって、ｍｉＲ１４０と同じく長期にわたって、治療効果を維持することが出来る。
　ここで遺伝子の発現が高いとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上、所定の遺伝子の発現量が高いことを意味する。
　遺伝子の発現量を測定する手法は、当該技術分野において周知であり、タンパク質の発現レベルを測定する手法としては、限定されずに、例えば、上で詳述したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫組織化 学法、免疫細胞化学法、フローサイトメータ、質量分析法などが、遺伝子の発現レベルを 測定する手法としては、限定されずに、例えば、ノーザンブロッティング法、サザンブロ ッティング法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等のＰＣＲ法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法などが、それぞれ挙げられる。
　本開示においてＳＯＸ９（ＣＭＤ１、ＣＭＰＤ１、ＳＲＡ１、ＳＲＸＸ２、ＳＲＸＹ１０とも称する）は、SRY-box transcription factor 9をコーする遺伝子であり、ヒトＳＯＸ９の遺伝子配列は、accession番号NM_000346等として登録されており、その配列は配列番号１に示すとおりである。
　本開示においてＣＯＬ２Ａ１（ＡＮＦＨ、ＡＯＭ、ＣＯＬ１１Ａ３、ＳＥＤＣ、ＳＴＬ１とも称する）は、collagen type II alpha 1 chainをコーする遺伝子であり、ヒトＣＯＬ２Ａ１の遺伝子配列は、accession番号NM_001844.5、等として登録されており、その配列は配列番号２に示すとおりである。
　本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１０～２５塩基のＲＮＡを意図して用いられる。また「ｍｉＲＮＡ」は、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を含み、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も含む。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）により同定することができ、ストリンジェントな条件下で、特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」が挙げられる。
　本開示において、ヒトｍｉｒ－１４０は、miRbase ID: Stem-loop sequence hsa-mir-140、miRbase accession番号．MI0000456として登録されており、配列番号３に示すとおりである。
　本開示において、ヒトｍｉＲ１４０－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004597として登録されており、配列番号４に示されるＲＮＡ配列「uaccacaggguagaaccacgg」に示すとおりである。
　本開示においてヒトｍｉＲ１４０－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-140-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000431として登録されており、配列番号５に示されるＲＮＡ配「cagugguuuuacccuaugguag」に示すとおりである。
　本開示において、ヒトｍｉｒ－２１は、miRbase ID:Stem-loop sequence hsa-mir-21、miRbase accession番号．MI0000077として登録されており、配列番号６に示すとおりである。
　本開示において、ヒトｍｉＲ２１－３ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-3p、miRbase accession番号．MIMAT0004494として登録されており、配列番号７に示されるＲＮＡ配列「caacaccagucgaugggcugu」に示すとおりである。
　本開示においてヒトｍｉＲ２１－５ｐは、miRbase ID: Mature sequence hsa-miR-21-5p、miRbase accession番号．MIMAT0000076として登録されており、配列番号８に示されるＲＮＡ配列「uagcuuaucagacugauguuga」に示すとおりである。
　一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物のｍｉＲＮＡの保持能力である。保持能力とは、軟骨細胞培養物がｍｉＲＮＡを軟骨細胞培養物中に保持する能力である。ｍｉＲＮＡを軟骨細胞培養物中に保持する能力とは、ｍｉＲＮＡを培養時に分泌せずに、軟骨細胞培養物中に保持する能力であってよい。ｍｉＲＮＡが培養時に軟骨細胞培養物中に保持されることで、当該軟骨細胞培養物を対象に適用した場合、適用箇所および適用箇所周囲にｍｉＲＮＡを高濃度で分泌し得る軟骨細胞培養物を得ることができる。
　ｍｉＲＮＡとしては、限定されずに、ｍｉＲ１４０、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ－１２５ｂ、Ｈａｓ－ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２６ｂ、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－６３４、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－３７０ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１３０Ａ、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－５６２－５ｐなど軟骨組織の変性状態を正常化し得るｍｉＲＮＡを含み（Zhang.et al.J Arthritis. 2017 Apr;6(2). pii: 239. doi: 10.4172/2167-7921.1000239参照）、好ましくはｍｉＲ１４０（ｍｉＲ１４０－３ｐおよび－５ｐを含む）、ｍｉＲ２１（ｍｉＲ２１－３ｐおよび－５ｐを含む）、特に好ましくはｍｉＲ１４０（ｍｉＲ１４０－３ｐおよび－５ｐを含む）である。
　ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上高い濃度で培養時の軟骨細胞培養物中にｍｉＲＮＡが存在することを言う。一態様において、ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物の媒体（液体培地）を基準として、限定されずに、９９％以下、９５％以下、９７％％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下低い濃度で培養時の軟骨細胞培養物の液体培地中にｍｉＲＮＡが存在することを言う。一態様において、ｍｉＲＮＡの保持能力が高いとは、培養時の対照培養物を基準として、培養時の軟骨細胞培養物中に高い濃度でｍｉＲＮＡが存在し、および、対照培養物の液体培地を基準として、培養時の軟骨細胞培養物の媒体中に低い濃度でｍｉＲＮＡが存在することを言う。
　一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物中の幹細胞の含有量であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりも幹細胞の含有量が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の幹細胞を維持また増殖するための方法であってもよい。一態様において、幹細胞の含有量とは限定されずに、細胞培養物に占める幹細胞の量または割合であってよい。幹細胞は、軟骨細胞に分化し得る能力を有する細胞あれば限定されずに、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞などの体性幹細胞、またはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞などの多能性幹細胞などが含まれる。
　幹細胞の含有量は、当該技術分野で既知の幹細胞の測定方法により測定することができ、限定されずに、軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在するＵＥＡ－１などのレクチンに反応するα１－２フコース、もしくはＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－Ｉなどのレクチンに反応するα２－６シアル酸の量を測定すること、または、前記α１－２フコース酸もしくは前記α２－６シアル酸の量の変化と相関する他の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現などを測定することで定量できる。軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在する前記α１－２フコースのレベルが高ければ、多能性幹細胞が多く存在し、前記α２－６シアル酸レベルが高ければ、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が多く存在することを意味する。（Wang et al, Cell Res. 2011 Nov;21(11):1551-63、Tateno et al, Glycobiology. 2016 Dec;26(12):1328-1337,WO2016006712A1を参照）。
　「分化ポテンシャル」とは、ある細胞が適切な分化誘導状態に置かれた場合に、前駆細胞、体細胞などの別種の細胞に変化することができる能力を有していることをいう。一般的に、体性幹細胞を長期培養すると、増殖能と共に分化ポテンシャルが低下する傾向がある。分化ポテンシャルが低下した体性幹細胞は体性幹細胞マーカーを細胞表面に持ちながらも前駆細胞、体細胞などの別種の細胞に変化することができないため、このような体性幹細胞は、組織再生能を持たない。
　本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の含有量が高い。分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の含有量とは、限定されずに、単位量当たり細胞培養物に占める分化ポテンシャルが高い体性幹細胞の量または割合であってよい。ある態様において、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の体性幹細胞の分化ポテンシャルを維持または増加させる方法であってもよい。別の態様において、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を維持または増殖する方法であってもよい。体性幹細胞は、軟骨細胞に分化し得る体性幹細胞であれば限定されずに、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞などであってよい。
　このような幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が多く含まれる軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に分化ポテンシャルが高い細胞から分化した軟骨細胞が恒常的に供給し得るため、長期にわたり正常な軟骨組織を修復し、維持することができる。また、幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞が、間葉系幹細胞であれば、軟骨細胞のアポトーシス保護用、軟骨組織の抗炎症用、抗繊維化用など、損傷した軟骨組織を正常化する能力、損傷に対する回復能力などが高いため、長期にわたって、治療効果を維持することができる。
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
　軟骨細胞培養物に含まれる細胞の細胞膜に存在するＵＥＡ－１などのレクチンに反応するα１－２フコース、もしくはＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－Ｉなどのレクチンに反応するα２－６シアル酸の量は、限定されずに、前記レクチンまたは前記レクチンが反応するα１－２フコースもしくはα２－６シアル酸に特異的に反応する抗体を使用したフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫染色、または抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ等を用いて測定することができる。前記α１－２フコース酸またはα２－６シアル酸の量の変化と相関する他の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現などを測定する方法は、当該技術分野において細胞表面マーカーまたは遺伝子発現を測定する常法を用いることができる。
　本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりも幹細胞、または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を多く含む。幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞を多く含むとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上、α１－２フコース酸もしくはα２－６シアル酸を有する細胞の含有量、またはこれらと相関する細胞表面マーカーまたは遺伝子発現が高いことを意味する。
　一態様において組織再生能は、軟骨細胞培養物のヒアルロン酸の分泌能であってよい。本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物は、対照培養物よりもヒアルロン酸の分泌能が高い。したがって、本発明は、軟骨組織から分離された細胞集団中の分泌能を高める方法であってよい。ヒアルロン酸は、ＥＣＭ分解系酵素の発現に対して抑制的に作用し、軟骨から遊出したマトリクスや抗炎症因子の緩和、炎症関連因子の発現を制御することが知られている（Ohtsuki.et al.J Orthop Res. 2018 Aug 17. doi: 10.1002/jor.24126）。
　したがって、本発明の方法によって製造された軟骨細胞培養物を対象の軟骨組織に適用すると、適用箇所に正常な軟骨組織を補完し得るだけでなく、適用箇所周囲のＥＣＭ分解または炎症が抑制されるため、適用箇所の周囲の軟骨組織の変性状態を正常化することができ、長期にわたって、正常な軟骨組織を修復し維持することができる。
　ヒアルロン酸の分泌能の測定方法は、媒体（液体培地）またはＴＧＰ中のヒアルロン酸を経時的に定量すればよい。ヒアルロン酸は、限定されずに、質量分析、液体クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなどの他、市販のキットによって定量し得る。
　ヒアルロン酸の分泌能が高いとは、対照培養物を基準として、限定されずに、１０１％以上、１０５％以上、１１０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上または２００％以上ヒアルロン酸の分泌能が高いことを意味する。
　さらに本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物は、ＥＣＭに富むため損傷部位に生着し易い。したがって、本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物は移植用に用いることができる。また、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１の発現量が高く、幹細胞を多く含み、ヒアルロン酸の分泌量が高いためグレード２以上または高齢者の変形性関節症の治療用に好ましく用いられる。
　本発明は、さらに本発明の方法により製造された軟骨細胞培養物を含む。本発明の軟骨細胞培養物は上述した通りである。
　本発明は、本発明の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法を含む。疾患は、軟骨に関連する疾患であれば限定されずに、変形性関節症、関節リウマチ、骨肉腫、大腿骨頭壊死症、臼蓋形成不全、半月板損傷、外傷性関節炎、スポーツや事故等による物理的な軟骨の欠損または損傷を含む。
　対象への適用（投与）方法は、軟骨細胞培養物の移植であってよい。軟骨細胞培養物の移植は、限定されずに、軟骨組織への注射、または関節鏡視下手術および切開等により、患部に軟骨細胞培養物を送達し、フィブリンゲル等の任意の組織接着剤を使用するか、または吻合することにより患部に固定し得る。
　本発明の治療方法において、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体、生着性などを高める成分、さらなる有効成分などを含有させて適用することができる。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。
　以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
[製造例１]
　Ｎ－イソプロピルアクリルアミド４２．０ｇおよびｎ－ブチルメタクリレート４．０ｇ をエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（PD E6000、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気 流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメ チルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ） 水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。さらにＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰ Ｓ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を５℃以下に冷 却後、５℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて５℃で２Ｌまで濃縮した。
　該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記 の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。こ の限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結 乾燥し、分子量１０万以上の本発明のTGP４０ｇを得た。上記により得た本発明のTGP１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解し１０ｗｔ％ の水溶液を得た。この水溶液の貯蔵弾性率をストレス制御式レオメーター（AR500、TAイ ンスツルメント社製）を用い、適用周波数１Ｈｚで測定したところ、１０℃で４３Ｐａ、 ２５℃で６８０Ｐａ、３７℃で１３１０Ｐａであった。この温度依存性貯蔵弾性率変化は 、可逆的に繰り返し観測された。
１．軟骨組織から分離された細胞集団の培養
＜サンプルの回収＞
　変形性関節症グレードＩＩＩまたはＩＶの患者６名から人工関節置換術により切除したＯＡ患者６名の膝関節の損傷部における軟骨組織（約１０×５ｍｍ、厚さ３ｍｍ）を一部採取し、抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)含有PBSに3０分間浸漬した。各患者の年齢および性別を以下に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜軟骨組織の分離＞
　各組織片をメスにて１ｍｍ２以下に細切した。この細切片をＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ液（０．２５％）にて３７Ｃ°、３０分間処理し、次いでコラゲナーゼII液（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７Ｃ°で１２～１６時間酵素処理した。ＤＭＥＭ液にて洗浄した後フィルター（１００μｍ）にてろ過し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、１０分間）した。このようにして得られた細胞集団を細胞算定盤で計数した。細胞数は、１×１０４～４×１０４cells/mlであった。
［比較例１］
　１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)を含有した培地に各サンプルの軟骨組織由来の細胞を分注し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータにて培養した。培養液は1週間ごとに交換して4～７週間培養した。
［実施例１］
＜ＴＧＰゲルでの培養＞
　製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを４℃でＤＭＥＭ９ｍＬに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、次、次いで軟骨組織由来の細胞を分散し、６ｗｅｌｌプレートに分注した。室温に放置してゲル状にした後、１０％自己血清含有ＤＭＥＭ液に抗生物質（gentamicin(50μg/ml)、amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した培地７～８ｍｌを加えて５％炭酸ガス培養器（ESPEC BNA-111）にて培養した。培養液は１週間ごとに交換して２０週間培養した。
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
＜培養された軟骨組織の観察＞
（１）位相差顕微鏡観察
　比較例１では、培養を開始した当初は球形の正常な軟骨細胞が確認されたが、培養経過に伴って徐々に細長い線維芽細胞様の細胞が出現し始め、１２日目頃から20日目頃までに徐々に変性または死滅を開始し、培養開始から約４週間で完全に変性または死滅した。例えば、サンプル１０５９は２８日目に、１０６６は２３日目、１０６８は１８日目に死滅した。
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
　実施例１では、培養開始から３～５日目には大きさ２００～３００μｍの軟骨細胞培養物が確認され、２１日後には直径０．５～１．０ｍｍの大きさにまで成長し、全てのサンプルで２０週間の培養期間、成長が維持された。実施例１では、線維芽細胞様の細胞の増殖は認められなかった。
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
（２）ＨＥ染色
　比較例１のサンプル（１０５９）の一部を培養開始から２５日目に、および、実施例１のＴＧＰゲル培養のサンプルの一部（１０５９）を培養開始から４９日目に採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後１０μｍに切断して、組織切片を作成した。光学顕微鏡（×２００）で観察したこれらの像を図１に示す。
　比較例１のサンプルにおいてＥＣＭは確認されなかった。一方、実施例１のサンプルでは一般的な健常な軟骨組織と同様、軟骨細胞がＥＣＭに取り囲まれてお健常な硝子軟骨の組織と同様の組織構造を持つことが分かった。
（３）ＣＤ４４免疫染色
　健常な軟骨組織、比較例１のサンプル、および、実施例１のサンプルから得られた組織切片を、ホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製した後５μｍで切断して、組織切片を作成した。脱パラフィンン後、一次抗体ウサギモノクローナル抗ＣＤ４４抗体ＳＰ３７（Ventana Medical Systems Inc. USA）を室温で32分間反応させた。次いでiView DAB detection kit(Ventana Medical Systems Inc. USA）で発色させた。結果を図２に示す。
　軟骨細胞培養物では、ＣＤ４４陽性である軟骨細胞とＥＣＭが散在していた。比較例１の平面培養サンプルでは、ＥＣＭが存在せず、ＣＤ４４陽性細胞のみが存在していた。
（４）各サンプルにおける遺伝子発現の測定
　比較例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から１４、１７および２６日目に回収した。また、実施例１のサンプル１０５９、１０６６および１０６８の一部を培養開始から４２日目に回収した。なお、比較例１と実施例１のサンプルでは回収日に違いがあるが、これは比較例１のいずれのサンプルも４２日目には軟骨細胞が完全に死滅しており、これらのサンプル中で軟骨細胞が生存していた期間に回収できた最後のタイミングのものを使用した。
　回収したサンプルをRNAlater（登録商標） Stabilization Solution（Invitrogen、CatNo.AM7020）-２０℃で保存した。これらのサンプルの一部をNucleoSpin（登録商標）miRNAキット（TaKaRa、U0971）を用いてスモールＲＮＡ（２００塩基以下のＲＮＡ）を精製し、配列番号９～１２のプライマーとmRQ 3'Primer、U6 Forward PrimerとU6 Reverse Primer（Mir-X（商標）miRNA qRT-PCR TB Green Kit (TaKaRa、Z8314N)を使用しThermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System Lite (TP700、TaKaRa)によりＵ６、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－３ｐおよびｍｉＲ－１４０－５ｐのｑＰＣＲを行った。Ｕ６の発現量を１として、各ｍｉＲＮＡの定量値をノーマライズした。
　同じようにmiRNAeasy Mini Kit ( QIAGEN、217004)を使用してtotal ＲＮＡを精製した。Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen、18080044)を用いて逆転写によりcDNAを合成し、配列番号１３～１６のプライマーとTB Green Premix Ex Taq II（Takara,Cat No. RR820S/A/B）を用いて、Thermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System LiteによりＧＡＰＤＨ、ＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１のｑＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨの発現量を１として、各遺伝子の定量値をノーマライズした。使用したプライマーを表２に、結果を表３～５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　１０５９、１０６６および１０６８のいずれのサンプルでも、ＴＧＰゲル中で培養した実施例１が、比較例１のサンプルと比較してｍｉＲ―２１およびｍｉＲ－１４０の発現量が増加して、ｍｉＲ２１－５ｐ、ｍｉＲ－１４０－３ｐおよびｍｉＲ－１４０－５ｐが大幅に増加することが分かった。
　また、ＳＯＸ９の発現量を測定した１０５９および１０６８のいずれのサンプルでも、実施例１のサンプルで、比較例１のサンプルと比較して、ＳＯＸ９の発現量が大幅に増加することが分かった。またＣＯＬ２Ａ１を測定した１０６８でも実施例１で、比較例１のサンプルと比較して発現量が増加することが分かった。ｍｉＲ２１、ｍｉＲ－１４０、ＳＯＸ９およびＣＯＬ２Ａ１は、いずれも健全な軟骨組織の形成時に発現が上昇することが知られていることから、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は健全な機能を有する軟骨組織であることが分かった。なかでもｍｉＲ－１４０およびｍｉＲ２１は、変形性関節症の微小環境を改善することが知られているため、実施例１で製造された軟骨細胞培養物は移植した部分の軟骨組織の再生を促すだけでなく、移植された周囲の変性状態を改善し得る。
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
（５）液体培地中のｍｉＲ１４０の定量
　比較例１および実施例１で培養したサンプル１０６７および１０６８の液体培地を培養開始から７または８日目に２．０ｍずつ採取し、RNAlater（商標） Stabilization Solution（Invitrogen、CatNo.AM7020）中で-２０℃で保存した。これらのサンプルの一部をNucleoSpin（登録商標） miRNAキット（TaKaRa、U0971）を用いてスモールＲＮＡ（２００塩基以下のＲＮＡ）を精製し、配列番号３のプライマーとmRQ 3'Primer（Mir-X（商標） miRNA qRT-PCR TB Green（登録商標）Kit (TaKaRa、Z8314N)）を使用しThermal Cycler Dice（登録商標）Real Time System Lite (TP700、TaKaRa)によりｍｉＲ－１４０－３ｐのｑＰＣＲを行った。結果を表６に示す。平均Ct値は、予め定めたThresholdに達するまでのサイクル数であり、平均Ｃｔ値が低いほどｍｉＲ－１４０－３ｐが液体培地中に多く存在することを示すものである。表中の「ＳＮＰ」は、採取した後、遠心分離およびフィルタレーションした後に保存したものであり、「ＳＮＦ」は、かかる処理せずに保存したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６より、いずれのサンプルでも実施例１と比較して、比較例１の液体培地中にｍｉＲ－１４０－３ｐが多く存在していることが分かった。（４）の遺伝子発現において、比較例１と比較して、実施例１の軟骨細胞培養物でｍｉＲ－１４０－３ｐを高く発現していたことに照らすと、実施例１の軟骨細胞培養物で発現したｍｉＲ－１４０－３ｐの殆どが液体培地中に分泌されず、軟骨細胞培養物中に保持されることが分かった。したがって、ＴＧＰゲル中で組織培養するとｍｉＲＮＡの含有量が高い組織培養物が得られることが明らかとなった。
（６）ヒアルロン酸の測定
　実施例１のＴＧＰゲル培養において培養開始から0日、３２日および１１３日に液体培地を２．０ｍｌずつ採取し、これらをそれぞれ－２０℃で凍結した。各サンプルに存在するヒアルロン酸をヒアルロン酸測定キット(PGリサーチHA-Kit. Lot. 18H４８４)により測定した。結果を表７に示す。
　培養当初は存在しなかったヒアルロン酸が、３２日目には８２２．８ｎｇ／ｍｌ、１１３日後には６７０．１ｎｇ／ｍｌ存在した。このことから軟骨細胞培養物からヒアルロン酸が安定的に分泌されていることが分かった。したがって、ＴＧＰゲルで培養された軟骨細胞培養物は、健全な状態を示す軟骨組織であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
[規則91に基づく訂正 04.06.2021]　
（７）培養された軟骨細胞培養物を構成する細胞の細胞表面のグリカン解析
　実施例１において培養した軟骨細胞培養物を、培養開始から１４～１２６日の間に採取し、それぞれのＴＧＰゲルを４°Ｃに冷却して水溶液状にして回収した。当該サンプルをＴｒｉｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．２５％）液にて細胞に分散し、細胞を回収した。次いでＤＭＥＭにて４℃で３回遠心洗浄し（１８００rpm、１５分）、それぞれのサンプルを凍結保存した。当該サンプルをGlycoTechnica LtdによるGlycan Profiling Analysis Serviceによって委託解析した。具体的には、融解したサンプルから細胞膜タンパク質を抽出し、タンパク質をＢＣＡ法（TaKaRa BCA Protein Assay Kit)により、当該膜タンパク質濃度を測定した。測定したタンパク質濃度をもとにＰＢＳＴｘを加えてタンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬになるように希釈した。１００μｇのCy3 Mono-reactive Dye Pack（GE healthcare、カタログ番号：PA23011）を含むチューブに１００μＬのサンプル（１０μｇ／ｍＬの濃度）を加え、ピペットで混和しスピンダウンした。チューブを遮光袋に入れて、室温（２５℃）で1時間インキュベートした。
　次いで、Desalt Spin Columns（商標）0.5ml(25カラム)(Thermo、カタログ番号:89882)スピンカラムを２ｍＬチューブに入れ、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、遊離のＣｙ３を除去した。３００μLのＴＢＳをカラムに添加し、１５００×ｇ、４℃で１分間遠心し、このプロセスを３回繰り返した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブに入れ、ラベル付きサンプル（１００μＬ）をカラムに加え１５００×ｇ、４℃で２分間遠心した。
　サンプルを回収し、２μｇ／ｍＬの濃度で５００μＬのサンプル量を得るために４０５μＬのProbing Solution（Glyco Technica）を加えた。すべてのサンプルは、Probing Solutionを使用して２μｇ／ｍＬから１５．６２５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度に希釈した。その後、LecChip Ver.1.0（商標、Glyco technica）をProbing Solutionで３回洗浄した後、サンプルをLecChip に６０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。LecChip上のサンプルを２０℃で約１３時間反応させた。GlycoLite2200（（商標）、Glyco technica）によりLecChipTMの蛍光パターンを累積４回、露光時間、１９９６、２９９５、３９９３、４９９２、６９８８、９９８４（ミリ秒）、カメラゲインを固定値で測定した。得られた４５レクチンのシグナルをGlycoStaion（登録商標） ToolsPro Suite 1.5（GlycoStaion（商標）ToolsPro Suite 1.5.）によって計測し、A. Kuno et al., J. of Proteomics & Bioinformatics, Vol.1, May 2008, p.68.に基づいて４５レクチンの平均強度で除した値に、１００を乗じて平均正規化した。以上の方法で得られた軟骨細胞培養物中を構成する細胞の細胞表面のＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉ、ＵＥＡ－１に対するシグナル強度の結果を表８および図３～図６に示す。表中の最上段に記載の１４～１２６の数字は、回収したサンプルの培養日数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８および図３～図６から、実施例１において、ＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉなどのα２－６シアル酸結合レクチン、およびＵＥＡ－１などのα１－２フコース結合レクチンのシグナルが、培養日数に応じて増強することが分かる。ＳＮＡ、ＳＳＡおよびＴＪＡ－Ｉに反応するα２－６シアル酸は、分化ポテンシャルが高い間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）または軟骨前駆細胞などの体性幹細胞のマーカーであり（ＷＯ２０１６／００６７１２Ａ１）、ＵＥＡ－１などのα１－２フコース結合レクチンは、多能性幹細胞のマーカーであることが知られている（Wang et al., Cell Res. 2011 Nov;21(11):1551-63. doi: 10.1038/cr.2011.148. Epub 2011 Sep 6.）。実施例１で作製された軟骨細胞培養物では、培養日数に伴ってＳＮＡ、ＳＳＡ、ＴＪＡ－ＩおよびＵＥＡ－１に反応するα２－６シアル酸およびα１－２フコースの増加が確認されたことから、当該組織培養物は、分化ポテンシャルが高い体性幹細胞および多能性幹細胞を多く含むことが分かった。したがって、実施例１の軟骨細胞培養物は高い組織再生力を有する組織培養物であることが明らかとなった。
２．ＴＧＰゲルのヒアルロン酸の保持試験
［実施例２］
　ヒアルロン酸（帝人ファーマ(株）５ｍｇをＤＭＥＭに抗生物質（gentamicin(50μg/ml), amphotericin(0.25μg/ml), penicillin(100 Units/ml)/streptomycin(100 μg/ml)及びL-Ascorbic acid(5mg/ml)含有した溶液２．５ｍｌに溶解し、これを液体組成１および２とした。
　製造例１で作製したＴＧＰ１ｇを℃でＤＭＥＭ９ｍｌに溶解して１０％ＴＧＰ溶液を作成し、ここに液体組成１および２と同じヒアルロン酸濃度になるようにヒアルロン酸を添加し、ＴＧＰ溶液中のヒアルロン酸が均一になるように振盪した。ＴＧＰ溶液を３７℃でゲル化し、次いで、液体培地（ＤＭＥＭ）１．０ｍｌ添加し、これをＴＧＰ組成１およびＴＧＰ組成２とした。
　作成したヒアルロン酸含有の液体組成およびＴＧＰ組成を、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータに入れ、各液体培地部分に含まれるヒアルロン酸濃度を上述の＜ヒアルロン酸の測定＞と同じ方法にて計測した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　液体組成1および２では、７日目にヒアルロン酸が、約１３０００ｎｇ／ｍｌ存在していたが、２１日目には５．６ｎｇ／ｍｌにまで減少した。これに対して、ＴＧＰ組成１および２では、７日目の時点で６．１および１１．４ｎｇ／ｍｌであり、これは液体組成１および２に対して約１／１０００の低い濃度に当たることから、ＴＧＰゲル内部にヒアルロン酸の殆どが保持されていたことが認められる。さらに２１目においても１０．３および１１．５ｎｇ／ｍｌであり、その濃度が殆ど変化しなかったことから、ＴＧＰゲルはヒアルロン酸が分解されずに長期安定して保持する能力を有することが明らかとなった。

Claims (10)

  1. 　組織再生能が高い軟骨細胞培養物を製造する方法であって、軟骨組織から分離された細胞集団を熱可逆性ポリマーで培養するステップを含む、前記方法。
  2. 　組織再生能が、軟骨細胞培養物のＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ｍｉＲ１４０およびｍｉＲ２１から選択される１以上の遺伝子の発現能、ｍｉＲＮＡの保持能力、幹細胞の含有量、またはヒアルロン酸の分泌能である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ１４０である、請求項２に記載の方法。
  4. 　幹細胞が、多能性幹細胞または分化ポテンシャルが高い体性幹細胞である、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　幹細胞の含有量が、軟骨細胞培養物中の１－２フコースまたはα２－６シアル酸の含有量である、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　軟骨組織が、５０歳以上の変形性関節症の対象に由来する、請求項１～５に記載の方法。
  7. 　熱可逆性ポリマーが、血清以外の成長因子が添加されていない熱可逆性ポリマーである、請求項１～６に記載の方法。
  8. 　請求項１～７に記載の方法によって製造された軟骨細胞培養物。
  9. 　請求項８に記載の軟骨細胞培養物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、対象における疾患を治療する方法。
  10. 　疾患が、変形性関節症である請求項９に記載の治療方法。
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