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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur homogenen
Verteilung einer zellhaltigen viskösen Suspension innerhalb
eines porösen Trägermaterials. Damit ist die Besiedelung
von Gerüststrukturen mit Zellen für das Tissue
engineering (= Züchtung komplexer Gewebe) zur Erzeugung
vitaler, biologischer Ersatzgewebe möglich. Das derart besiedelte
Trägermaterial eignet sich für den sich nachfolgend
anschließenden Kultivierungsprozess, der die Aufrechterhaltung
der Nährstoffversorgung und Differenzierung beinhaltet.
Weitere Anwendungsgebiete finden sich dort, wo Suspensionen innerhalb
poröser Trägermaterials verteilt werden müssen.
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Zur
Züchtung komplexer Gewebe im Rahmen des Tissue engineering
ist der Einsatz von lebenden Zellen Vorraussetzung. Für
die meisten Gewebe, insbesondere jedoch Binde- und Stützgewebe wie
Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder, sind Form und mechanische
Festigkeit der Regenerste von größter Bedeutung.
Zur Gewährleistung dieser Bedingungen greift man daher
meist auf Trägermaterialien in Form von Gerüststrukturen
zurück, die auf Grund Ihrer Biokompatibilität
und Biodegrabilität die Stütz- und Formgebungsfunktion
temporär wahrnehmen, sowie die Anhaftung und Ausreifung
der Zellen und Integration der Implantate fördern. Je nach
Konfiguration der Gerüststrukturen ist der initiale Prozess der
Verteilung der zellulären Komponenten auf dem Material
problematisch. Dies gilt insbesondere für starre Gerüste,
kann aber auch bei flexiblen Gerüsten ein limitierender
Faktor sein. Weitere Einflussfaktoren auf die homogene Verteilung
der Zellen finden sich in der Viskosität des Trägermediums,
in dem die Zellen aufgenommen werden, sowie in der Porosität und
Geometrie der Gerüststruktur bzw. die Zusammensetzung des
Trägermaterials.
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Als
Beispiel für die vielfältigen Möglichkeiten und
deren Bedeutung für die moderne medizinische Versorgung
sei auf den Einsatz von Implantaten zur knöchernen Regeneration
des Unterkiefers verwiesen. Die Atrophie des Unterkieferalveolarkammes
ist ein häufiges Krankheitsbild, das meist in Folge von Zahnverlust
auftritt und spezifische mechanische Anforderungen an die Implantate
stellt. Zum Einsatz kommen dabei hoch poröse mineralische
Gerüststrukturen mit Dimensionen von 1·1·3
bis 2·2·5 Zentimetern, die direkt auf den Kieferknochen
an- bzw. aufgelagert werden. Das Tissue engineering von Implantaten,
die mit adulten Stammzellen besiedelt sind, kann dabei die volumenmäßig
limitierte, sowie risiko- und nebenwirkungsreiche Transplantation
von Knochen aus dem Beckenkammknochen ersetzen, die mit einen einwöchigen
stationären Aufenthalt und bis sechs Wochen Arbeitsunfähigkeit
verbunden sein kann. Somit kann bei Atrophie der Kiefer ein implantatgetragener
Zahnersatz, der aus demographischen und funktionellen Gründen
immer häufiger wird, mit einer erheblichen Reduktion der
Therapiekosten und -risiken ermöglicht werden.
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Eine
wesentliche Vorraussetzung für die Anwendung von neuen
Technologien im Tissue engineering besteht in der einfachen Handhabbarkeit nach
GMP-Standard, wie der zuverlässigen individualisierbaren
Funktion bei möglichst einfacher Technologie und geringem
apparativen Aufwand insbesondere zur Gewährleistung steriler
Bedingungen.
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Die
initiale Verteilung von Zellen auf Trägermaterialien stellt
einen kritischen Prozess der Züchtung komplexer Gewebe
dar und wird auch als Besiedelungsprozess bezeichnet. Man geht dabei
von der Hypothese aus, dass die gleichmäßige Verteilung
der zellulären Komponenten sowohl zur Versorgung der Zellen
mit Nährstoffen als auch für die Interaktion der Zellen
untereinander eine notwendige Bedingung darstellt und Zellhaufen
oder zellfreie Areal die Ausreifung der Gewebe behindern. Dies steht
in Analogie zum feingeweblichen Aufbau der Zielgeweben, in denen
sich meist eine nach funktionellen Gesichtspunkten orientierte gleichmäßige
Ausrichtung von Zellen findet. Zur Gewährleistung und Aufrecherhaltung
der homogenen Verteilung der Zellen sind komplexe Besiedlungs- und
Kultivierungstechnologien entwickelt worden. Dabei müssen
Methoden der Besiedlung und Kultivierung auf Grund Ihrer andersartigen
Zielsetzung unterschieden werden, auch wenn in technisch komplexen
Systemen, sogenannten Bioreaktoren, versucht wird diese beiden Schritte
zusammen zu führen.
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Alle
bekannten Lösungen zur homogenen Verteilung von Zellen
innerhalb eines porösen Trägermaterials nutzen
stets eine Flüssigkeit als Trägermedium zur Aufnahme
und Verteilung der Zellen. Diese wird gemäß den
spezifischen Anforderungen der Zellen, der Gerüststruktur
oder des Prozesses entweder als visköse Flüssigkeit,
zum Beispiel als aushärtendes Hydrogel genutzt, um die
Zellen durch die kontinuierliche Viskositätserhöhung im
Gel ortsansässig zu halten und zudem eine Einbettung der Zellen
in eine hydrophile Matrix zu ermöglichen. Oder man setzt
eine nicht visköse bis niedrig-visköse Flüssigkeit
zum Beispiel ein Kulturmedium ein, so dass die Zellen vornehmlich über
oder durch das Material gespült und auf diese Weise verteilt
werden. Im letzteren Fall resultiert im Idealfall eine Bedeckung
der Oberfläche des Gerüstmateriales mit einem
Zellrasen. Schließlich ist es auch prinzipiell möglich,
mit bereits vitalen also besiedelten Materialen eine Gerüststruktur
aufzubauen.
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Für
die Verteilung der Zellen sind die folgenden vier grundsätzlichen
Lösungen bekannt.
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(1.) Aufnahme und Verteilung der Zellen
durch eine meist visköse Suspension, die auf Grund von
Kapillarkräften passiv oder durch Injektion bzw. Aufträufeln
auf den porösen Festkörper auf- beziehungsweise
eingebracht wird.
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Bei
der alleinigen Nutzung von Kapillarkräften zur Verteilung
von Zellen werden meist hoch visköse Suspensionsmedien
eingesetzt. Dabei ist die Sedimentation ein wesentliches technisches
Problem, da die aktive Anhaftung von Zellen am Trägermaterial
ein langsamerer Prozess ist als das Absacken der Zellen gemäß der
Gewichtskraft in der Suspension. In dreidimensionalen Gewebekulturen
kann eine rasche und stabile Verteilung der Zellen innerhalb einer
porösen Gerüststruktur durch ein aushärtendes
Hydrogel erfolgen. Derartige Trägermedien können
die Nährstoffversorgung, sowie Differenzierung der Zellen
fördern. Vielerlei Gele sind auf ihre Anwendbarkeit für
das Tissue engineering untersucht worden, wobei sich für
die knöcherne Gewebezüchtung Kollagen-I- und Fibrin-Gele
als besonders geeignet erwiesen haben, siehe Weinand, Pomerantseva
et al. 2006. Während der niedrig viskösen
Aushärtephase des Hydrogels kann das Zellpellet aufgenommen
und innerhalb der Flüssigkeit suspendiert werden. Die Aushärtung
des Gels muss so eingestellt werden, dass es nach Verteilung im
Festkörper idealer Weise so rasch fest wird, dass die Sedimentation verhindert
wird.
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Diese
Lösung ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Die
Nutzung passiver Kapillarkräfte setzt voraus, dass die
Poren und Dimensionen des Trägermaterials und die Viskosität
der Suspension aufeinander abgestimmt sind. Daher kann die Porengrößen
nicht an die spezifischen Vorraussetzungen des Zielgewebes oder
den Bedarf der Vaskularisation in vivo angepasst werden, sondern
muss auf die Bedingungen des Besiedlungsprozesses abgestimmt sein.
Dass dies möglich ist, haben Weinand, Pomerantseva
et al. 2006 gezeigt. Die passive Verteilung einer zellhaltigen
Suspension ist darüber hinaus ein langsamer Prozess, so
dass mit einer erheblichen Sedimentation zu rechnen ist. Dies wird durch
die verhältnismäßig schnellere Verteilung
zellarmer und damit leichterer Anteile der Suspension noch verstärkt.
Nach eigenen Ergebnissen ist die Anwendung von Kapillarkräften
für die Besiedlung großer Konstrukte ungeeignet.
Zudem ist sie auf den klinischen Bedarf hinsichtlich der Implantatform
hin nur bedingt individualisierbar.
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Ähnlich
problematisch stellt sich die manuelle Injektion auf und in das
Trägermaterial dar. Neben dem Verbleib von Luftblasen,
resultiert bei dieser Technik eine nicht reproduzierbare ungleiche
Verteilung der Zellen, wie auch Janssen, Hofland et al. 2006 berichten.
Maschinell gesteuerte Injektionstechniken sind nicht bekannt, würden
jedoch auch eine erhebliche technische Herausforderungen darstellen
und so dem Primat der leichten Handhabbarkeit widersprechen.
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(2.) Aufnahme und Verteilung der Zellen
durch eine Suspension, die mittels Änderung physikalischer
Parameter, vornehmlich die Anwendung von Unter- oder Überdruck
und/oder Rotation, durch den porösen Festkörper
bewegt wird.
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Hier
gibt es vielerlei technische Möglichkeiten, die jedoch
alle einen hohen technischen Aufwand zur Umsetzung der Druckunterschiede
und vor allem der freien Rotation zeigen. Technisch komplexe Systeme
sind für Anwendungen im Tissue engineering auf Grund der
Notwendigkeit der einfachen Handhabung zur Sicherstellung steriler
Arbeitsbedingungen nur bedingt geeignet. Zudem ist auch die mehrfache
Verwendung solcher Systeme mit Zellen verschiedener Patienten auf
Grund der Übertragung von Infektionen oder Fremdzellen
bzw. Fremdeiweißen problematisch. Weiterhin besteht bei
komplexen Prozessen oft das Problem der Individualisierung je nach
der Geometrie der verwendeten Gerüststrukturen, die in
Abhängigkeit der klinischen Notwendigkeiten variabel sein
müssen. Auch ist zu bedenken, dass Strömungen
und Drücke für die meisten Zellen unphysiologische
Bedingungen darstellen, die vor allem für „nackte” Zellen
aus Zellkulturen, die nicht in eine natürliche extrazelluläre
Matrix eingebunden sind, schädlich bis tödlich
sein können. Dennoch ermöglicht die Anpassung
solcher Systeme an die individuellen Bedingungen eine ideale homogene
Verteilung selbst der komplexesten Gerüststrukturen.
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Eine
einfache, häufig angewandte Methode ist der sogenannte
Spinner Flask. Dabei handelt es sich um ein Zellkulturgefäß,
in dem die Gerüststrukturen, die an einem Trägersystem
befestigt werden, in dem Gefäß um eine zentrale
Achse in Längsrichtung rotieren. Komplexere Systeme erlauben
eine Rotation in allen drei Raumebenen. Unter- (Vakuumverfahren)
und Überdruck erlauben darüber hinaus eine rasche
Verteilung im porösen Festkörper und können
darüber hinaus in ein Rotationssystem eingebunden sein.
Bei unzureichender Abstimmung der Porengröße zur
Suspension kann sich jedoch ein Filter effekt ergeben, der zu einer
ungleichmäßigen Verteilung der Zellen führen
kann. Van Wachem, Stronck et al. 1990; Griffon,
Sedighi et al. 2005; Wang, Asou et al. 2006 beschreiben
derartige Techniken, die auf Unterdruck basieren und einen hohen
technischen Aufwand bedingen.
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Aus
der Patentanmeldung
DE
199 62 456 A1 ist ein Beispiel für eine derartige
Technik bekannt. Die Verteilung der Zellen wird durch einen Filtereffekt
erreicht, in dem ein poröser Festköper durch einen passgenauen
Zylinder bewegt wird. Die korpuskulären Bestandteile der
Lösung werden dabei durch das Abpressen der Flüssigkeit
in dem porösen Festkörper gefangen. Dies setzt
jedoch eine angepasste Größe der Poren für
den Filtereffekt, sowie eine Anpassung des Zylinders auf das Gerüstet
oder umgekehrt voraus.
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(3.) Aufnahme und Verteilung der Zellen
durch eine vornehmlich nicht oder niedrig-visköse Suspension, die
auf Grund eines kontinuierlichen oder pulsatilen Strömungsflusses,
sogenannte Perfusion über eine längere Zeit, durch
einen Festkörper transportiert wird und die Zellen dabei
gleichmäßig verteilt.
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Lösungsansätze,
die über einen längeren Zeitraum die zellulären
Komponenten der Gewebezüchtung über die exakte
Einstellung physikalischer Parameter, vornehmlich Perfusion, in
einem Gerüstsystem verteilen, vereinen unweigerlich die
Verteilungs- und Kultivierungs- bzw. Züchtungsprozesse
in einem Schritt. Die Möglichkeit der Kombination von Besiedlung
und Kultivierung in einem System ist in vielerlei Hinsicht vorteilhaft.
Zum einen wird ein Übertragungsschritt vermieden. Zum anderen
können physikalische Parameter nicht nur die Verteilung, sondern
auch die Umverteilung der Zellen gemäß ihren Bedürfnissen
und sogar die Entwicklung der Zellen positiv beeinflussen. So ist
beispielsweise die Anwendung von Druck zur Entwicklung von Knorpelgewebe
förderlich. Darüber hinaus können diese
Bedingung kontrolliert eingestellt werden, da auf Grund des langsamen
Ablaufes viele Parameter der Verteilung und Entwicklung der Zellen
kontinuierlich gemessen werden können. Solche Systeme werden
auch als Bioreaktoren bezeichnet und müssen für
verschiedene Zell- und Gewebearten sowie Implantatkonfigurationen
individuell entwickelt werden. Die hohe technische Komplexität,
einschließlich Messtechnik und Sterilisierbarkeit, stellt
somit neben der eingeschränkten Möglichkeit der
individuellen Konfiguration der Implantate den wesentlichen Nachteil
dieser Systeme dar. Zudem ist eine Umverteilung der Zellen in der
Regel nur mit niedrig-viskösen Nährmedien möglich,
so dass primär nur eine Besiedelung und Kultivierung der
Oberflächen starrer Gerüstmaterialien möglich
ist. Es resultiert daher in der Regel primär ein Zellrasen
und somit eine zweidimensionale Besiedlung der Oberflächen
in Analogie zur Monolayerkultur in Kulturflaschen.
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Für
die Züchtung knöcherner Gewebe erscheint der Einsatz
von Perfusionskulturen von Vorteil. So lassen sich durch gleichmäßige
Strömung nicht nur verschiedenartige Gerüststrukturen
mit Zellen besiedeln, siehe Alvarez-Barreto, Linehan et
al. 2007, sondern sogar die Zellen in ihrer knöchernen Differenzierung
fördern Datta, Pham et al. 2006.
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Aus
der Patentanmeldung
DE
100 53 014 A1 ist die Kultivierung von vitalem biologischem
Ersatzmaterial mittels pulsierender Strömungen und pulsierender
Bewegung der Gerüststruktur vorzugsweise zur Züchtung
flächiger Implantate für kardiovaskuläre Strukturen
bekannt. Dabei werden die Druck- und Strömungsunterschiede
eingesetzt, um einen positiven Effekt auf die Ausreifung und Entwicklung
der Zellen in Richtung Zellwandbestandteile zu erreichen. Es werden
dabei die physiologischen Druck- und Pulsationseffekte im Blutkreislaufsystem
imitiert und sehr kontrolliert durch ein aufwendiges technisches
System reguliert.
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Vornehmlich
für die Züchtung von Knorpelgewebe wird in der
DE 103 49 484 A1 ein
Verfahren beschrieben, in dem auf ein Zellen-Matrix-System mittels
Perfusion und einem komplexen berührungsfreiem mechanischem
System pulsatile Drücke ausgeübt werden. Diese
dienen ebenfalls primär der Förderung der Reifung
und Entwicklung des Konstrukts in Knorpelgewebe und weniger der
Verteilung der Zellen.
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Die
vorgenannten geschützten Lösungen nutzen pulsatile
physikalische Parameter wie Druck und Strömung zur Stimulation
der Ausreifung, Differenzierung und Ernährung spezifischer
Gewebe und nur in zweiter Linie zur Umverteilung und Besiedelung
von dünnen Konstrukten. Zudem sind diese Parameter auf
eine langfristige Einwirkung ausgelegt und daher unmittelbar mit
dem Besiedelungsprozess kombiniert.
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(4.) Schichtweise Besiedlung von Netzstrukturen oder
sehr dünnen Gerüsten wie Vliese oder Folien und
anschließende Stapelung der Netze zu einer größeren
Gerüststruktur.
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Die
Zusammensetzung von größeren Gerüststrukturen
aus mehreren dünnen flächigen besiedelten Netzen,
Vliesen oder Folien erfüllt zwar die Ansprüche
bezüglich einer homogenen Verteilung, erfordert jedoch
hohe materialtechnische Ansprüche zur Generierung stabiler
mechanisch belastbarer Konstrukte und einen sehr hohen technischen
Aufwand zur reproduzierbaren Schichtung unter sterilen Bedingungen.
Vor allem die mechanischen Eigenschaften zur Bindegeweberegeneration
erfordern eine Vernetzung der einzelnen Schichten, die weitere chemische
Prozesse notwendig machen, die sich jedoch negativ auf das Wohlbefinden
der Zellen auswirken könnten. Zudem besteht bei der Verlagerung der
Schichten ein hohes Risiko für eine Verunreinigung. Es
ist darüber hinaus zu bedenken, dass die Zellverteilung
verfahrensbedingt ebenso eine wenn auch homogene Schichtung erfährt.
Zuletzt ist die Größe der resultierenden Gerüststrukturen
durch die aufwendigen Schichtungsprozess als begrenzt anzusehen.
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Ein
derartiges Verfahren wird beispielsweise in der Patentanmeldung
DE 199 19 242 A1 vorgeschlagen.
Hier wird eine Methode zur Herstellung von wabigen Netzstrukturen
aus polymeren Substanzen erläutert, die entweder durch
Schichtung oder mittels Rotation (Vergleiche 2.) besiedelt werden.
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Die
zu lösende Problemstellung besteht demzufolge in der verbesserten
Verteilung von Zellen in einem porösen Trägermaterial
als notwendige Voraussetzung für eine Anwendung von Zellen
zur Erzeugung vitaler biologischer Ersatzgewebe im Rahmen des Tissue
engineering (= Gewebezüchtung). Dabei soll die gleichmäßige
Verteilung einer zellulären Suspension in einem porösen
Trägermaterial in einem technisch einfachen, schnellen
und leicht auf andere Bedingungsgefüge (bezüglich
Porosität, Viskosität der Suspension oder Festkörpergeometrie,
individualisierbares Verfahren) übertragbaren Verfahren
erfolgen. Weiterhin wird eine Vorrichtung angegeben.
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Das
in den Patentansprüchen beanspruchte Verfahren und die
Vorrichtung ermöglichen auf technisch sehr einfache Weise
eine Verteilung von Zellen in einem porösen Trägermaterial
und machen sich dabei passive Kapillarkräfte und gegensinnige
pulsatile mechanische Belastungen zu Nutze. Dabei besteht das Wesen
der Erfindung darin, dass durch Deformation einer flexiblen mit
dem Trägermaterial beladenen Kammer in einem Formkörper
Druckunterschiede und daraus resultierende Strömungen durch den
Festkörper erzeugt werden. Diese ermöglichen sowohl
eine Entlüftung als auch eine homogene Verteilung der korpuskulären
Bestandteile über ein sehr einfaches und leicht steuerbares
Verfahren. Das Verfahren bzw. die Vorrichtung kann sowohl als Ausgangssituation
für die weitere Kultivierung oder zur direkten Implantation
verwendet werden, wobei lediglich eine kurzzeitige Einwirkung von
Druck und Strömung zur Verteilung einer zellulären
Suspension notwendig ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende
Verfahrensschritte gekennzeichnet:
Zur homogenen Verteilung
einer zellulären Suspension in porösem Trägermaterial
für das Tissue engineering wird in einem ersten Schritt
das zur Besiedelung vorgesehene Trägermaterial in die Kammer
eines Formkörpers eingebracht. Die Kammer ist hierbei so
gestaltet, dass durch Anpassung der Spaltgröße
zwischen der Innenwand des Formkörpers bzw. der Kammerwand
und des Trägermaterials in Abhängigkeit von der
Viskosität der einzubringenden Suspension und der Porösität
des Trägermaterials variiert werden kann. In einem zweiten
Schritt wird die Suspension von unten nach oben in die Kammer und/oder
durch einen Kanal im Trägermaterial injiziert. Danach wird
der formstabile, aus einem elastischen Material bestehende Formkörper
gegensinnig, pulsatil durch Krafteinwirkung auf die Längsseiten solange
komprimiert, bis die Suspension gleichmäßig in
dem Trägermaterial verteilt ist und das Sistieren aufsteigender
Luftblasen eine vollständige Entlüftung anzeigt.
Schließlich wird entweder bei aushärtender Suspension
das Trägermaterial mit der Suspension entnommen, gegebenenfalls
nach Auftrennen des Formkörpers bei empfindlichen Trägermaterialien.
Bei nicht aushärtender Suspension wird nach Adhäsion
der Zellen an der Gerüststruktur des Trägermaterials
dieses entnommen, um es weiter zu kultivieren oder direkt als vitales
biologisches Ersatzgewebe zu implantieren.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einem
elastischen Formkörper, in dem eine Kammer zur Aufnahme
eines Trägermaterials angeordnet ist. Idealerweise sollte
es sich dabei um ein hoch elastisches, bioinertes, preisgünstiges
Material handeln, so dass der Formkörper zu Einmalgebrauch beispielsweise
aus Silikon hergestellt werden kann. Die Elastizität des
Materials für den Formkörper, sowie der Abstand
zwischen der Innenwand der sich im Formkörper ausbildenden
Kammer und der Gerüststruktur des Trägermaterials,
sowie die Verteilung und Intensität der auf den Formkörper
wirkenden Kräfte bestimmen die Funktionsweise, da durch
diese Faktoren die pulsatilen, gegensinnigen Druckunterschiede im
Formkörper bewirkt werden.
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Durch
diese Eigenschaft unterscheidet sich die erfindungsgemäße
Lösung von den technisch hoch komplexen Bioreaktorlösungen,
da diese auf Grund der langen Einwirkung der mechanischen Effekte
sehr fein justierbare Technologien benötigen und darüber
hinaus Vorrichtungen zur Kultivierung der Zellen enthalten müssen.
Ein besonderer Vorteil ist die sehr schnelle, in der Regel innerhalb
von wenigen Sekunden erfolgende Verteilung der Suspension im Trägermaterial,
wodurch Filter- und Sedimentationseffekten auf optimale Weise entgegengewirkt werden
kann. Dabei ist die Handhabbarkeit durch die leicht zu beobachtende
Verteilung der Suspension über die nach oben offene Kammer
gegebenenfalls auch durch einen transparenten elastischen Formkörper
und der manuellen Kraftentfaltung, die durch den Spalt zwischen
dem Trägermaterial und Kammerwand, sowie der Elastizität
des Materiales einstellbar ist, sehr einfach. Einen weiteren Vorteil
stellen die Möglichkeiten der Individualisierung sowohl hinsichtlich
der Gerüststruktur des Trägermaterials als auch
der Stärke der pulsatilen Strömung durch das Konstrukt
mittels Variation des Randspaltes zwischen dem Trägermaterial
und der Kammerwand dar. Es ist daher eine große Variation
aus porösen Trägermaterial und Hydrogel-Kombinationen
anwendbar. Schließlich ist der geringe technische Aufwand,
der lediglich in der Herstellung des Modells und der anschließenden
Abformung im Gussverfahren besteht, ein entscheidender Vorteil für
die Handhabbarkeit in der Praxis, sowie die mögliche industrielle
Verwertung der erfindungsgemäßen Lösung.
Die technische Einfachheit der Lösung fördert
darüber hinaus die sterile Handhabung.
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Im
folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren
und die Vorrichtung in Ausführungsbeispielen beschrieben.
Die zugehörigen Abbildungen zeigen in
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1:
Formkörper 1 mit Kammer 2, sowie einem
Trägermaterial 3 in Form einer Gerüststruktur als
Blöckchen aus porösem Beta-TCP mit Kanüle 4.
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2:
Formkörper 1 mit Beta-TCP-Blöckchen 3 in
der Kammer 2, sowie Kanüle 4 nach Injektion
der zellulären Suspension.
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3:
Deformation des elastischen Formkörpers 1, der
mit dem Beta-TCP-Blöckchen 3 in der Kammer 2 beladen
ist.
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4:
Entfernung des Beta-TCP-Blöckchens 3 aus der Kammer 2 des
Formkörpers 1 nach Verteilung der Suspension.
Hier mit der Kanüle 4 als Hilfsmittel.
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Ausführungsbeispiel 1 (Verfahren)
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Das
Verfahren zur homogenen Verteilung einer zellulären Suspension
in porösem Trägermaterial für das Tissue
engineering verwendet einen Formkörper mit einer Kammer
mit wenigstens einer Öffnung zur Aufnahme des Trägermaterials
an der Schmalseite. Zur Besiedelung wird das Trägermaterial
in die Kammer eingebracht. Danach wird die Suspension von unten
nach oben in die Kammer injiziert. Das kann auch durch einen Kanal
im Trägermaterial erfolgen. Der formstabile, aus einem
elastischen Material be stehende Formkörper wird anschließend
gegensinnig, pulsatil durch Krafteinwirkung auf die Längsseiten
solange komprimiert, bis die Suspension gleichmäßig
in dem Trägermaterial verteilt ist und das Sistieren aufsteigender
Luftblasen eine vollständige Entlüftung anzeigt.
Schließlich wird entweder bei aushärtender Suspension
das Trägermaterial mit der Suspension entnommen, gegebenenfalls
nach Auftrennen des Formkörpers bei empfindlichen Trägermaterialien,
oder bei nicht aushärtender Suspension nach Adhäsion
der Zellen an der Gerüststruktur des Trägermaterials
dieses entnommen, um es weiter zu kultivieren oder direkt als vitales
biologisches Ersatzgewebe zu implantieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren ist sehr variabel gestaltbar.
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Zur
Erzeugung eines Modells der Gerüststruktur des Trägermaterials
wird ein polier- und bearbeitbares Material verwendet, z. B. Polymetylacrylatkunststoff,
Wachs oder Metall. Das Modell muss je nach Viskosität der
Suspension und Porosität des Trägermaterials größer
dimensioniert werden. Die Dimensionierung ist entscheidend für
die entstehenden Strömungsgeschwindigkeiten durch das poröse
Trägermaterial und damit für die Homogenität der
Verteilung der zellulären Komponente. Diese Parameter müssen
für jede Materialkombination ermittelt werden. Dies kann
im Vorfeld empirisch an Festkörper-Suspensions-Kombinationen
mit verschieden dimensionierten Kammern im Formkörper erfolgen. Dabei
ist die Geometrie des Trägermaterials nicht vorgegeben
und kann daher nach den klinischen Erfordernissen beispielsweise
in einem CAD/CAM-Verfahren hergestellt werden. Jedoch ist eine Parallelität der
Wände in Längsrichtung von Vorteil, da so die Gelmenge
reduziert und somit die Zelldichte pro Gelvolumen erhöht
werden kann.
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Zur
Erzeugung einer Kammer durch Abformung des Modells im Gussverfahren
mit einem sterilisierbaren, bioinerten, formstabilen und hochelastischen
Material werden vornehmlich Silikone verwendet. Die Form der Kammer
im Formkörper kann nach belieben gestaltet werden. Eine
zylindrische Form mit einem variablen Durchmesser je nach Größe
des Trägermaterials bietet sich jedoch auf Grund der guten
Handhabbarkeit und etablierten Form in der Zellkulturtechnik, sowie
der Möglichkeit der Rotation bei Verschluss der Kammer
des Formkörpers nach oben an. Dabei sollte die Wandstärke
je nach Elastizität des Abformmaterials eine Dicke haben,
die zuverlässig eine spontane Deformation des Formkörpers
vermeidet und gleichzeitig einen möglichst geringen Kraftaufwand
zur Deformation des Formkörpers erfordert.
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Nach
Einbringen des Trägermaterials in die Kammer des Formkörpers
wird die Suspension seitlich durch die Poren oder durch einen zentralen
Kanal von unten nach oben langsam in die Kammer injiziert. Es ist
auch möglich, die Suspension vorzulegen und das poröse
Trägermaterial gleich im Anschluss in die Kammer einzuführen.
Anschließend wird die Kammer gegensinnig, pulsatil je nach
Viskosität der Suspension schnell oder langsam komprimiert,
bis sich die Suspension gleichmäßig verteilt hat
und das Sistieren aufsteigender Luftblasen eine vollständige
Entlüftung anzeigt. Es ist von Vorteil, wenn das Flüssigkeitsvolumen,
dass das poröse Trägermaterial voll ausfüllt,
im Vorfeld berechnet oder empirisch ermittelt wird, so dass die
vollständige Ausfüllung des porösen Trägermaterials
an Hand des Füllungsstandes als zusätzliches Merkmal
kontrolliert werden kann. Dieser Prozess dauert wenige bis zu 30
Sekunden.
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Falls
die Suspension aushärtet, kann das Trägermaterial
mit dem Gel entnommen werden, gegebenenfalls nach Auftrennen des
Formkörpers bei empfindlichen Trägermaterialien,
und weiter kultiviert oder direkt als vitales biologisches Ersatzgewebe
implantiert werden. Falls die Suspension nicht aushärtet,
muss die Adhäsion der Zellen an der Gerüststruktur
des Trägermaterials abgewartet werden. Dazu kann die Kammer
im Formkörper nach Verschluss der oberen Öffnung
mit einem konfektionierten Stopfen bei zylindrischer Form auf Rollen
rotiert werden, bis mit der Adhäsion der Zellen zu rechnen
ist. Anschließend kann das Trägermaterial entnommen werden
und weiter kultiviert oder im Patienten implantiert werden.
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Ausführungsbeispiel 2 (Vorrichtung)
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Die
in 1 dargestellte Vorrichtung zur homogenen Verteilung
einer zellulären Suspension in porösem Trägermaterial 3 besteht
aus dem Formkörper 1 mit der Kammer 2 zur
Aufnahmen des zu besiedelnden Trägermaterials 3.
Als Hilfsmittel wird die Kanüle 4 eingesetzt.
Eine zylindrische äußere Form des Formkörpers 1 erweist
sich aus Sicht der guten Handhabbarkeit als besonders günstig,
da diese Form dem gängigen Erscheinungsbild eines Falcons entspricht
und daher die Handhabung im Labor einfacher ist. Die im Formkörper 1 zentrisch
in der Längsrichtung angeordnete Kammer 2 zur
Aufnahme des Trägermaterials 3 weist dessen Form
auf, etwa zur Besiedelung eines 1·1·3 cm großen
porösen Beta-TCP-Blockes (TCP – Tri-Calcium-Phosphat).
Orientiert an der Viskosität der Suspension, der Porosität
und Größe der Gerüststruktur des Trägermaterials 3,
der Dichte und Widerstandfähigkeit der Zellen wurde umseitig
eine Spalt von 1 mm Breite zwischen Trägermaterial 3 und
Innenwand der Kammer 2 gewählt. Das Trägermaterial 3 besitzt
in diesem Fall einen zentralen Perfusionskanal, der zur Injektion
genutzt wird wie dargestellt in 2. Durch
manuelle Kompression von bis zu 30 Sekunden wird erreicht, dass der
Flüssigkeitsspiegel unter Aufsteigen von Luftblasen aus
dem Trägermaterial 3 mit dem oberen Rand des Trägermaterials 3 abschließt,
siehe 3. Die Deformation des Formkörpers 1 und
damit der Kammerwände wird manuell durchgeführt.
Der Einsatz an sich bekannter mechanisch wirkender Hilfsvorrichtungen
ist möglich. Nach Ende der Verteilung der Suspension wird
der Formkörper 1 zur weiteren Aushärtung
der Suspension abgestellt. Zur Entnahme des sich aus dem Trägermaterial 3 gebildeten
Konstruktes wird entweder eine Pinzette verwendet oder die Kammer 2 mit
einem Skalpell der Länge nach aufgeschnitten. In 4 ist
die Entnahme dargestellt. Anschließend wird das besiedelte
Konstrukt nach Durchstechen des Perfusionskanales in einem Perfusionsbioreaktorsystem
zur osteogenen Differenzierung der Zellen weiter kultiviert.
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Liste der aufgeführten
Literaturstellen
-
Alvarez-Barreto,
J. F., S. M. Linehan, et al. (2007). "Flow perfusion improves
seeding of tissue engineering scaffolds with different architectures." Ann
Biomed Enq 35(3): 429–42.
-
Datta,
N., Q. P. Pham, et al. (2006). "In vitro generated extracellular
matrix and fluid shear stress synergistically enhance 3D osteoblastic
differentiation." Proc Natl Acad Sci USA 103(8): 2488–93.
-
Griffon,
D. J., M. R. Sedighi, et al. (2005). "Evaluation of vacuum
and dynamic cell seeding of polyglycolic acid and chitosan scaffolds
for cartilage engineering." Am J Vet Res 66(4): 599–605.
-
Janssen,
F. W., I. Hofland, et al. (2006). "Online measurement of
oxygen consumption by goat bone marrow stromal cells in a combined
cell-seeding and proliferation perfusion bioreactor." J
Biomed Mater Res A 79(2): 338–48.
-
van
Wachem, P. B., J. W. Stronck, et al. (1990). "Vacuum cell
seeding: a new method for the fast application of an evenly distributed
cell layer on porous vascular grafts." Biomaterials 11(8):
602–6.
-
Wang,
J., Y. Asou, et al. (2006). "Enhancement of tissue engineered
bone formation by a low pressure system improving cell seeding and
medium perfusion into a porous scaffold." Biomaterials 27(13):
2738–46.
-
Weinand,
C., I. Pomerantseva, et al. (2006). "Hydrogel-beta-TCP
scaffolds and stem cells for tissue engineering bone." Bone
38(4): 555–63.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 19962456
A1 [0013]
- - DE 10053014 A1 [0016]
- - DE 10349484 A1 [0017]
- - DE 19919242 A1 [0020]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Weinand, Pomerantseva
et al. 2006 [0008]
- - Weinand, Pomerantseva et al. 2006 [0009]
- - Janssen, Hofland et al. 2006 [0010]
- - Wachem, Stronck et al. 1990 [0012]
- - Griffon, Sedighi et al. 2005 [0012]
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