DE10053014A1 - Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial - Google Patents

Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial

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Abstract

Bei einem Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial wird ein aus dem Trägermaterial und den Zellkulturen gebildetes Zell-Gewebe-Konstrukt einer sich ändernden mechanischen Beanspruchung, insbesondere einer Kombination aus einer pulsierenden Strömung eines Zellkulturmediums und einer pulsierenden Bewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts ausgesetzt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Es ist bekannt, sogenanntes "Tissue Engineering" zur Herstellung künstlicher Binde- und Epithelgewebe sowie neuronaler Organoide auf der Basis von kultivierten Zellen und mit Hilfe verschiedenster Biomatrices außerhalb des Körpers "in vitro" herzustellen und die kultivierten Zellen dann zu implantieren. Das Tissue Engineering kombiniert Erkenntnisse aus der Medizin und Biologie mit Methoden der Ingenieurswissenschaften, und ermöglicht es, räumlich definierte Gewebe und organoide Strukturen für eine Implantation aufzubauen.
Das Konzept des Tissue Engineerings besteht darin, körpereigene Zellen auf geeignete Matrices aufzubringen, ihre Vermehrung zu steuern und ihre dreidimensionale Ausbreitung zu lenken, um einen vitalen und funktionalen Gewebeersatz zu fertigen. Zu diesem Zweck werden die körpereigenen Zellen auf einem Trägermaterial, insbesondere auf individuell ausgesuchten Filterunterlagen, Vliesen, bioabbaubaren Gerüstmaterialen oder schwammartigen Matrices verankert und in Kulturcontainern mit Nährstoffen und anderen Zusätzen versorgt. Die unter Einhaltung der Gewebedifferenzierung vermehrte und in vitro zu einer stabilen Struktur gefestigten, körpereigenen Zellen führen theoretisch zu einem vitalen, für Implantationen geeigneten Ersatzgewebe.
Neben einer gewebetypischen Differenzierung und optimalen Zellverankerung ist für die Anwendung des Tissue Engineerings eine leichte Handhabbarkeit, hohe Funktionssicherheit bei möglichst geringem apparativen Aufwand und die Gewährleistung steriler Bedingungen bei der Herstellung des biologischen Ersatzgewebes von Bedeutung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial anzugeben, mit dem insbesondere ein flächenförmiges, sogenanntes Patch-Gewebe in vitro herstellbar ist, das eine hohe und steuerbare Zellvermehrungsrate unter Beibehaltung der gewünschten Zelleigenschaften ermöglicht, das einfach handhabbar und funktionssicher sowie mit geringem apparativen Aufwand unter Gewährleistung steriler Bedingungen anwendbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial gelöst, bei dem ein aus dem Trägermaterial und den Zellkulturen gebildetes Zell-Gewebe-Konstrukt einer sich ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.
Die erfindungsgemäße Lösung gewährleistet die Herstellung eines vitalen, stabilen und funktionellen Ersatzgewebes, insbesondere eines flächenförmigen Patch-Gewebes in vitro, das eine hohe und steuerbare Zellvermehrungsrate unter Beibehaltung der gewünschsten Zelleigenschaften ermöglicht und das einfach handhabbar sowie funktionssicher und mit geringem apparativen Aufwand unter Sicherstellung steriler Bedingungen anwendbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von flächenförmigen Gewebestücken für kardiovaskuläre Strukturen.
Vorzugsweise wird das Zell-Gewebe-Konstrukt einer sich periodisch ändernden mechanischen Beanspruchung, insbesondere einer pulsierenden Druckbeanspruchung, ausgesetzt.
Um eine adäquate extrazelluläre Matrixbildung zur Herstellung eines lebendigen Patch- Gewebes in vitro zu induzieren, wird das Zell-Gewebe-Konstrukt einem gewebestimulierenden Fluß des Zellkulturmediums ausgesetzt, indem eine Kombination aus einer pulsierenden Strömung und einer pulsierenden Bewegung des Zell-Gewebe- Konstrukts auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkt.
Vorzugsweise erfolgt die auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkende pulsierende Bewegung abwechselnd nach beiden Seiten des Zell-Gewebe-Konstrukts, insbesondere bei einem waagerecht angeordneten Zell-Gewebe-Konstrukt durch Heben und Senken des Zell-Gewebe-Konstrukts.
Als besonders geeignetes Trägermaterial hat sich ein resorbierbares bzw. bioabbaubares Gewebegerüst, insbesondere ein resorbierbares Gerüstmaterial, zur optimalen Zellverankerung und damit zum Erhalt von gewebetypischen Eigenschaften erwiesen.
Zur Wachstumssteuerung des vitalen Ersatzgewebes unter Wahrung der Zellverankerung im Trägermaterial und damit der biologischen und funktionalen Eigenschaften des Patches sind in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Lösung die Amplitude der vorzugsweise senkrecht zur Oberfläche des Zell-Gewebe- Konstrukts gerichteten pulsierenden Bewegung und die Strömungsgeschwindigkeit des Zellkulturmediums veränderbar, d. h. die gepumpte Flüssigkeitsmenge kann durch Einstellung der Frequenz und des Pumpvolumens eines entsprechenden Antriebsaggregates für das Zellkulturmedium beliebig variiert werden.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung vitaler und funktionaler Ersatzgewebestücke (Patch-Gewebe) nach dem Prinzip des Tissue-Engineerings unter Verwendung eines resorbierbaren Trägermaterials, das mit vaskulären Zellen besiedelt und in vitro zu einem Zell-Gewebe-Konstrukt zur Bildung einer adäquaten, extrazellulären Matrix konditioniert wird, insbesondere zur Rekonstruktion kardiovaskulärer Strukturen, ist dadurch gekennzeichnet, daß das Zell- Gewebe-Konstrukt einem das Zell-Gewebe-Konstrukt in wechselnde Richtung pulsierend bewegenden pulsatilen Fluß einer Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt wird.
Vorzugsweise wirkt der pulsatile Fluß sowohl senkrecht als auch im wesentlichen parallel zur Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts auf das Zell-Gewebe-Konstrukt ein. Dabei wird durch Ausüben eines wechselnden Druckes auf die das Zell-Gewebe- Konstrukt umgebende Zellkulturflüssigkeit sowohl eine Bewegung des Zell-Gewebe- Konstrukts senkrecht zu dessen Oberfläche als auch eine Strömungsbewegung der Zellkulturflüssigkeit entlang der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts erzeugt.
Vorzugsweise wird eine Strömungsrichtung der am Zell-Gewebe-Konstrukt vorbeibewegten Zellkulturflüssigkeit vorgegeben.
Zur Optimierung der Herstellung des vitalen Ersatzgewebes wird das Zell-Gewebe- Konstrukt in der Weise mechanisch beaufschlagt, daß die Zellkulturflüssigkeit an der einen Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts entlangströmt, während die andere Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts bzw. das Gewebegerüst mit Zellkulturflüssigkeit befeuchtet wird. Diese das Gewebegerüst befeuchtende Zellkulturflüssigkeit wird in vorgegebenen Intervallen abgesaugt und ausgetauscht.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Vorrichtung geeignet, die aus einem Bioreaktor zur Aufnahme des Zell-Gewebe-Konstrukts, einem mit dem Bioreaktor verbundenen und auf das Zellkulturmedium einwirkenden Antriebsaggregat und einem mit dem Bioreaktor über eine Zufuhr- und eine Abflußleitung verbundenen Behälter für das Zellkulturmedium besteht.
Eine derartige Vorrichtung ermöglicht einen kompakten Aufbau sowie ein Höchstmaß an Sterilität bei der Erzeugung eines vitalen Ersatzgewebes sowie eine einfache Handhabung und optimale Einflußnahme auf die Steuerungsmechanismen beim Wachstum des vitalen Ersatzgewebes.
Das Antriebsaggregat ist so beschaffen, daß es mittelbar oder unmittelbar einen wechselnden Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt sowie auf das Zellkulturmedium zur Erzeugung einer mechanischen Wechselbewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts und eines pulsatilen Flusses des Zellkulturmediums ausübt. Eine unmittelbare Einwirkung des Antriebsaggregates auf das Zell-Gewebe-Konstrukt kann beispielsweise in der Weise erfolgen, daß das mit Zellkulturen besiedelte und in einer Zellkulturflüssigkeit befindliche Trägermaterial mechanisch bewegt wird und dabei neben einer mechanischen Wechselbewegung auch eine Fließbewegung der Zellkulturflüssigkeit hervorruft, die durch entsprechende Steuerungsmittel in einen pulsatilen Fluß umgesetzt wird.
Vorzugsweise besteht das Antriebsaggregat jedoch aus einer im wesentlichen parallel zur Ausrichtung des Zell-Gewebe-Konstrukts angeordneten Membranpumpe, zwischen der und dem Zell-Gewebe-Konstrukt sich das Zellkulturmedium befindet.
Zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts im Bioreaktor dient eine das Zell-Gewebe- Konstrukt an seinem Randbereich einspannende Haltevorrichtung des Bioreaktors, so daß beide Oberflächen des Zell-Gewebe-Konstrukts in geeigneter Weise mit dem Zellkulturmedium beaufschlagt werden können.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bioreaktors ist dadurch gekennzeichnet, dass dieser mehrere übereinander angeordnete Kammern aufweist, von denen eine untere Kammer die Membranpumpe bildet, eine mittlere Kammer von der unteren Kammer durch die Membran der Membranpumpe und von einer oberen Kammer durch das Zell-Gewebe-Konstrukt getrennt und über die Zufuhr- und Abflußleitung mit dem Reservoir für das Zellkulturmedium verbunden ist und damit Zellkulurmedium enthält und daß die obere Kammer die das Zell-Gewebe-Konstrukt einspannende Haltevorrichtung sowie Zellkulturmedium enthält.
Zur Versorgung des Zell-Gewebe-Konstrukts mit dem Zellmedium bzw. mit Zellkulturflüssigkeit und zur mechanischen Beanspruchung des Zell-Gewebe-Konstrukts durch eine gerichtete Flüssigkeitsströmung weist die mittlere Kammer zwei diametral zueinander angeordnete Schlauchanschlüsse auf und von den Schlauchanschlüssen zu dem Zell-Gewebe-Konstruktführen Bohrungen und zumindest in der Zufuhr- oder der Abflußleitung ist ein Rückschlagventil angeordnet.
Zur mechanischen Beanspruchung und zur Erzeugung eines pulsatilen Flusses besteht die Membranpumpe aus der die untere Kammer von der mittleren Kammer trennenden Membran und einem mit der unteren Kammer über eine Druckleitung verbundenen Beatmungsgerät, einer Infusionspumpe oder dergleichen zur periodischen Erzeugung eines Über- und Unterdrucks in der unteren Kammer.
Die zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts vorgesehene Haltevorrichtung besteht vorzugsweise aus einem zylindrischen Stempel, dessen kreisförmige Grundfläche das Zell-Gewebe-Konstrukt gegen einen oberen Rand der mittleren Kammer drückt, einem Stützdeckel, der mit einem Gehäuseteil des Bioreaktors verbunden ist, und einem Stellelement, das die der kreisförmigen Grundfläche des zylindrischen Stempels entgegengesetzte Deckfläche am Stützdeckel abstützt.
Zum Austausch von Zellkulturflüssigkeit und zur sterilen Abdichtung des Bioreaktors weisen die Deckfläche des zylindrischen Stempels und der Stützdeckel mindestens eine Bohrung auf und ein über den Stützdeckel greifender und mit dem Gehäuseteil des Bioreaktors verbindbarer zylinder- oder topfförmiger Deckel schließt die obere Kammer ab.
Zur Erleichterung der im Bioreaktor ablaufenden Prozesse und zur Kontrolle der einzelnen Funktionen des Bioreaktors besteht dieser vorteilhafterweise aus einem durchsichtigen Material, vorzugsweise aus Acryl.
Zur Einhaltung optimaler Randbedingungen bei der Herstellung von biologischem Ersatzgewebe in-vitro sind der Bioreaktor, das Reservoir für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen in einem Inkubator angeordnet und der Bioreaktor ist über die Druckleitung mit dem außerhalb des Inkubators angeordneten Beatmungsgerät, der Infusionspumpe oder dgl. verbunden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von vitalem Ersatzgewebe und insbesondere eines vitalen Patch-Gewebes in vitro sowie ein Ausführungsbeispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollen anhand der Zeichnungsfiguren dargestellt werden. Es zeigen
Fig. 1 und 2 eine schematische Darstellung der mechanischen Beanspruchung eines Zell-Gewebe-Konstrukts in verschiedenen Bewegungsphasen;
Fig. 3 und 4 zeitliche Darstellungen des auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkenden Druckes und der Strömungsgeschwindigkeit eines Zellkulturmediums;
Fig. 5 einen Schnitt durch einen insbesondere zur Herstellung eines vitalen Patch-Gewebes geeigneten Bioreaktors;
Fig. 6 einen Schnitt durch den Bioreaktor gemäß Fig. 5 entlang der Linie VI- VI;
Fig. 7 einen Schnitt durch den Bioreaktor gemäß Fig. 5 entlang der Linie VII-VII und
Fig. 8 eine schematische Darstellung eines Versuchsaufbaus für die Herstellung von biologisch-funktionalem Ersatzgewebe.
Die schematischen Darstellungen der Fig. 1 und 2 sollen die Prinzipien des neuen Flußsystems zur Herstellung eines Patch-Gewebes in vitro durch eine kombinierte mechanische Beanspruchung eines Zell-Gewebe-Konstrukts in Verbindung mit einem gewebestimulierenden Fluß zur Induzierung einer adäquaten extrazellulären Matrixbildung erläutern.
Das in einer Haltevorrichtung 7 eingespannte Zell-Gewebe-Konstrukt 1 besteht vorzugsweise aus einem Trägermaterial in Form eines resorbierbaren Gewebegerüsts, das beispielsweise mit vaskulären Zellen besiedelt ist. Das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 wird in einer ersten Phase gemäß Fig. 1 von der Unterseite her mit einem Überdruck P1 beaufschlagt, so daß das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 nach oben gewölbt wird. Gleichzeitig wird ein gewebestimulierender Fluß F erzeugt, der von einer Einlaßleitung 41 zu einer Auslaßleitung 42 fließt und dabei an der Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 entlangströmt.
In einer zweiten Bewegungsphase gemäß Fig. 2 wird unterhalb des Zell-Gewebe- Konstrukts 1 anstelle eines Überdrucks ein Unterdruck P2 erzeugt, der das Zell-Gewebe- Konstrukt 1 nach unten ablenkt. In dieser Bewegungsphase ist die Strömung des Zellkulturmediums unterbrochen.
Durch diese kombinierte Bewegung wird das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 sowohl einem pulsatilen Fluß F als auch einem wechselnden Druck P1 bzw. P2 und damit einer mechanischen Beanspruchung ausgesetzt. Ein Beispiel für die Erzeugung dieser wechselnden, mechanischen Beanspruchung des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 wird nachstehend in Verbindung mit der Beschreibung eines Bioreaktors gemäß Fig. 5 näher erläutert.
Fig. 3 zeigt einen typischen Verlauf der Druckbeanspruchung des Zell-Gewebe- Konstrukts mit einem abwechselnd nach einer Sinusfunktion auf das Zell-Gewebe- Konstrukt einwirkendem Überdruck und Unterdruck. Fig. 3 verdeutlicht, daß der auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkende Überdruck größere Druckwerte erreicht als der auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkende Unterdruck.
Fig. 4 zeigt eine zeitliche Darstellung des auf das Zell-Gewebe-Konstrukt einwirkenden pulsatilen Flusses, dessen Strömungsgeschwindigkeit bei zunehmendem, auf das Zell- Gewebe-Konstrukt einwirkendem Überdruck ebenfalls sinusförmig zunimmt, während er bei auf das Zell-Gewebe-Konstrukteinwirkendem Unterdruck im wesentlichen auf Null absinkt, wobei die dargestellten Schwingungen durch die systembedingte Reibung infolge der laminaren Strömung der Zellkulturflüssigkeit und die Bewegung des Zell- Gewebe-Konstrukts bedingt sind.
Fig. 5 zeigt einen Schnitt durch einen Bioreaktor 2 zur Herstellung eines Patch-Gewebes in vitro, mit dessen Hilfe das Zell-Gewebe-Konstrukt sowohl einer mechanischen Beanspruchung als auch einem gewebestimulierenden, pulsatilen Fluß ausgesetzt wird, um eine adäquate extrazelluläre Matrixbildung zu induzieren.
Der Bioreaktor 2 weist eine untere Kammer 3 auf, die durch ein erstes Gehäuseteil 30 und eine Silikonmembran 6 abgegrenzt wird. Die untere Kammer 3 ist mit Luft oder einem geeigneten Gas gefüllt und weist einen Schlauchanschluß 31 auf, an den über einen Schlauch ein Antriebsaggregat, beispielsweise in Form eines Beatmungsgerätes, einer Infusionspumpe oder dergleichen angeschlossen wird. Ein entsprechendes Antriebsaggregat kann beispielsweise aus einem sogenannten "dual phase control ventilator" oder einer der WO 96/25963 zu entnehmenden Infusionspumpe bestehen. Oberhalb der Silikonmembran 6 befindet sich eine mittlere Kammer 4, die durch ein zweites Gehäuseteil 40, die Silikonmembran 6 und durch das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 begrenzt wird. In der mittleren Kammer 4 befindet sich Zellkulturflüssigkeit mit einem Volumen von beispielsweise 370 ml. Unterhalb des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 befinden sich zwei Bohrungen 41, 42, die mit Schlauchanschlüssen 43, 44 kommunizieren, die am zweiten Gehäuseteil 40 des Bioreaktors 2 befestigt sind. Die beiden Bohrungen 41, 42 sind diametral zueinander angeordnet und auf die Unterseite des Zell-Gewebe- Konstrukts 1 gerichtet.
Die beiden Schlauchanschlüsse 43, 44 sind gemäß Fig. 8 über Silikonschläuche mit einem Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit verbunden.
Eine obere Kammer 5 wird durch ein drittes Gehäuseteil 50, einen den Bioreaktor 2 zur Oberseite abschließenden und abdichtenden Deckel 10 und an seiner Unterseite durch das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 abgegrenzt. Innerhalb der oberen Kammer 5 ist eine Haltevorrichtung zum Fixieren des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 angeordnet, die aus einem zylindrischen Stempel 7 und einer Spannvorrichtung 8, 9 besteht. Der zylindrische Stempel 7 preßt mit seiner kreisförmigen Grundfläche das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 gegen den oberen Rand des zweiten Gehäuseteils 40. Der hierfür erforderliche Stempeldruck wird durch eine Rändelschraube 9 erzeugt, die die Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 gegen einen am dritten Gehäuseteil 50 des Bioreaktors 2 abgestützten Stützdeckel 8 vorspannt. Zum Fixieren des Anpreßdruckes ist eine Kontermutter 90 vorgesehen, die die Stellung der Rändelmutter 9 sichert.
In der oberen Kammer 5 befindet sich ebenfalls Zellkulturflüssigkeit mit einem Volumen von beispielsweise 40 ml, deren Zugänglichkeit durch Bohrungen 72 bis 74 bzw. 81-83 (Fig. 6 und 7) in der Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 bzw. in dem Stützdeckel 8 sowie den vom dritten Gehäuseteil 50 lösbaren, topfförmigen Deckel 10 gewährleistet ist.
Die Abdichtung des Innenraums des Bioreaktors 2 zur Einhaltung steriler Bedingungen für das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 wird durch einen Silikon-O-Ring 11 an den aufeinanderstoßenden Stirnflächen des zweiten Gehäuseteils 40 und des dritten Gehäuseteils 50, die die mittlere Kammer 4 und obere Kammer 5 begrenzen sowie durch die Silikonmembran 6 gewährleistet.
Für die Gehäuseteile 30, 40, 50 sowie für den topfförmigen Deckel 10 wird Acryl als Material verwendet und die Anschlußverbindungen sowie Verbindungen der Gehäuseteile werden über Edelstahlschrauben bewirkt.
In die Fig. 6 und 7 sind Draufsichten auf den Stützdeckel 8 sowie die Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 mit den darin angeordneten Bohrungen 72 bis 74 bzw. 81 bis 83 zum Austausch von Zellkulturflüssigkeit dargestellt.
Fig. 8 zeigt einen Versuchsaufbau in schematischer Darstellung mit dem Bioreaktor 2, der zusammen mit dem Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit und einer Ringleitung 16 aus Silikonschläuchen zur Zufuhr und zum Abfluß von Zellkulturflüssigkeit in einem Inkubator 12 angeordnet sind. Über eine Druckleitung 17 ist der Bioreaktor 2 mit einem Beatmungsgerät 11 als Antriebsaggregat verbunden, das außerhalb des Inkubators 12 angeordnet ist.
In die Ringleitung 16, d. h. in den das Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit mit den Schlauchanschlüssen 43, 44 der mittleren Kammer 4 verbindenden Silikonschläuchen sind Rückschlagventile 13, 14 angeordnet, die eine Fließrichtung der Zellkulturflüssigkeit vorgeben.
In Betrieb weist der Bioreaktor 2 folgende Funktionen auf:
Im Ruhezustand ist die Silikonmembran 6 infolge der Schwerkraft und der in der mittleren Kammer 4 befindlichen Zellkulturflüssigkeit nach unten, d. h. in die untere Kammer 3 durchgewölbt. Erzeugt das Antriebsaggregat 12 einen Überdruck in der unteren Kammer 3, so bewirkt dieser Überdruck nach dem Prinzip einer Membranpumpe eine Bewegung der Silikonmembran 6 nach oben, d. h. in die mittlere Kammer 4 hinein und damit eine Volumenverkleinerung der mit Zellkulturflüssigkeit gefüllten mittleren Kammer 4. Durch diese Wölbung der Silikonmembran 6 wird gemäß Fig. 1 ein von der mittleren Kammer 4 zur oberen Kammer 5 gerichteter Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 ausgeübt, so daß sich das Zell-Gewebe-Konstrukt 1 in die obere Kammer 5 hineinwölbt.
Gleichzeitig fließt durch den in der mittleren Kammer 4 erzeugten Überdruck überschüssige Zellkulturflüssigkeit über eine der beiden diametral zueinander angeordneten Bohrungen 41, 42 sowie einen der beiden den Bohrungen 41, 42 zugeordneten Schlauchanschlüsse 43, 44 und die daran angeschlossenen Silikonschläuche der Ringleitung 16 in das Reservoir 15 für Zellkulturflüssigkeit ab.
In der zweiten Pumpphase wird mittels des Antriebsaggregats 12 ein Unterdruck in der unteren Kammer 3 erzeugt und dadurch die Silikonmembran 6 in die untere Kammer 3 hineingezogen. Die dadurch in der mittleren Kammer 4 bewirkte Volumenvergrößerung sorgt dafür, daß Zellkulturflüssigkeit aus dem Reservoir 15 über eine der beiden Bohrungen 41, 42 angesaugt wird. Durch die vorgegebene Flußrichtung und die auf die Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 gerichteten Bohrungen 41, 42 strömt Zellkulturflüssigkeit an der Unterseite des Zell-Gewebe-Konstrukts 1 bzw. Patch- Gewebes entlang und wölbt das Zell-Gewebe-Konstrukt nach unten in die mittlere Kammer 4 gemäß Fig. 2 durch.
Der Zyklus beginnt von neuem, wenn das Antriebsaggregat 12 wieder einen Überdruck in der unteren Kammer 3 erzeugt und dadurch bedingt die Silikonmembran 6 sich in die mittlere Kammer 4 hineinwölbt. Bei diesen Vorgängen wölbt sich das Zell-Gewebe- Konstrukt 1 jeweils in die obere Kammer 5 oder mittlere Kammer 4 durch und wird parallel dazu einem pulsatilen Fluß der Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt, die infolge der Rückschlagklappen 13, 14 gemäß Fig. 8 gerichtet an der Unterseite des Zell-Gewebe- Konstrukts 1 entlangströmt. Auf diese Weise wird das Zell-Gewebe-Konstrukt sowohl einer mechanischen (Druck-) Beanspruchung als auch einem pulsatilen Fluß ausgesetzt.
Die in der oberen Kammer 5 befindliche Zellkulturflüssigkeit dient der Befeuchtung des Trägermaterials und wird in bestimmten Intervallen über die Bohrungen 72 bis 74 und 81 bis 83 im Stützdeckel 8 bzw. in der Deckfläche 71 des zylindrischen Stempels 7 abgesaugt und ausgetauscht.
Durch Einstellung der Frequenz und des Pumpvolumens des Beatmungsgeräts 12 kann die gepumpte Flüssigkeitsmenge der Zellkulturflüssigkeit beliebig variiert werden.

Claims (26)

1. Verfahren zur In-vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung von Zellkulturen und einem Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus dem Trägermaterial und den Zellkulturen gebildetes Zell-Gewebe- Konstrukt (1) einer sich ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Gewebe- Konstrukt (1) einer sich periodisch ändernden mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell- Gewebe-Konstrukt (1) einer pulsierenden Druckbeanspruchung ausgesetzt wird.
4. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) der Kombination einer pulsierenden Strömung eines Zellkulturmediums und einer pulsierenden Bewegung ausgesetzt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die pulsierende Bewegung abwechselnd nach beiden Seiten des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das waaagerecht eingespannte Zell-Gewebe-Konstrukt (1) angehoben und abgesenkt wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplitude der vorzugsweise senkrecht zur Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) gerichteten pulsierenden Bewegung und die Strömungsgeschwindigkeit des Zellkulturmediums veränderbar sind.
8. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche zur Herstellung vitaler und funktionaler Ersatzgewebestücke (Patch-Gewebe) nach dem Prinzip des Tissue-Engineerings unter Verwendung eines resorbierbaren Trägermaterials, das mit vaskulären Zellen besiedelt und in vitro zu einem Zell-Gewebe-Konstrukt zur Bildung einer adäquaten, extrazellulären Matrix konditioniert wird, insbesondere zur Rekonstruktion kardiovaskulärer Strukturen, dadurch gekennzeichnet, daß das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) einem das Zell-Gewebe- Konstrukt (1) in wechselnde Richtung pulsierend bewegenden pulsatilen Fluß einer Zellkulturflüssigkeit ausgesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pulsatile Fluß sowohl senkrecht als auch im wesentlichen parallel zur Oberfläche des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) auf das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) einwirkt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß durch Aus­ üben eines wechselnden Druckes auf die das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) umge­ bende Zellkulturflüssigkeit sowohl eine Bewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) senkrecht zu dessen Oberfläche als auch eine Strömungsbewegung der Zell­ kulturflüssigkeit entlang der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) erzeugt wird.
11. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Strömungsrichtung der am Zell-Gewebe- Konstrukt (1) vorbeibewegten Zellkulturflüssigkeit vorgegeben wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturflüssigkeit an der einen Oberfläche des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) entlangströmt und dass die andere Oberfläche des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) bzw. das Gewebegerüst mit Zellkulturflüssigkeit befeuchtet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die das Gewebegerüst befeuchtende Zellkulturflüssigkeit in vorgebbaren Intervallen abgesaugt und ausgetauscht wird.
14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Bioreaktor (2) zur Aufnahme des Zell-Gewebe-Konstrukts (1), ein mit dem Bioreaktor (2) verbundenes und auf das Zellkulturmedium einwirkendes Antriebsaggregat (6, 12) und ein mit dem Bioreaktor (2) über eine Zufuhr- und eine Abflußleitung (16, 17) verbundenes Reservoir (15) für das Zellkulturmedium.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Antriebsaggregat (6, 12) mittelbar oder unmittelbar einen wechselnden Druck auf das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) sowie auf das Zellkulturmedium zur Erzeugung einer mechanischen Wechselbewegung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) und eines pulsatilen Flusses des Zellkulturmediums ausübt.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antriebsaggregat aus einer im wesentlichen parallel zur Ausrichtung des Zell- Gewebe-Konstrukts (1) angeordneten Membranpumpe (6, 12) besteht, wobei sich zwischen der Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) und der Membranpumpe das Zellkulturmedium befindet.
17. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 16, gekennzeichnet durch eine das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) an seinem Randbereich einspannende Haltevorrichtung (7, 8) des Bioreaktors (2) und eine beidseitige Beaufschlagung des Zell-Gewebe-Konstrukts (1) mit dem Zellkulturmedium.
18. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreaktor (2) mehrere übereinander angeordnete Kammern (3, 4, 5) aufweist, von denen eine untere Kammer (3) die Membranpumpe (6, 12) bildet, eine mittlere Kammer (4) von der unteren Kammer (3) durch die Membran (6) der Membranpumpe (6, 12) und von einer oberen Kammer (5) durch das Zell-Gewebe-Konstrukt (1) getrennt und über die Zufuhr- und Abflußleitung (16, 17) mit dem Reservoir (15) für das Zellkulturmedium verbunden ist und daß die obere Kammer (5) die das Zell- Gewebe-Konstrukt (1) einspannende Haltevorrichtung (7, 8) sowie Zellkulturmedium enthält.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Kammer (4) zwei diametral zueinander angeordnete Schlauchanschlüsse (43, 44) aufweist, daß Bohrungen (41, 42) von den Schlauchanschlüssen (43, 44) zu dem Zell-Gewebe-Konstrukt (1) führen und daß zumindest in der Zufuhr- oder der Abflußleitung (16, 17) ein Rückschlagventil (13, 14) angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranpumpe (6, 12) aus der die untere Kammer (3) von der mittleren Kammer (4) trennenden Membran (6) und einem mit der unteren Kammer (3) über eine Druckleitung (19) verbundenen Beatmungsgerät (12), einer Infusionspumpe oder dergleichen zur periodischen Erzeugung eines Über- und Unterdrucks in der unteren Kammer (3) besteht.
21. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltevorrichtung (7, 8) aus einem zylindrischen Stempel (7), dessen kreisförmige Grundfläche (70) das Zell- Gewebe-Konstrukt (1) gegen einen oberen Rand der mittleren Kammer (4) drückt, einem Stützdeckel (8), der mit einem Gehäuseteil (50) des Bioreaktors (2) verbunden ist, und einem Stellelement (9) besteht, das die der kreisförmigen Grundfläche (70) des zylindrischen Stempels (7) entgegengesetzte Deckfläche (71) am Stützdeckel (8) abstützt.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckfläche (71) des zylindrischen Stempels (7) und der Stützdeckel (8) mindestens eine Bohrung (72-74; 81-83) aufweisen und daß ein über den Stützdeckel (8) greifender und mit dem Gehäuseteil (50) des Bioreaktors (2) verbindbarer zylinder- oder topfförmiger Deckel (10) die obere Kammer (5) abschließt.
23. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreaktor (2) aus einem durchsichtigen Material, vorzugsweise aus Acryl, besteht.
24. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran als Silikonmembran (6) ausgebildet ist.
25. Vorrichtung nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreaktor (2), das Reservoir (15) für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen (16, 17) steril abgedichtet sind.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreaktor (2), das Reservoir (15) für das Zellkulturmedium und die Verbindungsleitungen (16, 17) in einem Inkubator (18) angeordnet und der Bioreaktor (2) über die Druckleitung (19) mit dem außerhalb des Inkubators (18) angeordneten Beatmungsgerät (12), der Infusionspumpe oder dgl. verbunden ist.
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