DE3850652T2

DE3850652T2 - Zellenzuchtverfahren und vorrichtung.

Info

Publication number: DE3850652T2
Application number: DE3850652T
Authority: DE
Inventors: Kenji Baba; Ryoichi Haga; Masahiko Ishida; Kazuyuki Itoh; Masayoshi Kubota; Harumi Matsuzaki; Yuusaku Nishimura; Setsuo Saitou; Hayao Yahagi; Tetsuo Yamaguchi
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2008-09-06
Also published as: WO1989002458A1; EP0336966B1; DE3850652D1; EP0336966A4; EP0336966A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung biologischer Zellen und insbesondere ein Zellzüchtungsverfahren im großen Maßstab und bei hoher Konzentration sowie eine Vorrichtung dafür, die eine wirksame Entfernung von Schaum, der durch eine Submersbelüftung gebildet wird, ermöglicht.
In den letzten Jahren ist mit der Herstellung von Arzneistoffen, wie Interferon, nicht nur durch Züchtung mikrobieller Zellen, d. h. Bakterienzellen, was auf diesem Gebiet üblicherweise durchgeführt wird, sondern auch durch Züchtung von tierischen Zellen begonnen worden.
Um diese Arzneistoffe in einem großtechnischen Maßstab herzustellen, ist es erforderlich, ein Züchtungsverfahren anzuwenden, das es ermöglicht, Zellen in einer hohen Konzentration in einem großen Maßstab in einem stabilen Zustand für eine lange Zeitspanne zu züchten. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines Zellzüchtungsverfahrens, das die Anforderungen hinsichtlich:
(1) einer Technik zur Abtrennung biologischer Zellen von einem Medium und zur Zufuhr eines frischen Mediums; und
(2) einer Technik zur Zufuhr von Sauerstoff, der für das Wachstum biologischer Zellen erforderlich ist, erfüllt.
Um die vorstehend genannte Anforderung (1) zu erfüllen, ist es erforderlich, aseptisch Zellen, die in einem Medium suspendiert sind, abzutrennen und zu konzentrieren. Wenn Zellen ohne Austausch des Mediums gezüchtet werden, dann beträgt die maximale Zellkonzentration etwa 2 · 10&sup6;/ml bei den meisten Zellsystemen. Andererseits kann die Zellkonzentration auf mindestens 10&sup7;/ml durch Abtrennen und Konzentrieren der Zellen, die im Medium enthalten sind, und Fortsetzen der Züchtung in einem frischen Medium erhöht werden, was zu einer Verringerung der Größe des Züchtungsbehälters und zu einer Verkürzung der Züchtungszeit beiträgt.
Die Zentrifugation wird zwar im allgemeinen bei Tests geringer Größe angewandt, es ist jedoch schwierig, die Zentrifugation aseptisch in einem großen Maßstab durchzuführen, und zwar vom Standpunkt der Zeit, die zum Austausch des Mediums erforderlich ist, und der Komplexität des Verfahrens. Aus diesem Grund ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, bei dem die Zufuhr von frischem Medium in den Züchtungsbehälter und die Entfernung von Abfallkomponenten, die als Nebenprodukt von den Zellen gebildet werden, gleichzeitig mit der Abtrennung und der Konzentration der Zellen durchgeführt werden. Zum Beispiel schlagen JP-B-16635/1980 und JP-A-265/1987 jeweils ein Verfahren vor, bei dem eine Zellsedimentationszone innerhalb eines Züchtungsbehälters bereitgestellt wird und ein frisches Medium dem Züchtungsbehälter zugeführt wird, während der überstand aus der Sedimentationszone abgelassen wird. JP-A-257181/1986, JP-B-12989/1987 und JP-B-12990/1987 schlagen jeweils ein Verfahren vor, bei dem eine Hohlfasermembran mit einer Wand, die einen Durchtritt von Medium erlaubt, die jedoch nicht den Durchtritt von Zellen erlaubt, bereitgestellt wird, und bei dem die Zufuhr von frischem Medium und die Entfernung von Nebenprodukten dadurch durchgeführt werden.
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebene Anforderung (2), d. h. im Hinblick auf eine Technik zur Zufuhr von Sauerstoff, werden Maßnahmen zum direkten Durchleiten von Luft oder mit Sauerstoff angereicherter Luft durch ein Medium bei der herkömmlichen Züchtung von Mikroorganismen und dergl. angewandt. Bei vielen der flüssigen Medien, die zum Züchten von Zellen verwendet werden, oder bei zellhaltigen Medien besteht jedoch die Gefahr der Schaumbildung. Insbesondere beim Züchten von tierischen Zellen, bei dem ein Serum zugegeben ,wird, tritt ein bemerkenswert starkes Schäumen des Mediums aufgrund der Biopolymere, die im Serum enthalten sind, und derjenigen, die während des Züchtens abgesondert werden, auf. Der gebildete Schaum wird kaum zerstört, selbst wenn Scherkräfte mechanisch darauf angewandt werden, füllt den Gasphasenanteil des Züchtungsbehälters und fließt schließlich nach außen aus dem System.
Wenn ohne weiteres schäumende Medien verwendet werden, ist es erforderlich, Sauerstoff dem Medium durch Lösen von Sauerstoff im Medium zuzuführen, so daß es nicht zum Schäumen kommt, oder den durch die Submersbelüftung gebildeten Schaum zu zerstören.
Das erstgenannte Verfahren wird hauptsächlich angewandt und umfaßt das Zuführen von Sauerstoff in den Gasphasenanteil des Züchtungsbehälters, um den Sauerstoff im Medium von der Flüssigkeitsoberfläche her zu lösen. Bei diesem Verfahren ist es üblich, das Medium zu rühren, um einen verbesserten Kontakt des Mediums mit Sauerstoff zu erzielen, oder die Menge an zugeführtem Sauerstoff zur Verbesserung des Kontakts des Sauerstoffs mit der Flüssigkeitsoberfläche zu erhöhen.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wird in JP-A- 74574/1986, JP-A-36915/1986 und JP-A-259179/1985 beschrieben.
Keine wirksame Entschäumungstechnik ist im Hinblick auf ein Verfahren zum Zuführen von Sauerstoff durch Submersbelüftung entwickelt worden. Genauer gesagt ist nur ein Vorschlag für ein Verfahren gemacht worden, bei dem Schaum bei einem Züchtungsverfahren mechanisch mit Hochgeschwindigkeits- Rührerblättern zerstört wird, wobei das Verfahren für einige Mikroorganismen mit starken Zellwänden, die eine hohe Proliferationsgeschwindigkeit zeigen, gedacht ist (vgl. JP-A- 13464/1979 und JP-B-12108/1981). Bei diesem Verfahren sollte ein Hochgeschwindigkeitsantriebsabschnitt im Behälter bereitgestellt werden, was zu einer komplizierten Struktur des Behälters führt. Dieses Verfahren kann nicht auf tierische Zellen angewandt werden, da sie schwach gegenüber dieser Art von Scherkräften sind.
Ferner beschreibt JP-61-283 311 ein Entschäumungssystem, das ein auf ein Sieb aufgebrachtes Teflonpulver umfaßt. Dieses System wird jedoch für das Entschäumen bei der Züchtung von Mikroorganismen, wie Hefen, und nicht bei der Züchtung lebender Zellen verwendet. Starker Schaum, wie er bei dem Verfahren zum Züchten lebender Zellen gebildet wird, kann nicht in wirksamer Weise durch den vorgeschlagenen Feststoff zerstört werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Zellzüchtungsverfahren und eine Vorrichtung dafür bereit zustellen, die es ermöglichen, ein Medium ohne Beeinträchtigung der Proliferation der Zellen zu entschäumen.
Die vorstehend beschriebene Aufgabe kann durch das Verfahren und die Vorrichtung, wie sie in den Ansprüchen 1 und 2 dargelegt werden, gelöst werden.
Das erfindungsgemäße Zellzüchtungsverfahren wird für die proliferierende Züchtung biologischer Zellen verwendet und umfaßt einen Züchtungsbehälter, eine Einrichtung zum Abtrennen von Zellen von einem Medium, eine Einrichtung zur Entfernung von Abfallprodukten, eine Einrichtung zum Zurückführen eines Mediums nach der Entfernung von Abfallkomponenten in den Züchtungsbehälter und Rohrleitungen zur Verbindung dieser Elemente.
Im Züchtungsgefäß, d. h. einem Züchtungsbehälter, sind biologische Zellen im Medium suspendiert. Das Medium enthält ein anorganisches Salz, Glucose, eine Aminosäure, eine antibiotische Substanz und dergl. und gegebenenfalls ein Serum.
Der für das erfindungsgemäße Züchtungsverfahren verwendete Züchtungsbehälter ist dadurch charakterisiert, daß er einen Belüftungszüchtungsbehälter umfaßt, der aus einem Behälter zur Aufnahme eines Mediums, einer Einrichtung zum Bewegen des Mediums, einer Einrichtung zur Abtrennung von Zellen von dem Medium, einer Einrichtung, um dem Medium ein Gas, das für die Züchtung erforderlich ist, von nahe dem Boden des Gefäßes zuzuführen, einer wasserabweisenden Entschäumungseinrichtung, die oberhalb der Oberfläche des Mediums bereitgestellt wird und eine Anzahl gasdurchlässiger Öffnungen aufweist, und einer Einrichtung zum Nachweis des Fortschritts der Züchtung besteht.
Obwohl Schaum auftritt, wenn ein Gas durch ein Medium geleitet wird, ermöglicht es die Bereitstellung einer porösen Entschäumungseinrichtung, die ein wasserabweisendes Material umfaßt, auf der Oberfläche des Mediums, den Schaum zu zerstören. Es ist bevorzugt, daß das wasserabweisende Material für die Entschäumungseinrichtung einen Kontaktwinkel von mindestens 30º, bezogen auf einen Tropfen des Mediums, aufweist.
Mindestens die Oberflächenschicht der vorstehend beschriebenen Entschäumungseinrichtung umfaßt das vorstehend beschriebene wasserabweisende Material.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 bis 7 und 14 sind jeweils schematische Ansichten eines Beispiels der vorliegenden Erfindung; Fig. 8A ist eine perspektivische Ansicht eines Membranträgerelements; Fig. 8B ist eine perspektivische Ansicht einer Filtrationseinheit, die das in Fig. 8A gezeigte Membranträgerelement und eine daran befestigte Hohlfasermembran umfaßt; Fig. 9 ist eine Draufsicht und ein Querschnitts eines Membranträgerelements; Fig. 10 bis 13 sind perspektivische Ansichten von Formen der Filtrationseinheiten; Fig. 15 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen dem Filtrationsdruck einer Hohlfasermembran und der Filtrationsdurchflußgeschwindigkeit zeigt; Fig. 16 bis 20 sind jeweils Graphen, die die Beziehung zwischen der Anzahl der Tage für die Züchtung der Zellen und der Zellkonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen; und Figuren 21 bis 28 sind perspektivische Ansichten von Entschäumungsschichten.
Fig. 15 zeigt die Durchlässigkeitsmerkmale hydrophiler und hydrophober Membranen. In der Zeichnung stellt die gestrichelte Linie einen Graph im Hinblick auf die Verwendung einer hydrophilen Membran dar, während die durchgezogene Linie einen Graph im Hinblick auf die Verwendung einer hydrophoben Membran darstellt.
Die Durchlässigkeitscharakteristiken der hydrophilen Membran sind proportional zum Filtrationsdruck. Im Fall der hydrophoben Membran andererseits tritt, wenn ein Gas in den Poren vorhanden ist, d. h. vor dem Betrieb, kein Medium durch die Membran bei einem Filtrationsdruck unterhalb eines kritischen Drucks (abhängig von der hydrophoben Beschaffenheit, dem Porendurchmesser, der Membrandicke, der Porosität im Innern der Membran und dergl.), bis der Druck den kritischen Druck erreicht. Sobald das Medium durch die Membran tritt, d. h., wenn die Poren der Membran mit Medium gefüllt sind, werden die Durchlässigkeitscharakteristiken gleich denen der hydrophilen Membran unabhängig vom Filtrationsdruck. Die Durchlässigkeit ändert sich entlang des Pfeils auf der durchgezogenen Linie, wie es in der Zeichnung gezeigt ist.
Der kritische Druck einer Polytetrafluorethylenhohlfaser (mit einem Außendurchmesser von 2 mm und einem Innendurchmesser von 1 mm) mit einem Porendurchmesser von 0,8 um beträgt 1,5 kg/cm², und die Durchlässigkeit davon, nachdem die Poren mit dem Medium gefüllt sind, beträgt etwa 0,75 ml/Pa·m²·h (100 ml/mmHg·m²·h). Die Durchlässigkeit ist im wesentlichen gleich derjenigen der hydrophilen Membran.
Wenn daher die Filtration und das Rückspülen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Hohlfaser durchgeführt werden, ist es erforderlich, den tatsächlichen Betrieb vor der ersten Verwendung der Hohlfasermembran unter einem Druck oberhalb des vorstehend beschriebenen kritischen Drucks durchzuführen, um die Poren der Membran mit dem Medium zu füllen.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der hydrophoben Hohlfasermembran. Es ist jedoch erforderlich, eine Hohlfasermembran zu verwenden, die aus einem hydrophoben Material gefertigt ist, das eine ausreichende Festigkeit aufweist und zu keiner Veränderung in den Poren vor der Filtration führt, selbst wenn die Membran einer Atmosphäre von etwa 130ºC ausgesetzt wird. In dieser Hinsicht wird eine hydrophobe Hohlfasermembran, die aus einem Tetrafluorethylenharz gefertigt ist, besonders bevorzugt.
Die hydrophobe Filtermembran kann zwar die Form einer langen einzelnen Hohlfasermembran aufweisen, vom Standpunkt der Wirksamkeit der Nutzung der Oberfläche der Membran ist es jedoch bevorzugt, daß die Membran eine Mehrzahl von Hohlfasermembranen in einer gebündelten Form umfaßt.
Wenn eine Hohlfasermembran verwendet wird, die aus einem Tetrafluorethylenharz gefertigt ist, das Schwierigkeiten bei der Verbindung der Membran durch Schweißen oder Kleben verursacht, dann kann eine hervorragende Membraneinheit durch Anwendung des nachstehenden Verbindungsverfahrens hergestellt werden.
Wie in Fig. 9 gezeigt ist, wird ein Membrandehnungselement 52 in beide Enden der Hohlfasermembran 10 eingeführt. Das Membrandehnungselement 52 ist ein Hohlrohr mit einem Außendurchmesser, der größer als der Innendurchmesser der Hohlfasermembran ist, es weist eine derartige Form auf, daß die Querschnittsfläche allmählich zur Spitze hin verringert wird, um das Element in einfacher Weise in die Hohlfasermembran 10 einzuführen, und es weist einen vorstehenden Abschnitt mit einem großen Außendurchmesser auf einem Teil der Oberfläche auf. Das Ende der Hohlfasermembran mit dem darin eingeführten Membrandehnungselement 52 wird in einem bei Raumtemperatur härtbaren Harzlack eingebettet, und der Harzlack wird gehärtet. Gegebenenfalls wird die äußere Form modifiziert, um ein Membranverknüpfungselement 51 herzustellen, das als eine Endverbindung zu einer Filtrationsleitung verwendet wird. Eine Filtrationseinheit, die eine Mehrzahl von Membranen umfaßt, kann durch Bündeln der Enden einer Mehrzahl von Hohlfasermembranen 10 und Befestigen der Bündel im gleichen Membranverbindungselement 51 hergestellt werden. Beispiele für die Hohlfasermembranfiltrationseinheit sind in den Fig. 8 und 10 bis 13 gezeigt.
Die Verwendung einer hydrophoben Membran trägt zu einer bemerkenswerten Verringerung der Menge an Zellen oder Schmutzteilchen, die auf der Oberfläche der Membran abgelagert werden, bei, was es ermöglicht, die Membran für Filtrationen über lange Zeitspannen zu verwenden.
Nachdem eine vorbestimmte Menge an Medium abgezogen ist, wird frisches Medium umgekehrt unter Druck in die hydrophobe Filtermembran zur Entfernung von Zellen und Schmutzteilchen, die auf der Oberfläche der Filtrationsmembran abgeschieden sind, eingeführt. Bei der Rückspülflüssigkeit kann es sich um frisches Medium, eine Flüssigkeit, die durch Entfernen von Abfallkomponenten aus dem verbrauchten Medium hergestellt wurde, oder ein Gemisch davon handeln.
Wenn die hydrophobe Filtermembran 10 in dem Medium, das im Züchtungsbehälter 2 (Fig. 5) enthalten ist, bereitgestellt wird, dann sollte der Form der Membran und dem Ort der Bereitstellung Aufmerksamkeit geschenkt werden, so daß es möglich ist, einen glatten Fluß von Medium 1 aufrechtzuerhalten und keine Ablagerung von Zellen, die aus dem Auftreten eines verbleibenden Anteils im Züchtungsbehälter 2 stammen, hervorgerufen wird. In diesem Fall ist es günstig, das Medium mit der niedrigsten möglichen Durchflußgeschwindigkeit abzuziehen.
Wenn die hydrophobe Filtermembran 10 außerhalb des Züchtungsbehälters 2 (Fig. 2) bereitgestellt wird, dann befindet sie sich in einer Filtereinheit 8. Die Filtereinheit 8 ist mit dem Züchtungsbehälter 2 über eine Leitung oder dergl. verbunden. Wenn die hydrophobe Filtermembran 10 außerhalb des Züchtungsbehälters 2 bereitgestellt wird, dann ist es erforderlich, die Vorrichtung in einer solchen Weise zu betreiben, daß das Medium mit der höchsten möglichen Durchflußgeschwindigkeit abgezogen wird und die Zellen in den Züchtungsbehälter zurückgeführt werden, sobald die Menge an abgezogenem Medium die vorbestimmte Menge erreicht hat.
Wenn sich die hydrophobe Filtermembran 10 in einer Filtereinheit 8, die außerhalb des Züchtungsbehälters 2 bereitgestellt wird, befindet, dann ist es bevorzugt, daß es sich bei der verwendeten Membran 10 um eine vorbeschichtete Membran mit einer hydrophilen Filterhilfe auf der Oberfläche handelt. In diesem Fall wird ein Filter 11 innerhalb der Filtereinheit 8 am Boden davon oder sowohl am Boden als auch am oberen Ende davon nahe der hydrophoben Filtermembran 10 bereitgestellt, um die Filterhilfe 9 zu tragen.
Der Filter 11 umfaßt ein poröses Material, wie ein organisches polymeres Material, Glas, keramisches Material oder gesintertes Metall, und die Porengröße davon wird so gewählt, daß sie ein geringes oder kein Durchtreten von Teilchen der Filterhilfe 9 erlaubt.
Wenn eine Züchtungslösung aus dem Züchtungsbehälter 2 in die Filtereinheit 8 eingeführt wird, dann werden die in dem Medium enthaltenen Zellen durch die Teilchen der Filterhilfe 9 eingefangen. Die Filterhilfe 9 ist ein organisches Polymeres oder eine anorganische Verbindung, die für die Zellen nicht toxisch ist, und sie kann allein oder in Kombination von 2 oder mehr davon verwendet werden. Das Material, die Teilchengröße, die Form und die Menge der Packung werden abhängig von der Haftung der Zellen, dem Teilchendurchmesser der Zellen und dergl. bestimmt.
Im Hinblick auf Zellen mit einem Teilchendurchmesser von 5 bis 50 um entspricht z. B., wenn die Zellen nur durch den sog. Siebeffekt zwischen den Teilchen der Filterhilfe 9 eingefangen werden, der Teilchendurchmesser der Filterhilfe im wesentlichen demjenigen der Zellen. Wenn andererseits die Zellen an der Filterhilfe 9 haften, dann ist es bevorzugt, daß der Teilchendurchmesser der Filterhilfe 9 mehrere 10 bis mehrere 100 um beträgt. Wenn Mikroträgerkügelchen verwendet werden, dann ist es möglich, eine anhaftende Kultur durchzuführen. Im Fall der meisten Zellen wird die Filterhilfe 9 gewählt, indem beide vorstehend genannten Wirkungen in Betracht gezogen werden. Wenn daher das in die Filtereinheit 8 eingeführte Medium durch die Filterhilfe 9 tritt und die hydrophobe Filtermembran 10 erreicht, dann enthält das Medium eine geringe Anzahl an Zellen oder keine Zellen, was es ermöglicht, daß ein Verstopfen der hydrophoben Filtermembran 10 weitgehend verhindert wird, und zwar selbst im Fall des Langzeitbetriebs.
Wenn das Medium der Filtereinheit 8 mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 0,1 bis 10 m³/m²·h pro Einheitsfläche, bezogen auf einen charakteristischen Innendurchmesser der Filtereinheit, zugeführt wird, dann ist es möglich, zu verhindern, daß die Zellen durch die Scherkräfte, die hervorgerufen werden, wenn das Medium zwischen den Teilchen der Filterhilfe 9 durchtritt, beschädigt werden. Die Durchflußgeschwindigkeit variiert jedoch abhängig von der Art der Zellen, dem Teilchendurchmesser der Filterhilfe 9, der Struktur der Filtereinheit 8 und dergl.
Nebenprodukte, die im Medium enthalten sind, können durch die hydrophobe Filtermembran 10 treten. Daher werden nach dem vorstehenden Verfahren die Zellen, die im Medium enthalten sind, abgetrennt und konzentriert, und Nebenprodukte, wie Abfallprodukte, werden abgegeben.
Nachdem eine vorbestimmte Menge an Medium abgegeben worden ist, wird frisches Medium in die Filtereinheit 8 eingeführt. Der Ausdruck "frisches Medium" soll hier nicht nur unbenutztes Medium umfassen, sondern auch eine Flüssigkeit, die durch Entfernen der Nebenprodukte der Zellen, die in verbrauchtem Medium enthalten sind, hergestellt worden ist. Die Zusammensetzung des Mediums kann sich von der des Mediums, das im Züchtungsbehälter enthalten ist, unterscheiden. Wenn das vorstehend genannte frische Medium umgekehrt in die Filtereinheit 8 eingeführt wird, dann steigen (oder fallen) die Teilchen der Filterhilfe 9 und werden zusammen mit den in der vorstehend beschriebenen Stufe eingefangenen Zellen aufgeschlossen.
Um die vorstehend beschriebene Stufe in wirksamer Weise durchzuführen, sollten das Material, der Teilchendurchmesser, die Form und dergl. der Teilchen der vorstehend beschriebenen Filterhilfe 9 so gewählt sein, daß die Filterhilfeteilchen sich rascher als die Zellen absetzen (oder rasch in der Züchtungslösung suspendiert werden). Wenn eine Gruppe von Teilchen, die sich rascher absetzt als die Zellen, als Filterhilfe 9 verwendet wird, dann ist es günstig, daß das frische Medium in die Filtereinheit 8 mit einer solchen Durchflußgeschwindigkeit eingeführt wird, daß in der Filterhilfe 9, die aufgeschlossen werden soll, eine Gruppe von Teilchen, die die höchste Sedimentationsgeschwindigkeit zeigt, langsam aufsteigt. Zu dem Zeitpunkt ist die aufzuschließende Filterhilfe 9 im wesentlichen vollständig aufgeschlossen, so daß die Zellen von der Filterhilfe 9 getrennt sind und auf mindestens einer Gruppe von Teilchen mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit, die höher ist als die der Zellen, suspendiert sind. Da die Leitung so gefertigt ist, daß das frische Medium, das durch die Filterhilfe 9 geleitet wird, in den Züchtungsbehälter 2 übertragen werden kann, werden die Zellen, die an der Spitze der Filtereinheit 8 suspendiert sind, in den Züchtungsbehälter 2 zusammen mit dem frischen Medium zurückgeführt.
In diesem Fall, wenn die Filterhilfe 9 eine Gruppe von Teilchen mit einem Teilchendurchmesser enthält, der größer ist als der der Zellen, ermöglicht es die Bereitstellung einer Einrichtung, wie eines Siebes, mit einer Öffnungsgröße, die einen Durchtritt von Zellen erlaubt, nicht jedoch den Durchtritt der Gruppe von Teilchen an der Spitze der Filtereinheit 8 erlaubt, der Filterhilfe 9, aufzusteigen und im Züchtungsbehälter 2 gemischt zu werden. Da ferner die hydrophobe Filtermembran 10 mit frischem Medium rückgespült wird, kann die Betriebsdauer der Membran verlängert werden.
Im Fall des Systems, das in Fig. 2 gezeigt ist, worin eine Gruppe von Teilchen, die im Medium suspendiert ist, als Filterhilfe 9 verwendet wird, ist es bevorzugt, daß das frische Medium in die Filtereinheit 8 mit einer solchen Durchflußgeschwindigkeit eingeführt wird, daß in der Filterhilfe 9, die aufgeschlossen werden soll, eine Gruppe von Teilchen mit der höchsten aufsteigenden Geschwindigkeit absinkt und die Filterhilfeschicht geringfügig aufgewirbelt wird. Dementsprechend trennen sich die Zellen von der Filterhilfe 9 und setzen sich ab, und die abgesetzten Zellen werden anschließend zusammen mit einer Rückspülflüssigkeit durch eine Leitung, die die Filtereinheit 8 mit dem Züchtungsbehälter 2 verbindet, getragen und in den Züchtungsbehälter 2 zurückgeführt. In diesem Fall ist es bevorzugt, daß ein Filter 11 mit einer Öffnungsgröße, die den Durchtritt der Zellen erlaubt, die jedoch nicht den Durchtritt der Filterhilfe 9 erlaubt, am Boden der Filtereinheit 8 bereitgestellt wird.
Obwohl es keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Menge an pro Schritt eingeführtem Medium gibt, entspricht die eingeführte Menge vorzugsweise im wesentlichen der abgelassenen Menge an Medium in der vorstehend beschriebenen Stufe zum Ablassen des Mediums, und die Durchflußgeschwindigkeit ist vorzugsweise so, daß die meisten Zellen, die in der Filterhilfe 9 gefangen sind, mit dem frischen Medium zurück in den Züchtungsbehälter 2 geführt werden.
Die Beendigung der Einführung von frischem Medium bewirkt, daß eine Gruppe von Teilchen der aufgeschlossenen Filterhilfe 9 sich auf oder um den Filter 10 absetzt. Da die Filterhilfe 9 jedoch eine Gruppe von Teilchen enthält, die sich rascher absetzen können als die Zellen, ist die Menge an Zellen, die den Filter 10 erreichen, klein.
Die wasserabstoßende Entschäumungseinrichtung wird bereitgestellt, um Schaum zu zerstören, der sich auf der Oberfläche des flüssigen Mediums bildet, wenn ein Gas durch das flüssige Medium geleitet wird, und sie weist eine Anzahl von Öffnungen auf, durch die das Gas treten kann. Es wird bevorzugt, daß das Öffnungsverhältnis und der Öffnungsdurchmesser der Entschäumungseinrichtung mindestens 50% bzw. 50 bis 2 mm betragen. Mindestens die Oberflächenschicht der Entschäumungseinrichtung ist aus einem wasserabstoßenden Material gefertigt.
Die Entschäumungseinrichtung zeigt eine hervorragende Wirkung selbst im Fall der Züchtung tierischer Zellen, wobei ein serumhaltiges Medium, das ein besonders starkes Schäumen hervorruf t, verwendet wird, was es ermöglicht, den Sauerstoff mit einem hohen Wirkungsgrad durch Submersbelüftung zuzuführen.
Bei dem wasserabweisenden Material kann es sich um ein Material handeln, das einen Kontaktwinkel von mindestens 300 zeigt, wenn die Oberfläche davon in Kontakt mit einem Tropfen des Mediums gebracht wird, das im wesentlichen unlöslich oder nicht dispergierbar in dem Medium ist und das im wesentlichen nicht toxisch für die Zielzellen ist. Die Entschäumungsschicht als solche kann das vorstehend beschriebene wasserabstoßende Material umfassen. Alternativ dazu kann sie durch Abdecken, Beschichten oder Imprägnieren durch Verwendung des vorstehend beschriebenen wasserabstoßenden Materials hergestellt werden.
Beispiele für das wasserabstoßende Material umfassen Silane oder Siloxane mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen. Ein wasserabstoßendes Material mit einer Viskosität von mindestens 1 · 10&sup4; cP ist besonders geeignet.
Wenn die Viskosität des wasserabstoßenden Materials weniger als 1 · 10&sup4; cP beträgt, dann wird die Oberfläche des Mediums mit dem wasserabstoßenden Material bedeckt, oder das wasserabstoßende Material bildet eine Emulsion mit dem Medium und hemmt die Proliferation der Zellen durch Haftung an den Zellen. Ferner wird es schwierig, das Produkt vom Medium nach dem Abschluß der Züchtung zu trennen.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der oberen Grenze der Anzahl der Kohlenstoffatome und der Viskosität. Da das wasserabstoßende Material jedoch fest wird, wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome und die Viskosität 1 · 10&sup4; bzw. 1 · 10&sup7; cP betragen, sind diese Werte die entsprechenden Obergrenzen für die Anzahl der Kohlenstoffatome und die Viskosität.
Wenn das Öffnungsverhältnis geringer als 50% ist, dann ist es schwierig, Gas gleichmäßig durch die Entschäumungsschicht zu leiten, wenn der auf der Oberfläche des Mediums vorhandene Schaum zerstört wird, was zu einer sekundären Schaumbildung führt. Der Durchmesser der Öffnung der Entschäumungsschicht beträgt vorzugsweise 2 bis 50 mm. Wenn der Durchmesser 50 mm überschreitet, dann wird der Kontakt von kleinen Blasen mit der Entschäumungsschicht unzureichend, was es schwierig macht, den Schaum zu zerstören. Wenn andererseits der Durchmesser weniger als 2 mm beträgt, dann können das Gas und das Medium nicht gleichmäßig in die Öffnung und aus der Öffnung treten.
Die Entschäumungsschicht kann eine Monoschichtstruktur oder eine laminierte Struktur aufweisen. Ferner kann die Schicht in einer integralen Form oder in einer in longitudinaler oder lateraler Richtung trennbaren Form vorliegen. Die Schichtstruktur wird in geeigneter Weise gemäß den Eigenschaften der Flüssigkeit, der Menge des Gasstroms und dem Blasendurchmesser gewählt.
Das Gas kann üblicherweise in den Züchtungsbehälter 2 durch eine Düse 4 eingeführt werden, die am Boden des Züchtungsbehälters bereitgestellt wird. Die Düse kann in einer geeigneten Position unterhalb der Oberfläche des Mediums bereitgestellt werden. Ferner kann sie auch zwischen dem Boden und der Oberfläche des Mediums bereitgestellt werden. Insbesondere wenn ein Belüftungsrohr 3 bereitgestellt wird, dann trägt die Bereitstellung der Düse 4 unter dem Belüftungsrohr 3 zu einer Verbesserung des Prozentsatzes der Sauerstoffnutzung bei, da der Abwärtsstrom des Mediums bewirkt, daß Blasen für eine längere Zeitspanne im Medium bleiben.
Erfindungsgemäß wird es bevorzugt, daß das Medium eine Oberflächenspannung von 45 bis 90·10&supmin;&sup5; N/cm² (45 bis 90 dyn/cm²) aufweist. Beispiele für ein hochgradig wirksames Medium umfassen ein Medium, das ein Biopolymer, wie Serum, enthält. Neben einem serumhaltigen Medium ist auch ein Medium, das ursprünglich ein Protein, wie Albumin, oder eine Nucleinsäure enthält, oder dem diese Bestandteile zugesetzt werden, sehr wirksam. Bevorzugt sind auch ein Medium mit einem Gehalt an einer Komponente, die von außen zugegeben wird, und ein Medium, das eine Schaumkomponente enthält, die während der Züchtung abgesondert wird.
Beispiele für die Abfallkomponente umfassen Milchsäure und Ammoniak, die in einem Kulturfiltrat enthalten sind, das unter Verwendung einer hydrophoben Membran erhalten wird.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Einrichtung zur Entfernung der Abfallkomponenten. Zum Beispiel können die Abfallkomponenten nach einem bekannten Verfahren unter Verwendung eines Diffusionsdialysators, einer Ultrafiltrationsvorrichtung oder eines Elektrodialysators entfernt werden.
Da jedoch das Kulturfiltrat eine große Menge feiner Feststoffe enthält, wie aus dem Serum stammende Ausfällungen und Zellbruchstücke, ist es bevorzugt, daß die Einrichtung zur Entfernung der Abfallkomponenten eine solche Form aufweist, daß eine Verstopfung kaum auftritt. Milchsäure und Ammoniak unter den Abfallkomponenten hemmen in besonderer Weise die Proliferation der Zellen. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, daß die Entfernung der Abfallkomponenten unter Verwendung von Ammoniak und Milchsäure als Gradmesser für die Entfernung durchgeführt wird. Das Kulturfiltrat enthält auch große Mengen an Komponenten, die für das Wachstum der Zellen erforderlich sind, wie verschiedene Hormone und Proteine. Es ist erwünscht, daß diese Komponenten wiedergewonnen und soweit möglich wiederverwertet werden. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, daß die Diffusionsdialysemembran und die Ultrafiltrationsmembran jeweils ein Fraktionierungsmolekulargewicht von etwa 1000 bis 10 000 aufweisen. Wenn das Fraktionierungsmolekulargewicht der Membran geringer als 1000 ist, dann ist die Durchlässigkeit so gering, daß die Membranfläche erhöht werden sollte, und es besteht die Möglichkeit, daß die Membran nicht für eine lange Zeitspanne verwendet werden kann, da ein starkes Verstopfen der Membran auftritt. Wenn andererseits das Molekulargewicht 10 000 überschreitet, dann treten Substanzen, die für die Proliferation der Zellen nützlich sind, wie Hormone, auch durch die Membran, und dies führt zu einer Verringerung der Wiedergewinnung dieser Substanzen.
Es ist bevorzugt, daß eine feine Filtrationsmembran mit einem Porendurchmesser von etwa 0,01 um zur Abtrennung der nützlichen Substanzen, wie Proteinantikörper mit einem hohen Molekulargewicht, verwendet wird. Es ist von größerem Vorteil, daß die Trennung der nützlichen Substanzen durch eine Mehrstufenfiltration unter Kombination der vorstehend beschriebenen Membranen durchgeführt wird.
Wenn die Abfallkomponenten unter Verwendung eines Diffusionsdialysators entfernt werden, dann ist es bevorzugt, daß eine Lösung mit der gleichen Konzentration und Zusammensetzung im Hinblick auf die niedermolekularen Komponenten, die im frischen Medium enthalten sind, wie verschiedene Flüssigkeiten, verschiedene Aminosäuren und Vitamine, als Dialyselösung verwendet wird.
Die Lösung nach der Entfernung der Abfallkomponenten wird als Rückspülflüssigkeit für die vorstehend beschriebene Filtereinheit verwendet und anschließend in den Züchtungsbehälter zurückgeführt, um sie in wirksamer Weise für die Züchtung der Zellen zu verwenden.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der biologischen Zellen, für die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, und Beispiele umfassen tierische Zellen, mikrobielle Zellen und Pflanzenzellen. Beispiele für tierische Zellen umfassen verschiedene Zellen von Vertebraten, von Invertebraten und von Protozoen. Die Zellen umfassen nicht nur einzelne Zellen, sondern auch Zellcluster.
Beispiele für die mikrobiellen Zellen umfassen verschiedene Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Actinomycetes.
Beispiele für die Pflanzenzellen umfassen Zellen niederer Pflanzen, Zellcluster niederer Pflanzen, Algenzellen und Algenzellcluster.
Im Hinblick auf das Belüftungsgas, das erfindungsgemäß anwendbar ist, werden je nach Anwendung Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid, Gemische davon mit einer geeigneten Zusammensetzung und Gemische davon mit einem inerten Gas verwendet. Im allgemeinen wird ein sauerstoffhaltiges Gas für die Züchtung tierischer Zellen verwendet, während Kohlendioxid oder ein kohlendioxidhaltiges Gas für die Züchtung von Pflanzenzellen verwendet wird.
Die Menge an Zellen, die an der Filtermembran haften, die ein hydrophobes Material umfaßt, ist kleiner als die Menge der Zellen, die an einer hydrophilen Membran haftet, wie sie nach dem Stand der Technik verwendet wird. Ferner werden die anhaftenden Zellen von der Membran auch ohne weiteres durch Rückspülen freigesetzt, und die Membran führt kaum zu einer Verstopfung, was es ermöglicht, die Züchtung der Zellen mit einem hohen Wirkungsgrad durch zwischenzeitliches Rückspülen durchzuführen.
Da ferner ein wirksames Entschäumen des Mediums durch die erfindungsgemäße Entschäumungseinrichtung durchgeführt werden kann, ist es möglich, in wirksamer Weise die Züchtung der Zellen durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung erläutert.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm eines Beispiels für ein erfindungsgemäßes Zellzüchtungssystem.
In einem Züchtungsbehälter 2 werden Zellen in Form einer Dispersion oder Suspension in einem Medium 1 gezüchtet. Eine Düse 4 zur Einführung eines sauerstoffhaltigen Gases in das Medium wird am Boden des Kulturbehälters bereitgestellt. Sauerstoff, der für das Wachstum der Zellen erforderlich ist, und Kohlendioxid zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums werden durch die Düse zugeführt. Insbesondere werden der Durchsatz von Luft aus einem Luftkompressor 16 und der Durchsatz einem sauerstoffhaltigen Gas aus einer Bombe 17 so eingestellt, daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff konstant wird, und der Durchsatz von Kohlendioxid aus einer Bombe 18 wird so eingestellt, daß der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,6 liegt. Diese Gase werden durch einen Bakterienentfernungsfilter 7 geleitet und anschließend in das Medium durch die Düse 4 eingeblasen. Das in das Medium eingeblasene Gas verwirbelt das Medium, wenn es in Form von Blasen an die Oberfläche des Mediums steigt. Ein Luftrohr 3 wird zum Zweck eines wirksamen Strömens des Mediums innerhalb des Behälters durch das eingeblasene Gas bereitgestellt. Die Blasen, die die Oberfläche des Mediums erreichen, bilden ohne Zerstörung eine Schaumschicht. Der Schaum kann in wirksamer Weise zerstört werden, indem die Schaumschicht in Kontakt mit der Entschäumungsschicht 5, die ein hydrophobes Material umfaßt und auf der Oberfläche des Mediums bereitgestellt wird, gebracht wird.
Das Gas wird durch einen Feuchtigkeitsabscheider 6 und einen Filter 7 geleitet und dann als Abgas 24 nach außerhalb des Züchtungsbehälters abgegeben. Der Züchtungsbehälter 2 ist zwar mit verschiedenen Vorrichtungen, wie einer Einrichtung zum Konstanthalten der Konzentration an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes, einer Einrichtung zur Sterilisierung der Innenseite des Behälters und der Rohrleitung, einer Einrichtung zum Zuführen und Ablassen von Medium, einer Einrichtung zum Konstanthalten der Temperatur, Fühlern zum Nachweis der Konzentration an gelöstem Sauerstoff, des pH-Wertes, der Temperatur, des Innendrucks des Behälters und dergl. und einem Fühler zum Nachweis des Spiegels des Mediums, das im Behälter enthalten ist, ausgestattet, diese Vorrichtungen sind in Fig. 1 jedoch nicht gezeigt.
Eine Filtereinheit 8 wird am Boden des Züchtungsbehälters 2 bereitgestellt. Ein poröser Hohlfasermembranfilter 10 wird innerhalb der Filtereinheit 8 bereitgestellt, und eine Filterhilfe 9 wird auf oder um den Hohlfasermembranfilter 10 gepackt. Die Filterhilfe 9 wird durch einen Trägerfilter 11 getragen.
Sorgfalt sollte daraufangewandt werden, daß der Hohlfasermembranfilter 10 nicht deformiert oder auf der Filterhilfeschicht 9 freigelegt wird, und zwar selbst während des Sterilisierens, des Rückspülens und dergl., wenn das Medium rasch strömt. Es gibt keine Beschränkung hinsichtlich der Form des Hohlfasermembranfilters.
Fig. 8A und 8B sind jeweils erläuternde Ansichten einer hydrophoben Hohlfasermembraneinheit, die in den Beispielen für die vorliegende Erfindung verwendet wird. Ein Membranträgerelement 50 ist aus einem Material gefertigt, das Steifigkeit selbst bei 130ºC zeigt und bei dem keine Gefahr besteht, daß es durch das Medium angegriffen wird. Es weist eine äußere Form auf, die entsprechend der inneren Form der in Fig. 1 gezeigten Filtereinheit 8 gebildet ist, und wird so bereitgestellt, daß es sich nicht innerhalb der Filtereinheit bewegt, selbst wenn eine geringe äußere Kraft darauf angewandt wird. Wie in Fig. 8A gezeigt ist, ist das Filterträgerelement 50 mit einer Anzahl kleiner Löcher 55 versehen, die geeignet sind, die Hohlfasermembran zu tragen. Die Größe der Löcher ist vorzugsweise so gewählt, daß die Hohlfasermembran 10 frei hindurchgeführt werden kann. Fig. 8B ist eine Filtrationseinheit, die ein Membranträgerelement 50 und eine Hohlfasermembran 10, die daran befestigt ist, umfaßt. Die Hohlfasermembran 10 kann zwar eine Filtrationseinheit in Form einer einzelnen Hohlfasermembran darstellen, üblicherweise wird es jedoch bevorzugt, daß die Filtrationseinheit eine Mehrzahl von Hohlfasermembranen umfaßt. In diesem Fall macht es das Bündeln einer Mehrzahl von Hohlfasermembranen mit einem Membranverbindungselement 51 einfach, die Filtrationseinheit auf der Filtrationseinheit zu befestigen.
Fig. 9A und 9B sind jeweils schematische Ansichten des Membranverbindungselements 51. Dieses Membranverbindungselement ist geeignet zum Zusammenfügen einer Hohlfaserfiltermembran, die aus einem Material gefertigt ist, das zu Schwierigkeiten beim Zusammenfügen der Membran durch Verkleben oder Schweißen führt, z. B. einer Hohlfasermembran, die aus einem Tetrafluorethylenharz gefertigt ist.
Fig. 9A ist ein Diagramm der Oberfläche des Membranverbindungselements 51, die gegenüber der Oberfläche, mit der die Hohlfasermembranen verbunden werden, liegt. Ein Membrandehnungselement 52 ist in das Membranverbindungselement 51 eingeschlossen. Es ist bevorzugt, daß die äußere Oberfläche des Membranverbindungselements 51 kreisförmig ausgebildet ist. Fig. 9B ist ein Querschnitt entlang der Linie A-A' von Fig.
9A. Das Membrandehnungselement 52 weist einen Innendurchmesser auf, der im wesentlichen dem der Hohlfasermembran entspricht, einen Außendurchmesser, der größer als der Innendurchmesser der Hohlfasermembran ist, einen konisch zulaufenden Vorderabschnitt, so daß es leicht in die Hohlfasermembran eingeführt werden kann, und einen besonders hervorragenden Abschnitt, der so ausgelegt ist, daß eine Freigabe der Hohlfasermembran verhindert wird. Jeder Abschnitt der Hohlfasermembran, in den das Membrandehnungselement 52 eingeführt ist, ist im Membranverbindungselement 51 eingeschlossen, und das Membranverbindungselement wird anschließend gehärtet, um die Hohlfasermembranen fest zu binden. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Membranverbindungselements, solange es keine ungünstige Wirkung auf die Zellen hat, keine Korrosion im Medium hervorgerufen wird und das Element der Dampfsterilisation bei etwa 130ºC widerstehen kann. Zum Beispiel kann ein härtbares Zweikomponenten-Epoxidharz verwendet werden.
Das Medium wird nach folgendem Verfahren ausgetauscht. Ventile 31 und 32, die in Fig. 1 gezeigt sind, sind geschlossen, und ein Ventil 33 ist geöffnet. Eine Pumpe 22 wird betätigt, um das Medium 1 aus dem Züchtungsbehälter 2 in die Filtereinheit 8 zu führen. Die in dem Medium enthaltenen Zellen werden von der Oberfläche der Filterhilfe 9 und des porösen Hohlfaserfilters 10 eingefangen, während das Medium durch die Filterhilfe und den Hohlfaserfilter tritt. In diesem Fall wurde ein poröser Hohlfaserfilter 10 mit einer Öffnungsgröße, die kein Durchtreten der Teilchen der Filterhilfe 9 und der Zellen erlaubt, gewählt. Ein Kulturfiltrat, das durch Filtration der Zellen erhalten wird, wird in einem Kulturfiltratvorratsbehälter 15 gelagert.
Nachdem eine vorbestimmte Menge an Medium aus dem Züchtungsbehälter 2 abgelassen worden ist, wird die Pumpe 22 angehalten, und das Ventil 33 wird geschlossen. Anschließend werden die Ventile 31 und 32 geöffnet, und die Pumpen 19, 20 werden betätigt. Die Pumpen 19 und 20 führen frisches Medium aus einem Vorratsbehälter 12 für frisches Medium in die Filtereinheit. Zu diesem Zeitpunkt führt die Pumpe 19 frisches Medium durch den Boden der Filtereinheit 8 mit einer solchen Durchflußgeschwindigkeit, daß das gepackte Bett der Filterhilfe 9 aufgewirbelt und aufgeschlossen wird. Andererseits führt die Pumpe 20 frisches Medium unter Druck in umgekehrter Richtung zur porösen Hohlfasermembran 10 zum Rückspülen, wobei Feststoffe, wie Zellen, die an der Oberfläche des Filters 10 haften, freigesetzt werden. Die Gesamtdurchflußgeschwindigkeit der Pumpen 19 und 20 wird so eingestellt, daß keine Filterhilfe 9 aus dem Bereich der Filtereinheit freigesetzt wird.
Die an der Oberfläche der Filterhilfe 9 und des Hohlfasermembranfilters 10 in der vorstehend beschriebenen Filtrationsstufe eingefangenen Zellen werden aus dem gepackten Bett durch Aufschließen der Filterhilfe 9 freigesetzt. Da das spezifische Gewicht, der Teilchendurchmesser und die Form der Teilchen der Filterhilfe 9 so gewählt sind, daß die Teilchen der Filterhilfe 9 eine höhere Sedimentationsgeschwindigkeit als die Zellen aufweisen, steigen die Zellen aus dem aufgeschlossenen gepackten Bett auf und werden in den Züchtungsbehälter 2 zusammen mit frischem Medium zurückgeführt.
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für ein erfindungsgemäßes Zellzüchtungssystem. Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß Teilchen mit einem kleineren spezifischen Gewicht als das Medium als Filterhilfe 9 für die Filtereinheit 8 verwendet werden. Beispiele für die Filterhilfe 9 umfassen hohle Glaskügelchen und hohle Kohlenstoffkügelchen. Die Filterhilfe 9 wird von zwei Trägerfiltern 11 getragen, die an der Spitze bzw. am Boden der Filtereinheit 8 bereitgestellt werden. Die Öffnungsgröße des Trägerfilters 11 wird so gewählt, daß keine Teilchen der Filterhilfe 9 durch die Öffnung treten können, während die Zellen frei durch die Öffnung treten können.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel können die durch das gepackte Bett der Filterhilfe 9 und den Hohlfasermembranfilter 10 eingefangenen Zellen während des Rückspülens vollständiger in den Züchtungsbehälter zurückgeführt werden.
Fig. 3 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für das erfindungsgemäße Zellzüchtungssystem. Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß eine Einrichtung zur Entfernung von Abfallkomponenten dem in Fig. 1 gezeigten Beispiel zugefügt wurde. Im vorliegenden Beispiel wird die Ultrafiltration als Maßnahme zur Entfernung von Abfallkomponenten angewandt.
Ein Ultrafilter 14 ist über eine Leitung mit dem Kulturfiltratvorratsbehälter 15 verbunden. Eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Fraktionierungsmolekulargewicht von 10 000 wird als Ultrafilter 14 verwendet. Diese Membran erlaubt den Durchtritt von Abfallkomponenten, wie Milchsäure und Ammoniak, sie erlaubt jedoch nicht den Durchtritt von Substanzen, wie Hormonen, die für das Wachstum der Zellen nützlich sind. Das Kulturfiltrat wird unter Druck durch eine Pumpe 23 dem Ultrafilter 14 zugeführt. Niedermolekulare Substanzen, wie Abfallkomponenten, treten durch die Ultrafiltrationsmembran während des Kontakts des Kulturfiltrats mit der Membran und werden als Abfallkomponenten 26 nach außerhalb des Systems abgegeben.
Die Flüssigkeit, aus der die Abfallkomponenten mit dem Ultrafilter 14 entfernt wurden, wird in einem Vorratsbehälter 13 für von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit gelagert. Da die Menge an Flüssigkeit, die durch Ultrafiltration filtriert werden muß, klein ist, wird die Filtration durchgeführt, indem die Flüssigkeit zwischen dem Ultrafilter 14 und dem Vorratsbehälter für von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit mit der Pumpe 23 im Kreis geführt, um die Abfallkomponenten zu entfernen. Im allgemeinen ist es erforderlich, daß bei Verwendung der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit als Teil des frischen Mediums die Konzentration an Abfallkomponenten 1000 ppm oder weniger, vorzugsweise 100 ppm oder weniger für Milchsäure und 20 ppm oder weniger und vorzugsweise 5 ppm oder weniger für Ammoniak beträgt.
Die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit wird zum frischen Medium als Teil der Rückspülflüssigkeit der Filtereinheit 8 durch Betätigen einer Pumpe 21 zugefügt, in den Züchtungsbehälter 2 zurückgeführt und erneut für die Proliferation der Zellen verwendet. Da die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit nicht nur große Mengen nützlicher Komponenten, wie Hormone und Wachstumsfaktoren, die im Kulturfiltrat verbleiben, sondern auch Wachstumsförderungsfaktoren und nützliche Produkte, die von den Zellen als solche abgesondert werden, enthält, führt ihre Verwendung zu einem guten Ergebnis im Hinblick auf das Wachstum der Zellen.
Fig. 4 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für das erfindungsgemäße Zellzüchtungssystem.
Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß bei dem in Fig. 3 gezeigten Beispiel Teilchen mit einem geringeren spezifischen Gewicht als dem des Mediums als Filterhilfe 9 für die Filtereinheit 8 verwendet werden. Beispiele für die Filterhilfe 9 umfassen hohle Glaskügelchen und hohle Kohlenstoffkügelchen. Die Filterhilfe 9 wird von zwei Trägerfiltern 11 getragen, die an der Spitze bzw. am Boden der Filtereinheit 8 bereitgestellt werden. Die Öffnungsgröße des Trägerfilters 11 ist so gewählt, daß keine Teilchen der Filterhilfe 9 durch die Öffnung treten können, während die Zellen frei durch die Öffnung treten können. Die weitere Struktur entspricht der des in Fig. 3 gezeigten Beispiels.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel können die Zellen, die durch das gepackte Bett der Filterhilfe 9 und den Hohlfasermembranfilter 10 eingefangen wurden, während des Rückspülens vollständiger in den Züchtungsbehälter zurückgeführt werden.
Fig. 5 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für das erfindungsgemäße Zellzüchtungssystem.
Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß bei dem in Fig. 3 gezeigten Beispiel die hydrophobe Membran 10 im oberen Teil des Züchtungsbehälters 2 bereitgestellt wird und daß zusätzlich ein Rührer bereitgestellt wird. Im vorliegenden Beispiel wird das Medium wie folgt ausgetauscht. Ein Ventil 33 ist geöffnet, und ein Ventil 32 ist geschlossen. Wenn eine Pumpe 22 betätigt wird, dann wird das Innere der Hohlfasermembran evakuiert. Als Ergebnis werden die im Medium suspendierten Zellen auf der Oberfläche der Hohlfasermembran eingefangen, und ein Kulturfiltrat, das frei von den Zellen ist, wird innerhalb der Membran abgezogen und im Kulturfiltratvorratsbehälter 15 gelagert.
Nachdem eine vorbestimmte Menge an Medium aus dem Züchtungsbehälter 2 abgelassen worden ist, wird die Pumpe 22 angehalten, und das Ventil 33 wird geschlossen. Anschließend wird das Ventil 32 geöffnet, und die Pumpen 20 und 21 werden betätigt. Die Pumpe 20 führt frisches Medium aus dem Vorratsbehälter 12 für frisches Medium zu, während die Pumpe 21 die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit aus dem Vorratsbehälter 13 für die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit zuführt. Das frische Medium und die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit werden unter Druck der Hohlfasermembran zugeführt und strömen durch die Poren auf der Oberfläche der Membran in den Züchtungsbehälter 2. Zu diesem Zeitpunkt werden Feststoffe, wie Zellen, die an der äußeren Oberfläche der Hohlfasermembran und innerhalb der Poren adsorbiert sind, freigesetzt, wobei die Filtrationsoberfläche regeneriert wird. Um zu verhindern, daß sich Zellen und Verunreinigungen auf der Oberfläche der hydrophoben Membran 10 ablagern, ist es bevorzugt, daß die hydrophobe Membran 10 an einer Stelle bereitgestellt wird, wo das Medium mit der höchsten Geschwindigkeit strömt. Wie im vorliegenden Beispiel gezeigt wird, führt bei Bereitstellung eines Rührers 29 und einer hydrophoben Membran um den Rührer herum der Strom des Mediums, der durch die Rotation der Rührerblätter bewirkt wird, dazu, daß sich die Feststoffe, die auf der Oberfläche der Membran vorhanden sind, bewegen, ohne dort zu verbleiben, so daß die Ablagerung von Feststoffen auf der Oberfläche der Membran in wirksamer Weise verhindert werden kann.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Form der im vorliegenden Beispiel verwendeten Filtrationseinheit. Die Filtrationseinheit hat vorzugsweise jedoch eine Form, die den Strom des Mediums nicht hemmt und die keine unnötigen äußeren Kräfte auf die Zellen ausübt.
Die in den Fig. 10 bis 13 gezeigten Filtrationseinheiten haben jeweils eine für das vorliegende Beispiel besonders geeignete Form.
Erfindungsgemäß treten, da die Filtration im Züchtungsbehälter durchgeführt wird, keine Phänomene, wie ein Mangel an Sauerstoff oder eine Verringerung der Temperatur während der Filtration auf, was es ermöglicht, daß die Zellen unter guten Bedingungen proliferieren.
Fig. 6 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für das erfindungsgemäße Zellzüchtungssystem. Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß ein Mediumherstellungsbehälter 41 dem in Fig. 5 gezeigten Beispiel zugefügt wird.
Die Rückspülflüssigkeit, die für das Rückspülen der innerhalb des Züchtungsbehälters bereitgestellten hydrophoben Hohlfasermembran verwendet wird, wird hergestellt, indem zunächst frisches Medium mit der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit im Mediumherstellungsbehälter 41 gemischt wird. Der Mediumherstellungsbehälter 41 ist mit Einrichtungen zur Messung der Konzentrationen an Milchsäure, Ammoniak und Protein ausgestattet. Durch diese Einrichtungen wird das Mischungsverhältnis von frischem Medium zur von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit eingestellt.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel kann stets ein Medium, das für die Proliferation der Zellen geeignet ist, verwendet werden, um die Züchtung durchzuführen.
Fig. 7 ist ein Blockdiagramm eines weiteren Beispiels für das erfindungsgemäße Zellzüchtungssystem. Das charakteristische Merkmal des vorliegenden Beispiels besteht darin, daß ein Diffusionsdialysator als Vorrichtung zur Entfernung der Abfallkomponente anstelle der in Fig. 6 gezeigten Ultrafiltrationsmembran verwendet wird.
Das Kulturfiltrat wird durch eine Leitung in einen Diffusionsdialysator 44 geleitet und durch eine Pumpe 23 zwischen dem Vorratsbehälter 13 für die Abfallkomponente und dem Diffusionsdialysator 44 im Kreis geführt.
Eine Lösung niedermolekularer Komponenten, die gelöst darin verschiedene niedermolekulare Komponenten, wie Aminosäuren, Vitamine, anorganische Salze, Glucose und dergl. enthält, wird in einem Vorratsbehälter 42 für eine Lösung niedermolekularer Komponenten gelagert und durch eine Pumpe 47 in den Diffusionsdialysator übertragen. Im Diffusionsdialysator 44 wird das Kulturfiltrat in Kontakt mit der Lösung der niedermolekularen Komponenten über eine Dialysemembran gebracht. Die niedermolekularen Komponenten, die durch die Dialysemembran treten können, werden während des vorstehend beschriebenen Kontakts dialysiert. Insbesondere diffundieren Abfallkomponenten unter Einschluß von Milchsäure und Ammoniak, die im Kulturfiltrat enthalten sind, in die Lösung der niedermolekularen Komponenten, während verschiedene Aminosäuren, Glucose, verschiedene anorganische Salze und Vitamine, die in der Lösung der niedermolekularen Komponente enthalten sind, in das Kulturfiltrat diffundieren. Hochmolekulare Komponenten, wie verschiedene Hormone und Wachstumsfaktoren, die für die Proliferation der Zellen nützlich sind, verbleiben in der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit, ohne dialysiert zu werden. Die Dialyse wird in einer solchen Weise durchgeführt, daß die Milchsäurekonzentration und die Ammoniakkonzentration 1000 ppm oder weniger und vorzugsweise 100 ppm oder weniger bzw. 20 ppm oder weniger und vorzugsweise 5 ppm oder weniger betragen.
Die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit, aus der die Abfallkomponenten durch Diffusionsdialyse entfernt worden sind, wird in den Mediumherstellungsbehälter 41 durch eine Pumpe 46 übertragen. Eine Lösung hochmolekularer Komponenten wird aus einem Vorratsbehälter 43 für die Lösung hochmolekularer Komponenten durch eine Pumpe 45 dem Mediumherstellungsbehälter zugeführt, wo die Lösung der hochmolekularen Komponenten mit der vorstehend beschriebenen, von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit gemischt wird, um ein frisches Medium herzustellen. Die hochmolekularen Komponenten, wie Serum und Hormone, die nicht durch die Dialysemembran treten können, sind in der Lösung der hochmolekularen Komponenten gelöst. Der Mediumherstellungsbehälter 41 ist mit einer Einrichtung zur Messung der Konzentrationen an Milchsäure, Ammoniak und Protein ausgestattet. Durch diese Einrichtungen wird das Mischungsverhältnis der Lösung der hochmolekularen Komponenten mit der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit eingestellt.
Erfindungsgemäß kann ein Medium, das sich zur Proliferation der Zellen eignet, stets hergestellt werden, so daß es möglich ist, die Zellen in einer hohen Konzentration zu züchten.
Fig. 14 ist ein weiteres erfindungsgemäßes Beispiel, wobei die in Fig. 6 gezeigte Einrichtung zur Entfernung der Abfallkomponenten durch einen Adsorptionszylinder ersetzt ist.
Zeolith wurde auf einem unlöslichen Träger zur Adsorption von Ammoniak immobilisiert, während Lactatdehydrogenase auf einem unlöslichen Träger für die Absorption von Milchsäure immobilisiert würde. Adsorption und Regenerierung können unabhängig vom Stand der Züchtung durchgeführt werden, indem eine Mehrzahl von Adsorptionszylindern bereitgestellt und die Leitungen in geeigneter Weise geschaltet werden. Gemäß dem vorliegenden Beispiel ist, da nur die Abfallkomponenten selektiv entfernt werden, die Menge an verlorenem Medium klein.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 (nicht durch die Erfindung abgedeckt)

Ein Membrandehnungselement 52 aus SUS316, wie es in Fig. 9 gezeigt ist, mit einem maximalen Außendurchmesser von 2,5 mm, einem Innendurchmesser von 0,9 mm und einer Länge von 30 mm wurde in beide Enden einer hydrophoben Hohlfasermembran (TB- 21), die ein Tetrafluorethylenharz umfaßte und einen Außendurchmesser von 2 mm, einen Innendurchmesser von 1 mm, einen Porendurchmesser von 0,8 um und eine Länge von 1 in aufwies, eingeführt. Anschließend wurden 4 Hohlfasermembranen des vorstehend beschriebenen Typs geordnet und in eine zylindrische Härtungsform mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Tiefe von 30 mm eingeführt. Ein härtbares Zweikomponenten- Epoxidharz (Araldite Rapid; eingetragenes Warenzeichen für ein Produkt von Ciba Geigy) wurde in die vorstehend beschriebene Härtungsform unmittelbar nach dem Mischen des Hauptbestandteils und des Härtungsmittels des Epoxidharzes gegeben, und eine Zentrifugalkraft von 1000 G wurde unter Verwendung eines Zentrifugalseparators angewandt, wobei das Epoxidharz während der Anwendung der Zentrifugalkraft gehärtet wurde. Nachdem das Epoxidharz vollständig gehärtet worden war, wurde das gehärtete Produkt der Härtungsform entnommen, und das Ende des gehärteten Produkts wurde um 5 mm geschnitten.
Dampf mit einem Druck von 1,8 kg/cm²·G und einer Temperatur von 130ºC wurde von beiden Enden der vorstehend beschriebenen Hohlfasermembraneinheit eingeführt, und die Hohlfasermembraneinheit wurde 1 Stunde in diesem Zustand gehalten. Es wurde keine Hohlfasermembran aus dem Membranverbindungselement 51 gezogen, selbst wenn ein Zug von 1 kg pro Hohlfasermembran angewandt wurde, nachdem die Hohlfasermembraneinheit auf Raumtemperatur abgekühlt war.

Vergleichsbeispiel 1

Eine Hohlfasermembraneinheit wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Hohlfasermembranen mit einem Epoxidverbindungsmittel ohne Einführen des Membrandehnungselements 52 in beide Enden der Hohlfasermembranen fixiert wurden. Wasserdampf mit einem Druck von 1,8 kg/cm²·G und einer Temperatur von 130ºC wurde von beiden Enden der vorstehend beschriebenen Hohlfasermembraneinheit zugeführt, und die Hohlfasermembraneinheit wurde 1 Stunde in diesem Zustand gehalten. Nachdem die Hohlfasermembran auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde ein Zug von l kg pro Hohlfasermembran angewandt. Dies führte dazu, daß die Hohlfasermembranen aus dem Membranverbindungselement 51 herausgezogen wurden.

Beispiel 2

15 flache Kolben mit einem Gehalt an jeweils 5 ml Medium, das 9,4 g/l Eagle-MEM-Medium (Eagle MEM Nissui (1); Produkt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 0,292 g/l Glutamin, 29 ml/l einer 7,5%-igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, 20 g/l Glucose und 100 ml/l fötales Kälberserum und, überimpft darauf, eine Tumorzellinie der Rattenleber, nämlich JTC-1 (Japan Tissue Culture Nr. 1) umfaßte, wurden einer stationären Züchtung unterworfen. Die Züchtung wurde bei 37ºC durchgeführt, und Luft wurde zur Bildung der Gasphase verwendet.
Nach 3-tägiger Züchtung wurden die an der Oberfläche der einzelnen Kolben haftenden Zellen freigesetzt, wobei 75 ml eines Mediums mit einer Zellkonzentration von 5,1 · 10&sup5;/ml hergestellt wurden. Dieses Medium wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem gleichen Volumen frischem Medium suspendiert.
Sodann wurden in eine Rollerflasche mit einem Durchmesser von 110 mm, einer Länge von 171 mm und einem Volumen von 1250 ml 75 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension und 175 ml des vorstehend beschriebenen frischen Mediums gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC und 2 U/min 3 Tage unter Verwendung von Luft als Gas zur Bildung der Gasphase gezüchtet. Anschließend wurde das Medium zentrifugiert, und der überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem gleichen Volumen an frischem Medium suspendiert. Die Suspension wurde erneut 3 Tage unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet. Das Medium wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem 2-fachen Volumen an frischem Medium suspendiert. Die Suspension wurde auf die 2-fache Anzahl von Rollerflaschen verteilt und erneut 3 Tage unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet.
Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde 2 mal wiederholt, um 2000 ml Vorkulturmedium mit einer Zellkonzentration von 1,7 · 10&sup6;/ml herzustellen. Dieses Medium wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem gleichen Volumen an frischem Medium suspendiert.
Anschließend wurden in den zylindrischen Züchtungsbehälter aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 165 mm, einer Höhe von 350 mm und einem Volumen von 7000 ml in dem in Fig. 1 gezeigten Zellzüchtungssystem 2000 ml der vorstehend beschriebenen Vorkultur-Zellsuspension und 3000 ml eines Mediums (insgesamt 5000 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Ein Netz aus rostfreiem Stahl mit quadratischen Maschen (Länge einer Seite: 3 mm), dessen Oberfläche dünn mit einem Silan, nämlich einem organischen Siliconpolymeren (Viskosität: 1 · 10&sup5; cP) beschichtet war, wurde 50 mm oberhalb der Oberfläche der Flüssigkeit angeordnet, und das Gemisch wurde gezüchtet, indem ein sauerstoffhaltiges Gas durch einen Verteilerkranz mit einem Durchmesser von 60 mm (Lochdurchmesser: 1 mm; 10 Löcher), der am Boden des Behälters bereitgestellt wurde, eingeführt wurde. Die Menge des eingeführten sauerstoffhaltigen Gases wurde mit einer Vorrichtung zur Einstellung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff eingestellt, die imstande war, die Menge an Luft und Sauerstoff automatisch so einzustellen, daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) im Medium 2,5 ppm betrug. Ferner wurde Kohlendioxid zu dem sauerstoffhaltigen Gas gegeben und in das Medium mit einer Vorrichtung zur Einstellung des pH- Wertes eingeführt, so daß der pH-Wert des Mediums 7,0 bis 7,6 betrug.
Eine Filtereinheit ist mit dem Boden des Züchtungsbehälters über eine Leitung verbunden. Ein Trägerfilter wird am Boden der Filtereinheit bereitgestellt, um die hydrophile Filterhilfeschicht zu tragen. Eine hydrophobe Hohlfaserfiltereinheit ist in der hydrophilen Filterhilfeschicht verborgen. Die hydrophobe Hohlfaserfiltereinheit wurde mit der in Fig. 8B gezeigten Form hergestellt, indem 4 hydrophobe Hohlfasermembranen mit einer Länge von jeweils 1,2 in gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Ein Produkt, das durch Behandlung von Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 70 um mit Ethylalkohol, um den Glaskügelchen eine hydrophile Beschaffenheit zu verleihen, hergestellt wurde, wurde als hydrophile Filterhilfe verwendet.
Die Innenseite des Hohlfasermembranfilters wurde mit einer peristaltischen Pumpe zum Abziehen evakuiert, um das Kulturfiltrat mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/min abzuziehen. Das Beimischen von Zellen im Kulturfiltrat wurde überhaupt nicht beobachtet. Als die abgezogene Menge 500 ml erreichte, wurde die peristaltische Pumpe zum Abziehen angehalten. Das Rückspülen des Hohlfasermembranfilters und das Aufschließen der Filterhilfeschicht wurden mit einer peristaltischen Pumpe zum Rückspülen des Hohlfasermembranfilters bzw. einer peristaltischen Pumpe zum Aufschließen der Filterhilfeschicht durchgeführt.
Der Hohlfasermembranfilter wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 80 ml/min 2 Minuten rückgespült. Die Filterhilfeschicht wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 70 ml/min während des Rückspülens des Hohlfasermembranfilters und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 150 ml/min nach Abschluß des Rückspülens des Hohlfasermembranfilters aufgeschlossen, und das Aufschließen wurde so gesteuert, daß es abgeschlossen war, als die Menge an frischem Medium, das dem Züchtungsbehälter zugeführt wurde, die gleiche Menge erreichte, die abgezogen worden war. Frisches Medium, das im Vorratsbehälter für frisches Medium hergestellt worden war, wurde zum Rückspülen des Hohlfasermembranfilters und zum Aufschließen der Filterhilfe verwendet. Die Filtration des Mediums, das Rückspülen des Hohlfasermembranfilters und das Aufschließen der Filtermediumschicht wurden 10 mal pro Tag durchgeführt, so daß das im Züchtungsbehälter erhaltene Medium 1 mal pro Tag ausgetauscht wurde.
Die Ergebnisse des vorliegenden Beispiels sind in Fig. 16 gezeigt. Nach 12 Tagen vom Beginn der Züchtung war es möglich, eine Zellkonzentration von mindestens 1 · 10&sup7;/ml und eine Überlebensrate von mindestens 88% aufrechtzuerhalten. Die maximale Zellkonzentration betrug 1,6 · 10&sup7;/ml.

Vergleichsbeispiel 2

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß ein Züchtungssystem, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, verwendet wurde, von dem jedoch die Filtereinheit, der Hohlfasermembranfilter und die Filterhilfe entfernt worden waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 17 gezeigt. Der Austausch des Mediums konnte aufgrund der Entfernung der Filtereinheit, des Hohlfasermembranfilters und der Filterhilfe nicht durchgeführt werden. Dies führte zu einer Verarmung an Nährstoffkomponenten, so daß die Zellkonzentration rasch abnahm, nachdem sie 2,1 · 10&sup6;/ml erreicht hatte. Dies zeigt klar, daß der Austausch des Mediums für das Züchten der Zellen unabdingbar ist.

Vergleichsbeispiel 3

Das Züchten wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß bei dem in Fig. 1 gezeigten Züchtungssystem die Zufuhr von Sauerstoff durch Belüftung der Flüssigkeitsoberfläche durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 gezeigt. Die maximale Zellkonzentration betrug 5,6 · 10&sup6;/ml, und die Überlebensrate nahm allmählich ab. Dies zeigt, daß dem Medium der Sauerstoff fehlt, der für die Proliferation der Zellen erforderlich ist. Es ist also offensichtlich, daß keine ausreichende Menge an Sauerstoff durch Belüftung der Flüssigkeitsoberfläche zugeführt werden kann.

Vergleichsbeispiel 4

Das Züchten wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das in Fig. 1 gezeigte Züchtungssystem verwendet wurde, von dem jedoch die Entschäumungsschicht entfernt worden war. Bei dieser Züchtung floß Schaum über das Kulturabgasrohr aus. Dies zeigt, daß es erforderlich ist, eine Entschäumungseinrichtung innerhalb des Züchtungsbehälters bereit zustellen, um Sauerstoff durch Submersbelüftung zuzuführen.

Beispiel 3

Eine Vorkultur-Zellsuspension mit einer Zellkonzentration von 1,8 · 10&sup6;/ml wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 hergestellt. Sodann wurde die Züchtung in dem in Fig. 6 gezeigten Zellzüchtungssystem durchgeführt. Der Züchtungsbehälter dieses Systems war ein zylindrischer Behälter aus SUS316 mit einem Innenvolumen von 7000 ml, und ein Rührer 29 wurde bereitgestellt, um ein Strömen des Mediums zu ermöglichen. Eine hydrophobe Hohlfasermembranfiltereinheit 10 zum Abtrennen der Zellen aus dem Medium wies die in Fig. 13 gezeigte Form auf und wurde an der Oberfläche der Umdrehung der Rührerblätter bereitgestellt. Die hydrophobe Hohlfasermembranfiltereinheit wurde unter Verwendung von 4 Hohlfasermembranfiltern mit einer Länge von jeweils 1,5 m der gleichen Art, wie der in Beispiel 1 verwendeten, hergestellt. Die Einrichtung zum Zuführen von Sauerstoff, die Entschäumungseinrichtung und die Züchtungsbedingungen entsprachen denen von Beispiel 2.
In den Züchtungsbehälter wurden 2000 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension und 3000 ml des gleichen Mediums wie in Beispiel 2 (insgesamt 5000 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Die absatzweise Züchtung wurde nach dem Beginn der Züchtung für 2 Tage durchgeführt, und der Austausch des Mediums wurde am 3. Tag nach dem Beginn der Züchtung eingeleitet. Die Innenseite des Hohlfasermembranfilters wurde mit einer peristaltischen Pumpe evakuiert, um das Kulturfiltrat mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/min abzuziehen. Ein Beimischen von Zellen zum Zellfiltrat wurde überhaupt nicht beobachtet. Als die abgezogene Menge 500 ml erreichte, wurde die peristaltische Pumpe zum Abziehen angehalten. Anschließend wurde frisches Medium unter Druck dem Hohlfasermembranfilter 10 mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 200 ml/min mit einer peristaltischen Pumpe zum Rückspülen des Hohlfasermembranfilters zugeführt, wobei der Hohlfasermembranfilter 10 rückgespült wurde. Das für das Rückspülen verwendete Medium umfaßte 9,4 g/l Eagle-MEM-Medium, 0,292 g/l Glutamin, 29 ml/l einer 7,5%-igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und 50 ml/l fötales Kälberserum und wurde im Vorratsbehälter 12 für frisches Medium gelagert. Das Rückspülen wurde so gesteuert, daß es abgeschlossen war, als die Menge an frischem Medium, die dem Züchtungsbehälter zugeführt wurde, die gleiche Menge wie die Menge, die als Kulturfiltrat abgezogen worden war, erreichte. Die Filtration und das Rückspülen wurden 10 mal pro Tag durchgeführt, so daß das im Züchtungsbehälter enthaltene Medium einmal am Tag vollständig durch frisches Medium ersetzt wurde.
Das abgezogene Kulturfiltrat wurde im Vorratsbehälter 15 für Kulturfiltrat gelagert. Anschließend wurden die niedermolekularen Komponenten, die die Abfallkomponenten enthielten, durch einen Ultrafilter 14 abfiltriert, wodurch die hochmolekularen Komponenten konzentriert wurden. Die hochmolekularen Komponenten wurden im Vorratsbehälter 13 für von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit gelagert. Die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit wurde zwischen dem Ultrafilter 14 und dem Vorratsbehälter 13 für von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit durch eine peristaltische Pumpe im Kreis geführt, bis das Volumen der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit 1/10 des Kulturfiltrats betrug. Der Ultrafilter wies ein Fraktionierungsmolekulargewicht von 10 000 auf.
Vom 8. Tag nach dem Beginn der Kultur an wurde frisches Medium mit der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit im Mediumherstellungsbehälter in einem Anteil von 900 ml frischem Medium pro 100 ml von Abfallkomponenten freier Flüssigkeit gemischt. Das Gemisch wurde zum Rückspülen des Hohlfasermembranfilters 10 im Mediumherstellungsbehälter verwendet.
Vom 18. Tag nach dem Beginn der Kultur an wurden die Filtration und das Rückspülen 20 mal pro Tag durchgeführt, so daß das im Züchtungsbehälter enthaltene Medium 2 mal am Tag ausgetauscht wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 19 gezeigt. Aufgrund der Entfernung der Abfallkomponenten durch den Ultrafilter waren die Konzentrationen an Milchsäure und Ammoniak niedriger als diejenigen, die in Beispiel 2 erzielt wurden. Ferner erreichte die maximale Zellkonzentration 2,8 · 10&sup7;/ml, was zeigt, daß im vorliegenden Beispiel hervorragende Wirkungen erzielt wurden.

Beispiel 4

Eine Vorkultur-Zellsuspension mit einer Zellkonzentration von 1,1 · 10&sup6;/ml wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 hergestellt. Sodann wurde die Züchtung der Zellen in dem in Fig. 7 gezeigten Zellzüchtungssystem durchgeführt. Dieses System entspricht dem in Fig. 6 gezeigten und in Beispiel 3 verwendeten Züchtungssystem, wobei nur die Einrichtung zur Entfernung der Abfallkomponenten durch den Diffusionsdialysator 44 ersetzt wurde. Die Einrichtung zur Zufuhr von Sauerstoff, die Entschäumungseinrichtung, die Einrichtung zum Austausch des Mediums und die Züchtungsbedingungen entsprachen denen von Beispiel 3.
In den Züchtungsbehälter wurden 2000 ml der vorstehend beschriebenen Zellsuspension und 3000 ml des gleichen Mediums wie in Beispiel 2 (insgesamt 5000 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Eine absatzweise Züchtung wurde nach dem Beginn der Züchtung für 2 Tage durchgeführt, und der Austausch des Mediums wurde 3 Tage nach dem Beginn der Züchtung eingeleitet. Die Innenseite des Hohlfasermembranfilters 10 wurde mit einer peristaltischen Pumpe zum Abziehen des Kulturfiltrats mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 15 ml/min evakuiert. Das abgezogene Kulturfiltrat wurde im Vorratsbehälter 15 für Kulturfiltrat gelagert. Ein Beimischen von Zellen zum Zellfiltrat wurde überhaupt nicht beobachtet. Als die abgezogene Menge 500 ml erreichte, wurde die peristaltische Pumpe zum Abziehen angehalten.
Die Kulturlösung wurde vom Vorratsbehälter 15 für Kulturfiltrat dem Diffusionsdialysator 44 mit einer peristaltischen Pumpe zugeführt, um niedermolekulare Komponenten, die Abfallkomponenten enthielten, durch Diffusionsdialyse zu entfernen. Eine Membran, die ein Durchtreten einer Substanz mit einem Molekulargewicht von 6000 oder weniger erlaubt, die jedoch kein Durchtreten einer Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr als 6000 erlaubt, wurde als Diffusionsdialysemembran verwendet. Bei der Diffusionsdialyse wurde eine Lösung niedermolekularer Komponenten, die 9,5 g/l Eagle-MEM-Medium, 0,292 g/l Glutamin, 29 ml/l einer 7,5%-igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und 20 ml/l Glucose enthielt, als eine Kontrolle verwendet und mit einer Durchflußgeschwindigkeit, die 2 mal höher war als diejenige des Kulturfiltrats, zugeführt. Die von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit, aus der die niedermolekularen Komponenten, die Abfallkomponenten enthielten, entfernt worden waren, wurde im Vorratsbehälter für von Abfallkomponenten freie Flüssigkeit gelagert.
Im Mediumherstellungsbehälter wurde fötales Kälberserum in einer Menge von 1% zu der von Abfallkomponenten freien Flüssigkeit gegeben. Das Gemisch wurde unter Druck durch eine peristaltische Pumpe dem Hohlfasermembranfilter 10 mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 200 ml/min zugeführt, um den Hohlfasermembranfilter 10 rückzuspülen. Das Rückspülen wurde so gesteuert, daß es abgeschlossen war, als die Menge der Rückspülflüssigkeit, die dem Züchtungsbehälter zugeführt wurde, die gleiche Menge wie die Menge des abgezogenen Kulturfiltrats erreichte. Die Filtration und das Rückspülen wurden 30 mal am Tag durchgeführt, so daß das im Züchtungsbehälter enthaltene Medium 3 mal am Tag ausgetauscht wurde.
Die Ergebnisse des vorliegenden Beispiels sind in Fig. 20 gezeigt. Aufgrund der Entfernung der Abfallkomponenten durch Diffusionsdialyse wurden die Konzentrationen an Milchsäure und Ammoniak verringert, so daß die maximale Zellkonzentration 3,0 · 10&sup7;/ml erreichte.

Vergleichsbeispiel 5

Das Züchten der Zellen wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß bei der in Fig. 1 gezeigten Züchtungsvorrichtung eine hydrophile Filtermembran (ein Produkt von Amicon Corporation; Diaflow Hollow Fiber System; DH1; Hohlfasermembran; HIMP01-43; Porendurchmesser von 1,1 um) anstelle der hydrophoben Filtermembran verwendet wurde.
Als die Filtermembran rückgespült wurde, wurde die Filtrationsdurchflußgeschwindigkeit rasch verringert, und eine Verstopfung trat 6 Tage nach dem Beginn des Züchtens auf, was es unmöglich machte, das Züchten fortzusetzen.

Beispiel 5

15 flache Kolben, die jeweils 5 ml des nachstehenden Mediums und, überimpft darauf, eine Tumorzellinie der Ratte, nämlich JTC-1 (Japan Tissue Culture Nr. 1) enthielten, wurden einer stationären Züchtung unterworfen.
Das Züchten wurde bei 37ºC durchgeführt, und die Gasphase umfaßte Luft mit einem Gehalt an 5% Kohlendioxid.
Zusammensetzung des Mediums
Glucose 1000 mg/l
Glutamin 200 mg/l
Asparaginsäure 100 mg/l
Glutaminsäure 50 mg/l
Glycin 10 mg/l
Alanin 10 mg/l
Leucin 20 mg/l
Isoleucin 20 mg/l
Valin 15 mg/l
Arginin 10 mg
Cystin 10 mg
Cystein 10 mg
Serin 20 mg
Threonin 15 mg
Lysin 10 mg
Methionin 10 mg
Natriumcitrat 25 mg
Citronensäure 10 mg
α-Ketoglutarsäure 15 mg
Biotin 0,1 mg
Thiamin 0,1 mg
Pyridoxal 0,01 mg
Nicotinsäure 0,01 mg
Riboflavin 0,02 mg
Inosit 0,1 mg
Vitamin B&sub1;&sub2; 0,001 mg
Glutathion 1 mg
Natriumchlorid 50 mg
Kaliumchlorid 50 mg
Magnesiumchlorid 10 mg
Calciumchlorid 10 mg
Manganchlorid 0,01 mg
Natriumbicarbonat 10 mg
fötales Kälberserum 100 ml
pH-Wert: 7,0 Gesamt: 1 l
Nach 3-tägigem Züchten wurden die an den Oberflächen der einzelnen Kolben haftenden Zellen freigesetzt, wobei 75 ml eines Vorkulturmediums mit einer Zellkonzentration von 1,1 · 10&sup5;/ml hergestellt wurden. Dieses Medium wurde zentrifugiert, und der überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem gleichen Volumen an frischem Medium suspendiert.
Anschließend wurden in einen zylindrischen Züchtungsbehälter aus Glas mit einem Durchmesser von 70 mm, einer Höhe von 390 mm und einem Volumen von 1500 ml 75 ml der vorstehend beschriebenen Vorkultur-Zellsuspension, 725 ml eines flüssigen Mediums und 10 ml fötales Kälberserum (insgesamt 900 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Ein Netz aus rostfreiem Stahl, das mit quadratischen Maschen (Länge einer Seite: 5 mm) versehen war und eine Oberfläche aufwies, die dünn mit einem Silan, nämlich einem organischen Siliconpolymer (HIVAC-G; Produkt von The Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.; Viskosität von 1 · 10&sup5; cP) beschichtet war, wurde 10 mm oberhalb der Oberfläche des Mediums angeordnet, und das Gemisch wurde 5 Tage gezüchtet, während aseptische Luft durch eine Einzellochdüse 4 mit einem Innendurchmesser von 1 mm, die am Boden des Behälters 2 bereitgestellt wurde, bei einem Durchsatz von 0,2 cm/sec geleitet wurde. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs bei einer Luftzufuhrrate von 0,2 cm/sec betrug 7 mMol O&sub2;/l·h. Beim Züchten erreichte die Zellkonzentration 6 · 10&sup6;/ml. Die Konzentrationen an Ammoniak und Milchsäure, die während des Züchtens gebildet wurden, betrugen 400 ppm bzw. 1100 ppm. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde bei 2 bis 5 ppm während des Züchtens gehalten. Während des Züchtens gebildeter Schaum wurde in Kontakt mit der Entschäumungsschicht 5 gebracht und glatt zerstört. Daher strömte während der gesamten Züchtung kein Schaum von der oberen Oberfläche der Entschäumungsschicht in die Gasphase des Behälters.

Beispiel 6

15 flache Kolben mit einem Gehalt an jeweils 5 ml des nachstehenden Mediums und, überimpft darauf, einer Tumorzellinie der Rattenleber, nämlich JTC-1 (Japan Tissue Culture Nr. 1), wurden einer stationären Züchtung unterworfen. Die Züchtung wurde bei 37ºC durchgeführt, und die Gasphase umfaßte Luft mit einem Gehalt an 5% (Vol./Vol.) Kohlendioxid.
Zusammensetzung des Mediums
Glucose 2000 mg/l
Arginin-hydrochlorid 126 mg/l
Cystin 24 mg/l
Glutamin 292 mg/l
Histidin-hydrochlorid 42 mg/l
Isoleucin 52 mg/l
Leucin 52 mg/l
Lysin-hydrochlorid 73 mg/l
Methionin 15 mg/l
Phenylalanin 32 mg/l
Threonin 48 mg/l
Tryptophan 10 mg/l
Tryosin 36 mg/l
Valin 46 mg/l
Thiamin 1,0 mg/l
Riboflavin 0,1 mg/l
Pyridoxal 1,0 mg/l
Pantothensäure 1,0 mg/l
Nicotinsäure 1,0 mg/l
Biotin 0,02 mg/l
Cholin-hydrochlorid 1,8 mg/l
Folsäure 1,0 mg/l
Inosit 2,0 mg/l
Natriumchlorid 8000 mg/l
Kaliumchlorid 200 mg/l
Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat 200 mg/l
fötales Kälberserum 1 · 10&sup5;
pH-Wert: 7,0 Gesamt: 1 l
Nach 3-tägiger Kultur wurden die an den Oberflächen der einzelnen Kolben haftenden Zellen freigesetzt, wobei 75 ml eines Vorkulturmediums mit einer Zellkonzentration von 1,21 · 10&sup5;/ml hergestellt wurden. Dieses Medium wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde in einem gleichen Volumen an frischem Medium suspendiert.
Anschließend wurden in einen zylindrischen Züchtungsbehälter aus Glas mit einem Durchmesser von 70 mm, einer Höhe von 390 mm und einem Volumen von 1500 ml 75 ml der vorstehend beschriebenen Vorkultur-Zellsuspension, 725 ml eines flüssigen Mediums und 10 ml fötales Kälberserum (insgesamt 900 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Eine wabenartige Polyethylen-Entschäumungsschicht 5 mit einer Höhe von 5 mm (eine Seite des regelmäßigen sechseckigen Lochs: 4 mm) und einer Oberfläche, die dünn mit einem Polysiloxan (HIVAC-G; Produkt von The Shin-Etsu-Chemical Co., Ltd.) beschichtet war, wurde 0,5 mm oberhalb der Oberfläche des Mediums angeordnet. Das Gemisch wurde 5 Tage gezüchtet, während sterilisierte Luft durch eine poröse Glasdüse 4, die am Boden des Behälters bereitgestellt wurde, mit einem Durchsatz von 0,2 cm/sec eingeführt wurde, so daß der mittlere Blasendurchmesser 2 mm betrug. Die Oberflächenspannung und der Kontaktwinkel zwischen dem Tropfen des Mediums und dem wasserabstoßenden Material betrugen 65 dyn/cm² bzw. 90º. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs bei der vorstehenden Belüftung betrug 7 mMol O&sub2;/l·h. Bei der Züchtung erreichte die Zellkonzentration 5,2 · 10&sup6;/ml. Die Konzentrationen an Ammoniak und Milchsäure, die während des Züchtens gebildet wurden, betrugen 35 ppm bzw. 1050 ppm. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde bei 2 bis 5 ppm während des Züchtens gehalten. Schaum auf der Oberfläche des Mediums, der sich während des Züchtens bildete, wurde durch die Entschäumungsschicht 5 vollständig zerstört.

Beispiel 7

Der folgende Test wurde im gleichen Züchtungsbehälter und unter den gleichen Züchtungsbedingungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß eine andere Entschäumungsschicht verwendet wurde. Bei der Entschäumungsschicht 5 handelte es sich um eine Entschäumungsschicht, die unter Verwendung eines Netzes aus rostfreiem Stahl mit quadratischen Maschen (Größe einer Masche: 8 mm) als Gerüst durch Abscheiden eines Polyurethanharzes auf dem Netz aus rostfreiem Stahl, so daß die Maschengröße 5 mm betrug, und durch Imprägnieren des Netzes mit Polysiloxan (2 · 10³ cP) in einer Menge von 5% hergestellt wurde.
Das Gemisch wurde 5 Tage gezüchtet, während sterilisierte Luft durch eine poröse Glasdüse 4, die am Boden des Behälters bereitgestellt wurde, bei einem Durchsatz von 0,2 cm/sec zugeführt wurde, so daß der mittlere Blasendurchmesser 2 mm betrug.
Der Kontaktwinkel zwischen einem Tropfen des Mediums und dem wasserabstoßenden Material betrug 85º. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs bei der vorstehenden Belüftung betrug 7 mMol O&sub2;/l·h. Bei der Züchtung erreichte die Zellkonzentration 5,2 · 10&sup6;/ml. Die Konzentrationen an Ammoniak und Milchsäure, die während des Züchtens gebildet wurden, betrugen 36 ppm bzw. 1040 ppm. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde bei 6 ppm während des Züchtens gehalten. Schaum auf der Oberfläche des Mediums, der sich während des Züchtens bildete, wurde durch die untere Oberfläche der Entschäumungsschicht 5 vollständig zerstört. Die Zellkonzentration erreichte 5,1 · 10&sup6;/ml nach 5-tägigem Züchten.

Vergleichsbeispiel 6

Das Züchten wurde in einem System mit Belüftung der Flüssigkeitsoberfläche im Gegensatz zum Submersbelüftungssystem von Beispiel 6 durchgeführt.
Ein Züchtungsbehälter mit der gleichen Form und dem gleichen Volumen wie der Züchtungsbehälter von Beispiel 6 wurde bereitgestellt, und die Entschäumungsschicht 5 und die Submersbelüftungsdüse 4 wurden entfernt. Anstelle dessen wurden eine Belüftungsleitung und eine Abgasleitung im Gasphasenteil gegenüber von einander und parallel zur Oberfläche des Mediums angeordnet. Es wurde die gleiche Zellinie in der gleichen Weise gezüchtet, um ein Vorkulturmedium herzustellen. Die Züchtung wurde 3 Tage bei dem gleichen Luftdurchsatz, unter Verwendung des gleichen Volumens an Vorkulturmedium und unter Verwendung von flüssigem Medium und Serum aus der gleichen Charge durchgeführt. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs betrug 0,3 mMol O&sub2;/l·h. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff betrug 0 bis 0,2 ppm am ersten Tag des Züchtens und 8 ppm 3 Tage nach Beginn des Züchtens. Die Zellkonzentration betrug 0,9 · 10&sup6;/ml. Vergleichsbeispiel 6 ist ein Beispiel des Stands der Technik, und bei dem Belüftungssystem für die Flüssigkeitsoberfläche konnte keine ausreichende Menge an gelöstem Sauerstoff, die für die Proliferation der Zellen erforderlich ist, zugeführt werden, so daß die Zellkonzentration nur ungefähr 1/6 derjenigen von Beispiel 6 entsprach.

Vergleichsbeispiel 7

Das Züchten wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Entschäumungsschicht 5, die eine wabenartige Polyethylenschicht umfaßte, mit Olivenöl (Viskosität: 22 cP) beschichtet wurde. Der Kontaktwinkel relativ zum Medium betrug 25º. Durch die Submersbelüftung gebildeter Schaum wurde in Kontakt mit der Entschäumungsschicht gebracht, die 3 Stunden eine Entschäumungswirkung zeigte. Anschließend zeigte die Entschäumungsschicht jedoch keine Wirkung mehr, und Schaum strömte aus der Abgasöffnung 24, die an der Spitze des Behälters bereitgestellt wurde, über die Entschäumungsschicht, was es unmöglich machte, den Betrieb fortzusetzen. Ferner wurde beobachtet, daß das Olivenöl in Form eines Ölfilms sich auf der Oberfläche des Mediums verteilte.
Wie aus dem vorstehenden Vergleichsbeispiel ersichtlich ist, ist das Entschäumen durch direkten Kontakt eines wasserabstoßenden Mittels niedriger Viskosität mit dem Medium zwar für eine kurze Zeit wirksam, die Entschäumungswirkung dauert aber nicht lange Zeit.

Beispiele 8 bis 15

Die etablierten tierischen Zellen, die in Beispiel 6 verwendet wurden, wurden gezüchtet, indem Gebrauch vom gleichen flüssigen Medium wie in Beispiel 6 gemacht wurde. Ein Glasbehälter mit einem Durchmesser von 15 cm und einer Höhe von 30 cm wurde als Züchtungsbehälter 2 verwendet. Verschiedene Entschäumungsschichten 5, die in der Tabelle gezeigt sind, wurden parallel zum Boden des Behälters in einer Position etwa 10 cm oberhalb des Bodens des Behälters bereitgestellt. Ein Verteilerkranz mit einem Durchmesser von 10 cm (Lochdurchmesser von 1 mm; 12 Löcher) wurden am Boden des Behälters bereitgestellt, und aseptische Luft mit einem Gehalt an 5% (Vol./Vol.) Kohlendioxid wurde bei dem in Tabelle 1 gezeigten Durchsatz zugeführt. Die Temperatur wurde automatisch auf 30ºC mit einem äußeren Mantel eingestellt. Das Züchten wurde 4 Tage durchgeführt, und die entschäumende Wirkung der Entschäumungsschicht, der Druckverlust und die maximal während der Dauer des Züchtens erzielte Zellkonzentration wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Alle Entschäumungsschichten zeigten eine Entschäumungswirkung.
Ein überaus geringer Lochdurchmesser, wie er in Beispiel 8 gezeigt ist (r = 0,5 mm), führt jedoch zu einem Anstieg des Druckverlustes. Tabelle 1 Beispiel Nr. Struktur der Entschäumungsschicht Fig. Entschäumungswirkung (0: vollständige Entschäumung; X: Entschäumung unmöglich) Gasdurchsatz (cm/sec) Druckverlust bei 0,1 cm/sec (kg/cm²) max. Zellkonzentration (Zellen/ml) Tabelle 2 Beispiel Nr. Struktur der Entschäumungsschicht Fig. Entschäumungswirkung (0: vollständige Entschäumung; X: Entschäumung unmöglich) Gasdurchsatz (cm/sec) Druckverlust bei 0,1 cm/sec (kg/cm²) max. Zellkonzentration (Zellen/ml)

Vergleichsbeispiel 8

Das Züchten wurde unter Verwendung der gleichen Art von Züchtungsbehälter wie in Beispiel 8 unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, daß sich die Entschäumungsschicht 5 von der Entschäumungsschicht von Beispiel 8 unterschied. Bei der Entschäumungsschicht 5 handelte es sich um eine Entschäumungsschicht, die durch Verschweißen von rostfreien Stahldrähten mit einem Durchmesser von jeweils 1 mm und einer Länge von 5 cm in Kreuzform auf einer Ebene hergestellt wurde, und der Schnittpunkt befand sich im mittleren Abschnitt des ebenen Querschnitts des Behälters. Es wurde also eine Entschäumungsschicht verwendet, die mit einem bogenförmigen Loch mit einem Durchmesser von 50 mm und einem Innenwinkel von 90º versehen war. Die Entschäumung konnte durchgeführt werden, wenn der Gasdurchsatz 0,01 cm/sec betrug. Wenn der Luftdurchsatz jedoch 0,1 cm/sec betrug, dann trat der entstehende Schaum durch, d. h. der Schaum passierte das bogenförmige Loch, ohne zerstört zu werden, und strömte aus der Abgasöffnung 24, was es unmöglich machte, den Betrieb fortzusetzen. Das vorstehend beschriebene Vergleichsbeispiel zeigt, daß die Entschäumungswirkung verringert wird, wenn der Durchmesser des Lochs in der Entschäumungsschicht 5 zu groß ist.

Beispiel 16 (nicht von der Erfindung abgedeckt)

Hela-Zellen (menschliche Gebärmutterkrebszellen) wurden mit einer Zellkonzentration von 5 · 10&sup4;/ml in 500 ml fassende Rollerkulturflaschen aus Glas mit einem Gehalt an 100 ml des gleichen Mediums, wie es in Beispiel 6 verwendet wurde, überimpft und 3 Tage bei 37º und einer Rotationsgeschwindigkeit von 10 U/min gezüchtet. Luft wurde als Gasphase verwendet.
Die auf diese Weise gezüchteten, an der Oberfläche der Kulturflasche haftenden Zellen wurden freigesetzt, um 100 ml eines Vorkulturmediums mit einer Zellkonzentration von 1,1 · 10&sup5;/ml herzustellen.
Anschließend wurden in einen zylindrischen Züchtungsbehälter 2 aus Glas mit einem Durchmesser von 104 mm, einer Höhe von 164 mm und einem Volumen von 1500 ml 100 ml der vorstehend beschriebenen Vorkultur-Zellsuspension, 705 ml eines flüssigen Mediums und 90 ml fötales Kälberserum (insgesamt 900 ml) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC gehalten. Eine erste Entschäumungsschicht, die mit Stearinsäure beschichtetes Teflon® mit einem Gitterabstand von 3 mm umfaßte, wurde 5 mm oberhalb der Oberfläche des Mediums bereitgestellt, und ein Gitter des gleichen Typs wie das vorstehend beschriebene wurde als zweite Entschäumungsschicht 3 mm oberhalb der ersten Entschäumungsschicht in einer senkrechten Richtung davon bereitgestellt. Das Gemisch wurde 5 Tage gezüchtet, während sterilisierte Luft durch eine poröse Glasdüse 4, die am Boden des Behälters bereitgestellt wurde, mit einem Durchsatz von 0,3 cm/sec eingeführt wurde, so daß der mittlere Blasendurchmesser 1,5 mm betrug. Die Oberflächenspannung und der Kontaktwinkel zwischen einem Tropfen des Mediums und dem wasserabstoßenden Material betrugen 5 dyn/cm² bzw. 85º. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs bei der vorstehenden Belüftung betrug 7 mMol O&sub2;/l·h.
Die Zellkonzentration erreichte 4,2 · 10&sup6;/ml. Die Konzentrationen an Ammoniak und Milchsäure, die während des Züchtens gebildet wurden, betrugen 29 ppm bzw. 900 ppm. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde während des Züchtens bei 2 bis 5 ppm gehalten. Schaum, der sich während des Züchtens an der Oberfläche des Mediums bildete, wurde durch die Entschäumungsschicht 5, die in einer Zweistufenform bereitgestellt wurde, vollständig zerstört.

Beispiel 17

150 ml eines flüssigen Mediums mit der nachstehenden Zusammensetzung wurden in 20 Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben:
Sojabohnenextrakt (eine Flüssigkeit, die durch Zugabe von 900 ml Wasser zu 100 g Sojabohnen, Durchführen einer Hitzeextraktion bei 120ºC für 30 Minuten und Filtrieren des Extraktes erhalten wurde) 987 g
Pepton 10 g
Kaliumphosphat 2 g
Magnesiumsulfat-hexahydrat 0,5 g
Calciumchlorid 0,5 g
Natriumchlorid 0,5 g
pH-Wert: 7,0
Bacillus subtilis-Zellen, die einer aeroben stationären Züchtung in einem Teströhrchen mit einem Gehalt an Schrägagargelmedium unterworfen worden waren, wurden in jeden Kolben mit einer Zellkonzentration von 1,1 · 10&sup6;/ml überimpft und einer aeroben Schüttelkultur mit einer Amplitude von 7 cm und 120 Schlägen unterworfen. Das auf diese Weise erhaltene Medium wurde als Vorkulturmedium für die nachstehende Hauptkultur verwendet.
In einen Züchtungsbehälter 2 mit einem Innendurchmesser von 16 cm und einer Höhe von 25 cm wurden 2,5 l eines flüssigen Mediums mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung gegeben und 20 Minuten einer Dampfsterilisation bei 120ºC unterworfen. Der Züchtungsbehälter wies in einer Position 1 cm über der Oberfläche des Mediums eine Entschäumungsschicht 5, die aus einem porösen Blech aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 16 cm und einer Dicke von 0,5 mm (Lochdurchmesser: 3 mm; Öffnungsverhältnis: 50%) gefertigt und mit Dimethylpolysiloxan (Viskosität: 1 · 10&sup5; cP) beschichtet war, und am Boden einen Verteilerkranz (Lochdurchmesser: 1 mm; 12 Löcher) und einem Flügelrührer auf.
Das Züchten wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Gasdurchsatz: 0,2 m/sec (Geschwindigkeit des Sauerstoffs 10 mMol O&sub2;/l·h)
Temperatur: 350ºC
pH-Wert: automatisch auf 7,0 eingestellt (Neutralisationsmittel: 4n NaOH)
Rührgeschwindigkeit: 50 U/min
Obwohl die Menge an Schaum, der in einem frühen Stadium der Kultur gebildet wurde, klein war, bildete sich eine große Menge an Schaum 8 Stunden nach dem Beginn des Züchtens. Der Schaum wurde jedoch durch die Entschäumungsschicht 5 leicht zerstört, und kein Schaum strömte über das obere Ende des Züchtungsbehälters.
Der Zustand der Proliferation während des Züchtens ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Züchtungszeit (h) Zellkonzentration (Zellen/ml) 0 1,1 · 10&sup6;
10 1,6 · 10&sup7;
15 2,5 · 10&sup7;
20 2,4 · 10&sup7;

Vergleichsbeispiel 8

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 9 begonnen, mit der Ausnahme, daß die Entschäumungsschicht 5 aus dem in Beispiel 17 verwendeten Züchtungsbehälter entfernt wurde.
Die Zufuhr an Luft wurde mit einem Durchsatz von 0,2 cm/sec begonnen. 8 Stunden nach dem Beginn des Zuführens von Luft bildete sich eine große Menge an Schaum an der Oberfläche des Mediums, und mehrere Sekunden später strömte der Schaum in die Abgasöffnung 24 des Züchtungsbehälters. Da dies es unmöglich machte, die Züchtung fortzusetzen, wurde die Züchtung in diesem Zustand beendet.

Vergleichsbeispiel 9

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 begonnen, mit der Ausnahme, daß die Entschäumungsschicht 5 im Züchtungsbehälter, der in Beispiel 17 verwendet wurde, entfernt wurde, und ein Entschäumungsblatt mit einer Breite von 1 cm befestigt und mit 500 U/min gedreht wurde.
Wenn jedoch die Zufuhr von Luft bei einem Durchsatz von 0,2 cm/sec begonnen wurde, bildete sich Schaum auf der Oberfläche des Mediums, und mehrere Sekunden später strömte der Schaum in die Abgasöffnung 24 des Züchtungsbehälters. Da dies es unmöglich machte, den Betrieb fortzusetzen, wurde die Züchtung in diesem Zustand beendet.

Vergleichsbeispiel 10

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie in Vergleichsbeispiel 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Luft bei einem Durchsatz von 0,01 cm/sec zugeführt wurde, d. h. der oberen Grenze des Durchsatzes im Hinblick auf die Entschäumungswirkung des rotierenden Entschäumungsblatts. Die Geschwindigkeit des Sauerstoffs bei dem vorstehend angegebenen Durchsatz der Luft betrug 0,02 mMol O&sub2;/l·h. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff während des Züchtens wurde nach einem Elektrodenverfahren gemessen, und es wurde festgestellt, daß sie 0 ppm betrug.
Der Zustand der Proliferation während der Züchtung ist in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Dauer der Züchtung (h) Zellkonzentration (Zellen/ml) 0 1,1 · 10&sup6;
10 2,0 · 10&sup6;
15 4,2 · 10&sup6;
20 4,2 · 10&sup6;
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich ist, hemmt bei der Belüftung über die Flüssigkeitsoberfläche und der mechanischen Entschäumung durch das rotierende Blatt, die dem Fachmann jeweils bekannt sind, Schaum, der auf der Oberfläche des Mediums verbleibt, das Auflösen von Sauerstoff im Medium, so daß die Proliferation der Zellen den geringen Wert von 1/6 derjenigen von Beispiel 17 erreicht.

Beispiel 18

1 l des nachstehenden flüssigen Mediums wurde in einen 2 l fassenden Züchtungsbehälter aus Glas (mit einem Durchmesser von 7 cm · einer Höhe von 52 cm) gegeben, und Chlorella pyrenoidza wurden überimpft, so daß die Zellkonzentration 1 · 10&sup5;/ml betrug. Eine fluoreszierende Lampe wurde an der Seitenfläche des Züchtungsbehälters installiert, so daß die Lichtintensität an der Innenseite der Wand des Behälters 5 · 10³ Lux betrug. Die Temperatur wurde mit einem äußeren Mantel auf 30ºC eingestellt. Ein Polybutadiennetz (quadratische Löcher; 5 · 5 mm), das mit Dimethylpolysilan (Viskosität: 7 · 10&sup5; cP) imprägniert war, wurde 1 cm oberhalb der Oberfläche des Mediums, das in dem Züchtungsbehälter enthalten war, bereitgestellt. Ferner wurde ein Verteilerkranz (mit einem Durchmesser von 5 cm; Lochdurchmesser: 1 mm; 8 Löcher) am Boden des Behälters bereitgestellt. Luft mit einem Gehalt an 5 % (Vol./Vol.) Kohlendioxid wurde bei einem Durchsatz von 0,1 cm/sec zugeführt.
Hefeextrakt 1 g
Malzextrakt 1 g
Leberextrakt 1 g
Pepton 0,3 g
Glucose 0,3 g
Dextrin 2 g
Kaliumnitrat 2 g
Magnesiumnitrat-hexahydrat 0,5 g
Kaliumphosphat 0,01 g
Eisen(II)-nitrat 0,005 g
pH-Wert: 7,0
Da die Menge an Schaum, die sich auf der Oberfläche in einem frühen Stadium der Züchtung bildete, gering war, konnte der Schaum in zufriedenstellender Weise durch die Entschäumungsschicht zerstört werden. 5 Stunden nach dem Beginn der Züchtung bildete sich eine große Menge Schaum auf der Oberfläche des Mediums. Dieser Schaum konnte jedoch in wirksamer Weise durch die Entschäumungsschicht 5 zerstört werden. Daher strömte während der gesamten Züchtung kein Schaum über die Entschäumungsschicht.
Der Zustand der Proliferation während der Züchtung ist in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Dauer der Züchtung (h) Zellkonzentration (Zellen/ml) 0 1,1 · 10&sup4;
1 2,8 · 10&sup4;
2 1,8 · 10&sup6;
4 7,0 · 10&sup6;
6 7,5 · 10&sup6;
8 6,9 · 10&sup6;

Vergleichsbeispiel 11

Die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 18 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Entschäumungsschicht aus dem Züchtungsbehälter entfernt wurde.
Die Zufuhr an Luft wurde bei einem Durchsatz von 0,1 cm/sec begonnen. Auf der Oberfläche des Mediums gebildeter Schaum zerfiel spontan für eine Dauer der Züchtung von 12 Stunden. 13 Stunden nach dem Beginn der Züchtung jedoch war der Gasphasenabschnitt des Züchtungsbehälters mit Schaum gefüllt, und Schaum strömte in die Abgasöffnung 24, was dazu führte, daß ein aseptischer Filter, der mit der Abgasöffnung verbunden war, durch Zellen verstopft wurde. Da dies es unmöglich machte, den Betrieb fortzusetzen, wurde die Züchtung in diesem Zustand beendet.

Großtechnische Anwendbarkeit

Erfindungsgemäß ist es möglich, ein zellfreies Kulturfiltrat durch Filtration eines Mediums mit einer hydrophoben Membran abzuziehen, ohne eine Schädigung der Zellen durch Scherkräfte eines Fluids und eine Verstopfung der Membran hervorzurufen. Daher kann das im Züchtungsbehälter enthaltene Medium in wirksamer Weise durchgeleitet werden, und die Zellen können stabil in einer hohen Konzentration für eine lange Zeitspanne gezüchtet werden, was die Erfindung der vorliegenden Anmeldung sehr geeignet für die Herstellung von Insulin oder dergl. macht.

Claims

1. Verfahren zur Züchtung von Zellen umfassend:

Bereitstellen einer Kulturlösung, in der lebende Zellen in einem Kulturbehälter suspendiert sind,

Anordnen einer wasserabweisenden Entschäumungsstruktur in einer Position oberhalb der Kulturlösungsoberfläche und

Durchführen der Züchtung der Zellen in der Lösung, wobei eine Entschäumungsstruktur verwendet wird, die gasdurchlässige Poren sowie eine Oberfläche aufweist, die aus einem flüssigen, organosilikon-polymeren, wasserabweisenden Material mit einer Viskosität von zumindest 1 · 10&sup4; cP gebildet ist.

2. Zellenzüchtungsvorrichtung zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend:

einen Kulturbehälter (2) zur Aufnahme einer Kulturlösung, in der lebende Zellen suspendiert sind; und

eine wasserabweisende Entschäumungsstruktur (5), die in dem Kulturbehälter (2) in einer Höhe oberhalb der Kulturlösungsoberfläche angeordnet ist,

wobei die wasserabweisende Entschäumungsstruktur gasdurchlässige Poren aufweist und zumindest eine Oberfläche aus einem flüssigen, organosilikon-polymeren, wasserabweisenden Material mit einer Viskosität von mindestens 1·10&sup4; cP aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Oberfläche der Entschäumungsschicht (5) derartig wasserabweisend ist, daß der Kontaktwinkel relativ zu einem Tropfen des Mediums mindestens 30º beträgt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Entschäumungsschicht (5) eine Porosität von mindestens 50% aufweist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, 3 oder 4, wobei die Entschäumungsschicht (5) Poren mit einer Größe von 2 bis 50 mm aufweist.