WO1989002458A1 - Cell culture method and apparatus - Google Patents

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WO1989002458A1
WO1989002458A1 PCT/JP1988/000890 JP8800890W WO8902458A1 WO 1989002458 A1 WO1989002458 A1 WO 1989002458A1 JP 8800890 W JP8800890 W JP 8800890W WO 8902458 A1 WO8902458 A1 WO 8902458A1
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WO
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culture
culture solution
cells
membrane
cell
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PCT/JP1988/000890
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masahiko Ishida
Yuusaku Nishimura
Tetsuo Yamaguchi
Kazuyuki Itoh
Harumi Matsuzaki
Kenji Baba
Setsuo Saitou
Hayao Yahagi
Masayoshi Kubota
Ryoichi Haga
Original Assignee
Hitachi, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/18—Flow directing inserts
    • C12M27/24—Draft tube
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M29/02—Percolation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/02—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of foam
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing biological cells, and more particularly, to a large-scale and high-concentration cell culturing method and apparatus, in which biological cells are aerated in a liquid medium to efficiently remove by-products. .
  • Japanese Patent Publication No. 62-12989 discloses a method in which a wall membrane through which a culture solution but cells do not penetrate into a culture tank.
  • a hollow fiber membrane is provided, through which fresh culture solution is supplied and by-products are removed.
  • the oxygen supply technique described in (1) conventionally, in culturing microorganisms and the like, means for directly passing air or oxygen-enriched air into a culture solution has been adopted.
  • the liquid medium used for culturing these cells or the culture solution containing the cells is often effervescent.
  • cultivation due to biopolymers contained in serum and biopolymers secreted during culture Liquid foaming is remarkable. This does not break easily even if left unattended or mechanically applied with a shearing force. The foam fills the citrus part of the culture tank and eventually overflows outside the system.
  • the former method has been mainly used. Specifically, this is a method in which oxygen is dissolved from the liquid level by aerating the gas phase in the culture tank. Usually, the liquid is agitated to improve the contact with oxygen, or the amount of aeration is increased. To increase the contact with the liquid surface.
  • JP-A-61-74574 JP-A-61-36915, and JP-A-60-259179.
  • the method of separating and concentrating cells by sedimentation of cells requires a slower sedimentation speed of cells, so the volume of sedimentation tank occupied in the culture tank Had to be larger. If the culture solution causes convection due to vibration or temperature difference, there is a problem that cells are mixed into the supernatant and the separation efficiency is reduced.
  • the oxygen supply method using the liquid surface aeration method if the liquid is agitated more strongly, the cells are crushed, so that animal cells are practically limited to 50 rpm or less, and the air flow rate is 1 cm / s. ec is the upper limit.
  • a large volume of sterile air conditioning equipment is required in the culture equipment, and the loss of culture fluid that is dissipated with the gas during long-term culture is large.
  • a first object of the present invention is to provide a cell culture method and apparatus for preventing cell damage and filter clogging, and efficiently and aseptically separating and concentrating cells and exchanging a culture solution.
  • the second purpose of Honoki is to dissolve cells in the culture broth.
  • An object of the present invention is to provide a high-concentration cell culture method and apparatus for removing a waste component which has been solved and reusing the waste component for cell culture.
  • Another object of the present invention is to provide a cell culture method and apparatus for defoaming a culture solution without harming cell growth.
  • the filtration membrane is hydrophobic.
  • a cell culture method comprising a filtration membrane, wherein the membrane is intermittently cultured and backwashed with a solution.
  • a cell culture method in which a part of the culture solution is filtered out using a filtration membrane while a biological cell is subjected to liquid culture, and the culture medium is replenished with a new culture solution, the filtration membrane is hydrophobic.
  • a cell culture method comprising: a filter membrane having a hydrophilic filter aid layer on a surface of a filtration membrane, wherein the filtration membrane is intermittently backwashed with a culture solution.
  • the cell culture method according to (1) or (2), wherein the culture solution for backwashing the hydrophobic filtration membrane is a culture solution obtained by removing waste components from the filtered culture solution.
  • waste components in the filtered culture solution are removed by waste component removing means, and the waste component remover is used as a part or all of a solution for reversal of a hydrophobic filtration membrane.
  • a cell culture method characterized in that the method is used for
  • the foam of the culture solution generated by the culture is brought into contact with the water-repellent defoaming layer arranged on the culture solution surface, thereby breaking the foam.
  • a cell culture method characterized by culturing.
  • the surface of the defoaming layer is A cell culture method characterized by having a water repellency having a contact angle with a droplet of 30 degrees or more.
  • a filter containing the filtration membrane is connected to the culture tank by piping and installed outside the culture tank, and a hydrophobic filtration membrane is placed in the upper part of the filter to improve the density.
  • a method for culturing cells comprising using a hydrophilic filtration aid having a density lower than that of a culture solution.
  • Means for supplying useful gas to cultured cells, supply of culture solution A liquid culture of biological cells having a supply means and a waste culture liquid discharging means, wherein the waste culture liquid discharging means is provided through a culture liquid filtration means comprising a water-repellent filtration membrane;
  • An apparatus for culturing a biological cell liquid comprising means for allowing a porous filtration membrane to be reversible with a culture solution.
  • a biological cell liquid culturing apparatus having a means for supplying a useful gas to cultured cells, a means for supplying a culture solution, and a means for discharging a waste culture solution
  • the means for discharging the waste culture solution is supplied from a hydrophobic filtration membrane.
  • a liquid culture device for biological cells which is provided via a culture solution filtration means, and has a step for allowing the aqueous filtration membrane to be backwashed with the culture solution, and has a defoaming means on the culture solution surface. Place.
  • Hydrophobic hollow fiber membrane C A slope is provided at the rain end so that the outer diameter is larger than the inner diameter of the hollow fiber membrane, and the tip has an outer diameter that can be inserted into the hollow fiber membrane.
  • a membrane expansion member formed and provided with a projection for preventing detachment of the hollow fiber membrane is inserted therein, the insertion portion is fixed to a gun contact portion, and piping is connected through the connection portion.
  • a filter for separating biological cells characterized in that the filter can be connected to a biological cell.
  • the cell culture method of the present invention is used for growing and culturing biological cells, and includes a culture vessel, a means for separating cells and a culture solution, a means for removing waste components, and a means for returning a culture solution from which waste components have been removed to a culture container. , And the piping connecting them.
  • Biological cells are suspended in a culture solution in a culture vessel or a culture tank.
  • the culture solution is supplemented with inorganic salts, glucose, amino acids, antibiotics, etc., and, if necessary, serum.
  • the culture tank used in the culture method of the present invention is characterized by a container for containing the culture solution, a means for stirring the culture solution, a means for separating the cells from the culture solution, and a method for culturing from near the bottom of the container.
  • Means for supplying a fresh gas to the culture solution water-repellent defoaming means located above the liquid level of the culture solution and having a large number of openings through which the gas can pass, and means for detecting the progress of the culture. It is in the existing aeration culture tank.
  • a hydrophobic filtration membrane is used as a means for separating cells and a culture solution.
  • water-based hollow fiber membranes are preferred.
  • the hydrophobic filtration membrane is made of a material having a contact angle with a culture droplet of 80 ° or more, preferably 95 ° or more.
  • the degree of opening is 5 ⁇ !
  • the biological cells In order for the biological cells to be substantially impervious and to allow the required amount of culture solution to pass through. ⁇ 0.5 ⁇ is preferred.
  • bubbles are generated. By providing a porous defoaming means formed of a water-repellent material on the culture solution surface, the bubbles are crushed. be able to.
  • the water repellent material of the defoaming means has a contact angle of 30 ° or more with the droplet of the culture solution.
  • the water repellent material for example, an organic silicon polymer material is used. I like it.
  • the surface layer is made of the water-repellent material.
  • FIGS. 1 to 7 and 14 are configuration diagrams showing an outline of an embodiment of the present invention
  • FIG. 8A is a perspective view of a membrane support member
  • FIG. 8B is FIG.
  • FIG. 9 is a perspective view of a filtration unit in which a hollow fiber membrane is mounted on a membrane support member.
  • FIG. 9 is a plan view and a cross-sectional view showing the membrane support member.
  • FIGS. 10 to 13 are diagrams of a filtration unit.
  • FIG. 15 is a curve diagram showing the relationship between the filtration pressure and the flow rate of the hollow fiber membrane
  • FIGS. IS to 20 show the relationship between the cell culture days and the cell concentration according to the present invention.
  • Fig. 21 to Fig. 28 are perspective views of the defoaming layer.
  • FIG. 15 shows the transmission characteristics of a hydrophilic membrane and a hydrophobic membrane.
  • the broken line shows the case where the hydrophilic film was used
  • the solid line shows the case where the hydrophobic film was used.
  • the permeability of a hydrophilic membrane is proportional to the filtration pressure- '(ID and hydrophobic membranes have a critical pressure (depending on the degree of hydrophobicity, pore diameter, film thickness, porosity in the membrane, etc.) when gas is present in the pores, that is, before operation.
  • the liquid does not permeate, but permeates only at the critical pressure: Once the liquid permeates, that is, once the pores of the membrane are filled with the liquid, the permeation characteristics are Equivalent to hydrophilic membrane regardless of pressure Changes as indicated by solid arrow in the figure.
  • the limiting pressure of a pore-fin (0.0 mm im) made of Polytetrafluoroethylene (outer diameter 2 mm, inner diameter 1 mm) is 1.5 kg / cm 2 ,
  • the transmission characteristic after filling is approximately 100 m ⁇ / mraHg ⁇ m 2 ⁇ hr. This permeation amount substantially coincides with the permeation amount of the hydrophilic membrane.
  • the hydrophobic hollow fiber membrane is not particularly limited, but has a sufficient hydrophobicity even in an atmosphere at about 130 ° C so that the small pore size for filtration does not change. It is necessary to use those made of materials. In particular, those made of tetrafluoro ⁇ -ethylene resin are preferred in this respect.
  • hydrophobic filtration membrane a single long hollow fiber membrane may be used, but in order to make effective use of the membrane surface, it is necessary to bundle multiple membranes. It is desirable to use it.
  • a good membrane unit can be obtained by the following connection method.
  • a membrane expansion member 52 is inserted into the rain end of the hollow fiber membrane 10.
  • the membrane expansion member 52 has a hollow tubular shape having an outer diameter larger than the inner diameter of the hollow fiber membrane 10, and the tip thereof is used to facilitate insertion into the hollow fiber membrane 10. It has a shape in which the area gradually becomes smaller toward the tip, and has a projection with a large outer diameter locally on one surface of the surface.
  • the end of the hollow fiber membrane into which the membrane expansion member 52 has been inserted is covered with a room temperature curable resin varnish, and then cured. If necessary, the outer shape is formed into a membrane connection member 51, which is a connection end to the filtration pipe.
  • FIG. 8 and FIGS. 10 to 13 show an example of the hollow fiber membrane filtration unit.
  • the adhesion of cells and dirt to the membrane surface can be significantly reduced, and the membrane can be used for long-term filtration.
  • fresh By reversely injecting a fresh culture solution, cells and dirt adhering to the filtration membrane surface are released.
  • the backwash solution may be an unused fresh culture solution, a solution obtained by removing waste components from a used culture solution, or a mixture thereof.
  • the hydrophobic filtration membrane 10 When the hydrophobic filtration membrane 10 is provided outside the culture tank 2 (FIG. 2), it is accommodated in the filter 8.
  • the filter 8 is connected to the culture tank 2 by a pipe or the like.
  • the culture medium When such a hydrophobic filtration membrane 10 is provided outside the culture tank 2, the culture medium is withdrawn at a flow rate as high as possible. It is necessary to perform a tillage operation to quickly return the cells to the culture tank 2.
  • the membrane When the hydrophobic filtration membrane 10 is contained in the filter 8 provided outside the culture tank 2, the membrane is a pre-coated membrane having a hydrophilic filtration aid on its surface. And are desirable. In this case, a filtration aid 9 was held in the filter 8 at the bottom or both the bottom and the top, near the hydrophobic filtration membrane 10. Filter 11 is provided.
  • the filter 11 is made of a porous material such as an organic polymer material, glass, ceramic, or sintered metal, and the opening degree of the filter 11 is substantially the same as that of the particles of the filter aid 9. It is selected so as not to be transparent.
  • the filter aid 9 is an organic compound having no toxicity to the cells. It is a mixture of one or more molecules and inorganic compounds.
  • the material, particle size, shape, and filling amount are selected according to the adhesion to cells, the particle size of the mother-of-pearl, and the like.
  • the particle size of the filter aid is the particle size of the cells.
  • the filter aid 9 was selected in consideration of the above-mentioned effect of the rain, and the filling amount was set so that most of the cells in the culture medium were captured by the filter aid 9. Select.
  • Liquid passing flow rate of the culture liquid to the filter 8 is represented in the unit surface area equivalent than zero based on the diameter of 1 to the filter 8:.
  • L 0 m 3 Z m 2 'h extent to the filter aid material 9 Cell damage due to shearing force when the culture solution passes between the particles can be prevented. However, this value varies depending on the type of cells, the particle size of the filter aid 9, the structure of the filter 8, and the like.
  • the hydrophobic filtration membrane 10 Since the hydrophobic filtration membrane 10 is permeable to the by-products in the culture solution, the cells in the culture solution are separated and concentrated, and the by-products such as waste products are discharged.
  • the fresh culture After draining the required amount of culture from the culture tank, the fresh culture is introduced into the filter 8.
  • the fresh culture solution may be an unused culture solution or a solution obtained by removing a by-product of cells in a used culture solution. Further, the composition of the culture solution may be different from that in the culture tank.
  • the particles of the filter aid 9 rise (or fall), and develop together with the cells captured in the above step.
  • the material, particle size, shape, etc. required for the filter aid 9 must be particles that sediment faster than cells (or particles that float in the culture solution) in order to perform the above steps efficiently. I have to. Particles that settle faster than the cells are used as filter aids 9.
  • the flow rate of the fresh culture solution to the filter 8 be such that: — the particles having the highest sedimentation speed among the filter aids 9 to be expanded are slightly lifted.
  • the filtration aid 9 to be expanded substantially unfolds, the cells are separated from the filtration aid 9 and at least on the upper part of the particles having a higher sedimentation velocity than the cells. Float up to. Since the piping is arranged so that the fresh culture solution that has passed through the filter aid fan 9 can be transferred to the culture tank 2, the cells suspended above the filter 8 are returned to the culture tank 2 together with the fresh culture solution.
  • the filter aid 9 when the filter aid 9 includes a group of particles larger than the particle diameter of the cells, the screen filters out a screen or the like having a degree of porosity that allows the cells to permeate but does not allow the particles to permeate.
  • the filtration aid 9 When installed above the vessel 8, it is possible to prevent the filtration aid 9 from floating into the culture tank 2. Furthermore, since the hydrophobic filtration membrane 10 is inverted by the fresh culture solution, the service life of the membrane can be further extended.
  • the flow rate of the fresh culture solution to the filter 8 depends on the filter aid to be developed. It is desirable that the particles with the highest levitation velocity among the 9 descend, and the filter aid layer should show a fluidized state. As a result, the cells separate from the filter aid 9 and settle, and are transported together with the backwashing solution through the pipe connecting the filter 8 and the culture tank 2 to the culture tank 2. ⁇ Here, it is preferable to install a filter 11 having an opening degree that allows cells to permeate and does not pass through the filter aid 9 at the bottom of the filter 8.
  • the amount of fresh culture solution introduced in one operation in this step is not particularly limited, but is desirably about the same as the amount of culture solution discharged in the culture solution discharging step. It is desirable that the flow rate is such that most of the cells are trapped by the filter aid 9 and returned to the culture tank 2 together with the fresh culture solution.
  • the water-repellent defoaming means aims to defoam bubbles generated on the liquid surface when aerating into a liquid medium containing biological cells, and has a large number of openings through which gas can pass. And placed above the level of the culture solution in the culture tank.
  • the aperture ratio is desirably 50% or more, and the aperture diameter is desirably 50 to 2 mm. Further, at least the surface layer of the defoaming means is formed of a water-repellent material.
  • the water-repellent material is a water-repellent material in which a droplet of the culture solution forms a contact angle of 30 degrees or more with the surface of the water-repellent material, and is substantially insoluble or non-dispersible in the culture solution.
  • any material that does not substantially show toxicity to the target cells may be used.
  • the defoaming layer itself may be composed of the above-described water repellent material, or may be coated, coated or impregnated.
  • silane or siloxane having 10 or more carbon atoms is used.
  • 1 X 1 0 4 which it has a viscosity of more than Senchipoizu are suitable.
  • the surface of the culture solution is covered with the water-repellent material, or it becomes an emulsion in the solution and adheres to cells to inhibit the growth. It also makes it difficult to separate the product from the culture after the culture.
  • the upper limit of the number of carbon atoms and the viscosity of the polysiloxane are not particularly limited, but the number of carbon atoms to be substantially solid is 1 ⁇ 10 and the upper limit of the viscosity is 1 ⁇ 10 7 cm.
  • the opening ratio of the defoaming layer is less than 50%, when the bubbles on the liquid surface break, the gas cannot pass through the defoaming layer smoothly, and secondary bubbles are likely to be generated.
  • the diameter of the opening is preferably between 2 and 50 mm. If it exceeds 50 mm, it is difficult for the foam to be incompletely contacted with the defoaming layer if the bubbles are fine. On the other hand, if it is less than 2 mm, the gas and liquid at the opening will be more smoothly Lack.
  • the structure of the defoaming layer may be a single layer or a laminated layer. Furthermore, they may be integrated or dividable in the vertical and vertical directions.
  • the layer structure is appropriately selected according to the liquid properties, air permeability, and bubble diameter.
  • Aeration into the culture tank 2 is usually performed by disposing the nozzle 4 at the bottom of the culture tank, but it may be arranged appropriately below the liquid level. In addition, it may be provided between the bottom and the liquid surface. In particular, if the draft tube 3 is provided, placing the nozzle 4 below the draft tube 3 will lower the culture solution. The flow allows the air bubbles to stay in the liquid for a longer period of time, thereby improving the oxygen utilization rate.
  • the culture solution preferably has a surface tension of 45 to 90 dyn Zcm 2 .
  • a culture solution having a large effect include a culture solution containing a biopolymer such as serum.
  • a culture solution containing or containing a protein such as albumin or a nucleic acid in addition to serum is also very effective. Not only components added from the outside, but also culture solutions containing effervescent components secreted during culturing are also targeted.
  • Waste components include lactic acid and ammonia contained in the culture filtrate using a hydrophobic membrane.
  • the means for removing waste components is not particularly limited, but may be a publicly available means such as a diffusion dialysis device, an ultrafiltration device, and an electrodialysis device. It can be done by knowledge.
  • the culture filtrate contains a large amount of fine solids such as serum-derived precipitates and cell debris, it is desirable that the culture filtrate has a shape that does not easily cause clogging. Lactic acid and ammonia, especially in waste components, inhibit cell growth. Therefore, waste components should be removed using ammonia and lactic acid as indicators.
  • the culture filtrate contains a large amount of components required for cell growth, such as various hormones and proteins, and it is desirable to recover and reuse these components as much as possible.
  • the molecular weight cut-off for diffusion dialysis membranes and ultrafiltration membranes is from 1,000 to 1,000.
  • microfiltration membrane having pores of about 0.01 m. Further, it is more advantageous to combine them to separate useful qualities in multiple stages.
  • the liquid from which waste components have been removed is used as a backwashing liquid for the above-mentioned filter, is introduced into a culture tank, and is effectively used for cell culture.
  • the biological cells applicable to the present invention are not particularly limited, and include animal cells, microbial cells, and plant cells.
  • animal cells include various cells of vertebrates, various cells of invertebrates, and various cells of protozoa.
  • Cells include not only single cells but also cell aggregates.
  • Microbial cells include various microorganisms such as bacteria, yeast, filamentous fungi, and actinomycetes.
  • Plant cells include higher plant cells and cell aggregates, and algal cells and cell aggregates.
  • ventilation gas air, oxygen, carbon dioxide, a gas mixed with an arbitrary composition, or a gas mixed with an inert gas is used depending on the application.
  • oxygen-containing gas is used for animal cell culture
  • carbon dioxide or carbon dioxide-containing gas is used for plant culture.
  • the filtration membrane made of a hydrophobic material has less adhesion of cells and the like to the membrane surface than a conventionally used hydrophilic filtration membrane.
  • the adhered cells and the like can be easily detached by the reverse method, clogging does not easily occur. By doing so, highly efficient cell culture can be achieved.
  • the defoaming means of the present invention enables effective defoaming of the culture solution, so that cell culture can be performed efficiently.
  • FIG. 1 is a diagram showing the configuration of an embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • the cells are cultured in the culture solution 1 in a dispersed and suspended state.
  • a nozzle 4 for aerating an oxygen-containing gas into the liquid, which supplies oxygen necessary for cell growth and carbon dioxide for adjusting PH. That is, the flow rate of the oxygen-containing gas from the air compressor 16 and the oxygen-containing gas from the cylinder 17 was controlled so that the dissolved oxygen concentration was constant, and the pH was 7.0 to 7.0.
  • the flow rate of carbon dioxide gas is controlled by a cylinder 18 so that S is reached, and after passing through a sterilization filter 7, it is blown from a nozzle 4.
  • the gas blown into the liquid becomes bubbles and causes the culture liquid to flow as it floats toward the upper surface of the culture liquid.
  • Draft tube 3 has been set up to allow the flow of the culture solution in the tank by the injected gas to be performed at a high impeachment rate. Bubbles that reach the liquid surface form a foam layer without breaking as they are, so they are efficiently broken by contacting the defoaming layer 5 formed of a water-repellent material on the liquid surface. You. The gas is Mistoseno. After passing through the radiator 6 and the filter 7, it is discharged out of the culture tank as exhaust gas 24.
  • the culture tank 2 means for keeping the dissolved oxygen concentration and pH constant, means for sterilizing the inside of the tank and pipes, means for injecting and discharging the culture solution, and keeping the temperature constant.
  • Various devices are installed, such as means for maintaining, sensors for dissolved oxygen concentration, pH, temperature, tank pressure, etc., and sensors for detecting the level of culture solution in the tank, but these are omitted in Fig. 1. did.
  • a filter 8 is provided below the culture tank 2.
  • a porous hollow fiber membrane filter 10 is provided in the filter 8, and a filter aid 9 is filled on or above the filter.
  • the filter aid 9 is held by the holding filter 11.
  • the hollow fiber membrane filter 10 must be careful not to deform its shape or to be exposed from the nine layers of the filter aid even when the liquid moves rapidly during sterilization or reverse operation.
  • the shape is not particularly limited.
  • FIG. 8 ⁇ and beta lambda illustrate the hydrophobic hollow fiber Makuyu Knitting bets used in this embodiment.
  • the membrane supporting member 50 is made of a material that is rigid even at 130 ° C and does not corrode in the culture solution, and its outer shape is the inside of the filter 8 in FIG. It is made according to the shape and is provided so that the position in the filter does not move even if some external force is applied. You.
  • the membrane support member 50 is provided with a large number of small holes 55 for holding the hollow fiber membrane. The size of the hole should be such that the hollow fiber membrane can pass freely.
  • FIG. 8B shows a filtration unit in which the hollow fiber membrane 10 is mounted on the membrane support member 50.
  • the filtration unit may be composed of a single hollow fiber membrane 10, but it is usually preferable to configure the filtration unit with two hollow fiber membranes. In this case, if a plurality of hollow fiber membranes are bound and used as one with the membrane connection member 51, it is possible to easily mount the filtration unit on the filter.
  • FIG. 9A and 9B are diagrams showing the concept of the membrane connection member 51.
  • the membrane connecting member is made of a hydrophobic hollow fiber membrane, and is a hollow fiber membrane made of a material that is difficult to bond with the bonding method or the welding method, for example, a hollow fiber made of tetrafluoroethylene resin. It is effective for film bonding.
  • FIG. 9A is a diagram showing a surface of the membrane connecting member 51 opposite to the surface to which the hollow fiber membrane is connected. It is desirable that the membrane bonding member 51 includes a membrane expanding member 52, and the outer surface of the membrane connecting member 51 is circularly shaped.
  • FIG. 9B is a diagram showing a cross section taken along the line A- ⁇ ′ of FIG. 9A.
  • the hollow fiber membrane 10 has an inner diameter that is approximately the same as the inner diameter of the hollow fiber membrane, and the outer diameter is larger than the inner diameter of the hollow fiber membrane. And is locally formed with an outer diameter Large projections are provided to prevent detachment of the hollow fiber membrane.
  • the hollow fiber membrane can be firmly bound by covering the part into which the membrane expansion member 52 is inserted with the membrane connection member 51 and curing it.
  • the membrane connecting member is not particularly limited, but may be any material that does not adversely affect cells, does not corrode in the culture solution, and can withstand steam sterilization at around 130 ° C.
  • a two-component curing type epoxy resin is used.
  • the exchange of the culture solution is performed as follows.
  • the valves 31 and 32 in FIG. 1 are closed and the valve 33 is opened to operate the pump 22, the culture solution 1 is guided from the culture tank 2 to the filter 8.
  • the cells in the culture solution are trapped on their respective surfaces in the process of passing through the filter aid 9 and the porous hollow fiber filter 10.
  • the porous porous fiber filter 10 was selected to have a pore opening degree that does not allow the particles and cells of the filter aid 9 to pass through.
  • the culture filtrate obtained by filtering the cells is stored in a culture filtrate storage tank 15.
  • the pump 22 After discharging a predetermined amount of the culture solution from the culture tank 2, the pump 22 is stopped, and the valve 33 is closed. Next, the valves 31 and 32 are opened, and the pumps 19 and 20 are operated.
  • the pumps 19 and 20 supply the fresh culture solution to the filter from the fresh culture solution storage tank 12. At this time, the pump 19 supplies a fresh culture solution from the bottom of the filter 8 and sets the flow rate so that the packed layer of the filtration aid 9 is floated and developed.
  • Pump 20 is porous A fresh culture solution is reversely applied to the hollow fiber membrane filter 10 for back washing to release solids such as cells attached to the surface of the filter 10. The total flow rate of the pumps 19 and 20 is adjusted so that the filter aid 9 is not dissipated from around the filter.
  • the cells trapped on the filtration aid 9 and the hollow fiber membrane filter 10 in the aforementioned filtration step are released from the inside of the packed bed by the development of the filtration aid 9. Since the specific gravity, particle size and shape of the particles of the filtration aid 9 are selected so that the sedimentation velocity is higher than that of the cells, the cells migrate to the upper part of the developed packed bed, and together with the fresh culture solution. Then, it is fed to the culture tank 2.
  • FIG. 2 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • the present embodiment is characterized in that particles smaller than the specific gravity of the culture solution are used as the filter aid 9 used in the filter 8.
  • the filter aid 9 a hollow glass bead, a hollow force bead, or the like is used.
  • the filter aid 9 is held by two holding filters 11 provided at the top and bottom of the filter 8. The aperture of the holding filter 11 is selected so that the particles of the filter aid 9 are not permeable, but the cells are freely permeable.
  • FIG. 3 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • waste component removing means is added to the embodiment of FIG.
  • an ultrafiltration method is used as a waste component removing means in this embodiment.
  • Ultrafiltration device 14 is connected to culture filtrate storage tank # 5 by piping.
  • the ultrafiltration device 14 uses an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 10,000, which allows the passage of waste components such as lactic acid and ammonia and does not allow the passage of substances useful for cell growth such as hormones. .
  • the culture filtrate is pumped into the ultrafilter 14 by the pump 23, and while connected to the ultrafiltration membrane, low-molecular substances such as waste components permeate through the membrane and become waste components 26. Is discharged out of the system.
  • the liquid from which waste components have been removed by the ultrafilter 14 is stored in the waste component remover storage tank 13. Since the amount of liquid filtered by the ultrafiltration is small, the liquid is circulated between the ultrafiltration device 14 and the waste component removing liquid storage tank by the pump 23, and the wastewater is filtered. Remove components. Normally, when the waste component removing solution is reused as a part of a fresh culture solution, the concentration of the waste component is 100 ppm or less as sulfuric acid, preferably 100 ppm or less, and ammonia. It should be below 20 ppm and preferably below 5 PPm.
  • the waste component removing liquid is obtained by operating the pump 21. It is added to the fresh culture solution as a part of the back solution of the re-filter 8, passed through the culture tank 2, and used again for cell growth.
  • the waste component removing solution contains a large amount of active ingredients such as hormones and growth factors remaining in the culture filtrate, as well as growth-promoting factors and useful products secreted by the cells themselves. Therefore, its use gives good results for cell growth.
  • FIG. 4 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • the feature of this embodiment is that, in the embodiment shown in FIG. 3, particles having a specific gravity smaller than that of the culture solution are used as the filter aid 9 used for the filter 8.
  • the filter aid 9 hollow glass beads, hollow carbon beads, and the like are used.
  • the filter aid 99 is held by two holding filters 11 provided at the top and bottom of the filter 8.
  • the opening degree of the retention filter 11 is selected so that the particles of the filter aid 9 do not permeate and the cells can freely permeate.
  • the rest is the same as Fig. 3.
  • the cells trapped in the filter aid 9 and the hollow fiber membrane filter 10 at the time of back washing of the filter can be completely returned to the culture tank.
  • FIG. 5 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • the water-phobic membrane 10 is provided in the upper layer of the culture tank 2 and a stirrer is attached.
  • the exchange of the culture solution in the present example is performed as follows. When the valve 33 is opened, the valve 32 is closed, and the pump 22 is operated, the pressure inside the hollow fiber membrane is reduced. As a result, the cells floating in the culture solution are captured on the surface of the hollow fiber membrane, the culture filtrate containing no cells is extracted from the membrane, and the culture filtrate storage tank 15 is stored.
  • the pump 22 After discharging a predetermined amount of the culture filtrate from the culture tank 2, the pump 22 is stopped, and the valve 33 is closed. Then, valve 32 is opened and pumps 20 and 21 are activated.
  • the pump 20 supplies a fresh culture solution from the fresh culture solution storage tank 12, and the pump 21 supplies a waste component removal solution from the waste component removal solution storage tank 13.
  • the fresh culture solution and the waste component removing solution are pressed into the hollow fiber membrane and flow into the culture vessel 2 through the pores on the membrane surface. At this time, solids such as cells adsorbed on the outer surface of the hollow fiber membrane and in the pores are peeled off, and the filtration surface is regenerated.
  • the hydrophobic membrane 10 be provided in a dog where the culture solution moves at a speed as low as possible, in order to prevent the attachment of cells and dust to the membrane surface.
  • the stirring blade 29 is provided and a hydrophobic membrane is provided around the stirring blade 29, solid matter on the membrane surface stays due to the flow of the culture solution discharged by the rotation of the stirring blade. Since it does not move, deposition on the film surface can be effectively prevented.
  • the shape of the filtration unit used in the present example is not particularly limited, but:-The shape is such that it does not block the flow of the culture solution and does not apply unnecessary external force to the cells. Desirable.
  • Each of the filtration units shown in FIGS. 10 to 13 has a shape particularly preferable for this embodiment.
  • the filtration since the filtration is performed in the culture tank, a decrease in the temperature of oxygen deficiency and a decrease in the temperature during the filtration do not occur, and the proliferation of the cells can be maintained well.
  • FIG. 6 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention. This embodiment is characterized in that a culture solution preparation tank 41 is added to the embodiment shown in FIG.
  • the backwashing liquid used for backwashing the hydrophobic hollow fiber membrane provided in the culture tank is prepared by mixing a fresh culture liquid and a waste component removing liquid in advance in the culture liquid preparation tank 41. I do.
  • the culture solution preparation tank 41 is provided with means for measuring the concentrations of lactic acid, ammonia, and protein, and controls the mixing ratio of the fresh culture solution and the waste component removing solution.
  • the culture can be always performed using a culture solution suitable for cell growth.
  • FIG. 7 shows the configuration of another embodiment of the cell culture system according to the present invention.
  • the ⁇ filter is an ultrafiltration device as a waste component removal device. Instead, a diffusion dialysis machine was used.
  • the culture filtrate is led to the diffusion dialyzer 44 by a pipe, and circulated between the waste component removing liquid storage tank 13 and the diffusion dialyzer 44 by the pump 23.
  • the low-molecular component liquid storage tank 42 stores a low-molecular component liquid in which low-molecular components such as various amino acids, vitamins, inorganic salts, and glucose are dissolved. By 7 it is sent to the diffusion dialyzer.
  • the culture filtrate comes into contact with the low molecular component solution via the dialysis membrane, during which the low molecular component passing through the dialysis membrane is dialyzed. That is, waste components typified by lactic acid and ammonia contained in the culture filtrate diffuse into the low-molecular component solution, and various kinds of aluminum dissolved in the low-molecular component solution. Acid, darcos, various inorganic salts and vitamins diffuse into the culture filtrate.
  • High-molecular components such as various hormones and growth factors that are useful for cell growth remain in the waste component removal solution without being dialyzed.
  • the dialysis is performed so that the lactic acid concentration is less than 100 ppm, preferably less than 100 ppm, and the ammonia is less than 20 ppm, preferably less than 5 ⁇ ⁇ .
  • the waste component removal liquid from which waste components have been removed by diffusion dialysis is sent to a culture solution preparation tank 41 by a pump 46.
  • the culture component preparation tank is supplied with the polymer component solution from the polymer component solution tank 42 by a pump 45 and mixed with the waste component removal solution. If it is adjusted, it becomes a fresh culture solution. Polymer components, such as serum and hormones, which cannot pass through the dialysis membrane, are dissolved in the liquid.
  • the medium preparation tank 42 is provided with means for measuring the concentrations of ammonia lactate and protein, and the mixing ratio between the polymer component liquid and the waste component removing liquid is adjusted based on the measured values.
  • a culture solution suitable for cell growth can always be prepared, so that cells can be cultured at a high concentration.
  • Fig. 10 shows the waste components removal means of Fig. 6 replaced by adsorption.
  • zeolite For adsorption of ammonia, zeolite was used, and for lactic acid, lactate dehydrogenase was immobilized on an insoluble carrier.
  • lactate dehydrogenase was immobilized on an insoluble carrier.
  • Water-based hollow fiber membrane made of tetrafluoro ⁇ ethylene resin with an outer diameter of 2 mm, an inner diameter of l mm, a pore diameter of 0.8 ⁇ , and a length of l m
  • the hollow fiber membrane unit produced above was held at 130 ° C. and a gauge pressure of 1.8 kg Zcm 2 from both ends for 1 hour. After cooling to room temperature, the hollow fiber membrane did not fall out of the membrane connection member 51 even when a tensile load of l kg was applied to .1 of the hollow fiber membranes.
  • Example 1 a hollow fiber membrane unit was manufactured by fixing the membrane expansion members 52 at both ends of the hollow fiber membrane with an epoxy connecting agent without inserting them. Then, steam was maintained at 130 ° C and a gauge pressure of 1.8 kg / cm 2 from both ends for 1 hour. After cooling to room temperature, when a tensile load of 1 kg was applied to one of the hollow fiber membranes, the hollow fiber membrane came off from the membrane connection member 51.
  • Eagle MEM medium Nisui Pharmaceutical Eagle MEM Nissin 9.4 g / i2, glutamin 0.292 g Z £,
  • liver tumor cell line JTC-11 Japan Tissue Culture Not 1
  • the culture temperature was 37 ° C and the gas phase gas was air.
  • the cells adhered to the surface of the flask after culturing for 3 days were detached to obtain a culture solution with a cell density of 5.1 ⁇ 10 5 cells and a culture solution of 75 ⁇ m.
  • the main culture was centrifuged, the supernatant was discarded, and the culture was suspended in the same volume of fresh culture.
  • the cell suspension (7 ⁇ m) and the above fresh culture solution (175 mfi) were placed in a roller bottle having a diameter of 110 mm, a length of 171 mm, and a volume of 1,250 m ⁇ . put, 3 7 C, Kishoga vinegar and cultured for 3 days air, at 2r P m. The culture was then centrifuged, the supernatant was discarded and the culture was suspended in the same volume of fresh culture. Then, the cells were cultured again under the above conditions for 3 days. The culture solution was centrifuged, the supernatant was discarded, and the suspension was suspended in twice the amount of fresh culture solution. The suspension was divided into twice the number of roller bottles, and cultured again under the above conditions for 3 days.
  • the seed cell suspension was placed in a cylindrical stainless steel culture tank with a diameter of 16.5 mm, a height of 350 mm, and a capacity of 7,000 m £, as shown in Fig. 1.
  • Solution 2 OOOmJ2 and culture solution 3, 000 m fi were added (total 5, 000 m fi) and kept at 37 ° C.
  • a filtration device is connected to the lower part of the culture tank by piping.
  • a filter is provided at the bottom of the filter to hold the hydrophilic filter aid layer.
  • a hydrophobic hollow fiber filter unit is buried in the hydrophilic filter aid layer.
  • the hydrophobic hollow fiber filter unit was constructed using four hydrophobic hollow fiber membrane filters with a length of 1.2 mm as shown in Fig. 8B. It was created using the method in Example 1.
  • As the hydrophilic filter aid glass beads having a diameter of 70 m which had been made hydrophilic by ethyl alcohol treatment were used.
  • the culture filtrate was drawn out at a flow rate of 20 m ⁇ / min by reducing the pressure inside the hollow fiber membrane filter using a drawing peristaltic pump. No mixing of eight cells in the culture filtrate was observed. When the amount of withdrawal reached 500 m ⁇ , the peristaltic pump for withdrawal was stopped. Next, the hollow fiber membrane filter was backwashed and the filter aid layer was developed using a peristaltic pump for backwashing the hollow fiber membrane filter and a peristaltic pump for developing the filter aid layer.
  • Hollow fiber membrane filter One backwash was performed at a flow rate of 80.m ⁇ / min for 2 minutes.
  • the filter aid layer is developed at a flow rate of Omfi Zniin during hollow fiber membrane filter backwashing and at a flow rate of 150 m ⁇ / min after hollow fiber membrane filter backwashing, and cultivation is performed in the same amount as the withdrawal amount.
  • the system was controlled so that it ended when it was injected into the tank.
  • a fresh culture solution prepared in a fresh culture solution storage tank was used for backwashing of the hollow fiber membrane filter and development of the filter aid. Filtration of the culture medium, backwashing of the hollow fiber membrane filter, and development of the filter auxiliary layer were performed 10 times a day so that the culture medium in the culture tank was replaced once a day.
  • Example 2 The same culture as in Example 2 was carried out using a culture system in which the filter, the hollow fiber membrane filter and the filter aid were removed from the culture system of FIG. The results are shown in Figure 17. Filtration vessel, replacement of O Ri culture solution and this excluding the hollow fiber membrane filter first and filter aid is not possible, the cell concentration nutrients to ⁇ is 2. 1 X 1 0 6 cells Roh m J2 And then decreased rapidly. This indicates that the exchange of the culture solution is essential.
  • Example 2 In the culture system of FIG. 1, the same culture as in Example 2 was performed using a culture system in which oxygen was supplied by liquid level ventilation. The results are shown in Figure 18. The cell concentration was up to 5.6 ⁇ 10 6 cells Z m fi and the viability gradually decreased. This result indicates that oxygen required for cell growth is insufficient. In other words, it is understood that oxygen supply is not sufficient in the liquid level ventilation method.
  • Example 2 The same culture as in Example 2 was performed using the culture system from which the antifoam layer was removed from the culture system shown in FIG. As a result, bubbles flowed out from the culture waste gas pipe. This allows the air to flow through the liquid. It can be seen that defoaming means is required in the culture tank to supply sufficient oxygen.
  • a seed cell suspension having a cell concentration of 1.8 ⁇ 10 s Zm £ was prepared by the method of Example 2. Next, culturing was performed using the cell culture system shown in FIG.
  • the culture tank of this system was a SUS316 cylindrical type with an internal volume of 7,000 ⁇ , and a stirrer 29 was provided to allow the culture solution to flow.
  • a water-based hollow fiber membrane filter unit 10 for separating cells and culture solution had the shape shown in FIG. 13 and was provided around the rotating surface of the stirring blade.
  • a water-shrinkable hollow fiber membrane filter unit was prepared using four hollow fiber membrane filters having the same length as those used in Example 1 having a length of 1.5 m.
  • the oxygen supply means, defoaming means and culture conditions were the same as in Example 2.
  • Example 2 Put the above seed cell suspension (2,000 m ⁇ ) and the same culture solution (3,000 mfi) as in Example 2 (total 5,000 mfl) in a culture barrel, and bring to 37 ° C. Insulated. Batch culture was performed for two days after the start of the culture, and the culture medium was replaced from the third day. The pressure inside the hollow fiber membrane filter was reduced using a peristaltic pump, and the culture filtrate was drawn off at a flow rate of 10 m ⁇ / m.in. No cell contamination was found in the culture filtrate. Belt for pulling when the amount of pulling reaches 500 m ⁇ Stopped the thick pump.
  • a fresh culture solution is pressed into the hollow fiber membrane filter 10 at a flow rate of 200 m ⁇ / min by a hollow fiber membrane filter--a backwashing pellistic pump. Back washing of the membrane filter was performed.
  • the culture solution used for backwashing was Eagle's MEM medium 9.4 g / ⁇ , glutamin 0.292 g ZJ2, 7.5% aqueous sodium bicarbonate solution 29 m £, and fetal bovine serum 50 ⁇ It was composed of ⁇ / ⁇ and stored in fresh culture solution storage tank 12.
  • the backwashing was controlled so as to end when the same amount as the culture filtrate was drawn into the culture tank. Filtration and backwashing were performed 10 times a day so that the culture solution in the culture vessel was replaced once a day.
  • the drawn culture filtrate was stored in a culture filtrate storage tank 15. Thereafter, low molecular components including waste components were filtered by the ultrafilter 14, and the high molecular components were concentrated and stored in the waste component removal liquid storage tank 13.
  • the volume of waste component removal liquid is
  • the water was circulated between the ultrafiltration device 14 and the waste component removing liquid storage tank 13 by means of a peristaltic pump.
  • the ultrafiltration membrane used had a molecular weight cut off of 100,000.
  • Example 2 a seed cell suspension having a cell concentration of 1.1 ⁇ 10 6 ⁇ was prepared. Next, culturing was performed using the cell culture system shown in FIG. In this system, only the waste component removing means of the culture system shown in Fig. 6 used in Example 3 was replaced with diffusion dialysis 44. The oxygen supply means, defoaming means, medium exchange means and culture conditions were the same as in Example 3.
  • Example 2 Put the above seed cell suspension (2,000 in ⁇ ) and the same culture solution (3,00,0 ⁇ ) as in Example 2 into the culture tank (total 5,000 m ⁇ ) and incubate at 37 did. Batch culture was performed for two days after the start of the culture, and the culture medium was replaced from the third day. The inside of the hollow fiber membrane filter 110 was depressurized using a peristaltic pump, and the culture filtrate was drawn off at a flow rate of 15 m ⁇ / min, and stored in the culture medium storage tank 15. Mixing cells into the culture filtrate No entry was found. When the pulling amount reached 500 mJ2, the peristaltic pump for pulling was stopped.
  • the culture broth was sent to the diffusion dialyzer 44 by means of a peristaltic pump, and low molecular components including waste components were removed by diffusion dialysis.
  • the diffusion dialysis membrane a membrane that permeated a substance having a molecular weight of 6,000 or less and not permeated any more substance was used.
  • the symmetric liquids were 9.4 g / ⁇ of Eagle MEM medium, 0.292 g / J2 of glutamin, and 29 m £ / ⁇ of a 7.5% sodium hydrogencarbonate aqueous solution.
  • the flow rate was twice that of the culture filtrate.
  • the waste component removal liquid from which low molecular components including waste components were removed was stored in a waste component removal storage tank.
  • fetal bovine serum was added to the waste component removal solution 1. /. It was added to become. This was pressed into the hollow fiber membrane filter 10 with a peristaltic pump at a flow rate of 200 mJ2 / min, and the hollow fiber membrane filter 10 was backwashed. The backwashing was controlled so as to end when the same amount of the culture filtrate was poured into the culture tank. Filtration and backwashing were performed 30 times a day so that the culture solution in the culture tank was replaced three times a day.
  • FIG. 2 shows the results of this example. Diffusion dialysis Li by the and this was subjected to removal of the waste components, can and this to reduce the concentration of lactic acid ⁇ Pi ammonia, as a result, the maximum cell concentration 3. Reaches 0 X 1 0 7 or Z m beta.
  • a hydrophilic filtration membrane manufactured by Amicon, dia-flow hollow fiber system, DH-1, hollow fiber membrane: HIMP 0 1-43, pore size
  • DH-1 dia-flow hollow fiber system
  • HIMP 0 1-43, pore size hollow fiber membrane
  • Rat liver cancer cell line JTC-11 (Japan tissue culture # 1 strain) was cultured in 15 flat flasks dispensed with 5 mS of the following medium.
  • the cultivation temperature was 37 ° C, and the gas phase gas composition was 0.5% carbon dioxide mixed air.
  • Total 900 ⁇ 37. Heated to C.
  • Oxygen transfer measurement at 0.2 cmZ sec aeration rate is 7 m mo ⁇ e O 2 / ⁇ • h.
  • the cell concentration reached 6 ⁇ 10 S / m ⁇ .
  • the concentration of ammonia produced at this time was 40 PPDi, and that of lactic acid was 110 Oppm.
  • the dissolved oxygen concentration was maintained at 2 to 5 ppm during the culture period. Bubbles generated during the culture contacted the defoaming layer 5 and broke smoothly, and did not overflow from the upper surface of the defoaming layer into the tank gas phase throughout the entire culture.
  • a rat liver cancer cell line JTC-11 (Japan tissue culture No. 1 strain) was used as a stationary culture medium, and 15 flat S flasks into which 5 m ⁇ of the following medium was dispensed were used.
  • the culture temperature was 37 ° C, and the gas phase gas composition was 5% mixed (V–V).
  • the cells adhered to the surface of the flasks cultured for 3 days were detached to obtain a seed culture of 75 ⁇ with a cell concentration of 1.21 ⁇ 10 5 cells ⁇ .
  • the main culture was centrifuged, the supernatant was discarded, and suspended in the same volume of liquid medium.
  • the oxygen transfer rate in the ventilation was 7 mmoJ2e02 ⁇ ⁇ .
  • the cell concentration reached 5.2 ⁇ 10 s / m ⁇ .
  • the concentration of ammonia produced was 35 ppm, and the concentration of lactic acid was 150 ppm.
  • Dissolved oxygen concentration was maintained at 2 ⁇ 5 p P m during the culture period. Bubbles on the liquid surface generated during the culture were completely defoamed in the defoaming layer 5.
  • the defoaming layer 5 is made of a square mesh stainless steel mesh (a piece of the eye: 8 ram), to which a polyurethane resin is adhered, and the piece of the eye is reduced to 5 mm. And, those impregnated with 5% of polysiloxane (2 ⁇ 10 3 centipoise) were used. Sterilized air was aerated through a glass porous nozzle 4 placed at the bottom of the tank with an average bubble diameter of 2 mm and an aeration rate of 0.2 mmZsec, and cultured for 5 days.
  • the contact angle between the culture liquid droplet and the water-repellent material was 85 °.
  • the oxygen transfer rate during the ventilation was 7 mmol ⁇ e O 2 ⁇ ⁇ h.
  • the concentration of ammonia produced at this time was 36 ⁇ , and lactic acid was 104 ppm.
  • the dissolved oxygen concentration was maintained at 6 ppm during the culture period, and the bubbles generated on the liquid surface during the culture were completely defoamed on the lower surface of the defoaming layer 5. After 5 days of culture, the cell concentration reached 5.1 x 10 s Zm. No
  • Example 6 In contrast to the submerged aeration method of Example 6, the cells were cultured by a liquid level aeration method.
  • a culture tank having the same shape and the same volume as in Example 6 was prepared, and the defoaming layer 5 and the submerged ventilation nozzle 4 were removed. Instead, the ventilation pipe and the exhaust pipe were opposed to the gas phase in parallel with the liquid surface.
  • the same cell line was seeded in the same manner, and the same volume, the same volume of liquid medium and serum in the same volume were added at the same volume ratio, and the cells were cultured at the same aeration volume for 3 days.
  • the oxygen transfer rate was 0.3 mmo ⁇ e ⁇ 2 / ⁇ ⁇ 1 ⁇ .
  • the dissolved oxygen concentration was 0 to 0.2 ppm on the first day of culture and 8 PRIU on the third day and thereafter.
  • the cell concentration was 0.9 ⁇ 10 s keno m £. Book .
  • Comparative Example 6 is an example of the prior art. In the liquid level aeration method, the dissolved oxygen required for cell growth could not be supplied sufficiently, and the cell concentration was only about one-sixth of that in Example 6. Was.
  • Example 6 the polyethylene foam honeycomb layer used as the defoaming layer 5 was coated with olive oil (viscosity of 22 cm).
  • the contact angle with the culture solution was 25 °.
  • the foam generated by the aeration in the liquid was in contact with the defoaming layer and showed the defoaming effect until the third hour, but lost the defoaming effect after that, and the air bubbles exceeded the defoaming layer and became Operation overflowed due to overflow from exhaust port 24. It was also observed that the olive oil diffused as an oil film on the surface of the culture solution.
  • defoaming by direct contact between a low-viscosity water repellent and a culture solution is effective for a short period of time, but it is difficult to maintain the effect for a long period of time.
  • the established animal cells used in Example 6 were cultured using a liquid medium having the same composition.
  • the culture tank 2 is made of glass with a diameter of 15 cm and a height of 3 O cjn, and various defoaming layers 5 listed in the table are placed at a height of 1 O cm from the bottom of the tank and parallel to the bottom. installed.
  • a 10 cm diameter ring sparger (hole diameter: 1 mm, number of holes: 12) is placed at the bottom of the tank, and carbon dioxide gas is enriched by 5% (V-V) at the specified airflow shown in Table 1. Sterile air was passed through. The temperature was automatically adjusted to 30 ° C by an external jacket.
  • the cultivation period was 4 days, during which the defoaming effect of the defoaming layer and the maximum concentration of cells during the culturing period of the pressure loss were measured.
  • the results are shown in Table 1. Both can be defoamed as a result.
  • Example 8 Culture was carried out under the same conditions as in Example 8, except that a culture tank having the same structure as that of Example 8 was used except for the defoaming layer 5.
  • a culture tank having the same structure as that of Example 8 was used except for the defoaming layer 5.
  • a stainless steel wire with a diameter of 1 mm and a length of 5 cm was welded in a cross at right angles on a plane, and the intersection was located at the center of the tank cross section. That is, a defoaming tank with an arc-shaped hole with a radius of 5 O mm and an inner angle of 90 ° C was used.
  • He fia cells human carcinoma cells
  • the cells were inoculated at 5 ⁇ 10 4 cells / m ⁇ into a 50 ⁇ ⁇ glass rotary culture bottle containing 10 Om fi in the same medium as in Example 6, and The cells were cultured at 10 rpDi at 7 ° C for 3 days.
  • the gaseous gas was air.
  • the seed cell suspension 100 m ⁇ , liquid medium 705 was placed in a cylindrical glass culture tank 2 having a diameter of 104 mm, a height of 164 mm, and a capacity of 150 m fi, calf serum 90 m ⁇ (Total 900 m ⁇ ) and kept at 37 ° C.
  • the first-stage defoaming layer made of Teflon coated with stearic acid with a grid spacing of 3 ram at a height of 5 mm above the liquid surface, and a grid of the same specifications as the above grid is placed at a right angle to the grid 3 mm above.
  • a two-stage defoaming layer was used.
  • Sterilized air was bubbled through a glass porous nozzle 4 placed at the bottom of the tank at an average bubble diameter of 1.5 mffl at an aeration rate of 0.3 cmZsec and cultured for 5 days.
  • the surface tension of the culture solution was 5 dynZcm 2
  • the angle of contact between the culture solution droplets and the water-repellent material was 85. It was.
  • the oxygen transfer rate in the above aeration was 7 m mo ⁇ e 0 2 / ⁇ ⁇ h.
  • the cell concentration reached 4.2 XI 0 s ⁇ .
  • the concentration of ammonia produced at this time was 29 ppm, and the concentration of lactic acid was 900 ppm.
  • the dissolved oxygen concentration was maintained at 2 to 5 PPm during the culture period. Bubbles generated during the culture were completely eliminated by the defoaming layer 5 provided in two stages.
  • a liquid culture medium 150 & having the following composition was dispensed into 50 G'm fi Saka Lofrasco 20 tubes.
  • Soybean extract liquid obtained by adding water 900 ⁇ to 100 g of soybeans, heat-extracting at 120 ° C for 30 minutes, and filtering
  • Cells of Bacillus Zubuchi Li scan was aerobically static culture in the off La score on agar gel slants input Ri tube (Bacillus cells) 1. Inoculate concentration of 1 X 1 0 6 cells / m J2 Then, the cells were cultured aerobically with shaking at an amplitude of 7 cm and 120 strokes. The main culture was used as a preculture and used for the following main culture.
  • the liquid medium 2.52 having the above composition was placed in a culture tank 2 having an inner diameter of 16 cm and a height of 25 cm, and sterilized with steam at 120 ° C for 20 minutes.
  • a culture tank Jimechirupo Li Shi port hexane from the liquid surface to 1 cm upper (viscosity 1 X 1 0 5 Se Nchiboi's) the coated diameter 1 6 cm, a thickness of 0. 5 mm stearyl down Les scan of
  • the porous porcelain pore diameter 3 mm, opening ratio 50%
  • a ring sparger pore diameter 1 nm, pore number 12
  • a shell-shaped stirring blade were provided at the bottom of the tank. The provided one was used.
  • the culture was performed under the following conditions.
  • Air flow rate 0.2 mZsec, oxygen transfer speed at this time
  • Table 3 shows the state of proliferation by culture.
  • Example 17 Except that the defoaming layer of the culture tank used in Example 17 was removed and defoaming wings with a diameter of 5 cm and a radiation of 1 cm were attached to the gas phase and turned at 500 rpm, the procedure was repeated. Open the culture under the same conditions as in Example 8. Started.
  • Example 18 The liquid medium of lower Symbol 1 delta added to a glass fermentor 2 beta (diameter 7 cm X Height 5 2 cm), the concentration of the click b Les La arsenide les Neu Doza 1 X 1 0 5 cells / m ⁇ was inoculated. Fluorescent the culture vessel side - lamp was installed and the illuminance of the vessel inner wall surface and 5 X 1 0 3 lux. The temperature was adjusted to 30 ° C with an external jacket.
  • Table 5 shows the state of proliferation by culture.
  • the culture was started under the same conditions as in Example 18 except that the defoaming layer of the culture tank used in Example 18 was removed.
  • a cell-free culture filtrate is extracted without causing damage to cells or clogging of the membrane due to shearing force of the fluid. be able to.
  • the culture medium in the culture tank can be exchanged efficiently and high-concentration cells can be stably cultured for a long period of time, which is extremely useful for the production of insulin and the like.
  • defoaming which has been considered difficult in the past, can be effectively performed, so that oxygen can be supplied by the submerged ventilation method, and highly efficient use of oxygen can be achieved.
  • the oxygen consumption can be reduced to 1Z10 to 1 150 as compared with the above.
  • it can supply oxygen five times or more to a culture solution using serum or the like having a high foaming property, and can increase the culture efficiency, which is effective for mass production.

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Description

明 細 書
細胞培養方法及び装置
〔技術分野〕
本発明は、 生物細胞の培養方法に係 り 、 特に、 生物細 胞を液体培地中で通気培養し、 副生物質の除去を効率良 く行なう 、 大規模かつ高濃度な細胞培養方法並びに装置 に関する。
〔背景技術〕
最近、 従来の微生物細胞すなわち菌体の培養に加え、 動物細胞の培養によ リ イ ン タ ー フ ェ ロ ン等の医薬品の生 産が行われはじめた。
こ う した医薬品を工業的に生産するためには大規模か つ高濃度で長期間安定した培養法が必要となる。 このた め、
①生物細胞と培養液と を分離し、 新鮮な培養液を供給す る技術、
②生物細胞の生育に必要な酸素を供給する技術、
を具備した細胞培養方法の開発が望まれている
上記①の要件を達成するには、 培養液中に浮遊してい る細胞を無菌的に分離濃縮する必要がある。 培養液を交 換せずに細胞を培養した場合、 多く の細脸系においては、 2 X 1 0 6 個 " ιη β 前後の細胞濃度が最大値である。 こ れに対し、 培養液中の細胞を分離濃縮し、 新鮮培養液で 培養を継続した場合には 1 0 7 個/ πι 以上に細胞濃度 を上げる こ と ができ、 培養槽の小型化及び培養時間の短 縮を図る ことができる。
細胞の分離濃縮に対しては、 少量試験用には一般に遠 心分離法が用い られるが、 大規模にこれを無菌的に行な う こ とは、 培養液の交換に要する時間とプロセスの複維 さ から困難である。 そこで、 培養槽内への新鮮培養液の 供給と細胞が副生する老廃物の除去を、 細胞の分離濃縮 操作と時間をおかずに行う方法が提案されている。 例え ば特公昭 55 - 1 6635 号及び特開昭 6 2 - 265 号記載の方法 は、 培養槽内に細胞の沈降ゾーンを設け、 沈降ゾーンの 上澄液を排出しながら新鮮培養液を供給する。 また、 特 開昭 61— 2571 8 1号， 特公昭 62— 1 2989 号および特公昭 6 2 - 1 2990 号記載の方法は、 培養槽内に培養液は透過する が細胞は透過しない壁膜を有する中空糸膜を設け、 これ を介して新鮮培養液の供給と副生物質の除去を行う 。
また'前記②の酸素供給技術については、 従来、 微生物 等の培養においては培養液中に直接空気も し く は酸素富 化空気を通気する手段がと られてきた。 しかし、 これら の細胞を培養する際に用いる液体培地又は細胞を含む培 養液は発泡性のものが多い。 特に血清を添加して行う動 物細胞の培養の場合には、 血清中に含まれる生体高分子 類及び培養中に分泌される生体高分子類に起因する培養 液の発泡が著 しい。 これは放置 した り 、 機械的に剪断力 を与えても破泡 し に く く 、 泡が培養槽気柑部を満た し、 やがて系外に溢流 して し ま う 。
これ らの発泡性の培養液では、 液中に酸素を供給する 方式と して、 気泡を立てずに液中に酸素を溶解させる 力、、 液中通気によ リ発生する気泡を消泡する必要があ る。
従来は前者の方法が主と して指向さ れて きた。 具体的 には、 培養槽気相部に通気し、 液面から酸素を溶解させ る方法であ り 、 通常、 酸素と の接触を良 く する ため液を 撹拌した り 、 通気量を多 く して液面と の接触を増加させ ている 。
上記については、 特開昭 61— 74574 号公報， 特閧昭 61 - 36915 号公報， 特開昭 60— 2591 79号公報に記載されて いる。
従来の細胞を培養液よ り分離濃縮する技術の う ち、 細 胞を沈殿させて分離濃縮を行う方法では、 細胞の沈降速 度が遅いため必然的に培養槽内に占め る沈殿糟の容積を 大き く しなければな らなかった。 振動や温度差によ り培 養液が対流を起こす と、 上澄液に細胞が混入 し分離効率 が低下する と云う 問題がある。
また中空糸膜やフ ィルタ によ り細胞の分離濃縮を行う 方法では、 膜やフ ィルタ 上への細胞の付着を完全には防 止できないため に、 培養中に膜や フ ィ ルタ が目 づま り を 起こす。 この状態で強制的に加圧し分離濃縮を行う と、 細胞が損傷する等の問題がある。
一方、 液面通気方式による酸素供給法は、 液の撹拌を 強くする と細胞が破碎されるため、 動物細胞でば実質的 に 5 0 r p m 以下に限定される し、 通気量も 1 c m / s ec が 上限である。 上記の通気量を保持するには培養設備に大 容積の無菌空気調整設備が必要であ り、 また、 長期の培 養においてはガスに伴って散逸する培養液の損失も大き い
他方、 液中通気方式による酸素供給法は、 効果的な消 泡技術 ない。 細胞壁が強固でかつ増殖速度の大きい一' 部の微生物を対象と した培養法において、 気泡を高速回 転翼で機械的に破壌する方式が提案 （特開昭 54— 1 3464 号公報， 特公昭 56— 12108 号公報） されているにすぎな い。 この方法は、 槽内に高速駆動部を設けなければなら ないため、 構造が複雑となる。 動物細胞はこのような剪 断力には極めて弱いため、 この方法は適用できない - 〔発明の開示〕
本発明の第 1 の 目的は、 細胞の損傷やフィルタ の 目詰 リ を防止し、 かつ細胞の分離濃縮と培養液の交換を無菌 的に効率良く行う細胞培養方法並びに装置を提供する に ある。
本癸明の第 2 の 目的は、 細胞を分離した培養液中に溶 解 している老廃成分を除去 し、 これを再び細胞の培養に 供する高濃度の細胞培養方法並びに装置を提供する にあ る 。
本発明の他の 目的は、 細胞の増殖に害する こ と な く 、 培養液の消泡を行う細胞培養方法並びに装置を提供する にある 。
上記目 的は下記によって達成する こ と ができ る。
( 1 ) 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用 いて濾過 して取 り 出 し、 新 し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 であ り 、 該滤過膜は間欠的に培養.液で逆洗する こ と を 特徵とする細胞培養方法。
( 2 ) 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて濾過 して取 り 出 し、 新し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 の表面に親水性濾過助材層を有するプ レ コ一ト膜であ リ 、 該濾過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を特徵 とする細胞培養方法。
( 3 ) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が 1 本以上 の中空糸膜である こ と を特徴とする細胞培養方法。
( 4 ) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が培養液の 液滴と の接触角が 8 0度以上の素材で形成さ れてい る こ と を特徴とする細胞培養方法。 (5) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の濾過孔を 培養液で充墣してから濾過を行う こ とを特徴とする細 胞培養方法。
(6) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の限界圧以 上で逆法するこ と を特徴とする細胞培養方法。
(7) 前項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜を逆洗する 培養液が、 濾過した培養液から老廃成分を除去した培 養液であるこ と を特徴とする細胞培養方法。
(δ ) 前項 1 または 2 において、 濾過した培養液中の老廃 成分を老廃成分除去手段によ り除去し、 該老廃成分除 去液を疎水性濾過膜の逆铣用液の一部または全部と し て用いる こ と を特徵とする細胞培養方法。
( 9 ) 前項 8 において、 老廃成分除去手段が拔散透析法、 限并瀘過法または精密濾過法であること を特徵とする 細胞培養方法。
( 10)前項 1 または 2 において、 培養液中に撹拌翼を設け、 該撹拌鬂の回転面の周囲に疎水性濾過膜を設けたこと を特徵とする細胞培養方法。
( 11 )前項 1 または 2 において、 培養によ り生成する培養 液の泡沫を、 培養液面上に配置した撥水性消泡層と接 蝕させることによ り、 該泡沬を破泡しながら培養を行 う こと を特徵とする細胞培養方法。
(12)前項 1 1 において、 該消泡層の表面が、 培養液'の液 滴と の接触角が 3 0度以上の撥水性を有する こ と を特 徴とする細胞培養方法。
(13)前項 1 1 において、 少な く と も消泡層表面に形成さ れた撥水性材料が有機けい素高分子であ る こ と を特徴 とする細胞培養方法。
(14)前項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その開 口比が 5 0 %以上であ る こ と を特徴とする細胞培養方 法。 '
(15)前項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その孔 の大き さ が 2 〜 5 O mmであ る こ と を特徴とする細胞培 養方法。
(16)前項 1 0 において、 消泡層が、 粘度が 1 X 1 04 セ ンチポィ ズ以上の撥水剤を基材に塗布ま たは含浸さ れ たも のである こ と を特徴とする細胞培養方法。
(17)前項 2 において、 親水性瀘過助材が細胞の沈降速度 よ リ大なる沈降速度を有する こ と を特徴とする細胞培 養方法。
(18)前項 2において、 濾過膜を収納する瀘過器を培養槽 と配管で連結して培養槽の外部に設け、 疎水性濾過膜 を瀘過器内の上部に配置し、 密 '度が培養液の密度よ り も小さ い親水性瀘過助材を用い る こ と を特徴とする細 胞培養方法。
(19)培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培.養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性濾過膜からなる培養液濾過手段を介して設けられ、 かつ、 該疎水性濾過膜が培養液によ リ逆铣できる手段 を有する生物細胞の液体培養装置。
( 20 )培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性瀘過膜から培養液瀘過手段を介して設けられ、 該 琼水性濾過膜が培養液によ り逆洗できる丰段を備え、 かつ、 培養液表面上に消泡手段を有する生物細胞の液 体培養装.置。
( 21)前項 1 9 または 2 0 において、 培養液濾過手段が疎 水性中空糸膜の表面に親水性濾過助材層を有するプレ コ一 卜膜から成る こと を特徵とする生物細胞の液体培
( 22 )疎水性中空糸膜 C 雨端に、 外径が中空糸膜の内径よ リ大で、 その先端部において中空糸膜に揷入可能な外 径を有するよ う に勾配を持たせて成形され、 かつ、 該 中空糸膜の離脱防止のための突起部分が設けられた膜 拡張部材が揷入されており、 該揷入都が接銃部に固定 され、 該接続部を介して配管と連結し得るよう にした ことを特徵とする生物細胞分離用濾過器。 本発明の細胞培養方法は、 生物細胞の増殖培養に用い られ、 培養容器， 細胞と培養液と を分離する手段， 老廃 成分を除去する手段， 老廃成分を除去 した培養液を培養 容器に戻す手段、 及びこれ ら を接続する配管類から構成 されている。
培養容器すなわち培養槽では生物の細胞が培養液中に 浮遊している。 培養液中には無機塩， グルコース， ア ミ ノ酸， 抗生物質等が添加されてお り 、 また、 必要に応 じ て血清が加え られてい る。
本発明の培養方法に用い られてい る培養槽の特徵は、 培養液を収齊する容器， 培養液を撹拌する手段， 細胞と 培養液と を分離する手段， 該容器の底部近傍から培養に 必要な気体を該培養液に供給する手段， 該培養液の液面 の上方に位置 し、 気体を通過 し う る多数の開口 を有する 撥水性消泡手段、 及び培養の進行度を検出する手段を有 する通気培養槽にある。
本発明において、 細胞と培養液と を分離する手段と し ては、 疎水性濾過膜を用いる。 特に琼水性中空糸膜が好 ま しい。 疎水性濾過膜は、 培養液滴と の接触角が 8 0度 以上、 好ま し く は 9 5度以上の素材で構成さ れたもので ある こ と が望ま しい。 その開口度は、 生物細胞が実質的 に透過せず、 かつ所要量の培養液を透過させる ため には、 5 μ π！〜 0 . 5 μ πιのものが好ま し い。 次に、 培養液中に気体を通じる と気泡が発生するが、 培養液面上に撥水性材料によ リ搆成された多孔性の消泡 手段を設けることによ り、 該気泡を破砕することができ る。 該消泡手段の撥水性材料は， 培養液の液滴との接触 角が 3 0度以上のものであるこ とが望ま しい かかる、 撥水性材料と しては、 例えば有機けい素高分子材料が好 ま しい。 上記消泡手段は、 その少な く とも表面層が上記 の撥水性材料によって構成される。
〔図面の箇単な説明〕
第 1 図〜第 7 図および第 1 4図は、 本発明の一実施例 の概要を示す構成図、 第 8図 Aは膜支持部材の斜視図、 第 8 図 B は、 第 8 図 Aの膜支持部材に中空糸膜を装着し た濾過ユニッ トの斜視図、 第 9 図は膜支持部材を示す平 面図、 及び断面図、 第 1 0 図〜第 1 3図ば、 濾過ュニッ 卜の形状を示す斜視図、 第 1 5 図は中空糸膜の瀘過圧と 濾過流量との関係を示す曲線図、 第 I S図〜第 2 0 図は 本発明による細胞培養日数と細胞濃度との関係を示す曲 線図、 第 2 1 図〜第 2 8 図は、 消泡層の斜視図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
第 1 5図は、 親水性膜と疎水性膜の透過特性を示す。 図中、 破線が親水性膜、 実線が疎水性膜を用いた場合で ある。
親水性膜の透過特性は、 濾過圧に比例する - これに対 ' (ID し疎水性膜は、 その細孔内にガスが存在する場合、 すな わち運転前においては、 限界圧 （疎水性の程度， 細孔径 膜厚， 膜内空隙率等に依存する） 以下の濾過圧では、 液 は透過せず、 限界圧と なって初めて液が透過する。 一度 液が透過する と、 すなわち膜の細孔内が液で満たさ れる と その透過特性は、 瀘過圧によ らず親水性膜と 同等と な る。 図中実線の矢印のよ う に変化する。
細孔径 0 . 0 i m のポ リ テ ト ラ フルォ ロ エチ レ ン製ホ 口 一ファイ ノ （外径 2 mm, 内径 1 mm)の限界圧は、 1 . 5 kg/cm2 であ り 、 液充満後の透過特性は、 ほぼ 1 0 0 m β / mraHg · m 2· h r である。 この透過量は親水性膜の 透過量にほぼ一致する。
従って、 上記ホ ロ一ファイバを用いて、 濾過または逆 洗する場合は、 それが最初の使用の と きは、 上記限界圧 以上で一旦操作し、 膜細孔内に液を充満する こ と が必要 である。
疎水性中空糸膜と しては、 特に限定するも のではない が、 1 3 0 °C程度での雰囲気でも十分な強度を保ち、 濾 過のための小孔径が変化しないよ う な疎水性材料か ら成 るもの を用いる必要がある。 特にテ ト ラ フルォ πェチ レ ン樹脂製のものは、 こ う した点で好ま し い。
疎水性濾過膜は長い 1 本の中空糸膜を用 いても よいが、 膜表面の有効利用 を図る ためには複数本を束ねた状態で 用いるのが望ま しい。
特に溶接や接着による接続がむずかしいテ ト ラ フルォ 口エチレン樹脂製の中空糸膜を用いる場合には、 下記の よう な接続方法によ り良好な膜ユニッ ト を得る ことがで さる。
第 9 図に示すよ う に、 中空糸膜 1 0 の雨端に膜拡張部 材 5 2 を揷入する。 膜拡張部材 5 2 は、 中空糸膜 1 0 の 内径よ リ大なる外径を有する中空の管状をなしておリ、 その先端は、 中空糸膜 1 0内への挿入を容易にするため に先端に行く ほど靳面積が徐々 に小さ く なる形状を有し、 かつ表面の一都に局所的に外径の大なる突起部を有して いる。 膜拡張部材 5 2 を揷入した中空糸膜の末端を、 室 温硬化性の樹脂ワニスで包含したのち、 これを硬化させ る。 必要に応じて外形を成形して膜接続部材 5 1 と し、 濾過用配管への接続端とする。 複数の中空糸膜 1 0末端 を束ねて同一の膜接続部材 5 1 に敢付ければ、 複数の膜 から成る濾過ユニッ トを作製できる。 なお、 中空糸膜濾 過ュニッ トの一例を第 8図及び第 1 0 図〜第 1 3 図に示 す。
疎水性を有する膜を用いる こ と によ り 、 膜面への細胞 や汚れの付着を大幅に軽減でき、 長期間の濾過に使用が 可能となる。 - 所定量の培養液を抜き出した後に疎水性濾過膜に新鮮 な培養液を逆に圧入する こ と によ り 、 濾過膜面上に付着 した細胞や汚れを遊離させる。 逆洗用液と しては、 未使 用の新鮮培養液または使用済の培養液から老廃成分を除 去 した液あ るいはこれ ら の混合液でも よい。
疎水性濾過膜 1 0 を培養槽 2 内の培養液中に設ける場 合 （第 5 図） 培養槽 2 内に滞留部分が生 じて、 細胞の沈 積を起すこ と のないよ う に培養液 1 の 円滑な流動を維持 でき、 かつ細胞に不要な剪断力 を与えないよ う な形状及 び設置位置を考虑する必要がある 。 なお、 この場合の培 養液の抜き出 しは、 でき るだけ低流量で行な う こ と が望 ま しい。
疎水性濾過膜 1 0 を培養槽 2 の外に設ける場合 （第 2 図） は、 濾過器 8 内に収容さ れる 。 該濾過器 8 は配管等 によ り培養槽 2 に接続さ れる。 なお、 このよ う な疎水性 濾過膜 1 0 を培養槽 2外に設けた場合には、 培養液の抜 き出 し速度はでき るだけ高流量で行い、 所定の液量に達 した時点ですみやかに細.胞を培養槽 2 に戻すよ う な運耘 操作が必要と なる。
疎水性濾過膜 1 0 が培養槽 2外に設けた濾過器 8 内に 収容されている場合には、 該膜は、 その表面に親水性濾 過助材を有する プリ コー ト膜であ る こ と が望ま しい。 こ の場合、 瀘過器 8 内には、 底部ある いは底部と上部の両 方に、 疎水性瀘過膜 1 0近傍に瀘過助材 9 を保持するた めの フィルタ 1 1 を設ける。
ここでフィルタ 1 1 は有機高分子材料， ガラス， セラ ミ ック ， 焼結金属等の多孔質の材料で構成されるが、 そ のと きの開孔度は濾過助材 9 の粒子が実質的に透過しな いよう に選定される。
培養槽 2 から培養液を瀘過器 8 に導入する と、 培養液 内の細胞は濾過助材 9 の粒子によ り捕捉される = 瀘過助 材 9 は、 細胞に対し毒性がない有機高分子， 無機化合物 を 1種以上混合したものであ り、 細胞との付着性， 鈿飽 の粒径等に応じて材質， 粒径， 形状、 および充塡量を選 定する。
例えば、 粒径 5 〜 5 0 mの細胞に対しては、 濾過助 材 9 の粒子間のいおゆる "さえぎり効果" だけで細胞を 捕捉する場合にはろ過助材粒子径は細胞の粒径と同程度 とする。 これに対し、 細胞が濾過助材 9 に対して付着性 を示す場合には濾過助豺 9 と して数 1 0〜数 1 0 0 πι 程度の粒径の'ものを用いるのがよい。 マイク ロキャリア ビーズを用いれば付着性培養が可能である。 多く の細胞 に対しては、 上記の雨方の効果を考慮した濾過助材 9 が 選定され、 その充填量は濾過助材 9で培養液中.の細胞の 大部分が捕捉されるよ う に選定する。 したがって、 濾過 器 3 内に導入された培養液が濾過助材 9 を通過し、 疎水 性濾過膜 1 0 に到達した時には、 培養液中に細胞は殆ど 含まれておらず、 長期間の運転であっても実質的に疎水 性濾過膜 1 0 の 目づま り が防止できる。
濾過器 8への培養液の通液流量は、 濾過器 8 の代表内 径に基づく単位表面積当 り 0 . 1 〜 ： L 0 m 3 Z m 2 ' h程 度にする と濾過助材 9 の粒子間を培養液が通過する際の 剪断力による細胞の損傷を防止できる。 ただし、 この値 は、 細胞の種類、 濾過助材 9 の粒径、 瀘過器 8 の構造等 によって異なる。
疎水性瀘過膜 1 0 は培養液中の副生物質を透過でき る から、 上記によ り、 培養液中の細胞を分離濃縮し、 老廃 物等の副生物質の排出が達成される。
所要量の培養液を培養槽から排出 した後は、 濾過器 8 に新鮮培養液を導入する。 こ こで新鮮培養液とは、 未使 用の培養液であっても、 また使用済みの培養液中の細胞 の副生物質を除去処理したものでも良い。 また、 培養液 の組成も、 培養槽内と異なっていても良い。 こ う した新 鮮培養液を瀘過器 8 に逆に導入する と、 これによ り濾過 助材 9 の粒子が上昇 （又は下降） し前記工程で捕捉され た細胞と ともに展開する。
前記の濾過助材 9 に要求される材質， 粒径， 形状等は .， 上記の工程を効率良く 行う ために細胞よ リ も速く沈降す る粒子 （又は培養液中に浮上する粒子） でなければな ら ない。 細胞よ り も速く 沈降する粒子群を濾過助材 9 と し て用いた場合、 濾過器 8への新鮮培養液への流量は、 —展 開させる対象の濾過助材 9 のうち最も沈降速度の速い粒 子群がわずかに浮き上がる程度にすること が望ま しい。 この時、 展開させる対象の瀘過助材 9 は実質的に全て展 開するので、 細胞は瀘過助材 9 と分離し、 少な く とも細 胞よ り も沈降速度の速い粒子群の上部にまで浮遊する。 濾過助枋 9 を通過した新鮮培養液が培養槽 2 に移送でき るよう に配管されているから、 濾過器 8上部に浮遊した 細胞は新鮮培養液とともに培養槽 2 に戻される。
ここで、 濾過助材 9 の中に細胞の粒径よ りも大きい粒 子群が含まれる時には、 細胞は透過されるが該粒子群は 透過できない程度の開孔度を有するスク リーン等を濾過 器 8上部に設置する と、 濾過助材 9 の培養槽 2への浮上 混入が防止できる。 さ らに、 新鮮培養液によって疎水性 濾過膜 1 0 が逆铣されるのでよ り膜の使用寿命を延ばす こ と ができる。
また、 培養液中に浮上する粒子群を濾過助材 9 と して 用いる第 2 図のよう な場合には、 濾過器 8への新鮮培養 液の通液量は、 展開させる対象の濾過助材 9 のう ち最も 浮上速度の大きな粒子群が下降し、 濾過助材層が流動拔 態を示す程度にすることが望ま しい。 この結杲、 細胞は 濾過助材 9 と分離して沈降し、 瀘過器 8 と培養槽 2 を違 結した配管内を逆洗用液と ともに搬送されて培養槽 2 に 戾される。 こ こで、 濾過器 8 底部には、 細胞を透過 し、 濾過助材 9 を透過 しない開孔度を有する フィルタ 1 1 を 設置してお く こ と が好ま しい。
この工程によ る 1 回の操作での新鮮培養液の導入量は、 特に限定されないが、 前記培養液の排出工程における培 養液の排出量と 同程度である こ と が望ま し く 、 更に、 濾過助材 .9 に捕捉されて細胞の大部分が新鮮培養液と と も に培養槽 2 に戻されるだけの流量が望ま しい。
新鮮培養液の通液を停止する と展開 していた濾過助材 9 の粒子群はフィルタ 1 0 の上部あるいは周囲 に沈降す る が、 細胞の沈降速度よ り も速 く 沈降する粒子群が含ま れているため、 新鮮培養液中に培養槽に移送し きれなか つた細胞が淳遊していても、 この細胞がフィルタ 1 0 に 達する量はす く ない。
撥水性消泡手段は、 生物細胞を含有する液体培地中に 通気する際に液面上に発生する泡の消泡を 目 的とするも ので、 気体を逋過し う る多数の開口 を有し、 培養槽内の 培養液の液面の上方に設ける。 その開口比は 5 0 %以上 である こ と が望ま し く 、 開口径は 5 0 〜 2 mmである こ と が望ま しい。 さ ら に、 消泡手段は少な く と も表面層が撥 水性の材料によ リ形成する。
特に発泡性の著 し い血清添加培地を用 いる動物細胞の 培養に際 しても消泡効果が大きいので、 液中通気法によ る高効率酸素供給が可能となった。
撥水材と しては、 培養液の液滴が該撥水材の表面との 接触角 3 0度以上を形成する撥水性材料で、 かつ実質的 に培養液に不溶又は非分散性で、 かつ対象とする細胞に 実質上毒性を示さない材料であればよい。 消泡層はそれ 自体、 上記の撥水材で構成しても、 被覆， 塗布又は含浸 させたものでも良い。
例えば、 炭素数 1 0以上のシラン又はシロ キサンがあ げられる。 特に 1 X 1 0 4 センチポィズ以上の粘度を有 するものが適している。
1 X 1 0 センチボイズよ り低粘度の撥水材では、 培 養液面が撥水材で覆おれたり、 液中にェマルジヨ ン とな つて細胞に付着して增殖を阻害した りする。 また、 培養 後に培養液中から生産物の分離を困難にする。
ポリ シロキサンの炭素数の上限及び粘度は特に限定さ れないが、 実質的に固体となる炭素数が 1 X 1 0 個、 粘度では 1 X 1 0 7 センチボイズが上限となる。
消泡層の開口比が 5 0 %未満である と、 液面上の泡が 破泡した際、 気体が円滑に消泡層を通過できず、 2次泡 が発生しやすい、 消泡層の開口部の径は好ま し くは 2 〜 5 0 mmである。 5 0 mmを越える と、 気泡が細かい場合、 消泡層との接触が不完全とな リ消泡されにく い。 一方、 2 mm未満になる と、 開口部の気体及び液の出入に円滑性 を欠 く 。
消泡層の構造は、 単層でも、 積層 したも のでも よ い。 さ ら に、 これ らは一体化されていても縦方向， 撗方向に 分割可能であっても よい。 層構造は液性， 通気量， 気泡 径によ り適宜選定する。
培養槽 2 内への通気は通常培養槽底部に ノ ズル 4 を配 置して行う が、 液面下な ら適宜配置 しても よ い。 また、 " 底部と液面の間に設けても よ い。 特に、 ド ラ フ トチュー ブ 3 が設け られている場合には ドラ フ トチューブ 3 の下 に ノ ズル 4 を配置する と培養液の下降流によ り気泡を よ リ長時間液中に滞流させる こ と ができ るので酸素の利用 率を向上させる こ と ができ る。
本発明において、 培養液と しては、 液の表面張力 が 4 5 〜 9 0 d y n Z cm 2がよい。 効果の大き い培養液と して は、 血清等の生体高分子を含有する培養液があげられる。 血清以外にアルブミ ンの様な蛋白質や、 核酸を添加又は 含有する培養液も極めて有効である。 外部から添加する 成分だけでな く 、 培養中に分泌される発泡性成分を含む 培養液も対象と なる。
老廃成分と しては、 疎水性膜を用いた培養瀘液に含ま れる乳酸， ア ンモニア等がある。
老廃成分を除去する手段と しては、 特に限定さ れない が、 拡散透析装置， 限外濾過装置， 電気透析装置等の公 知方法によ り行なう こと ができる。
しかし、 培養濾液中には、 血清由来の沈殿物や細胞片 等の微細な固形物が多量に含まれている こ とから、 目詰 りの起り に く い形状を有する ことが望ま しい。 老廃成分 中の特に乳酸及びアンモニアは、 細胞の増殖を阻害する。 このため、 老廃成分の除去は、 上記のアンモニア， 乳酸 を指標と して行なう のがよい。 また培養濾液中には各種 のホルモン， 蛋白質等の細胞の生育に必要な成分も多量 に含まれており、 これらの成分はできるだけ回収して再 利用する ことが望まれる。 これらのこと から、 拡散透析 膜や限外濾過膜と しては、 分画分子量が 1 , 0 0 0 〜
1 0 , 0 0 0 程度のものを用いる こ と が望ま しい。 分画 分子量 1 , 0 0 0 未満の膜では透過量が小さ く 、 膜面積 を大き く しなければならないほ力、、 膜の 目詰リ が著しい ので、 長期間の使用に耐えない恐れがある。 一方、 分画 分子量 1 0， 0 0 0 を越える膜ではホルモン等の細胞の 増殖に有益な物質をも透過して しまう のでこれらの物質 の回収率が低下する。
なお、 分子量の大きい蛋白抗体等の有用物質の分離に は、 0 . 0 1 m 程度の細孔柽を有する精密濾過膜を用 いるのがよい。 また、 これら を組合せて有用称質の分離 を多段に行う こ-とがよ り有利である。
拡散透析装置によ り老廃成分を除去する場合には、 透 析用液と しては、 新鮮培養液に含まれる各種の液， 各種 のア ミ ノ酸， ビタ ミ ン等の低分子成分と 同 じ濃度， 組成 の溶液を用いる こ と が望ま し い。
老廃成分除去後の液は、 前記の濾過器の逆洗液と して 用い培養槽内に戾され、 細胞の培養に有効利用 される。
本発明に適用でき る生物細胞と しては、 特に限定され る ものではな く 、 動物細胞， 微生物細胞， 植物細胞が含 まれる 。 動物細胞と しては、 例えば脊椎動物の各種細胞， 無脊椎動物の各種細胞， 原生動物の各種細胞があげられ る。 細胞は単一細胞のみな らず細胞集合体も含まれる。 微生物細胞と しては、 細菌， 酵母， 糸状菌， 放線菌等 各種の微生物を含む。
植物細胞と しては、 高等植物の細胞及び細胞集合体， 藻類の細胞及び細胞集合体が含まれる。
本発明に適用でき る通気用気体と しては、 用途に応じ、 空気， 酸素， 炭酸ガス単独も し く は任意の組成に混合 し たガス又は不活性ガスを混合したガスが用い られる。 一 般に動物細胞培養には、 酸素含有ガス， 植物培養用 には 炭酸ガスまたは炭酸ガス含有ガスを使う 。
疎水性材料の濾過膜は、 従来用い られてきた親水性濾 過膜に比べて膜面への細胞等の付着が少ない。 また、 逆 法によっても付着 した細胞等が容易には く 離する作用 が あ る ので、 目詰 り が起 り に く く 、 従って間欠的に逆洗を 実施する こ と によって高効率の細胞の培養ができ る。
また、 本発明の消泡手段によって、 効果的な培養液の 消泡を行う こ と ができ るので、 細胞の培養を効率的に行 う こ と ができる。
¾下、 本発明を図面を しめ して具体的に説明する。
第 1図は本発明による細胞培養システムの一実施例の 構成を示した図である。
培養槽 2では、 細胞は培養液 1 に分散懸濁状態で培養 される。 培養槽の底部には液中に酸素含有ガスを通気す るための ノズル 4があ り 、 細胞の生育に必要な酸素及ぴ、 P Hを調節するための炭酸ガスを供耠する。 すなわち、 溶存酸素濃度が一定となるよう にエアーコンプレッサ — 1 6 ょ リ空気、 及びボンべ 1 7 から酸素含有ガスをそれ ぞれ流量制御され、 さ らに、 p Hが 7 . 0〜 7 . S となる ようボンべ 1 8 よ り炭酸ガスを流量制御し、 除菌フィル タ 7 を通過させた後ノズル 4 よ り吹込まれる。 液中に吹 込まれたガスは気泡となって培養液上面に向って浮上す る際に培養液を流動させる。 吹込まれたガスによる槽内 での培養液の流動を劾率よ く行わせるため、 ドラ フ トチ ユーブ 3 が設置されている。 液面に到達した気泡はその まま破泡するこ とな く泡層を形成するので、 液面上に撥 水性材料で形成された消泡層 5 に接触させる ことによ り 効率良く破泡される。 ガスは ミ ス トセノ、。レータ 6 ， フィルタ 7 を経て排ガス 2 4 と して培養槽外に排出される。 なお、 培養槽 2 には、 溶存酸素濃度や p Hを一定にするための手段， 槽内及び 配管内を殺菌するための手段， 培養液の注入， 排出のた めの手段， 温度を一定に保っための手段， 溶存酸素濃度， p H， 温度， 槽内圧等のセンサゃ槽内の培養液の液面を 検出するセンサ等、 各種の装置が設置されているが第 1 図ではこれらは省略した。
培養槽 2 の下部には瀘過器 8 が設けられている。 瀘過 器 8 内には多孔質中空糸膜フ ィルタ 1 0 が設置されてお り、 その上部あるいは周囲に濾過助材 9 が充填されてい る。 濾過助材 9 は保持フ ィルタ 1 1 によ り保持されてい る。
中空糸膜フィルタ 1 0 は、 殺菌時および逆 時等の液 が急速に移動する時でも、 形状が変形した り 、 濾過助材 9層よ り露出した り しないよ う に留意しなければな らな いが、 特にその形状は限定されない。
Λ 第 8 図 Α及び Β は本実施例に用いた疎水性中空糸膜ュ ニッ ト を説明するものである。 膜ま持部材 5 0 は 1 3 0 °Cでも剛性を有し、 かつ培養液にょ リ腐食する恐れのな い材料で作成されてお り 、 その外形は第 1 図中の濾過器 8 の内部形状にあわせて作られてお り 、 多少の外力が作 用 しても瀘過器内での位置が移動しない様設けられてい る。 膜支持部.材 5 0 には第 8 図 Aに示すよう に中空糸膜 を保持するための小孔 5 5 が多数設けられている。 穴の 大きさは中空糸膜を自由に通すこと ^できる程度がよい。 第 8図 Bは膜支持部材 5 0 に中空糸膜 1 0 を装着してな る濾過ユニッ ト を示したものである。 中空糸膜 1 0 は 1 本で該濾過ユニッ ト を構成してもよいが、 通常は 2本 J¾ 上の中空糸膜で構成することが好ま しい。 この場合は複 数の中空糸膜を膜接続部材 5 1で 1つに結束して使用す ると、 濾過器への濾過ユニッ トの装着を容易にする こ と ができる。
第 9 図 A及び B は、 膜接続部材 5 1 の概念を示す図で ある。 この膜接続部材は疎水性中空糸膜のうち、 特に接 着法や溶接法では、 膜の接合が困難な村料からなる中空 糸膜、 例えばテ トラ フルォ ロエチレ ン樹脂でつ く られた 中空糸膜の接合に有効である。
第 9 図 Aは、 膜接続部材 5 1 を中空糸膜が接続される 面の反対の面を示す図である。 膜接鐃部材 5 1 に膜拡張 部材 5 2 が包含され、 膜接続部材 5 1 の外面は円形に整 形されている こと が望ま しい。 第 9 図 B は、 第 9 図 Aの A - Α ' 断面を示す図である。 中空糸膜 1 0 に、 中空糸 膜の内径と同程度の内径を有し、 外径が中空糸膜内径よ リ も大であ り、 その先端部が中空糸膜内面に揷入しゃす いよう にテ一パ拔に成形されておリ、 かつ局部的に外径 の大な る突起部分を設け、 中空糸膜の離脱を防いでい る。 次いで膜拡張部材 5 2 を揷入 した部分を膜接続部材 5 1 で包含し、 硬化させる こ と によ り 、 中空糸膜を強固に結 束する こ と ができ る。 膜接続部材と しては特に限定する ものではないが、 細胞に悪影響を与えず、 培養液中で腐 食せず、 かつ 1 3 0 °C前後でのスチーム殺菌に耐える材 料であればよい。 例えば 2液硬化型のエポキシ樹脂が用 い られる。
培養液の交換は以下のよ う に実施さ れる 。 第 1 図の弁 3 1 及び 3 2 を閉 じ、 弁 3 3 を開いてポンプ 2 2 を作動 させる と培養槽 2 よ り培養液 1 が濾過器 8 に導かれる 。 培養液中の細胞は濾過助材 9 及び多孔質中空糸 フ ィルタ 1 0 を通過する過程でそれぞれの表面で捕捉さ れる。 多 孔質中空糸 フィルタ 1 0 は濾過助材 9 の粒子及び細胞を 透過 しない開孔度のもの を選定した。 細胞を濾過 した培 養濾液は、 培養濾液貯槽 1 5 に貯留される。
所定量の培養液を培養槽 2 から排出 した後、 ポンプ 2 2 を停止し、 弁 3 3 を閉 じ る。 次いで弁 3 1 ， 3 2 を 開き、 ポンプ 1 9， 2 0 を作動させる 。 ポンプ 1 9 , 2 0 は新鮮培養液貯槽 1 2 よ リ新鮮培養液を瀘過器に供 紿する 。 こ の と き 、 ポンプ 1 9 は濾過器 8底部よ り新鮮 培養液を供給 し、 瀘-過助材 9 の充瑱層 を浮上させ、 展開 させる よ う流量を設定する。 また、 ポンプ 2 0 は多孔質 中空糸膜フィルタ 1 0 に逆洗のため新鮮培養液を逆に圧 力し、 フィルタ 1 0表面に付着した細胞等の固形物をは く離させる。 なお、 ポンプ 1 9及び 2 0 の流量の合計は 濾過助材 9 が瀘過器周囲よ り散逸する こ とのないよう調 節する。
前述の濾過工程で滤過助材 9及び中空糸膜フィルタ 1 0上に捕捉されていた細胞は瀘過助.材 9 の展開によ リ 充塡層内から解放される。 瀘過助材 9 の粒子はその沈降 速度が細胞よ り大き く なるよう比重， 粒径， 形状が選定 されているので、 細胞は展開した充填層の上部まで淳遊 し、 新鮮培養液と とも に培養槽 2 に戾される。
第 2 図は本発明による細胞培—養システムの他の実施例 の構成を示すもので る。 本実施例の特徵は、 瀘過器 8 に用いた濾過助材 9 と して、 培養液比重よ リ小なる粒子 を用いた点にある。 濾過助材 9 と しては中空ガラスビー ズ， 中空力一ボンビーズ等が用いられている。 濾過助材 9 は濾過器 8の上部及び底部に設けられた 2枚の保持フ ィルタ 1 1 によ リ保持されている。 保持フ ィルタ 1 1 の 開口度は濾過助材 9 の粒子は透過させないが、 細胞は自 由に透過させるものを選択する。
本実施例によれば、 濾過器の逆洗時に濾過助材 9充塡 層及び中空糸膜フ ィルタ 1 0 に捕捉されている細胞を、 よ リ完全に培養槽に戻すことができる。 第 3 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実施例の特徴は、 第 1 図 の実施例に老廃成分除去手段を付加した点である。 なお、 本実施例での老廃成分除去手段と しては、 限外濾過法を 用いている。
培養濾液貯槽 〗 5 には配管によ り限外濾過器 1 4 が接 続されている。 限^濾過器 1 4 には分画分子量 10， 000の 限外濾過膜が用い られており、 乳酸， アンモニア等の老 廃成分を透過し、 ホルモン等の細胞の生育に有用な物質 は透過させない。 培養瀘液はポンプ 2 3 によ り 限外濾過 器 1 4 に圧入され、 限外濾過膜と接続している間に老廃 成分等の低分子物質は膜を透過し、 老廃成分 2 6 と して 系外に排出される。
限外瀘過器 1 4で老廃成分を除去した液は老廃成分除 去液貯槽 1 3 は貯留される。 なお、 限外瀘過によ り濾過 される液量はわずかであるため、 ポンプ 2 3 によ り限外 濾過器 1 4 と老廃成分除去液貯槽の間で、 循環して濾過 を行い、 老廃成分を除去する。 通常、 老廃成分除去液を 新鮮培養液の一部と して再利用 した場合に老廃成分濃度 が、 轧酸と して 1 0 0 0 p p m 以下、 好ま し く は 1 0 0 P P m 以下、 アンモニアと して 2 0 p p m 以下好ま し く は 5 P P m 以下と なるよ う にする必要がある。
老廃成分除去液は、 ポンプ 2 1 を作動させる こ と によ リ濾過器 8 の逆 液の一部と して新鮮培養液に加えられ、 培養槽 2 に戾され、 再び細胞の増殖に利用される。 老廃 成分除去液中には、 培養瀘液.中に残存していたホルモン や生育因子等の有効成分が多量に含まれている他、 細胞 自身が分泌する生育増長因子や有用生産物も含まれてい るので、 これを用いるこ とは細胞の生育に良好な結果を 与える。
第 4図は本発明による細胞培養システム他の実施例の 構成を示したものである。
本実施例の特徵は、 第 3 図に示した実施例において、 濾過器 8 に用いた濾過助材 9 と して、 培養液比重よ り小 さい比重の粒子を用いる点にある。 濾過助材 9 と しては 中空ガラスビース、 中空カーボンビーズ等が用い られて いる。 濾過助材 9 9 は濾過器 8 の上部及び底部に設けら れた 2枚の保持フィルタ 1 1 によ り保持されている。 保 持フィルタ 1 1の開口度は濾過助材 9 の粒子を透過させ ず、 細胞を自由に透過させるものが選択されている。 そ の他は第 3図と同じである。
本実施例によれば、 瀘過器の逆洗時に濾過助材 9充¾ 層及び中空糸膜フィルタ 1 0 に捕捉されていた細胞をよ y完全に培養槽に戻すこ とができる。
第 5 図は、 本発明による細胞培養システムの他の実施 例の構成を示したものである。 本実施例の特徵は、 第 3 図に示す実施例.において、 疎 水性膜 1 0 を培養槽 2 の上層に設けたこ と、 及び撹拌機 を取付けたこ と にあ る。 本実施例における培養液の交換 は以下のよ う に実施される。 弁 3 3 を開き、 弁 3 2 を閉 じてポンプ 2 2 を作動させる と 中空糸膜の内部が減圧さ れる。 その結果、 培養液中に浮遊している細胞は中空糸 膜の表面に捕捉さ れ、 膜内には細胞を含まない培養濾液 が抜き出さ れ、 培養濾液貯槽 1 5 を貯留される 。
所定量の培養瀘液を培養槽 2 から排出 した後、 ポンプ 2 2 を停止し、 弁 3 3 を閉 じ る。 次いで弁 3 2 を開き、 ポンプ 2 0 及び 2 1 を作動させる。 ポンプ 2 0 は新鮮培 養液貯槽 1 2 よ り新鮮培溶液を、 ポンプ 2 1 は老廃成分 除去液貯槽 1 3 よ り老廃成分除去液を供耠する 。 新鮮培 養液及び老廃成分除去液は中空糸膜内に圧入さ れ、 膜面 の細孔よ り培養糟 2 内に流入する。 この際、 中空糸膜の 外面や細孔内に吸着していた細胞等の固形物を剥離し、 滤過面の再生を行う 。 疎水性膜 1 0 は膜面への細胞やご み等の附着を防止するため、 でき る だけ培養液の移動速 度の犬なる所に設ける こ と が好ま しい。 本実施例のごと く 、 撹拌翼 2 9 を設け、 その周囲に疎水性膜を設置すれ ば、 撹拌翼の回転によ り吐出さ れる培養液の流れで膜面 の固形物が滞留する こ とな く 移動する ため、 膜面への沈 積を効果的に防止する こ と ができ る。 本実施例に用いる濾過ユニッ トの形状は、 特に限定す るものではないが、 - 培養液の流動をさ またげず、 かつ細 胞に不要な外力を与えないよ う な形状である ことが望ま しい。 第 1 0 図〜第 1 3図に示した各濾過ユニッ トは、 本実施例に特に好ま しい形状である。
本実施例によれば、 濾過を培養槽中で行う ため、 瀘過 時に酸素の欠.乏ゃ温度の低下を招く ことがなくな り、 細 胞の増殖を良好に保つこ と ができ る。
第 6 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実施例の特墩は、 第 5 図 に示す実施例において、 培養液調製槽 4 1 を付加した点
I ある。
培養槽内に設けられた疎水性中空糸膜の逆洗に用い ら れる逆洗用液は、 あ らかじめ新鮮培養液及び老廃成分除 去液を、 培養液調製槽 4 1 で混合， 調製する。 培養液調 製槽 4 1 にば、 乳酸， アンモニア， たん白質の濃度を測 定する手段が付設されており、 新鮮培養液及び老廃成分 除去液の混合割合を調節する。
本実施例によれば、 細胞の増殖に好適な培養液を常に 用いて培養を行う ことができる。
第 7 図は本発明による細胞培養システムの他の実施例 の構成を示したものである。 本実旌例 φ特徵は第 s図に 示す実施例において、 老廃成分除去装置と して限外瀘過 器にかえ、 拡散透析器を用いたこ とである。
培養濾液は配管によ り 拡散透析器 4 4 に導か'れ、 ポン プ 2 3 によ り老廃成分除去液貯槽 1 3 と、 拡散透析器 4 4 の間を循環させる。
また、 低分子成分液貯槽 4 2 には、 各種ア ミ ノ酸， ビ タ ミ ン， 無機塩類， グルコース等の低分子成分を溶解 し ている低分子成分液が貯留されてお り 、 ポンプ 4 7 によ り 、 拡散透析器に送られる 。 拡散透析器 4 4 内で培養濾 液は透析膜を介して低分子成分液と接触し、 その間に透 析膜を通過 し う る低分子成分の透析が行われる。 すなわ ち、 培養濾液中に含まれた乳酸やアンモニア に代表さ れ る老廃成分が低分子成分液中に拡散する と と も に、 低分 子成分液中に溶解されている各種のア ミ ノ酸， ダルコ一 ス， 各種の無機塩類， ビタ ミ ン類が培養濾液中に拡散す る。 細胞の増殖に有益な各種のホルモン， 生長因子等の 高分子成分は透析される こ とな く そのま ま廃成分除去液 中に と どま る 。 透析は、 乳酸濃度が 1 0 0 0 p pm 以下、 好ま し く は 1 0 0 p p m 以下、 アンモニアは 2 0 p p m 以下、 好ま し く は 5 ρ ρ πι 以下となる よ う実施する 。
拡散透析によ リ老廃成分を除去した老廃成分除去液は、 ポンプ 4 6 によ り培養液調製槽 4 1 に送 られる 。 該培養 液調製槽には、 高分子成分液聍槽 4 2 か らポンプ 4 5 に よ り高分子成分液が供給され、 前記老廃成分除去液と混 合， 調整する こ と によ リ新鮮培養液となる。 高分子成分 液中には、 血清， ホルモン等透析膜を透過できない高分 子成分が溶解している。 なお、 該培地調製槽 4 2 には、 乳酸アンモニア， たん白質の濃度を測定する手段を付設 し、 その測定値をも と に高分子成分液と老廃成分除去液 との混合割合を調整する。
本実施例によれば、 常に細胞の増殖に好適な培養液を 調製するこ と ができ るので、 細胞を高濃度培養する こ と ができる。
第 1 0 図は、 第 6 図の老廃成分除去手段を吸着箇に替 えたものである。
アンモニアの吸着にはゼオライ トを、 乳酸の吸着には 乳酸デヒ ドロゲナ一ゼを不溶担体に固定して用いた。 な お、 該吸着筒は複数本設けておき、 適宜配管を切替える こと によって培養工程に影響無く吸着， 再生を行う こ と ができる。 本実施例によれば、 老廃成分のみ選択的に除 去できるので、 培養液のロスが少ない。
次に、 よ り具体的な実施例を示し説明する。
実施例 1
外径 2 mm， 内径 l mm， 細孔径 0 . 8 μ πι ， 長さ l mの テ ト ラ フルォ □エチ レ ン樹脂からなる琼水性中空糸膜
(住友電気化学工業製、 -T B - 2 1 ) のそれぞれの両末 端に、 最大外径 2 . 5 mm ， 内径 0 . 9 mm ， 長さ 3 O mmの 第 9 図に示す断面を有する SUS316製の膜拡散部材 5 2 に 挿入した。 次いで、 上記中空糸膜 4本を揃え、 内径 1 5 mm, 深さ 3 0 mmの円筒形の硬化用.型に挿入 した。 これに 2液混合硬化型のエポキシ樹脂剤 （チバガイ ギー製， ァ ラルダイ トラ ピッ ド） を、 主剤と硬化剤を混合したのち 直ちに上記の硬化用型内に注入し、 遠心分離機を用いて 1 ， 0 0 0 G の遠心力をかけ、 その間に硬化せしめた。 完全に硬化した後、 硬化用型よ り硬化物を取り だし、 そ の末端を 5 nrnに切斬した。
上記で製作した中空糸膜ユニッ トについて、 その両端 から 1 3 0 °C , ゲージ圧 1 . 8 kg Zcm2の蒸気を通じ、 1 時間保持した。 室温まで冷却した後、 中空糸膜の .1 本に ついて l kgの引っ張 り荷重をかけても中空糸膜は膜接続 部材 5 1 から抜ける こ とは無かった。
比較例 1
実施例 1 において、 中空糸膜の両端に膜拡張部材 5 2 を揷入する こ とな く エポキシ接続剤で固定し、 中空糸膜 ユニッ ト を製作した。 次いで、 その両端から 1 3 0 °C， ゲージ圧 1 . 8 kgノ cm2の蒸気を通じ、 1 時間保持した。 室温まで冷却した後、 中空糸膜の 1本について 1 kgの引 つ張り荷重をかけたと ころ中空糸膜は膜接続部材 5 1 か ら拔けて しまった。 - 実施例 2 イーグル M E M培地 （日水製薬製イーグル M E Mニッ スィ①） 9 .4 g / i2 , グルタ ミ ン 0 . 2 9 2 g Z £ ，
- 7 . 5 % 炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液 2 9 m β / β ， ダル コース 2 0 g Z J2 、 及び牛胎児血清 1 0 0 m £. Ζ β を加 えた培養液 5 m £ に、 ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C一 1 (Japan Tissue Culture Not 1 )を接種した傷平フラスコ 1 5ケを静置培養した。 培養温度は 3 7 °C， 気相ガスは 空気と した。
3 日間培養したフ ラスコの表面に讨着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 5. 1 X 1 05 個ノ ιη β の培養液 7 5 m £ を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄みを捨て、 同容量 の新鮮な培養液に懸濁した。
次に、 直径 1 1 0 mm， 長さ 1 7 1 mm， 容積 1， 2 5 0 m β のローラーボ トルに上記細胞懸濁液 7 δ m 及び上 記の新鮮な培養液 1 7 5 m fi を入れて、 3 7 C、 気相ガ スは空気、 2rPm にて 3 日間培養した。 次いで、 培養液 を遠心分離し、 上澄みを捨て同容量の新鮮な培養液に懸 濁した。 そして再び上記条件下で 3 日間培養した。 培養 液を遠心分離して上澄みを捨て、 2倍量の新鮮な培養液 に懸濁し、 それを 2倍の本数のローラーボ トルに分割し、 再び上記条件下で 3 日間培養した。
上記の操作を更に 2回繰り返し、 1 . 7 X 1 0 S個 Z πι β の種培養液 2， 0 0 0 m fl を得た。 本培養液を遠心 分離して上澄みを捨て、 同容量の新鮮な培養液に懸濁し た。 '
次に、 第 1 図に示す細胞培養システムの直径 1 6 5 mm， 高さ 3 5 0 mm, 容量 7， 0 0 0 m £ の円筒型のステン レ ス製培養槽に、 上記種細胞懸濁液 2， O O O m J2 及び培 養液 3， 0 0 0 m fi を入れて （合計 5， 0 0 0 m fi ) 3 7 °Cに保温した。 液面上 5 0 mmの高さ に表面にシラ ン系有 機珪素ポリマ （粘度 1 X 1 0 5 センチボイ ズ） を薄く 塗 布した正方形網目のステン レス網 （目 の 1辺の長さ ： 3 mm) を置き、 槽底部に配置した直径 6 0 mmリ ングスパー ジャ （孔径 l nm， 1 0ケ） から酸素含有ガスを通気して 培養した。 _酸素含有ガスの通気量は培養液の溶存酸素濃 ( D O ) が 2 . 5 ppmと なるよ う に、 空気量及び酸素量 を 自動的に調節する溶存酸素濃度調節装置によ リ調節し た。 また、 培養液の P Hが 7 . 0〜 7 . 6 の範囲となる よ う に p H調節装置によ り炭酸ガスを酸素含有ガスに加え て通気した。
培養槽の下部には配管によ リ濾過器が接続されている。 濾過器底部にはま持フィルタ ーがあ り、 親水性濾過助材 層を保持している。 親水性濾過助材層の中には疎水性中 空糸フ ィルタ ーュニッ 卜が埋没している。 疎水性中空糸 フィルタ ーユニッ トは、 第 8 図 B に示した，状に、 長さ 1 . 2 mm の疎水性中空糸膜フ ィルタ ー 4本を用いて実旅 例 1 の手法によ り作成したものである。 親水性濾過助材 と しては直径 7 0 mのガラスビーズをェチルアルコ一 ル処理によ リ親水化した.ものを用いた。
引き抜き用ペリ スタ リ ックポンプを用いて中空糸膜フ ィルター内部を減圧する こ と によ-り、 2 0 m β /min の 流速で培養濾液を引き抜いた。 培養濾液内八の細胞の混 入は全く認め られなかった。 引き抜き量が 5 0 0 m β に 達した時、 引き抜き用ペリ スタ リ ックポンプを停止した。 次いで、 中空糸膜フ ィルター逆洗用ペリ スタ リ ックポン プ及ぴ濾過助材層展開用ペリ スタ リ ックポンプを用いて 中空糸膜フィルタ ー逆洗及び濾過助材層展開を行った。
中空糸膜フィルタ 一逆洗は 8 0. m β / min の流速で 2 分間行った。 濾過助材層展開は、 中空糸膜フィルタ ー逆 洗中は O m fi Zniin 、 中空糸膜フィルタ ー逆洗終了後 は 1 5 0 m β / min の流速で行い、 引き抜き量と同量を 培養槽内に注入した時点で終了するよう に制御した。 中 空糸膜フィルタ ー逆洗及び濾過助材展開には新鮮培養液 貯槽に調製しておいた新鮮培養液を用いた。 培養液の瀘 過、 及び中空糸膜フィルター逆洗及び濾過助村層展開は、 培養槽内の培養液が 1 日あたり 1回入れ替わるよう に 1 日あた り 1 0 回実施した。
- 本実施例の結果第 I S図に示した - 培養開始 1 2 日以 後 1 X 1 07 細胞 Ζ πι β以上、 生存率 8 8 %以上を維持 できた。 最高細胞濃度は 1 .6 X I 07細胞/ m fi であつ た。
比較例 2 .
第 1 図の培養システムよ り濾過器、 中空糸膜フ ィルタ 一及び濾過助材を除いた培養システム を用いて実施例 2 と同 じ培養を行った。 その結果を第 1 7 図に示 した。 濾 過器、 中空糸膜フィルタ 一及び濾過助材を除いたこ と に よ り培養液の交換が出来ず、 栄養成分が枯渴 して細胞濃 度が 2. 1 X 1 06細胞ノ m J2 に達し たあ と急速に減少 し た。 これよ り 、 培養液の交換が不可欠である こ と がわか る。
比較例 3
第 1 図の培養システムにおいて、 酸素供給を液面通気 によ リ行う培養システム を用いて実施例 2 と 同 じ培養を 行った。 その結果を第 1 8 図に示 した。 細胞濃度は最高 5.6 X 1 06細胞 Z m fi であ り 、 生存率が徐々 に低下 し た。 この結果は細胞の増殖に必要な酸素が不足 している こ と を示している。 すなわち、 液面通気法では酸素の供 紿が充分でない こ と がわかる。
比較例 4
第 1 図の培養システムよ リ消泡層 を除いた培養シスチ 厶 を用いて実施例 2 と 同 じ培養を行った。 その結果、 培 養廃ガス管よ り泡が流出 した。 これよ り 、 液中通気によ る酸素供給を行う ためには、 培養槽内に消泡手段が必要 である こ と がわかる。
実施例 3
実施例 2の手法によ り細胞濃度 1 .8 X 1 0 s個 Zm £ の種細胞懸濁液を調製した。 次いで、 第 6図に示した細 胞培養システムによる培養を行った。 本システムの培養 槽は内容積 7， 0 0 0 πι β の SUS316製円筒型をなしてお リ、 培養液の流動を行わせるために撹拌機 2 9 を設けた。 細胞と培養液とを分離するための琼水性中空糸膜フ ィル タ一ユニッ ト 1 0 は、 第 1 3 図に示す形状を有しており 撹拌翼の回転面の周囲に設けた。 なお、 竦水性中空糸膜 フィルタ 一ユニッ トは、 長さ 1 . 5 m の実施例 1で用い たものと同じ中空糸膜フィルタ一を 4本用いて作成した。 酸素供給手段， 消泡手段及び培養条件は実施例 2 と同じ と した。
培養樽に上記種細胞懸濁液 2， 0 0 0 m β 及び実施例 2 と同じ培養液 3 , 0 0 0 m fi を入れて （合計 5 , 0 0 0 m fl ) 、 3 7 °Cに保温した。 培養開始後 2 日間は回分培 養を行い、 3 日 目よ り培養液の交換を実施した。 中空糸 膜フィルタ一の内部をペリ スタ リ ックポンプを用いて減 圧し、 1 0 m ΰ / m.in の流速で培養濾液を引きぬいた。 培養濾液中への細胞の混入は全く 認め られなかった。 引 きぬき量が 5 0 0 m β に達したと き、 引きぬき用べリ ス タ リ ックポンプを停止 した。 次いで、 中空糸膜フ ィルタ -—逆洗用ペ リ スタ リ ッ クポンプによ り新鮮な培養液を 2 0 0 m β / min の流速で中空糸膜フィルタ ー 1 0内に 圧入 し、 中空糸膜フィルタ 一 1 0の逆洗を行った。 逆洗 に用いた培養液は、 イ ーグル M E M培地 9.4 g / β , グルタ ミ ン 0.2 9 2 g Z J2 ， 7.5 %炭酸水素ナ ト リ ウ ム水溶液 2 9 m £、 及び牛胎児血清 5 0 ιη β / β の組成 からな り 、 新鮮培養液貯槽 1 2に貯留 した。 逆洗は培養 瀘液引き ぬき量と 同量を培養槽に注入 した時点で終了す る よ う に制御 した。 滤過及び逆洗は、 培養糟内の培養液 が 1 日 に 1回入れ替る よ う に、 1 日 あた り 1 0回実施し た。
引 きぬいた培養瀘液は培養濾液貯槽 1 5 に貯留 した。 そののち、 限外濾過器 1 4 によ り老廃成分を含む低分子 成分を濾過し、 高分子成分を濃縮して老廃成分除去液貯 槽 1 3に貯留 した。 老廃成分除去液の容積が培養濾液の
1 / 1 0になる まで、 限外濾過器 1 4 と老廃成分除去液 貯槽 1 3の間をペ リ スタ リ ックポンプによ り循環 した。 限外濾過膜は分画分子量 1 0 , 0 0 0 のも の を用いた。
培養開始後 8 日 目 よ り 、 培養液調製槽において、 新鮮 培養液 9 Ο Ο ιη に対し老廃成分除去液を 1 ( Ο ιη β の 割合で混合 し、 これを中空糸膜フ ィルタ 一 1 0の逆洗に 用いた。 培養開始後 1 8 日 目 よ り、 培養槽内の培養液が 1 日 に 2回入れ替るよう に、 濾過、 及び逆洗の回数を 1 日あた ϋ 2 0 回に増加した。
本実施例の結果を第 1 9 図に示した。 限外濾過によ リ 老廃成分を除去した結果、 実施例 2での場合に比べ乳酸 及びアンモニアの濃度が低下している。 空に最高細胞濃 度が 2 . 8 X 1 07個 Z m β に達しており、 本実施例の効 果が認め られる。
実施例 4
実施例 2 の丰法によ り細胞濃度 1 . 1 X 1 06個 Ζ πι β の種細胞懸濁液を調製した。 次いで、 第 7 図に示した細 胞培養シ テムによ る培養を行った。 本システムは実施 例 3 にて使用 した第 6 図に示す培養システムの老廃成分 除去手段のみを拡散透析 4 4に替えたものである。 酸素 供給手段， 消泡手段， 培養液交換手段及び培養条件ば実 施例 3 と同 じ と した。
培養槽に上記種細胞懸濁液 2， 0 0 0 in β 及び実施例 2 と同じ培養液 3， 0 0 0 πι β を入れて （合計 5， 0 0 0 m β ) 、 3 7 でに保温した。 培養開始後 2 日間は回分培 養を行い、 3 日 目 よ り培養液の交換を実施した。 中空糸 膜フィルタ 一 1 0 の内部をペリスタ リ ックポンプを用い て減圧し、 1 5 m β /min の流速で培養瀘液を引きぬき、 培養滤液貯槽 1 5 に貯留した。 培養濾液中への細胞の混 入は全く認め られなかった。 引きぬき量が 5 0 0 m J2 に 達したと き、 引きぬき用ペリ スタ リ ックポンプを停止し た。 - 培養濾液貯槽 1 5 よ り培養滤液をぺリ スタ リ ックポン プで拡散透析器 4 4 に送液し、 老廃成分を含む低分子成 分を拡散透析によ り除去した。 拡散透析膜と しては、 分 子量 6， 0 0 0 以下の物質を透過し、 それ以上の物質を 透過させないものを用いた。 拡散透析では、 対称液と し て、 イ ーグル M E M培地 9 . 4 g / β ， グルタ ミ ン 0 . 29 2 g / J2 , 7 . 5 % 炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液 2 9 m £ / β 、 及ぴグルコース 2 0 g / J からなる低分子成分液を 用い、 培養濾液に対し 2倍の流量を瑋じて行った。 老廃 成分を含む低分子成分を除去した老廃成分除去液は老廃 成分除去貯槽に貯留 した。
培養液調製槽において、 老廃成分除去液に牛胎児血清 を 1 。/。になるよ う に加えた。 これを中空糸膜フィルター 1 0 にペ リ スタ リ ックポンプによ り 2 0 0 m J2 / min の 流速で圧入し、 中空糸膜フィルタ ー 1 0 の逆洗を行った。 逆洗は.培養濾液引きぬき量と同量を培養槽に注入した時 点で終了するよ う に制御した。 濾過及び逆洗は、 培養槽 内の培養液が 1 日 に 3 回入れ替るよ う に、 1 日 あた り 3 0 回実施した。
本実施例の結果を第 2 図に示した。 拡散透析にょ リ老 廃成分の除去を行ったこ と によ リ、 乳酸及ぴアンモニア の濃度を低くする こ と ができ、 その結果、 最高細胞濃度 が 3 . 0 X 1 07個 Z m β に達した。
比較例 5
第 1 図に示す培養装置において、 疎水性濾過膜に替え て親水性濾過膜 （アミ コン製， ダイアフ ロ一ホ ローファ ィバーシステム， D H— 1 ， 中空糸膜 ： H I M P 0 1 — 4 3 , 孔径 O . l m)を用いて、 実施例 2 と同様にして 細胞培養を行った。
その結果、 濾過膜の逆洗を行ったが、 濾過流量が急速 に減少し、 培養開始から 6 日 目で目詰 リ を起こし、 その ため培養を継続する ことができなかった。
実施例 5
ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C 一 1 (Japan tissue culture ¾ 1株） を下記培地 5 m S を分注した扁平フ ラ スコ 1 5ケを静置培養した。
培養温度は 3 7 °C、 気相ガス組成は .5 %炭酸ガス混合 空気と した。
培地組成
グルコース 1 0 0 0 m g / JS グルタ ミ ン 2 0 0 " ァスパラ ギン酸 1 0 0 '·' ダルタ ミ ン酸 5 0 ！! グ リ シン 1 0 m ァ ラ ニン 1 0
ロ イ シン 2 0
イ ソ ロ イ シン 2 0
バ リ ン 1 5 it アルギニン 1 0 m g シスチン 1 〇 II シスラ イ ン 1 0 I! セ リ ン 2 〇
ス レ才ニン 1 5
リ ジン 1 0
メチォニン 1 0
ク ェン酸ソ ーダ 2 5
クェン酸 1 0
α —ケ ト グルタ ール類 1 5
ピオチン 0 . 1
サイ ア ミ ン 〇 . 1
ピ リ ドキサ一ル 0 . 0 1
ニコチン酸 . 0 . 0 1
リボフ ラ ビン 0 . 0 2
イ ノ シ トール 0 , 1
ビタ ミ ン B i 2 0 . 0 0 1
ダルタ チオン 1 塩化ナ ト リ ウム 5 0 m g 塩化カ リ ウム 5 0
塩化マグネシウム 1 0 '
塩化カルシウ ム 1 0
塩ィヒマンガン 0 . 0 1
炭水素ナ ト リ ウム 1 0
牛胎児血清 1 0 0 m β
Ρ Η 7 .0 計 1 β
3 日間培養したフラスコ の表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 1-X 1 05細胞 β の種培養液 7 5 m β を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄をすて、 同容 量の液体培地に懸濁した。—
次に、 直径 7 0 mm, 高さ 3 9 0 mm, 容量 I S O O m fi の P3筒形のガラス製培養槽に上記種細胞懸濁液 7 5 m β 液体培地 7 2 δ m β ， 牛胎児の血清 1 Ο ιη β を入れて
(合計 9 0 0 πι β ) 、 3 7。Cに保温した。 液面上 1 0 mm の高さに表面にシラン系有機けい素ポリマと してポリ シ ロ キサン （信越化学製 H I V A C — G、 粘度 1 X 1 0 ε センチボイ ズ） を薄く塗布した 正方形網目のスチン レ ス網 （目の 1片の長さ ： 5 mm) をおき、 槽 2底部に配置 した内径 1 mmの単孔ノ ズル 4 から無菌空気を 0 . 2 cm Z sec の速度で通気しつつ、 5 日間培養した。 0 . 2 cmZ sec の通気速度での酸素移動測定は 7 m mo β e O 2/ β • hであった。 この結果、 細胞濃度は 6 X 1 0 S ケ / m β に達した。 この際に生成したア ンモニア濃度は 4 0 PPDi 、 乳酸は 1 1 0 O ppm であった。 溶存酸素濃度は培 養期間中 2〜 5 ppm を維持した。 培養中に発生する気泡 は消泡層 5 に接触し円滑に破泡し、 培養の全期間を通し 消泡層上面から槽気相部に溢流する こ と はなかった。 実施例 6
ラッ ト肝臓の癌細胞株 J T C一 1 (Japan tissue culture No. 1株） を下記培地 5 m β を分注した S平ブ ラ スコ 1 5 ケ を静置培用 した。 培養温度は 3 7 °C、 気相ガ ス組成は 5 %混 （ V— V ) 添加と した。
培地組成
ダリ コ ース 2 0 0 0 m
アルギニン塩酸塩 1 2 6
シスチン 2 4
グルタ ミ ン 2 9 2
ヒ スチジン塩酸塩 4 2
イ ソ ロ イ シ ン 5 2
ロ イ シン 5 2
リ ジン塩酸塩 7 3
メチォニン 1 5
フエ二ルァ ラ ニン 3 2
ス レオニン 4 8 ト レプ 卜 ファン 1 0 m g / β チ口シン 3 6
バ リ ン 4 6
チア ミ ン 1 . 0
レボフ ラ ビン 0 . 1
ビリ ドキサール 1 . 0
パン 卜テン酸 1 . 0
ニコチン酸 1 .0
ピオチン 0 . 0 2
コ リ ン塩酸塩 1 . 8
1 . 0
イ ノ シ 卜一ル 2 . 0
塩化ナ ト リ ウム 8 0 0 0
塩化カ リ ウム 、 2 0 0
りん酸水素 2ナ ト リ ウム · 1 2和物
2 0 0
牛胎児血清 . 1 X 1 05
Ρ Η 7 . 0 計 1 β
3 日間培養したフ ラスコ の表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 2 1 X 1 05細胞 Ζ πι β の種培養液 7 5 πι β を得た。 本培養液を遠心分離し、 上澄を—すて、 同容 量の液体培地に懸濁した。
先に、 直径 7 0 mm， 高さ 3 9 0 mni， 容量 1 5 Q O m J の 円筒形のガラ ス製培養槽に上記種細胞懸濁液 7 5 m β ， 液体培地 7 2 5 m J2 ， 牛胎児の血清 1 0 m J2 を入れて
(合計 9 0 0 m fi ) 、 3 7 °Cに保温 した。 液面上 0 . 5 の高さ にポリ シ ロ キサン（信越化学製 H I V A C — G ) を塗布 した高さ 5 mmのポリ エチ レ ン製ハニカ ムの消泡層 5 (正六角形穴の一辺 mm) を配置した。 槽底部に配置 し たガラス製多孔質ノ ズル 4 から滅菌処理空気を平均泡径 2 mmの泡径で通気速度 0 . 2 cm secで通気して、 5 日間 培養 した。 この際の培養液の表面張力は S 5 dynZcm2で 培養液液滴と撥水材と の接触角は 9 0 ° であった。 また、 上記通気での酸素移動速度は 7 m mo J2 e 02 ΰ · で あった。 その結果、 細胞濃度は 5 . 2 X 1 0 sケ / m β に 達した。 この際に生成したアンモニアの濃度は 3 5 ppm 、 乳酸は 1 0 5 0 ppra であった。 溶存酸素濃度は培養期間 中 2 〜 5 pPm を維持した。 培養中に発生する液面上の気 泡は消泡層 5で完全に消泡さ れた。
実施例 7
消泡層のみ異なるもの を用い、 その他の培養槽及び培 養条件を同一に して次の試験を行った。 消泡層 5 は、 正 方形網目 のステン レス網 （目 の一片 ： 8 ram) を骨格と し、 これにポ リ ウ レ タ ン樹脂を付着 せて、 目 の一片 を 5 mm に してから、 ポリ シ ロ キサン （ 2 X 1 0 3セ ンチポィ ズ） を 5 %含浸 したもの を用いた。 槽底部に配置したガラス製多孔質ノズル 4 から滅菌処 理空気を平均泡径 2 mmで、 通気速度 0 . 2 mmZsecで通気 し、 5 日間培養した。
この際の培養液液滴と撥水材と の接触角は 8 5 ° であ つた。 また、 上記通気での酸素移動速度は 7 m mo β e O 2 β · h であった。 この際に生成したアンモニアの 濃度は 3 6 ρρπι， 乳酸は 1 0 4 0 ppm であった。 溶存酸 素濃度は培養期間中で 6 ppm を維持し、 かつ培養中に発 生する液面上の気泡は消泡層 5下面で完全に消泡された。 5 日間培養後の細胞濃度は 5 . 1 X 1 0 sケ Z m に達し た。 ノ
比鲛例 6
実施例 6 の液中通気方式に対し、 液面通気方式で培養 した。
実施例 6 と同形同容量の培養槽を用意し、 消泡層 5及 び液中通気ノズル 4 を取り はずし、 代り に気相部に液面 に平行して通気配管と排気配管を相対して設置した。 同 一細胞株を同じ要領で種培養した種培養液を同容量、 同 じロッ トの液体培地及び血清を-同じ容量比で入れ、 同じ 通気量にて 3 日間培養した。 この際の酸素移動速度は 0 . 3 m mo β e 〇 2/ ^ · 1ιであった。 また、 溶存酸素濃 度は培養 1 日 目は 0〜 0 . 2 ppm、 3 日 目以降は 8 PRIU で あった。 細胞濃度は 0 . 9 X 1 0 sケノ m £ であった。 本 . 比較例 6 は、 従来技術の一例であ り、 液面通気方式では 細胞増殖に必要な溶存酸素を十分に供給できず、 細胞濃 度は実施例 6 に比べ約 6分の 1 にと どまった。
比較例 7
実施例 6 に於て、 消泡層 5 と して用いるポリ エチレン 製ハニカム層にオ リ一ブ油 （粘度 2 2 センチボイズ） を 塗布したものを用いた。 培養液との接触角は 2 5 ° であ つた。 液中通気によ り生成した泡は消泡層と接蝕し、 3 時間目 までは消泡効果を示したが、 それ以降は消泡効果 を失い、 気泡が消泡層を こえ槽上部の排気口 2 4 から溢 流し運転不能となった。 またオ リ ーブ油が培養液表面に 油膜と して拡散する こ と を観察した。
上記比較例に示すよ う に低粘度の撥水剤と培養液と の 直接接触による消泡は短期間は有効であるが長期間、 効 果を持続する こ とが困難である。
実施例 8 〜 1 5
実施例 6で用いた株化動物細胞を同一組成の液体培地 を用いて培養した。 培養槽 2 と して、 直径 1 5 cm高さ 3 O cjnのガラス製を用い、 槽内底部から高さ 1 O c mの位 置に底面と平行して表に記す各種の消泡層 5 を設置した。 さ らに槽底部には直径 1 0 c mの リ ングスパージャ （孔径 1 mm , 孔数 1 2ケ） を配置し第 1表に示す所定の通気量 で炭酸ガスを 5 % ( V - V ) 富化した無菌空気を通した。 温度は外部ジャケッ トによ リ 3 0 °Cに自動調整した。 培 養期間は 4 日 と し、 その間消泡層の消泡効果及び圧力損 失数の培養期間中における細胞の最高到達濃度を測定し た。 その結果を第 1表内に併記した。 いずれも交カ果的に 消泡できる。
伹し、 実施例 8 における r = 0 . 5 mm のよう に、 消泡 層の孔怪が小さすぎる と圧損が大き く なる。
第 1. 表
Figure imgf000053_0001
第 2 表
Figure imgf000054_0001
比較例 8
実施例 8 と同形の培養槽を用い、 消泡層 5 のみ異なる 構造のものを用いる以外は同一条件で培養した。 消泡層 5 は直径 1 mm長さ 5 cmのスチン レス線を平面上直角に十 字に溶接したものを用い、 交点を槽平断面の中心部に位 置するよ う にした。 すなわち半径 5 O mm内角 9 0 °Cの円 弧状の穴を持つ消泡槽を用いた。 通気量を 0 . 〇 1 cm .ノ s ec の時点では消泡できたが、 0 . 1 cm Z secでは、 泡が 破砕しないう ちに円弧状六をショー トパス し、 培養槽上 部の排気口 2 4 から溢流し運転不能となった。 上記比較 例は消泡層 5 の孔怪'が大きすぎる と消'泡効果が低下する こ と を示している。
実施例 1 S
He fi a細胞 （人子宫ガン細胞） を実施例 6 と同一培地 1 0 O m fi の入った 5 0 Ο πι β ガラス製回転培養ビン に 5 X 1 04cell/ m β に接種し、 3 7 °C， 回転速度 1 0 rpDi で 3 日間培養した。 気相ガスは空気と した。
上記の培養した培養ビンの表面に付着した細胞を剥離 し、 細胞濃度 1 . 1'X 1 05細胞 Z m. ώ の種培養液 1 〇 0 m & を得た。
次に、 直径 1 0 4 mm， 高さ 1 6 4 mm， 容量 1 5 0 0 m & の円筒形のガラス製培養槽 2 に上記種細胞懸濁液 1 0 0 m β , 液体培地 7 0 5 m fi 、 子牛血清 9 0 m β を 入れて （合計 9 0 0 m β ) 、 3 7 °Cに保温した。 液面上 5 mmの高さ に格子間隔 3 ramのステア リ ン酸塗布テフロン 製の第 1段消泡層、 さ らに 3 mm上に上記格子と同仕様の 格子を直角方向に配置し第 2段消泡層と した。 槽底部に 配置したガラス製多孔質ノズル 4 から滅菌処理空気を平 均泡怪 1 . 5 mffl の泡径で、 通気速度 0 . 3 cmZsecで通気 して、 5 日間培養した。 この際の培養液の表面張力は 5 dynZcm2で培養液液滴と撥水材と の接蝕角は 8 5。 であ つた。 また上記通気での酸素移動速度は 7 m mo β e 02 / β · hであった。
その結果、 細胞濃度は 4 . 2 X I 0 sケ πι β に達した この際に生成したアンモニアの濃度は 2 9 ppm 、 乳酸は 9 0 0 ppm であった。 溶存酸素濃度は培養期間中 2〜 5 PPm を維持した。 培養中に発生する気泡は 2段に設けた 消泡層 5で完全に消泡された。
実施例 1 7
下記組成の液体培地 1 5 0 & を 5 0 G' m fi坂ロフ ラ スコ 2 0本に分注した。
大豆抽出液 （大豆 1 0 0 g に水 9 0 0 πι β を添加し、 1 2 0 °C， 3 0分加熱抽出して濾過して得られる液）
9 8 7 g
ぺプ 卜 ン 1 0 g
り ん酸第 2 カ リ ウム 2 g 硫酸マ グネシ ウ ム · 7水和物 0 . 5 g
塩化カルシ ウ ム 0 . 5 g
塩化ナ ト リ ウム 0 . 5 g
P H 7 . 0
各フ ラ スコ に寒天ゲル斜面培地入 り試験管で好気的に 静置培養したバチルス · ズブチ リ ス （枯草細胞） の菌体 を 1 . 1 X 1 06cells/ m J2 の濃度に接種し、 振幅 7 cm, 1 2 0 strokes で好気的に振盪培養した。 本培養液を前 培養液と し、 以下の本培養に用いた。
前記組成の液体培地 2 . 5 2 を内径 1 6 cm， 高さ 2 5 cmの培養槽 2 に入れ、 1 2 0 °C , 2 0分間スチーム滅菌 した。 培養槽と しては、 液面から 1 cm上部にジメチルポ リ シ 口 キサン （粘度 1 X 1 0 5 セ ンチボイ ズ） を塗布し た直径 1 6 cm , 厚さ 0 . 5 mm のステ ン レ ス製多孔扳 （孔 径 3 mm , 開口比 5 0 % ) を消泡層 5 と してな らびに槽底 部に リ ングスパージャ （孔径 1 nm， 孔数 1 2ケ） と貝型 撹拌翼を設けたものを用いた。
培養は下記の条件下で行った。
通 気 量 ： 0 . 2 m Zsec、 この と き の酸素移動速度は
1 0 m mo ώ e O z / ΰ. · hであった。
温 度 ： 3 5 0 °C
P H : 7 . 0 に自動コ ン ト ロ ーノレ（中和剤 4NNa0n ) 撹拌坯度 ： 5 0 rpm 培養初期には少量しか発泡しないが培養 8時間以降で 多量の泡が発生した。 しかし、 発生する泡は消泡層 5 に よ リ容易に破砕し、 消泡層の上部に溢流する こ とはなか つた。
培養による増殖状態を第 3表に示した。
第 3
Figure imgf000058_0001
比較例 8
実施例 1 7 に用いた培養槽の消泡層 5 を敢リ はずした 以外は実施例 9 と同じ条件下で培養を開始した。
しかし、 通気量 0 . 2 cm Z secで通気を開始し 8時間後 に液面上に泡が多量に発生し、 数秒後に培養槽排気口 2 4 よ り溢流扰態となつたため、 運転不能とな リ培養を 中止した。 .
比較例 9
実施例 1 7で用いた培養槽の消泡層を取り はずし気相 部に直径 5 c m， 輻 1 cmの消泡用翼をと りつけて 5 0 0 rp m で^転する以外は、 実施例 8 と同じ条件で培養を開 始した。
しかし、 通気量 0 . 2 cm /secで通気を開始する と液面 上に泡が発生し、 数秒後に培養槽排気口 2 4 よ り溢流状 態となつたため、 運転不能とな り培養を中止した。
比較例 1 0
比較例 9 に於て、 通気量を回転消泡用翼による消泡効 果の限界通気量である 0 . 0 1 cm /secで通気しながら培 養した。 上記通気量での酸素移動速度は 0 . 0 2 m mo J2 e 〇 2 β · hであった。 培養中の溶存酸素濃度は電極法で 測定した結果、 O ppm であった。 培養による増殖状態を 第 4表に示した。
第 4 表
Figure imgf000059_0001
以上の様に従来公知の液面通気と回転翼によ る _機械的 消泡方法では液面に残る気泡が酵素の液中への溶解をさ またげるため、 菌の増殖が実施例 1 7 に比べ約 6分の 1 と低い。
実施例 1 8 2 β のガラス製培養槽 （直径 7 cm X高さ 5 2 cm) に下 記 1 Δ の液体培地を加え、 ク ロ レ ラ · ヒ レ ノイ ドザを 1 X 1 05cells/ m β の濃度に接種した。 培養槽側面に蛍 光-灯を設置し、 槽内壁面の照度を 5 X 1 03 ルク スと し た。 温度は外部ジャケッ トによ り 3 0 °Cに調節した。 培 養槽内の液面上 1 cmの位置にジメチルポリ シラン （粘度 7 X 1 05cPs) を含浸したポリ ブタ ジエン製の網 （孔形 ： 正方形 5 X 5 mm) を設置した。 さ らに槽底部にはリ ン ダスパージヤー （直径 5cm， 孔径 1 ， 孔数 8ケ） を設 置し、 炭酸ガスを 5 % ( V - V ) 富化した空気を 0 . 1 cm/ sec で通' し 7:
酵母ェキス 1 g
麦芽ェキス 1 ε
肝臓ェキス g
ペプ ト ン 0 ， 3 g
グリ コース 0 . 3 g
デキス ト リ ン 2 g
硝酸カ リ ウム 2 g
硝酸マグネシウム ' 7水和物 0 .5 g
リ ン酸第 1 カ リ ウム 0 ， 0 s
硝酸第 1鉄 0 . 0 0 5 g
P H 7. 0
液面上には培養初期には少量しか発生せず消泡層で十 分破泡する こ と ができ る。 培養 5時間以降では液面上に 多量の泡が発生するが、 消泡層 5 によ り効果的に铍泡す る こ と ができ、 培養全期間中泡が消泡層を越えて溢流す る こ と はなかった。
培養による増殖状態を第 5表に示した。
第 5 表
Figure imgf000061_0001
比較例 1 1
実施例 1 8で用いた培養槽の消泡層を取り はずした以 外は実施例 1 8 と同じ条件下で培養を開始した。
しかし、 通気量 0 . 1 c m Z s e cで通気を開始した。 培養 1 2時間目 までは液面上に発生した気泡が自然に破泡 し たが、 1 3時間 目 には培養槽の気相部分に泡が充満し、 培養槽上部の排気口 2 4 よ り溢流し、 排気口に接続 した無菌フィルタ が細胞によ り閉塞したため、 運転不能 とな り、 培養を中止した。 〔産業上の利用可能性〕
本発明によれば、 培養液を疎水性膜を用いて濾過する ことによ り、 流体の剪断力による細 ½の損傷や膜の目詰 り を招く ことなしに細胞を含まない培養濾液を抜き出す こ とができる。 これによ り 、 培養槽内の培養液交換を効 率よ く行う ことができ、 長期間安定して高濃度の細胞を 培養できるので、 イ ンシュリ ン等の製造に極めて有用で あ
また、 従来困難とされてきた消泡を効果的に行う こ と ができるので、 液中通気方式による酸素供給が可能とな リ、 酸素の高効率活用ができるため、 従来の液面通気方 式に比べ酸素の消費量を 1 Z 1 0〜 1 Ζ 5 0 に低減でき る。 さ らに発泡性の高い血清等を用いた培養液に対して も 5倍以上の酸素を供給する ことができ、 培養効率を高 めること ができるので、 量産化に有効である。

Claims

請求の範囲
. 生物の細胞を液俸培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて瀘過して取 り 出 し、 新しい培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が疎水性濾過膜 であ り、 該瀘過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を 特徴とする細胞培養方法。
. 生物の細胞を液体培養しながら培養液の一部を濾過 膜を用いて濾過して取 り 出 し、 新し い培養液を補給す る細胞培養方法において、 上記濾過膜が琼水性濾過膜 の表面に親水性濾過助材層を有するプレ コ ー ト膜であ リ 、 該濾過膜は間欠的に培養液で逆洗する こ と を特徴 とする細胞培養方法。
. 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が 1 本以 上の中空糸膜である こ と を特徴とする細胞培養方法。 . 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜が培養液 の液滴との接触角が 8 0度以上の素材で形成されてい る こ と を特徴とする細胞培養方法。
. 請求項 1 または 2 において、 疎水性瀘過膜の瀘過孔 を培養液で充塡 してか _ら濾過を行う こ と を特徵とする 細胞培養方法。
. 請求項 1 または 2 において、 疎水性濾過膜の限界圧 以上で逆洗する こ と を特徴とする細胞培養方法。
. 請求項 ： I または 2 において、 辣水性濾過膜を逆洗す る培養液が、 濾過した培養液から老廃成分を除去した 培養液であるこ と を特徵とする細胞培養方法。
. 請求項 1 または 2において、 濾過し.た培養液中の老 廃成分を老廃成分除去手段によ り除去し、 該老廃成分 除去液を疎水性濾過膜の逆洗用液の一部または全部と して用いる こと を特徴とする細胞培養方法。
. 請求項 8 において、 老廃成分除去手段が拡散透析法、 限并瀘過法または精密濾過法であること を特徵とする 細胞培養方法。 ―
. 請求項 1 または 2 において、 培養液中に撹拌翼を設 け、 該撹拌翼の回転面の周囲に琼水性濾過膜を設けた こと を特徴とする細胞培養方法。
. 請求項 1 または 2 において、 培養によ り生成する培 養液の泡沫を、 培養液面上に配置した撥水性消泡層と 接触させるこ とによ り、 該泡沬を破泡しながら培養を 行う こと を特徵とする細胞培養方法。
. 請求項 1 1 において、 該消泡層の表面が、 培養液の 液滴との接触角が 3 0度以上の撥水性を有する こと を 特徵とする細胞培養方法。
. 請求項 1 1 において、 少な く とも消泡層表面に形成 された撥水性材料が有機けい素高分子であることを特 徴とする細胞培養方法。
. 請求項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り、 その 開口比が 5 0 %以上である こ と を特徴とする細胞培養 方法。
15 . 請求項 1 1 において、 消泡層が多孔性であ り 、 その 孔の大き さ が 2 〜 5 0 mmである こ と を特徵とする細胞 培養方法。
1 6 . 請求項 1 0 において、 消泡層が、 粘度が 1 X 1 0 4 センチボイ ズ以上の撥水剤を基材に塗布または含浸さ れたものである こ と を特徵とする細胞培養方法。
1 7 . 請求項 2 において、 親水性濾過助材が細胞の沈降速 度よ リ大なる沈降速度を有する こ と を特徵とする細胞 培養方法。
1 8 . 請求項 2 において、 濾過膜を収納する濾過器を培養 槽と配管で連結して培養槽の外部に設け、 疎水性濾過 膜を濾過器内の上部に配置し、 密度が培養液の密度よ リ も小さ い親水性濾過助材を用いる こ と を特徴とする 細胞培養方法。
1 9 . 培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性滤過膜からなる培養液濾過手段を介 して設け られ、 かつ、 該疎水性瀘過膜が培養液によ り 逆洗でき る手段 を有する生物細胞の液体培養装置。
20 . 培養細胞に対する有用ガスの供給手段、 培養液の供 給手段、 老廃培養液の排出手段を有する生物細胞の液 体培養装置において、 上記老廃培養液の排出手段が疎 水性瀘過膜からなる培養液濾過手段を介して設けられ、 該疎水性濾過膜が培養液によ り逆洗できる手段を備え、 かつ、 培養液表面上に消泡手段を有する生物細胞の液 体培養装置。
. 請求項 1 9 または 2 0 において、 培養液濾過手段が 疎水性中空糸膜の表面に親水性'瀘過助材層を有するプ レコー ト膜から成るこ と を特徵とする生物細胞の液体 . 疎水性中空糸膜の雨端に、 外径が中空糸膜の内径よ リ大で、 その先端部において中空糸膜に揷入可能な外 怪を有するよう に勾配を持たせて成形され、 かつ、 該 中空糸膜の離脱防止のための突起部分が設けられた膜 拡張部材が揷入されており、 該揷入部が接続部に固定 され、 該接続部を介して配管と連結し得るよう にした こ と を特徵とする生物細胞分離用濾過器。
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