JPH04325083A - 細胞培養槽 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞の高密度培養にお
いて、培養液中に高濃度に酸素を供給することが可能で
あり、酸素供給と攪拌に伴う泡を消泡し、かつ連続的に
培養液回収が可能な細胞培養槽に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞の高密度培養とは、一般に培養液１
ｍｌ当りに１０６　〜１０８　個の細胞を培養すること
をさす。細胞、ことに動物細胞をこのような高密度で培
養するためには、細胞の生育に必要な、栄養成分の供給
と、増殖によって生産される物質や老廃物の除去と、高
密度培養時に消費される酸素（Ｏ２　）の速やかな供給
が必要である。栄養成分の供給と老廃物の除去は、新鮮
培地の連続供給と回収により、容易に達成され得るが、
高密度細胞の培養に必要な高濃度酸素の供給は非常に困
難であった。通常は、培養槽中に酸素若しくは空気を直
接曝気する方法が採用される。しかし、これは気体から
溶液への溶解速度が遅いため、必要とするだけの酸素が
培養に充分供給されず、また、酸素供給量を増やした場
合には、培養液の発泡が問題であった。このため、溶解
速度を向上させるため、攪拌を行なうことが提案されて
いる。しかし、この方法は、攪拌による発泡と、剪断力
による細胞の障害が問題とされている。特に、動物細胞
の培養においては、剪断力による細胞の障害が大きい。 このため、特開昭６３−１７７７８０号公報に開示され
るように、曝気のための特定の領域を設け、かつ、逆回
転する羽根車を用いた装置や、特開昭６０−２３４５８
０号公報に開示されるように半透膜を介し、酸素を供給
する装置や、特開昭６２−５００３５７号公報に開示さ
れたホローファイバーを用いる装置などが提案されてい
る。又特開昭６３−１４６８７号公報には、培養槽外で
培養液に酸素を溶解させる装置をそなえた培養槽や、特
開昭６１−２５７１８１号公報にはホローファイバーに
より、ガス交換と老廃物の交換を同時に行う培養方法が
開示されている。しかし、以上のものでは動物細胞の高
密度培養装置としては必ずしも満足のゆくものではない
。特に酸素供給量の不足や、細胞と培養液の分離など解
決しなければならない問題点は多い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、細胞の
高密度培養に適する装置として、特開平１−１７４３７
６号公報に開示した装置を提案した。この装置は、これ
までの装置の欠点であった、酸素の供給と培養液の灌流
を効率よく行ないうるものである。しかし、まだより高
密度の細胞培養を行うためには、培養中に高濃度に酸素
を溶解させる必要がある。しかるに前記提案の酸素溶解
用の攪拌羽根（１３）は、培養槽（１４）の攪拌羽根（
１２）の回転シャフト（１１）に直接連結する構造〔図
７〕となっており、したがって高速回転が困難であり、
また、培養液の攪拌による発泡が問題であった。以上の
ことから、本発明においては、培養槽の一部に、培養液
および、培養細胞の生産する蛋白質は透過するが、細胞
の接着担体は透過しないフィルターによって隔離される
領域を設け、この内部で酸素Ｏ２　を高濃度に溶解させ
ることができ、かつ消泡作用を有しており、培養液のみ
を回収できる機能を有する培養槽を提供することを目的
とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は以上のような目
的を達成するため、次のような細胞培養槽を提供するも
のである。すなわち、細胞培養槽の一部に培養液および
培養細胞の生産する蛋白質は透過するが、細胞又は細胞
の接着担体は透過しないフィルターによって隔離される
領域を設け、この領域の底部に酸素又は空気を供給する
導管を設置し、この導管の噴出ノズル直上に高速回転す
る攪拌羽根を設け、又フィルターの高さの３０〜５０％
は細胞培養槽内の気相部分に露出していて、領域内の液
面直下に培養液回収用の導管ノズルを有することを特徴
とする細胞培養槽であり、領域の上面部は気相に対し開
放されており、領域の液面上に高速回転する消泡羽根を
設けてなる細胞培養槽である。更に細胞又は細胞の接着
担体は通過しないフィルターによって隔離された領域内
の発生した泡によって低下した攪拌領域内の液面を上昇
せしめるための培養槽気相部分に開口した滅菌空気通気
管を設け、これによって前記領域内の泡をフィルターを
介して培養槽中に押し出させ消泡せしめることを可能と
した細胞培養槽である。ところで本発明は、浮遊性の細
胞若しくはマイクロキャリアによる細胞培養に適する装
置である。細胞培養槽は、通常の浮遊培養に適したもの
であればどのようなものでも使用できるが、通常は、低
速攪拌培養槽が好ましい。この培養槽内に１ないし数個
、細胞もしくは細胞付着性担体を通過しないフィルター
で隔離された領域をもうける。この領域を以下便宜上、
気液混合室と呼ぶ。フィルターは、浮遊性細胞の場合、
セラミックフィルターなどが適する。マイクロキャリア
の場合は、５０〜１５０メッシュのステンレスフィルタ
ーが適するが、これ以外の材質も使用可能である。 フィルターは、ポアサイズ、メッシュサイズの異なるも
のを多層に重ねたものでも良いし、さらに、培養液の灌
流に伴って、細胞が付着し、目詰まりを生じさせるのを
防止するため振動、もしくは回転させることも可能であ
る。気液混合室は、細胞密度の増加にあわせ、増加させ
ることで培養液への酸素供給をすみやかに、かつ高濃度
に行うことができる。培養槽の気相部分に、気液混合室
の高さの３０〜５０％が露出されていることが透液がす
みやかに行われて、消泡上重要であり、必要に応じて、
この部分のフィルターをより大きなメッシュサイズ、ポ
アサイズの材質とすることも消泡上効果がある。気液混
合室には、底部に酸素もしくは空気を供給する導管を配
し、導管ノズル上に１００〜５００ｒｐｍの回転数を有
する攪拌羽根を設置し、高速攪拌により酸素Ｏ２　を培
養液に溶解させる。気体混合室内液面下には、培養液回
収導管を設ける。又気液混合室の上面は密閉もしくは開
放してもさしつかえがないが、開放する場合は液面上に
消泡用の羽根を設置して、消泡効率を上げることもでき
る。ここで密閉する意味は、泡が外部に飛散しないよう
にするためである。

【０００５】

【作用】本発明は、フィルター内で隔離された領域内に
導管を介し、直接酸素又は空気を導入し、高速攪拌によ
り酸素Ｏ２　を培養液に溶解させている。このため、培
養液は、細胞の必要とする充分な酸素を含み、フィルタ
ーから培養槽へ出てゆく。またフィルターを気相と広い
面積で接するようにしており、気液混合室の通液がすみ
やかにおこり消泡される。また、消泡羽根によっても発
生した泡を消すことができる。高速攪拌は細胞の存在し
ない領域内のみであり、従来の装置で問題とされた高速
攪拌による剪断力で細胞の破壊はまったくない。また連
続的に細胞の含まれない培養液を、培養液回収用導管を
介して回収することができる。又気相部分に開口した滅
菌空気通気管から滅菌空気を導入し、培養槽内を加圧す
ることにより気液混合室内の液面を上昇せしめて気液混
合室内の泡をフィルターを介して培養槽内に押出し消泡
する。

【０００６】

【実施例】以下に本発明の実施例、実験例を説明する。 図１は本発明の細胞培養槽を示すものである。（Ａ）は
細胞培養槽本体であり、細胞槽中に（Ｂ）に示すフィル
ターで隔離された領域を１ないし複数個設ける。培養槽
および主攪拌羽根は浮遊細胞、もしくはマイクロキャリ
ア培養に適した形状を有しており、（１）の攪拌羽根を
回転するためのモータ（５）は攪拌羽根を５０ｒｐｍ程
度の低速回転できる能力を有している。（Ｂ）のフィル
ターにより隔離された領域は、（４）のモータにより高
速回転する気液混合用攪拌羽根（３）で３００ｒｐｍ以
上の回転数で激しく攪拌される。図３は図１に示した（
Ｂ）の領域の構造の詳細を示したものである。下部には
、酸素、もしくは空気導入用のノズル（６）をもち、ノ
ズルより放出された酸素は（３）の攪拌羽根で攪拌され
、培養液に溶解する。酸素又は空気の導入と攪拌に伴い
発生する泡は、（Ｄ）に示した培養槽の液面上に露出し
ているフィルターのメッシュを通過し、培養液上に滲出
し消泡される。（８）に示すフィルターのメッシュは、
マイクロキャリアーを使用した場合は、５０〜１５０メ
ッシュのものを使用すると目詰まりも生じず、培地の交
換もスムースに行われる。フィルターの材質としては、
細胞に毒性を与えず、気体の吸着のないもの、例えばポ
リエステル、ガラス、焼結金属、セラミックス、ステン
レスなどがあげられ、これらの多層、若しくは単層構造
を有するものが例示されるが、これに限定されるもので
はない。培養液の液面の直下には、開孔部を有する培養
液回収用導管（７）が設置され、細胞やマイクロキャリ
アーを含有しない培養液のみを回収することができる。

【０００７】図４は発生する泡を、培養液の液面（Ｄ）
の直上に、攪拌羽根（３）と同軸上に設けた羽根（９）
により消泡するものである。羽根は発生する泡の性状に
適したものを採用することができる。上部は（１０）で
示されるように培養槽の気相中に開口しており、消泡効
果と（９）の泡消用の羽根の回転による圧力変化を均一
にする機能を有している。

【０００８】図５は図３に示した（Ｂ）領域の構造を有
する培養槽にさらに、ＳＶ２、ＳＶ３の排気、通気用バ
ルブを設け、培養槽の圧力を調整する機能を付加させた
ものである。（Ｂ）領域内は上述したように、機体混合
のため高速攪拌され、発生する泡は８で示したフィルタ
ーを通過して培養槽中に移動する過程で消泡される。こ
の消泡効果をさらに増強するためには、培養槽の（Ａ）
領域と（Ｂ）領域の間に圧力差を生じさせれば良い。こ
のためには、図５に示した、ＳＶ１、ＳＶ２、ＳＶ３の
バルブの開閉により、圧力を調整する。ＳＶ１は酸素、
ＳＶ２は排気、ＳＶ３は通気用のバルブである。ＳＶ１
、ＳＶ２、ＳＶ３バルブの開閉は同調しており、ＳＶ１
開放時はＳＶ２が開放、ＳＶ３は閉鎖し、ＳＶ１閉鎖時
はＳＶ２は閉鎖、ＳＶ３は開放される。このようなバル
ブ開閉により、容器内の圧力は目的とする状態に制御さ
れる。

【０００９】さらに、領域（Ｂ）内では、酸素供給と高
速攪拌により泡が発生することは上述の通りである。こ
の泡は、領域（Ｂ）内の液面を培養槽側より押し下げ、
次第に（Ｂ）内に充満する。しかしこのバルブＳＶ１、
ＳＶ２を閉じ、ＳＶ３を開け、滅菌空気を培養槽内に導
入し、培養槽内の圧を加圧することにより、培養槽内の
培養液がフィルターを介して（Ｂ）内に流入し、低下し
た液面を回復せしめる。液面の上昇に伴い、領域（Ｂ）
に発生した泡はフィルター８を通過して培養槽に押し出
されて行き、フィルター８を通過することで消泡される
。また（Ｂ）領域の攪拌羽根３はバルブの開閉に同調し
ており、ＳＶ１開放時回転し、ＳＶ１閉鎖時停止する。 ＳＶ１バルブの開閉時間は、開放３〜５秒、閉鎖８〜１
３秒とすると消泡効果、酸素溶解効率が高まる。またＳ
Ｖ３より滅菌空気を供給し、ＳＶ３開放時は、培養槽内
の圧力を０．２〜０．４ｋｇ高くなるよう加圧する。

【００１０】〔実験例１〕実施例図３で述べた培養槽を
用いて、培養液中への酸素供給速度を求めた。又比較例
としてシリコンチューブによる酸素供給法、直接曝気に
よる酸素供給法、図７に示した特開平１−１７４３７６
号公報に開示された装置（以下回転フィルター法）によ
る供給法の値を求めた。その結果を次の表１に示す。 なお各方法の条件は以下の通りである。 ■　　本発明　　フィルター、孔径１５０、１００、６
０メッシュの三層 フィルター内回転翼・・・径７０ｍｍディスクタービン
３枚 曝気量、純酸素　　１リットル／分 ■　　シリコンチューブ法　　シリコンチューブ外径　
　３ｍｍシリコンチューブ長さ　　６０ｍ ■　　直接曝気　　曝気量　　１リットル／分■　　回
転フィルター法　　フィルター回転数８０ｒｐｍ曝気量
　　１リットル／分 上記条件で１時間経過後の溶存酸素を求め、酸素供給速
度（ｍｍｏｌ／ｈ）を計算した。あわせて、２％血清を
含む培地での泡の発生状態を観察し、上記〔表１〕に示
す結果を得た。以上の結果に示す通り、本発明装置は特
に高い酸素供給速度を示し、高密度培養が可能なことを
示した。

【００１１】〔実験例２〕図５に示した培養槽を用いて
長期間細胞培養槽を行った。ヒトエリスロポエチン（Ｅ
ＰＯ）を生産する遺伝子組み換えＢＨＫ細胞（特開昭６
２−２６９６９７号公報に開示）を用いて細胞培養と物
質生産について検討を行った。上記ＥＰＯ生産細胞を２
×１０５　個／ミリリットル、サイトデックス−１（フ
ァルマシア製）６０ｇを牛血清１０％を含むＤＭＥＭ培
地１５１中に懸濁させ、一晩ゆるやかに攪拌しながら培
養し、マイクロキャリアーに付着させた。翌日より、Ｓ
Ｖ１開放３秒、閉鎖１０秒のバルブ開閉条件に設定し、
また気液攪拌槽の攪拌数３００ｒｐｍ、酸素曝気量３〜
４リットル／分、ＳＶ１閉鎖時の培養槽内圧１．２〜１
．４ｋｇ／ｃｍ２　の条件により一ヵ月間連続的に細胞
培養を行った。培養液は図３に示した（７）より連続的
に回収し、回収培養液中のＥＰＯ活性をＥＰＯ測定用エ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法により測定した。 測定結果は培養開始日の活性に対する相対活性として図
６に示した。３０日間ＥＰＯが連続的に高い濃度で生産
されていることが確認できた。またこの培養期間中、従
来の浮遊培養法で発生する泡の問題は無く、本発明装置
が高い消泡効果を有することが確認できた。また培養液
中への酸素供給速度は４０ｍｍｏｌ／時間であり、従来
の酸素供給方法と比較して高いことが確認できた。

【００１２】

【発明の効果】以上、本発明によれば、従来の浮遊培養
槽において高密度細胞培養時に必要な高濃度Ｏ２　を供
給し、かつ、従来問題としていた発泡や、剪断による細
胞の破壊を防止することができる。また、酸素を連続供
給しても良好な消泡効果が得られるので、培養液の連続
供給、回収も可能であり、長期間の高密度細胞培養が可
能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明培養装置の断面図を示す。

【図２】本発明培養装置の半部を示す平面図である。

【図３】本発明の培養装置に設置される気液混合室にお
いて上面が密閉された形態の構造を示す断面図である。

【図４】本発明培養装置に設置される気液混合室におい
て上面が開放され、かつ、液面に消泡羽根を有する装置
の断面図を示す。

【図５】気液混合室を有する培養槽に圧力を調整する機
能を付加させたものの断面図を示す。

【図６】培養開始日の活性に対する相対活性を示す図で
ある。

【図７】特開平１−１７４３７６号に開示された回転フ
ィルター装置である。

【符号の説明】

３　　気液混合用攪拌羽根 ６　　空気導入用のノズル ７　　培養液回収用導管 ８　　フィルター

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　細胞培養槽の一部に培養液及び培養細
   胞の生産する蛋白質は透過するが、細胞又は細胞の接着
   担体は透過しないフィルターによって隔離される領域を
   設け、この領域の底部に酸素又は空気を供給する導管を
   設置し、この導管の噴出ノズル直上に高速回転する攪拌
   羽根を設け、又フィルター高さの３０〜５０％は細胞培
   養槽内の気相部分に露出していて、領域内の液面直下に
   培養液回収用の導管ノズルを有することを特徴とする細
   胞培養槽。
2. 【請求項２】　　領域の上面部は気相に対し開放されて
   おり、領域の液面上に高速回転する消泡羽根を設けてな
   る請求項１記載の細胞培養槽。
3. 【請求項３】　　細胞又は細胞の接着担体は通過しない
   フィルターによって隔離された領域内の発生した泡によ
   って低下した液面を上昇せしめるための培養槽気相部分
   に開口した滅菌空気通気管を設け、これによって前記領
   域内の泡をフィルターを介して培養槽中に押し出させ消
   泡せしめることを可能とした請求項１記載の細胞培養槽
   。