JPH0276571A

JPH0276571A - 浮遊細胞培養方法およびそれに用いる装置

Info

Publication number: JPH0276571A
Application number: JP22904588A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Hattori; 服部　博行
Original assignee: Nissho Corp
Current assignee: Nissho Corp
Priority date: 1988-09-13
Filing date: 1988-09-13
Publication date: 1990-03-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は浮遊細胞培養方法およびそれに用いる装置に関
する。

〔従来の技術・発明か解決しようとする課題〕近年、バ
イオテクノロジーの進歩にともない微生物や細胞などを
培養する方法や装置も種々提案されてきている。

たとえば浮遊細胞を培養する装置として、回分操作の必
要な反応器を一部連続化した半回分反応器、さらには四
分操作を連続操作に改善した連続捨型反応器などの種型
反応器や、連続操作に適した背型反応器などが提案され
、利用されてきている。

前記改善は、回分操作を半連続化、連続化するという点
ではそれなりの効果があるが、いずれも浮遊細胞と培地
およびその他必要とされる成分（たとえば血清、リンホ
カインなどの生理活性物質など）とを１つの系とし、こ
れを撹拌などすることにより所望の細胞や有用産生物を
うる方法である。

培養によりえられた細胞や有用産生物は多量の培地など
とともに存在するため、目的物の分離・精製が容易でな
く、前記細胞や有用産生物の濃度をいかにして高めるか
、また前記細胞や有用産生物の取出操作の妨げとなる培
地などを、いかにして少なくするかなどが、重要な課題
となっている。

このような課題を解決するための装置として、培養槽の
内部に設けられた菌体または細胞は透過しないが培地は
透過する膜製の袋中で菌体または細胞を培養する装置が
提案されている（特開昭６２−１２２５８０号公報）。

この装置を用いると袋中のものを取出すことにより、菌
体または細胞濃度の高い液を取出すことかでき、多量の
培地からこれらを分離・精製する手間が軽減されるとい
う効果が達成され、それなりの成果かえられるが、供給
された血清や細胞活性化物質は袋中にのみ存在するわけ
ではなく、袋外にも存在し、培地の交換時に排出され、
無駄に使用される。また生理活性物質などの産生物も袋
中にのみ存在するとは限らず、産生物を取出したいばあ
いには分離・精製に手間がかかるなどの問題がある。そ
のうえ袋中の培地などが必ずしも好ましい状態に維持し
難いなどの問題がある。とくに動物性細胞の培養のばあ
いに重要なｐｉの安定、ＩＩ　ＣＯ３−レベルの維持（
細胞の種類にもよるが、通常２６〜３２ＩＩｌｅｑ／、
ｌ？であることが好ましい）などがはかりにくいという
問題があり、従って培養できる細胞の濃度にも制約があ
った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上述のごとき実状に鑑み、とくに培養される浮
遊細胞や産生物の濃度を高め、かつ分離・精製される液
中の培地の割合をなるべ（少なくするとともに、血清や
細胞活性化物質の使用量を少なくすることを目的として
なされたものであり、浮遊細胞を培養して細胞および（または）産生物をつる
に際し、血清や生理活性物質は透過しないが培地は透過
する柔軟な膜および護膜を支持する支持部材からなる細
胞培養チャンバーを培地容器の内部に設けてなる培養装
置を用いて、前記細胞培養チャンバーの内部に設けた撹
拌装置を、１秒間当り１／ｌＯ〜１回転かつ１分間当り
１〜６０回転で撹拌しながら細胞を培養し、ガスの供給
を細胞培養チャンバーの外でバブル方式で行なうことを
特徴とする浮遊細胞培養方法および、培地容器内に収納配置された細胞培養チャンバーおよび
該チャンバー外に設けられたバブル方式によるガス供給
装置を有してなる細胞培養装置において、前記細胞培養
チャンバーが、培地は透過するが血清や生理活性物質は
透過しない柔軟な膜および護膜を支持する支持部材から
なり、該チャンバーに細胞や血清や細胞活性化物質の供
給および細胞や産生物の回収のための装置ならびに１秒
間当り１／１０〜１回転かつ１分間当り１、〜６０回転
に回転を制御された撹拌装置が設けられていることを特
徴とする前記方法に用いる浮遊細胞培養装置に関する。

〔作　用〕

本発明の方法では、培地容器中に設けられた血清や生理
活性物質は透過しないが培地は透過する柔軟な膜および
護膜を支持する支持部材からなる細胞培養チャンバー内
で細胞培養を行なうため、細胞、血清および細胞活性化
物質、さらには産生物と多量の培地とが１つの系になら
ない。

また、該細胞培養チャンバー内に撹拌装置を設けて１秒
間当り１／１０〜１回転かつ１分間当り１〜６０回転と
いう低速回転で撹拌しながら培養するため、細胞を傷め
ずに膜および支持部材からなる細胞培養チャンバー内外
の培地の交換が効率よく、容易に行なえ、培地を一定の
好ましい状態に保ちうる。

この結果、浮遊細胞を１０７〜１０８個／　ｍｌという
ような高密度で培養することができ、培養された細胞や
産生物の分離・精製が容易になる。

さらに血清や細胞活性化物質の使用量を少なくすること
ができる。

〔実施例〕

本発明の浮遊細胞培養方法をそれに用いる装置の一例を
示す説明図である第１図に基づき説明する。

第１図において、（１）は培地容器、（２）は血清や生
理活性物質は透過しないが培地は透過する柔軟な膜（３
）および護膜を支持する支持部材（４）からなり、撹拌
装置（５）、細胞や血清や細胞活性化物質の供給および
細胞や産生物の回収のための装置（以下、細胞などの供
給・回収装置という）（６）、エアフィルター（７）を
有するガス抜き装置（８）を備えた細胞培養チャンバー
、（９）は２このエアフィルター００）を介してエアポ
ンプ０１）よりバブル方式でガスを供給するガス供給装
置、０２）は排気装置、０３）は培地供給装置で、供給
された培地は下部の孔０４）から培地容器中の培地に供
給される。

なお第１図の装置では培地供給装置０３）が細胞培養チ
ャンバー（２＋の保持手段を兼ねている、旧はサンプリ
ング装置、０■は撹拌器である。

前記培養容器（１）とは、従来からの浮遊細胞培養装置
におけるいわゆるカルチャーボトルにあたるものであり
、その大きさ、形状、材質などにはとくに限定はなく、
従来からのカルチャーボトルのごとき、形状、材質など
のものであれば使用しうる。

このような容器（１）の好ましい具体例としては、たと
えば容Ｍ５００〜５０００　ｍｌ程度の小型のもののば
あい、硬質ガラス、合成樹脂、金属などから形成された
底面積５０〜３００ｃ♂程度で高さ１０〜３０印程度の
円筒状容器や、角柱状容器、球状容器などがあげられる
。

このような小型の装置では、通常、ガス供給装置（９）
、排気装置０２）、サンプリング装置日、細胞培養チャ
ンバー（２）などの保持手段を兼ねる培地供給装置０３
）などは容器の口の部分に取付けられるため、口広のも
のであるのが好ましい。これらの手段が設けられた口の
部分の残りの部分は、栓、蓋などで密封され、雑菌など
の混入が防止される。

また、容量が５Ω程度以上の中〜大型のもののばあい、
合成樹脂や金属などから形成された直径０．１５〜２ｍ
程度で、高さが０．３〜２ｍ程度の円筒状容器や、角柱
状容器、球状容器などがあげられる。

このような大型の容器のばあい、ガス供給装置（９）、
排気装置（１２＋、サンプリング装置叱、ばあいによっ
ては細胞培養チャンバー（２）などの保持手段を兼ねる
培地供給装置Ｏａなとを容器の栓や蓋などに設ける必然
性がないばかりでなく、むしろこれらに取付けたばあい
には、容器の開閉が必要になったばあいなどには取扱い
づらい、重量のある装置をつり下げるのは好ましくない
、などの理由から、通常は底面にすえつけ台を設けた上
にすえつけたり、側面に取付手段を設けて取付けるなど
するのが好ましい。

前記細胞培養チャンバー（２）は、培地は透過するが浮
遊細胞はもちろんのこと、血清や生理活性物質は透過し
ない柔軟な膜（３）および支持部材（４）からなり、撹
拌装置（５）を有し、細胞などの倶給・回収装置（６）
およびガス抜き装置（８）を有する装置である。

細胞培養チャンバー（２）の大きさ、形状などにはとく
に限定はないが、培地容器（１）の容量の１゜〜５０％
程度になるのが好ましく、チャンバーを形成する柔軟な
膜（３）と培地との接触面積が大きくなる方が好ましい
。

前記細胞培養チャンバー（２）における膜（３）は、培
地は透過するが、細胞、血清、生理活性物質は透過しな
い必要かあるから、前記透過物質、不透過物質の種類に
もよるが、通常、平均ポアサイズ３０〜８０人程度の孔
を有する膜である。

前記膜を構成する材料には、とくに限定はないが、培地
を透過させる必要があるから、表面は親水性のものであ
ることが必要である。それゆえ、膜を構成する材料の好
ましい具体例としては、たとえば再生セルロースなどの
親水性材料があげられる。たとえばセルローストリアセ
テート、セルロースジアセテート、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホ
ン、ポリアミドまたはポリエステルなどの親水性でない
材料からなる膜のばあいには、たとえばエタノールに浸
漬させたり、水酸基を膜表面にグラフト重合などにより
導入するなどの方法で膜を親水性にしうる。

前記支持部材（４）は、膜（３）が充分な強度を有さず
、僅かな力で変形するため、膜（３）のみでチャンバー
を形成したばあいにはチャンバーを支持したり、撹拌装
置（５）を設けたりするのが困難であるために使用する
部材である。それゆえ、適度の強度、硬さなどを有する
ものであることが必要であるが、このようなものである
かぎり支持部材（４）の形状、大きさ、材質などにはと
くに限定はなく、膜（３）とともに形成する細胞培養チ
ャンバー（２）の形状などに応じて適宜選択して使用す
ればよいが、膜（３）と培地とか充分接触し、チャンバ
ー内の培地交換のおこりやすいものであるのが好ましい
。

たとえば第１図に示す細胞培養チャンバー（２）におい
てはチャンバーの上面および底面が支持部材（４）から
なり、側面が膜（３）から形成されている。上面の支持
部材（４）は適度の強度、硬さなどを有するため、支持
手段を兼ねる培地供給装置０３）で上方から細胞培養チ
ャンバー（２）を支持することができ、細胞培養チャン
バー（２）に撹拌装置（５）、細胞などの供給・回収装
置（６）、ガス抜き装置（８）などの装置が容易に取付
けられつる。

上面の支持部材（４）は板状の部材であるのが好ましい
が、板状である必要はない。支持部材（４）が格子状や
スリット状などのように空隙を有するようなばあいには
、この空隙部分には膜（３）をはるなどしてチャンバー
の内外を区切るようにする必要がある。また底面も支持
部材からなるばあいには、底面の支持部材の材質は比重
が培地より若干大きいものが好ましく、底面の支持部材
の比重が培地の比重より過大であったり、培地の比重よ
り軽いばあいには、上面の支持部材と底面の支持部祠と
が相互に支持されるように両者を一体的に形成しておく
方が、底面が浮上したり、強度が充分でない膜（３）に
直接大きな−１２＝力がかかるなどの問題がなくなるので好ましい。

第１図においては細胞培養チャンバー（２）を上から支
持しているが、下または横から支持してもよいことは当
然のことである。

第１図の（６）は細胞培養チャンバー（２）に浮遊細胞
や血清や細胞活性化物質を供給し、増殖した細胞やその
産生物である生理活性物質などを回収する装置であり、
このような働きをするものであるかぎりとくに限定はな
いが、たとえばインジェクションプラグを用いたものが
あげられ、その下端が細胞培養チャンバー（２）の最下
部付近まで達している方が浮遊細胞などの回収がやりや
すい。また第１図では浮遊細胞などの供給と回収とを１
本の管で行なうようにしているが、別々の管を用いて連
続的に行なうようにしてもよい。

前記ガス供給装置（９）は培養に必要なガス、たとえば
０２をバブル方式により供給する装置であり、培養によ
り生ずるガス、たとえばＣＯ２は排気装置（１２］から
排気される。

ガス供給装置（９）の構造などにはとくに限定はなく、
一般に使用されているバブル方式のガス供給装置であれ
ば使用しうる。また培地容器（１）内に設けられるガス
供給装置（９）は１個でもよいが、要すれば２個以上設
けてもよい。

このようにして細胞培養を行なうと、バブル方式でガス
が供給されるため、供給時に培地にゆれが生じ、培地の
状態の均一化、さらには細胞培養チャンバー（２）内と
の培地の交換もおこりやすくなる。

本発明の装置には、第１図に示すように、撹拌装置（５
）が設けられているが、撹拌装置（５）を設けて細胞培
養チャンバー（２）内を撹拌するため、細胞培養手段（
２）内外の培地などの交換がおこりやすくなり、培地を
一定の状態に維持しやすくなる。また膜（３）などを常
にゆらし、細胞を浮遊させやすくするため、細胞が膜（
３）の表面に付着するのが防止され、増殖しやすくなる
。

前記撹拌装置（５）は１秒間当り１／１０〜１回転の割
合で回転し、かつ１分間当り１〜６０回転の割合で回転
する装置である。撹拌は連続的に行なわれる必要はなく
、前記条件を満たす撹拌であればよく、低速で撹拌する
ため細胞を傷めることなく細胞培養チャンバー（２）内
の液を均一にしうるとともに培地が膜（３）を透過しや
すくなり、細胞培養チャンバー（２）内外の液の交換が
おこりやすくなる。

第１図には培養中の培地の状態をモニターする手段など
は記載されていないか、随時設置しうることは当然のこ
とである。

第１図の装置はバッチ式の装置で培地取出し装置を設け
ていないが、たとえばサンプリング装置すを培地取出し
装置として使用しうるようにすれば、培地供給装置［相
］から培地を供給する一方で培地取出し装置から培地を
取出しながら培養することができる。このばあい、細胞
などの供給・回収装置（６）も細胞などの供給装置と回
収装置の２つの装置にわけて連続的に供給および回収で
きるようにするのが好ましい。

つぎに本発明の方法の具体的手順の一例を、本発明に用
いる細胞培養装置の一例である第１図に示す装置に基づ
き説明する。

培地の供給は培地供給装置ｆ１３）より行なわれる。

この際、培地容器（１）内の空気は排気装置０２）から
放出しながら行なうとスムーズに培地を供給することが
できる。

一方、培養する細胞、血清、リンホカインなどの細胞活
性化物質などを含む細胞浮遊液が細胞などの供給・回収
装置（６）から供給される。この際、細胞培養チャンバ
ー（２）内の空気を抜くためガス抜き手段（８）の開放
下で行なうと細胞などの供給をスムーズに行なうことが
できる。

培地、細胞、血清、細胞活性化物質などの供給後、ガス
供給装置（９）より、たとえばＣＯ２を５容量％程度含
有する空気がバブル方式により培地に導入され、排気装
置０２）から排気される。また撹拌装置（５）により細
胞培養チャンバー（２）内の液が１秒間当り１７１０〜
１回転で、かつ１分間当り１〜６０回転の割合で撹拌さ
れる。

供給されるガスの量は、培養する細胞の種類や密度など
によっても異なり、−概には規定できないが、一般に培
地１０００　ｍｌ当り３０〜１００　ｍｌ　／分程度の
割合でガス供給が行なわれる。

このようにして細胞培養を行なうと、バブル方式でガス
が供給されるため、供給時に培地にゆれが生じ、培地の
状態の均一化、さらには細胞培養チャンバー（２内との
培地の交換もおこりやすくなる。また細胞培養チャンバ
ー（２）内の液を撹拌するため、該チャンバー（２）内
の液が均一になるとともに膜（３）を透過しやすくなり
、細胞培養チャンバー（２）内外の液の交換がおこりや
すくなる。また、膜（３）として血清や生理活性物質は
透過しないが培地は透過する膜を使用しているため、血
清や細胞活性化物質は細胞培養チャンバー（２）内にと
どまり、これらの節約がはかられる。さらに撹拌を１秒
間当りＩ／１０〜１回転で、かつ１分間当り１〜６０回
転という低速で行なうため、細胞を傷めることも少ない
。

本発明の方法により培養される細胞としては、たとえば
リンパ球、骨髄細胞、マクロファージなどが、その際に
使用される細胞活性化物質としては、たとえばリンホカ
インやインターフェロンなどが、さらに培地としては、
たとえば牛胎児血清培地、無血清培地、ヒト血清培地な
どがあげられる。

前記説明においては主として培養細胞をうるばあいを念
頭において説明したが、産生物をうるばあいについても
同様であることは当然のことである。

このようにしてえられる産生物の具体例としては、たと
えばイムノグロブリン間１フィブリノーゲン、アルブミ
ン、リンホカイン、インシュリン、インターフェロン、
ウロキナーゼ、成長ホルモン、モノクローナル抗体など
の生理活性物質などがあげられる。

つぎに本発明を実施例に基づき説明する。

実施例１第１図に示す装置とほぼ同様の装置を用いた。

第１図における培地容器（１）は硬質ガラス製で容量３
３００　ｍｌ、直径約１．５０＋ｎｍＸ高さ約１９０ｍ
ｍの円筒状容器、ガス供給装置（９）はエアポンプ０１
）とパイプで連通された孔径１　ｍｍの多数の小孔を有
する筒状容器であった。そして培地容器（１）を外部か
ら遮断する蓋体には、」二面および底面がいずれも直径
約７４ｍＩＭのポリカーボネート製の円板からなり、側
面が直径約７４＋ａｍ、高さ約４０ｍｍの円柱状（内容
量的１６０ｍ１）で、平均ポアサイズ４０人の再生セル
ロース製の膜（側面の面積的９２ｄ）からなる細胞培養
チャンバー（２）を保持するための培地供給装置０３や
、エアフィルター（０，２２、ａｍ）を有するガス抜き
装置（８）および細胞などの供給・回収装置（６）が細
胞培養チャンバー（２）にセットされた状態で取付けら
れており、さらにガス供給装置（９）、排気装置（１２
）、サンプリング装置６が取付けられていた。

なお、細胞培養チャンバー（２）の底面は培地容器（１
）の底から約１０ｍｍうえになるようにセットされてお
り、上面の支持部材（４）には撹拌装置（５）が取付け
られていた。

排気装置０２）から培地容器内の空気を放出しながら培
地としてｌ？Ｐ旧−１６４０（味の素■製）　１．００
０ｍ１を供給したのち、細胞などの供給・回収装置（６
）から細胞培養チャンバー（２）にガス抜き装置（８）
の開放下、リンパ球１０６個／　ｍｌ　Ｘ　１００　ｍ
ｌ、血清１０ｍ１、リンホカインン２００単位からなる
細胞浮遊成約１．ｌ０ｍ１を供給した。そののち、３７
℃で培養を行なった。なお、培養中、２個のエアフィル
ター（０，２２ｕｍ）を介してエアポンプからＣＯ２を
５容量％含有する空気を流１ｊＡ　５０ｍｍ／　ｍｉｎ
　ｓバブル方式で供給し、排気装置０２＋がら排気した
。

また、１秒間当り１／２回転かつ１分間当り３０回転で
撹拌した。

培養中、１日ごとに培地のｐＨ１炭酸ガス分圧（ＰＣＯ
２）を測定し、７．２≦Ｉ）Ｈ≦７．３．３Ｂ＋ｎｍＨ
ｇ≦ｐｃｏ２≦４０ｍｍ１ｇであることを確かめた。

２０日間培養後、培養液には３　Ｘ　１０７個／　ｍｌ
の細胞が存在していた。

〔発明の効果〕

本発明の方法により細胞を培養すると１０７〜１０８個
／　ｍｌという高密度に細胞を培養することができ、培
養された細胞や産生物の分離・精製が容易になる。また
培養時に使用される血清・細胞活性化物質の量を節約し
うる。

また本発明の装置は本発明の方法に適した装置である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に用いる本発明の装置の一例を示
す説明図である。（図面の主要符号）（１）・培地容器（２）：細胞培養チャンバー（３）：膜（４）：支持部材（５）：撹拌装置（６）：細胞などの供給・回収装置（９）：ガス供給装置 −つり　−

Claims

【特許請求の範囲】１　浮遊細胞を培養して細胞および（または）産生物を
うるに際し、血清や生理活性物質は透過しないが培地は
透過する柔軟な膜および該膜を支持する支持部材からな
る細胞培養チャンバーを培地容器の内部に設けてなる培
養装置を用いて、前記細胞培養チャンバーの内部に設け
た撹拌装置を、１秒間当り１／１０〜１回転かつ１分間
当り１〜６０回転で撹拌しながら細胞を培養し、ガスの
供給を細胞培養チャンバーの外でバブル方式で行なうこ
とを特徴とする浮遊細胞培養方法。２　前記細胞培養チャンバーにおける柔軟な膜が、平均
ポアサイズ３０〜８０Åの再生セルロース製または親水
化されたセルローストリアセテート、セルロースジアセ
テート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリスルホン、ポリアミドもしくはポ
リエステル製の膜からなる請求項１記載の方法。３　培地容器内に収納配置された細胞培養チャンバーお
よび該チャンバー外に設けられたバブル方式によるガス
供給装置を有してなる細胞培養装置において、前記細胞
培養チャンバーが、培地は透過するが血清や生理活性物
質は透過しない柔軟な膜および該膜を支持する支持部材
からなり、該チャンバーに細胞や血清や細胞活性化物質
の供給および細胞や産生物の回収のための装置ならびに
１秒間当り１／１０〜１回転かつ１分間当り１〜６０回転に回転を
制御された撹拌装置が設けられていることを特徴とする
請求項１記載の方法に用いる浮遊細胞培養装置。