JPH0370469B2

JPH0370469B2 -

Info

Publication number: JPH0370469B2
Application number: JP61198898A
Authority: JP
Inventors: Katsuto Watanabe; Yoshihiko Nakamura; Takashi Noto; Masakazu Yamamura; Hitoshi Nakajima; Kazunori Ichinohe
Original assignee: Kawasumi Laboratories Inc
Current assignee: SB Kawasumi Laboratories Inc
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1986-08-27
Publication date: 1991-11-07
Also published as: JPS6356275A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、特に動物細胞を高濃度または高活性
に培養する方法及びその器具に関するものであ
る。（従来の技術）従来、動物細胞の培養方法としては、寒天固型
培地等を用いる平板培養、液体培地を用い振盪し
ながら培養するけん濁培養が知られている。ま
た、ローラボトルの内壁面に細胞を付着または浮
遊させる回転培養や、ビーズ表面に細胞を付着、
増殖させる方法、さらに半透膜の中空糸表面に細
胞を付着させ、裏面に培養液を供給するようにし
たもの、等が知られている。（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、平板培養や、けん濁培養では培
地を交換する際、細胞を集め、遠心操作などで細
胞を洗う必要があり、操作が面倒である。またロ
ーラボトルによる回転培養や、ビーズ表面に付
着、培養する方法は、細胞の回収も面倒であり、
恒温室などの設備も必要となる。さらに、中空糸
膜を用いた方法は、細胞が中空糸膜の壁面に付着
するため、細胞の回収率が劣り、大量培養する場
合には中空糸膜の面積を大きくしなければならな
い。さらに、培養液を循環供給するための装置が
必要であり、全体的に装置が大がかりとなり、コ
ストもかさむという問題がある。本発明はこのような従来の問題を解決するため
に、鋭意研究の結果提案されたものである。即
ち、本発明の目的は動物細胞を効率的かつ経済的
な方法で、高濃度または高活性に培養する方法及
びその器具を提供することである。このような目
的は以下に述べる手段によつて達成される。（問題点を解決するための手段）本発明の細胞培養器具は、培養すべき細胞を含んだ培養液を収容する半透
膜の内袋と、前記内袋を密封収納し、該内袋の外側に培養液
とガスを収容する外袋とを有し、前記内袋に培養すべき細胞を含む培養液を導入
するための連通口を設け、外袋は培養液及びガス
を導入するための連通口を設けること、を特徴とするものである。また、本発明は上記手段に加えて、前記内袋を
囲う保護メツシユを設けることを特徴とするもの
である。前記半透膜としては、再生セルロース、セルロ
ースアセテートなどのセルロース系の膜のほか、
ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレー
ト、ポリスルフオン、ポリカーボネート、ポリア
ミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成膜
であつてもよい。膜のポアーサイズについては細胞の大きさ、培
養液等によつて決定されるが、細胞は透過せず
に、培養液やガスが透過するものであればよく、
例えば0.2μ以下のものが好ましい。また、細胞培
養液のほかに添加物を加える場合は、添加物の大
きさを加味したポアーサイズを選択する必要があ
る（半透膜容器内に添加する場合は添加物が透過
しないポアーサイズを、また膜外の培養液に添加
する場合は添加物が透過するポアーサイズを選択
する）。また本発明では培養の間、アジテーターにより
培養器具を回転または振盪させて収納物をゆつく
り撹拌させる。回転方式の場合、その回転角度は
特に限定はないが、30゜、45゜、60゜のいずれの角度
でも良好な結果が得られた。また本発明では前記半透膜を保護するため、外
側にメツシユを当てるようにしてもよい。さらに
各連通口は必要により動物設けるようにしてもよ
い。（作用）上記した手段によれば、半透膜の内袋に、培養
すべき細胞を含む培養液を封入し、外袋に培養液
とガスを導入する。これにより内袋の培養液が消
費され、外袋の培養液との間の濃度勾配による拡
散現象により、外袋内の培養液と溶存ガスが内袋
内に移行しする。この拡散現象を利用して内袋内
の細胞を高密度で培養する。また、内袋の外側を保護メツシユで囲うことに
より、半透膜製の内袋を保護すると共に、内袋と
外袋が接触しないように、所定のスペースを確保
することで、内袋全体に培養液が均一に接触する
ことになる。（実施例）第１図は、本発明に係る器具の一実施例であ
る。図中１は塩化ビニル、酢酸ビニル共重合体等
の軟質もしくは半硬質プラスチツクの密封バツグ
であり、その上端部には培養液及びガスを注入す
る連通口２が設けられている。この連通口２は本
実施例では上下二箇所に設けられており、汚染防
止のため、一度使用した連通口は封止した後、再
使用しないようにしている。また、このバツグ１の内部には、半透膜の袋３
が収納され、その袋３の外側部には培養液収納部
５が形成される。そして、この袋３の上端部に
は、被培養物を注入する連通口４が設けられると
共に、この連通口４は、前記バツグ１の上端部か
ら突出せしめている。なお、この半透膜袋３の外
側は、プラスチツクをメツシユ状に成形した保護
カバー６で囲われている。前記バツグ１は、２枚のプラスチツクシートを
重ね合せ、周囲をシールしたものであり、上端部
に連通口２，４となるプラスチツクチユーブを固
定したものである。これらのプラスチツクチユー
ブは内面に破断可能な薄膜を形成した血液バツグ
等に使用される輸血口を固定してもよい。また、
半透膜の袋３は半透膜のチユーブの一方の開口部
を密封し、他方の開口部に連通口を取付けてい
る。さらに保護カバー６は袋状になつており、内
部に前記半透膜袋３を収納しているものである。なお、前記プラスチツクシートの四隅には回転
または振盪させる際の固定用の穴７が形成されて
いる。第２Ａ図は、浮遊培養等の振盪を必要とする場
合に用いるアジテーターの一例を示したものであ
る。このアジテーターは本体３０の前面に適度の
角度をもたせて回転板３１が設けられており、本
体３０内に内臓する駆動機構により可変式で回転
可能となつている。また、前記アジテーターは第
２Ｂ図に示すような設置台４０に載せ、設置台４
０をガイド４２に沿つて角度調整することによ
り、被培養物に適した角度に調整することができ
る。なお、回転板の四隅には前記培養器具を固定
するためのナツトその他の固定具３２が設けられ
ている。実施例１上記第１図の培養器具及び第２Ａ図のアジテー
ターを使用し、連通口４から半透膜袋３（ポアサ
イズ24Å）内にヒトリンパ球、インターロイキン
−２（以下IL−２という）＋ヒトAB血清（20％）
を含む培養液（RPMI1640 0.5）を封入し、バ
ツグ１の連通口２から培養液（RPMLI1640 1.5
）及びエアー（２）を注入した。前記培養器具をアジテーターの回転板３１に固
定し（回転角度30゜）、インキユベーター内で
LAK（lymphokine−activated killer）細胞の誘
導を行なつた。誘導中、別の連通口２から培養液
の交換を行なつた。本発明によるLKA細胞のキラー活性の変化を
従来法（ローラボトル法）と比較して第３図に示
す。縦軸はキラー活性、横軸は培養日数を示し、
実線は本発明法、破線は従来法を示す。キラー活性は、本発明法及び従来法共に同じ傾
向で16日間、最後まで活性上昇が認められた。本発明法と従来法の比較を第１表に示す。本発
明法によれば、培養液とリンパ球を混合して培養
する従来法に比較し、貴重なIL−２の使用量は
従来法の2500uに対し、1000u、またヒトAB血清
の使用量を従来法の1000mlに対し、100mlと大幅
に減少できるにもかかわらず、そのキラー活性は
本発明法及び従来法とも同等の活性を示した。ま
た、培養器具全体をプラスチツクバツクとしてデ
イスポーザブル化することで、無菌操作が従来に
比べ容易に行なうことができる。さらに、ローラ
ーボトルによる従来法では恒温室が必要であるの
に対し、本発明ではインキユベーター１台で培養
が可能となる。

【表】実施例２上記第１図の培養器具及び第２Ａ図のアジテー
ターを用い、連通口４より半透膜袋３内にRaji細
胞、FCSを含む培養液を封入し、バツグ１の連通
口２からFCSを含む培養液及びエアーを注入し
た。前記器具をアジテーターの回転板３１に固定
し、インキユベーター内で培養を行なつた。本発明法及び従来法によるRaji細胞の増殖曲線
を第４図に示す。縦軸は細胞濃度、横軸は培養日
数を示し、実線は本発明法、破線は従来法を示
す。本発明法及び従来法共に細胞濃度50／μ³で培養
を開始し、従来法では培養日数４日目で、細胞濃
度が455／μ³に達すると、その後低下したが、本
発明法は培養日数７日目においても細胞濃度’
2060／μ³と増殖を続けた。実施例３上記第１図の培養器具及び第２Ａ図のアジテー
ターを用い、連通口４より半透膜袋３内にマウス
ハイブリドーマ、FCSを含む培養液を封入し、バ
ツグ１の連通口２から培養液及びエアーを注入し
た。前記器具をアジテーターの回転板３１に固定
し、インキユベーター内で培養を行なつた。本発
明法及び従来法によるマウスハイブリドーマの増
殖曲線を第５図に示す。従来法では培養４日目で細胞濃度1000／μ³とな
り、それ以降次第に濃度が低下し始めたが、本発
明法によれば、培養数６日目に細胞濃度10000／
μ³と増殖し続けた。（発明の効果）以上説明した本発明によれば、以下のような優
れた効果が得られる。従来の中空糸型培養器と比較して膜面積が狭
いにもかかわらず、動物細胞を高濃度で大量に
培養することができる。培養日数が長期化しても培養濃度が増殖し続
ける。動物細胞の培養に不可欠で高価な血清や、
IL−２などの細胞増殖因子の使用量が従来に
比べて大幅に低減する。培養を密封系で行い、従来の中空糸型培養器
のごとく、培養液を環流させないため、無菌的
操作が容易に可能である。構成が簡単であり、安価に大量生産が可能で
あるため、デイスポーザブル化ができる。第２の発明のよる場合は、保護メツシユで半
透膜の内袋が保護されると同時に、該内袋と外
袋とが直接接触せず、これらの間に所定のスペ
ースが保持されるため、外袋内の培養液が内袋
と均一に接触し、培養効率が向上する。必要により、半透膜製内袋内の養分と膜外の
養分の成分条件を変えて培養することが可能で
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る培養容器の実施例を示す
概略図、第２Ａ図は本発明の実施例で使用される
アジテーターの斜視図、第２Ｂはアジテーター設
置台の側面図、第３図は本発明に係る培養器具と
従来の培養器具によるLAK細胞のキラー活性を
示したグラフ、第４図は同じくRaji細胞の増殖曲
線を示したグラフ、第５図は同じくマウスハイブ
リドーマの増殖曲線を示したグラフである。図中、１はバツグ、２は連通口、３は半透膜、
４は連通口、５は培養液収納部、６は保護カバー
である。

Claims

【特許請求の範囲】１動物細胞を大量培養するための器具であつ
て、培養すべき細胞を含んだ培養液を収容する半透
膜の内袋と、前記内袋を密封収納し、該内袋の外側に培養液
とガスを収容する外袋とを有し、前記内袋に、培養すべき細胞を含む培養液を導
入するための連通口を設け、外袋に培養液及びガ
スを導入するための連通口を設けること、を特徴とする細胞培養器具。２動物細胞を大量培養するための器具であつ
て、培養すべき細胞を含んだ培養液を収容する半透
膜の内袋と、前記内袋を密封収納し、該内袋の外側に培養液
とガスを収容する外袋とを有し、前記内袋に、培養すべき細胞を含む培養液を導
入するための連通口を設け、外袋に培養液及びガ
スを導入するための連通口を設けると共に、前記内袋を囲う保護メツシユを設けることを特
徴とする細胞培養器具。