CN102575219B - 连续回收收获袋 - Google Patents

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Abstract

一种能够保存液体的无孔容器，所述无孔容器包括外壁表面和内壁表面，所述内壁表面限定了保存液体的内室；滤器，其具有周边、第一表面和第二表面，并且环绕其整个周边固定连接至所述无孔容器的内壁表面的部分，因而在所述无孔容器内形成整合的内袋；以及配件，其在与所述整合的内袋的第一表面相邻的外壁表面的部分连接至所述无孔容器的外壁，所述配件形成通孔，通孔设置用于允许液体从内室流经所述整合的内袋，流经滤器，并从所述通孔流出。

Description

连续回收收获袋
相关申请
本申请根据35 USC 119(e)要求于2009年8月26日提交的美国临时申请61/237,286和于2009年9月8日提交的美国临时申请61/240,323的优先权，将两者以其全文在此引入作为参考。
发明领域
本公开涉及收获细胞的装置和方法，所述细胞在例如二维一次性袋(twodimensional disposable bag)或三维一次性台式生物反应器袋(three dimensionaldisposable bench top bioreactor bag)或更大的一次性生物反应器中的微载体上生长。
背景技术
细胞培养是制备许多生物产品必不可少的步骤，所述生物产品例如核酸、用于疫苗中的病毒、抗体和蛋白(例如干扰素)。依赖贴壁细胞(例如一些动物细胞)需要附着于表面以生长和分裂。
对于大规模细胞培养，微载体提供了依赖贴壁细胞生长所需的较大表面积。VanWezel于1967公开了微载体、小珠子(bead)或直径约0.2mm的颗粒在所述细胞生长中的用途。在生物反应器袋内将所述微载体混悬于培养基中。将细胞(接种物)加入混悬有所述微载体的液体培养基中。在该细胞培养方法中，有时用温和的搅动来帮助所述微载体珠子保持混悬。
不依赖贴壁细胞(又名“悬浮细胞”)不需要生长于其上的固体载体，并且能够生长于细胞混悬液中。
连续或灌注模式：在连续或灌注模式中，新鲜的富营养培养基连续地流经附着细胞群的微珠混悬液，或流经细胞混悬培养液。在整个培养期中都可收获产物。除去了毒性代谢产物，且有时除去了死细胞。在混悬培养液中，由于细胞的尺寸较小，因此除去营养枯竭的培养基同时在生物反应器中保留细胞的方法存在持续的问题。现有的过滤方法和系统存在一些典型的缺点，包括滤器的堵塞和所述生物反应器内死细胞的蓄积。这些问题影响了回收的产物量，并使所述灌注生物反应器系统难以放大至工业规模。
分批模式：在分批模式中，在开始时加入所有营养素，且直到一批结束时才取出产物。废物在进程中蓄积并且营养素被用尽，使所述分批方法在很多应用中并不有效。
补料分批模式：补料分批模式与分批模式的相似之处在于产物只在进程结束时才被取出，但不同之处在于在该方法过程中营养素以多次间隔加入。
在上述各个模式中，细胞群可将感兴趣的产物分泌或释放入培养基中。通过从所述生物反应器袋取出至少一部分所述培养基而收获产物，同时在所述生物反应器袋中留下来自细胞混悬液或附着细胞群的微载体珠子的细胞。如上文所述，在连续或灌注模式中，在整个培养期中收获产物。在分批和补料分批模式中，产物只在进程结束时才取出。
在培养细胞的这些模式的每一个中，在收获期中从培养基分离微载体珠子或细胞的最常规方法是使所述珠子或细胞沉降然后倾倒该液体，或在外部过滤该混合物。这些方法都不有效，并且都需要大量时间以完成分离。
外部滤器可用于法向流过滤(Normal Flow Filtration，NFF)中，其中液体流接近法向，即垂直于滤器表面。除了NFF是一种相对较慢的方法之外，在NFF中未通过滤器的颗粒会蓄积并且容易堵塞滤器。
在正切流动过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)中，液体流是沿滤器表面的正切方向。在TFF中，压力沿法向施加于滤器表面，以迫使部分的流动液体通过滤器至滤液侧。不仅不会堵塞滤器，未通过滤器的颗粒还会被液流带走。尽管所述装置一般不存在堵塞的问题，然而TFF装置需要大面积、高流速以及高压力，这可能破坏细胞或所述微载体珠子。
另一种并不十分有效的方法涉及使用在“振荡器(rocker)”式二维袋内的浮动灌注滤器。而另一种过滤系统是筒式滤器系统，其一般在筒或外壳内包括波纹状或褶状滤器。筒式滤器也容易发生堵塞。这些现有的系统都未能提供一种有效的回收微载体珠子的方法。
因此，仍然对从培养基分离微载体珠子或细胞、并在收获时回收微载体珠子或细胞提供更快、更有效的方式的设备和方法存在持续需求。尤其公认需要用于细胞培养的连续或灌注模式(其中营养素连续加入系统中并且在整个培养期内收获产物)中的装置和方法。
发明内容
本发明尤其单独或组合地包括如下内容。在一个方面中，本发明涉及我们对于收获和微载体回收袋的发现，以及涉及收获培养基并且同时将所述微载体珠子留在袋中的相应方法，该方法显著地比现有技术方法更为有效。在本发明的另一个实施方案中，培养基和珠子可从所述收获和微载体回收袋内部流出并返回生物反应器中。
本发明涉及一种能够保存液体的无孔容器，该容器包括：外壁表面和内壁表面，所述内壁表面限定了用于保存液体的内室；滤器，其具有周边(perimeter)、第一表面和第二表面，并且环绕其整个周边固定连接至所述无孔容器的内壁表面的部分，从而在所述无孔容器内形成整合的内袋；以及第一配件(fitment)，其在与所述整合的内袋相邻的外壁表面的部分连接至所述无孔容器的外壁表面，所述第一配件形成第一通孔(port)，该第一通孔设置用于允许液体从内室经过滤器流入所述整合的内袋，并从所述第一通孔流出。
在一个实施方案中，所述无孔容器包括柔性材料。在另一实施方案中，所述无孔容器包括可折叠袋(collapsible bag)。
在本发明的一个实施方案中，所述滤器的面积约等于所述无孔容器的内壁表面的面积。
本发明的另一个实施方案是一种无孔贮器，其具有能够保存液体的第一内室，所述无孔贮器包括：内囊，其具有第二内室且与所述无孔贮器的壁整合，所述内囊包括与所述无孔贮器的第一内室相邻的多孔性表面，且设置使得所述第一内室和所述第二内室彼此流体连通；配件，其在所述无孔贮器的表面形成通孔，所述通孔的位置允许通向所述第二内室，使得当使所述第一内室中所含的液体从所述无孔贮器的表面上的通孔流出时，液体从所述第一内室流出并经过该多孔性表面，形成滤液，该滤液通过所述内囊并从所述通孔流出。
本发明公开的无孔容器可具有连接至配件的通孔的管道，以收获所述无孔容器的内室中保存的液体。
本发明具有很多优势。存在解决涉及以下的问题的持续需求：收获包括感兴趣的产物的培养基，同时将微载体珠子留在生物反应器或细胞培养袋中。本发明相对于现有技术外部滤器提供的一个优势是，防止了滤器的堵塞或将其最小化。所述外部滤器通常用于“终端(dead end)”或分批模式中，其中在收获过程中所述微载体珠子蓄积且最终堵塞了所述滤器。与之相反，本发明公开的收获和微载体回收袋的整合的滤器并不像所述外部滤器那样易于堵塞。本发明公开的装置可用于分批模式或者连续或半连续模式中，其中浓缩的微载体珠子混悬液或细胞混悬液可重新回收入所述生物反应器中。
本发明的另一优势在于，其不仅比沉降和倾倒(decanting)液体更快，而且其是一种比倾倒更有效的分离方法。在倾倒方法中，无效分离(即，使珠子进入收获液)的可能性是很高的。
另外，使用本发明公开的装置和方法，本领域技术人员通常能够收回比倾倒更多的液体。我们使用多孔性管道装置的先前的尝试有着其它限制：例如堵塞，以及基于其在袋中的位置对液体回收更有限制，和当使用三维袋时其偶尔卷入叶轮中。
通过将本发明整合至生物反应器的设计或其它一次性装置中获得其它优势，使得这些装置是一次性的、单次使用、并可同时灭菌，而不存在经过无菌连接造成污染的风险。
附图说明
本发明的前述和其它特征以及优势将从以下本发明的例示性实施方案的更具体描述显而易见，如在附图中例示。附图不必按比例；重点在于示出所公开的设备的例示性实施方案的结果。
图1是二维可折叠袋形式的收获和微载体回收容器的部分的俯视图(top planview)的示意图，该袋具有矩形滤器和筛，其透过根据本发明的一个实施方案的透明袋部分可见。
图2A是二维收获和微载体回收袋的部分的俯视图的示意图，该袋具有圆形滤器和筛，其透过根据本发明的一个实施方案的透明袋部分可见。
图2B是收获和微载体回收袋的顶板的部分的剖视图，其显示了夹在根据本发明的一个实施方案的袋的滤器和内壁之间的筛。
图3A是根据本发明的一个实施方案的袋的连续回收的流经收获袋的顶板47的俯视图，以及该袋底板48的仰视图(bottom plan view)。
图3B是根据本发明的一个实施方案的连续回收的流经收获袋的截面图。
图4显示根据本发明的一个实施方案的连续回收的流经收获袋的顶部的透视图。
图5是根据本发明的一个实施方案的连续回收的流经收获袋的底部的透视图。
发明详述
以下是本发明的优选实施方案的描述。将理解的是，本发明的具体实施方案通过实例示出且不作为本发明的限制。在开始时，在本发明以最宽的总体方面描述，然后是更具体的描述。本发明的组合物和方法的特征和其它细节将在权利要求中进一步指出。
与从培养基分离微载体珠子的现有技术方法不同，本发明人在此公开一种连续回收收获容器或袋和相应的收获培养基且同时将所述微载体珠子留在收获和微载体回收袋或所述生物反应器中，或留在收获和微载体回收袋与所述生物反应器两者之中的方法，这是一种明显比现有技术方法更有效的方法。
本发明涉及一种容器，其可为对过滤应用产生特定功能的一种可折叠袋。所述袋可为任意尺寸。在一个实施方案中，所述可折叠袋选自二维一次性袋、三维一次性台式生物反应器袋和一次性生物反应器。在本发明的另一实施方案中，所述袋为单次使用的柔性无孔袋，其适于在微载体珠子上培养细胞。
本发明公开的连续回收收获容器可为一次性的或单次使用的。术语“连续回收收获容器”、“收获和微载体回收袋”、“无孔容器”和“无孔袋”在本文中作为同义词使用。
在本发明的另一个实施方案中，所述袋是柔性无孔袋，其适于收获细胞培养的培养基。
在图3A、3B、4和5中显示的本发明的另一个实施方案中，所述无孔袋是一种连续回收的流经(flow-thorugh)收获袋，其可用于例如在生物反应器中以连续或灌注模式培养细胞。在流经收获袋的一个实施方案中，培养基和微载体珠子可从生物反应器流入所述流经袋的底板(bottom panel)的通孔，并从所述袋的底板的另一通孔流出并返回所述生物反应器中。
在一个实施方案中，所述无孔袋包括柔性的聚乙烯材料或膜，且可具有与之相连接的配件。本文所用的术语“配件”是指单独的物件，其焊接(例如热焊接)至所述无孔袋膜以与之相连接。由此，配件通常包括可相同于或类似于构成所述无孔袋的壁的聚合物材料的聚合物材料。配件通常为比所述无孔袋的壁更致密的材料，且可被添加至所述袋以实现功能。配件的一个非限制性实例是形成通孔的配件。在本发明的一个实施方案中，将如下文所述的通孔添加至所述无孔袋的壁，以从所述无孔袋的内部抽取细胞培养基或其它液体。
本发明公开的无孔袋可具有与配件的通孔相连接的管道，用于收获所述无孔袋的内室中保存的液体。
所述无孔袋可具有多个设置有通孔和管道的配件，用于使含微载体珠子或细胞混悬液的培养基连续地流经该设备，使得随着培养基从所述内室流经所述整合的内袋、所述滤器并从所述通孔流出时可发生连续过滤。
在本发明的多种实施方案中，所述无孔袋为包括顶板和底板的二维一次性袋，或三维一次性台式生物反应器袋，或与支持结构一起使用的一次性生物反应器袋。所述无孔袋可为任意尺寸，例如10升、100升、200升、500升或5000升。
在本发明的一个实施方案中，所述无孔袋包括无孔性聚合物材料，其包括至少一个内壁部分，一片多孔性聚合物材料环绕着所述滤器的整个外周通过焊接(例如热焊接)直接连接至该内壁部分。该连接的滤器完全位于所述无孔袋内部，并在所述无孔袋内形成整合的内袋。所述滤器的一侧暴露于所述无孔袋中含有的大量液体(bulk fluid)。在所述滤器的另一侧，在所述滤器和所述无孔袋的内壁部分之间形成口袋。
图1是根据本发明的一个实施方案的二维收获和微载体回收袋20的部分的俯视图。矩形微孔性滤器(本文中称为“滤器”23)连接至该透明的无孔袋20的内壁表面。滤器23和筛22的边缘，透过无孔袋20的透明顶板28可见。管道26连接至配件24的收获通孔。另外的通孔30可用于例如填充所述无孔袋、喷洒或用于传感器的探针。
图2A显示收获和微载体回收袋21的另一个实施方案的俯视图。所述图1和图2A中所示的无孔袋的唯一区别在于，图2A所示的无孔袋21中的滤器是圆形或椭圆形的。
图2B是本发明公开的单次使用的收获和微载体回收袋21的顶板28的部分的剖视图，其显示袋外壁表面32、袋内壁表面34、滤器23(其围绕所述滤器23的整个周边在13处缝合焊接(seam-weld)至内壁表面34)以及自由浮动筛22(其夹在根据本发明的一个实施方案的袋21的滤器23和内壁表面34之间)。
所述筛22和所述滤器23可各自包括任何合适的材料，例如合适孔度的整合的聚乙烯(integrated polyethylene)。所述筛22可为自由浮动的并置于所述袋21的滤器23和内壁表面34之间，且所述滤器23围绕其周边缝合焊接至所述袋21的内壁表面34，因而在所述袋21内形成夹层。图2B显示，在围绕所述滤器23的周边的13处的缝合焊接在所述无孔袋21内形成具有多孔性壁的整合的内袋，该多孔性壁朝向所述无孔袋21的内室。
图3A提供了根据本发明的一个实施方案的连续回收的流经收获袋28的顶板32的俯视图47，以及所述袋28的底板50的仰视图48。收获通孔24在袋28的顶板32外侧的配件25处形成。筛(图3B中的22)在滤器23和顶板32的内壁表面之间自由浮动。在所述袋28的顶板内形成筛-滤器-袋的夹层结构35。袋28为连续回收的流经收获袋28，其可用于例如在生物反应器(未显示)中以连续或灌注模式培养细胞。在图3A和3B所示的实施方案中，所述滤器的面积约等于所述二维一次性袋的顶壁板的内壁表面的总面积。
在所述流经收获袋28的一个实施方案中，培养基和微载体珠子可从生物反应器流入流经袋28的底板50的通孔36之一中。参见例如图3B，其为根据本发明的一个实施方案的连续回收的流经收获袋28的截面图。在图3B中，所述袋内部54在一侧被底板50限制。箭头40表示培养基和微珠(或细胞)经过通孔并进入所述袋内部54的流动方向。箭头42表示培养基和珠子经过另一通孔从所述袋内部54流出并返回生物反应器(未显示)的方向。箭头44表示培养基从所述袋流出的方向，并将珠子留在所述袋内。
图3B的截面图显示，自由浮动筛22夹在所述袋28的滤器23和顶板32之间。所述滤器23在其周边焊接至袋28的顶板32，因而与所述袋28的顶板32形成整合的滤器袋。所述筛22简单地起到使所述滤器23与所述顶板32保持隔开的作用。在图3A和图3B中，配件25和收获通孔24显示位于顶板32中。在图3A中，通孔36之一可用于从所述生物反应器将培养基和珠子流入所述袋28，并且通孔36之一可用于将培养基和珠子从袋28流出并流回所述生物反应器。
图4是根据本发明的一个实施方案的二维连续回收的流经收获袋的顶部透视图。所述顶板32具有用于收获通孔的配件25以及连接至该收获通孔的管道26。
图5是图4所示的连续回收的流经收获袋的底板50的透视图。配件51可用于连接输送管，该输送管用于使培养基和珠子从生物反应器流入所述袋。管道52可用于使培养基和珠子流出所述袋并返回以连续、灌注模式操作的生物反应器中。
包括连接管道26的收获通孔24的配件与所述无孔袋28的壁部分连接，使得当液体(例如培养基)从所述无孔袋28的内部部分经过管道26抽出时，所述无孔袋28中的大量液体必须首先通过所述无孔袋28内的整合的内袋，并经过所述滤器或滤器23然后经过通孔24从所述无孔袋28流出并进入所述管道26。所述滤器23与所述无孔袋28完全整合，且允许液体通过并同时经机械过筛在所述无孔袋28中保留大于一定粒径的所有颗粒(例如微载体珠子)。
所述滤器23的面积可为任意大小，例如其可约等于所述袋28的内壁表面的面积。
在本发明的另一个实施方案中，所述滤器23的面积等于所述无孔袋28的内壁表面的面积的约2％至约95％。在本发明的另一个实施方案中，所述滤器的面积等于所述无孔袋28的内壁表面的面积的约25％至约50％。
在本发明优选的实施方案中，所述无孔袋28包括自由浮动筛22，其位于所述袋28的滤器23和内壁表面之间。在一个实施方案中，所述筛22的平均孔径大于所述滤器23的平均孔径。所述滤器的平均孔径可为例如约0.2微米至约200微米之间。
所述筛22辅助保持将所述滤器23与所述袋的内壁表面隔开。所述筛22透过所述袋28的透明顶部表面可见。
图2A显示所述无孔袋28的另一个实施方案，其中所述滤器23的形状为圆形。
本发明公开的无孔袋的滤器23可包括整合的聚乙烯滤器或高密度聚乙烯(HDPE)滤器。可为多孔性形式并且可为构成所述滤器23的合适材料的聚合物的其它非限制性实例包括：氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺(polyamideimide)、聚丙烯酸酯、聚苯并唑、聚碳酸酯、聚氰基芳基醚(polycyanoarylether)、聚酯、聚酯碳酸酯(polyestercarbonate)、聚醚、聚醚醚酮(polyetheretherketone)、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚二唑、聚苯醚(polyphenylene oxide)、聚苯硫醚(polyphenylene sulfide)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、再生纤维素、聚硅氧烷、及其共聚物或其物理混合物。
适用于根据本发明的实施方案的滤器的多孔性材料的另一个非限制性实例是一种多孔性基质，该基质由胶原和硫酸软骨素与戊二醛部分交联制成。另一个实例是聚交酯(polylactide)或聚乳酸(PLA)的高分子量聚合物。
在本发明的一个实施方案中，所述滤器23可为整合的聚乙烯滤器。所述孔径可取决于所选的微载体珠子的尺寸，或取决于当液体经滤器抽出时欲使之留在所述无孔袋中的其它颗粒的尺寸。孔径通常可为例如约0.2微米至约200微米。
可使用本发明公开的单次使用的收获和微载体回收袋的应用的非限制性实例包括：从细胞培养基分离微载体珠子，从细胞培养基或灌注培养液收获分离细胞。
实施例
为制备单次使用的收获和微载体回收袋，我们将微孔性聚合物薄片围绕其整个周边热焊接至柔性无孔袋的壁内部的部分，因而形成了整合的内袋，其包括：一个壁，其包括柔性无孔袋的部分，以及第二壁，其包括所述微孔性聚合物薄片。所述内袋的多孔性壁与所述柔性无孔袋的内部接触。所述内袋的无孔性壁包括所述无孔柔性袋的部分，其围绕其整个周边与该无孔柔性袋的部分连接。我们所用的无孔袋是聚乙烯袋。
将配件(包括形成收获通孔的配件)添加至所述无孔袋的外面。不将任何配件直接焊接至所述滤器。所述配件也由聚乙烯形成，但其密度比所述无孔袋的密度更高。所述配件根据多种因素可为各种尺寸和形状。构建的原型使用了半英寸(0.5英寸)软管倒钩(hosebarb)或3英寸卫生接头(sanitary fitting)作为所述配件。
当用于从培养基分离微载体珠子时，所述无孔袋内的整合的内袋的多孔性壁起到滤器的作用，将微载体珠子从所述袋内的其余溶液分离。液体可从所述无孔袋的内室中泵出，流经整合的内袋，经过微滤器23，并从所述收获通孔24流出并流入所述收获管道26，将所述微珠留在所述内室中。
遍及本说明书的描述和权利要求，词汇″包括″和″包含″及这些词汇的变体的意思是″包括但不限于″，且它们不意图(且不)排除其它部分、添加物、构件、整体或步骤。遍及本说明书的描述和权利要求，单数形式包括复数形式，除非上下文另有需要。特别地，在不定冠词使用之处，本说明书将被理解为考虑为复数或单数，除非上下文另有需要。
结合本发明具体的方面、实施方案或实施例公开的特征、整体、特性、化合物、化学部分或基团，应理解适用于本文公开的任何其它方面、实施方案或实施例中，除非与之不相容。本说明书中(包括附带的任何权利要求、摘要和附图)公开的所有这些特征和/或所公开的任何方法或工艺中的所有步骤可以任意地组合，除非至少一些所述特征和/或步骤的组合是互相排斥的。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明可扩展至本说明书中(包括附带的任何权利要求、摘要和附图)公开的特征的所有新特征或新组合，或扩展至所公开的方法步骤或工艺步骤的所有新步骤或新组合。
等同体
尽管本发明已参考其优选的实施方案具体示出和描述，本领域技术人员理解的是，其中可以进行各种形式上和细节上的变化，且本发明的原理和特征可以用在各种和许多实施方案中，而不背离由所附的权利要求包括的本发明的范围。

Claims (14)

1.一种能够保存液体的无孔容器，该容器包括：
外壁表面和内壁表面，所述内壁表面限定了用于保存液体的内室；
滤器，其具有周边、第一表面和第二表面，并且环绕其整个周边固定连接至所述无孔容器的内壁表面的部分，从而在所述无孔容器内形成整合的内袋；
第一配件，其在与所述整合的内袋相邻的外壁表面的部分连接至所述无孔容器的外壁表面，所述第一配件形成第一通孔，该第一通孔设置用于允许液体从内室经过滤器流入所述整合的内袋，并从所述第一通孔流出；
其中所述无孔容器为流经收获袋，并且还包含在底板上的通孔，配置用于流入来自生物反应器的培养基和微载体珠子，以及在所述底板上的另一通孔，配置用于流出并返回所述生物反应器中。
2.权利要求1的无孔容器，其中所述无孔容器包括柔性材料。
3.权利要求1的无孔容器，其中所述无孔容器包括可折叠袋。
4.权利要求3的无孔容器，其中所述可折叠袋为二维一次性袋。
5.权利要求1的无孔容器，其中所述滤器的面积等于所述容器的内壁表面的总面积。
6.权利要求1的无孔容器，其中所述滤器的面积等于所述无孔容器的内壁表面的面积的2%至95%。
7.权利要求6的无孔容器，其中所述滤器的面积等于所述无孔容器的内壁表面的面积的25%至50%。
8.权利要求1的无孔容器，其包括位于所述无孔容器的滤器与内壁表面之间的筛，所述筛具有的平均孔径大于所述滤器的平均孔径。
9.权利要求1的无孔容器，其中所述滤器包括整合的聚乙烯滤器。
10.权利要求1的无孔容器，其中所述滤器的平均孔径为0.2微米至200微米之间。
11.权利要求1的无孔容器，其包括用于收获无孔容器的内室中保存的液体的管道，所述管道连接至所述第一通孔的第一配件。
12.权利要求4的无孔容器，其中所述可折叠袋是二维一次性袋，其包括顶壁板和底壁板，且其中所述滤器连接至所述二维一次性袋的顶壁板的内壁表面的部分。
13.权利要求12的无孔容器，其中所述滤器的面积等于所述二维一次性袋的顶壁板的内壁表面的总面积。
14.一种用于收获培养基的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供权利要求1的流经收获袋，其中所述在底板上的通孔与生物反应器相连；
b) 使得来自所述生物反应器的培养基和微载体珠子流入所述底板上的一个通孔，并从另一个通孔流出并返回所述生物反应器；以及
c) 从所述第一个通孔收获培养基。
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