KR20230135601A - 세포 배양 시스템 - Google Patents

세포 배양 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20230135601A
KR20230135601A KR1020237026200A KR20237026200A KR20230135601A KR 20230135601 A KR20230135601 A KR 20230135601A KR 1020237026200 A KR1020237026200 A KR 1020237026200A KR 20237026200 A KR20237026200 A KR 20237026200A KR 20230135601 A KR20230135601 A KR 20230135601A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bag
interior compartment
port
microcarriers
fluid communication
Prior art date
Application number
KR1020237026200A
Other languages
English (en)
Inventor
캐티 캠벨
나탈리 페케테
레이 장
레이첼 제트. 피텔
로버트 고든 플리든
Original Assignee
생-고뱅 퍼포먼스 플라스틱스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 생-고뱅 퍼포먼스 플라스틱스 코포레이션 filed Critical 생-고뱅 퍼포먼스 플라스틱스 코포레이션
Publication of KR20230135601A publication Critical patent/KR20230135601A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Laminated Bodies (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은, 대체적으로, 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 태양은, 산소 투과성 백으로서, 백의 내부 구획의 경계를 한정하는 하나 이상의 중합체 필름 - 하나 이상의 중합체 필름 각각은, 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및 내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어를 포함하는, 산소 투과성 백이다.

Description

세포 배양 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/132291호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 이로써 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은, 대체적으로, 세포 배양 장치 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.
세포 배양 및 세포 분리는 다수의 응용에서 중요한 프로세스이다. 예를 들어, 치료 응용(예컨대, 면역요법, 재생 의학 등)에 사용하기 위한 소정 세포는, 전형적으로, 분리되고 체외에서 배양된다. 예를 들어, 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포, 및 단핵구 및 다른 면역 세포와 같은 세포는 비교적 낮은 농도로 혈액에 존재하고, 따라서, 전형적으로, 혈액으로부터 분리되고 체외에서 배양된다. 유사하게, 신경 세포, 심근세포, 상피 세포, 및 재생 의학(예컨대, 골 수복, 피부 수복, 췌도 재생 등)용 다른 세포가 체외에서 배양될 수 있다.
백 형태의 구매가능한 세포 배양 디바이스는 세포 배양에 사용되는 종래의 포맷이다. 세포 배양 백은 일회용이라는 이점을 갖는데, 이는 제조 및 소제 시간을 감소시킨다. 추가적으로, 세포 배양 백은 미리 멸균가능하고, 저렴하며, 사용하기 용이하고, 저장 및 사용을 위한 최소 공간을 필요로 한다. 일회용품은, 또한, 세포 배양 및 환경에 대한 오염의 위험을 감소시키는 것을 돕는다.
그러나, 그러한 백의 표면은, 전형적으로, 생존하기 위해 자연 세포 니치(niche)와 유사한 환경을 필요로 하는 부착 의존성 세포(anchorage-dependent cell)에 대한 불량한 접착 기재이다. 게다가, 그러한 백의 내부 표면적은 (예컨대, 총 백 부피와 비교하여) 비교적 제한된다.
따라서, 부착 의존성 세포의 개선된 배양을 용이하게 하는 세포 배양 및 분리 물품에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명의 일 태양은, 산소 투과성 백으로서, 접합되어 백의 내부 구획을 형성하는 에지를 갖는 하나 이상의 중합체 필름 - 하나 이상의 중합체 필름 각각은, 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및 내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어(microcarrier)를 포함하는, 산소 투과성 백이다.
본 발명의 다른 태양은, (예컨대, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 실시 형태에 따른) 백으로서, 분할되지 않은 내부 구획; 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제1 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고, 제1 액체 투과성 튜브는 튜브의 중심 루멘(lumen)을 한정하는 제1 내부 지지 구조체, 및 제1 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제1 외부 필터 층을 포함하는, 백이다.
본 발명의 다른 태양은, (예컨대, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 실시 형태에 따른) 백으로서, 분할되지 않은 내부 구획; 백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및 백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고, 제1 액체 투과성 튜브는 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백이다.
본 발명의 다른 태양은, (예컨대, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 실시 형태에 따른) 백으로서, 내부 구획의 제1 부분을 내부 구획의 제2 부분으로부터 분리하는 다공성 멤브레인 - 제2 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고, 제1 포트 및 제2 포트는 각각 내부 구획의 제1 부분과 유체 연통하고, 제3 포트는 내부 구획의 제2 부분과 유체 연통하는, 백이다.
본 발명의 다른 태양은, (예컨대, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 실시 형태에 따른) 백으로서, 내부 구획의 제1 측방향 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제1 다공성 멤브레인; 내부 구획의 제2 측방향 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제2 다공성 멤브레인 - 중심 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고, 제1 포트는 내부 구획의 제1 측방향 부분과 유체 연통하고, 제2 포트는 내부 구획의 제2 측방향 부분과 유체 연통하며, 제3 포트는 내부 구획의 중심 부분과 유체 연통하는, 백이다.
본 발명의 다른 태양은 부착 의존성 세포 및 배지를 (예컨대, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 실시 형태에 따른) 백에 추가하는 단계를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 방법이다.
도 1은 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 백의 개략적인 평면도(상부) 및 단면도(하부)이다.
도 2는 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 백의 구성에 사용하기에 적합한 중합체 필름의 부분 단면도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 액체 투과성 튜브의 개략적인 절결도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 액체 투과성 튜브의 개략적인 절결도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 백의 개략적인 평면도(상부) 및 단면도(하부)이다.
도 6은 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 백의 개략적인 단면도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 백의 개략적인 단면도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시 형태에 따른, 백의 개략적인 평면도이다.
도 9는 오토클레이브에서의 처리 후의 비교용의 구매가능한 플루오로중합체 백의 사진이다(실시예 1 참조).
도 10은 오토클레이브에서의 처리 후의, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 산소 투과성 백의 사진이다(실시예 1 참조).
본 발명은 세포 배양 백에서 부착 의존성 세포를 배양 및 분리하기 위한 물품 및 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 종래의 세포 배양 백 - 그의 표면은, 전형적으로, 부착 의존성 세포에 부적합한 기재임 - 이 또한 마이크로캐리어 세포 배양에 부적합할 수 있다는 것에 주목한다. 당업자가 인식할 바와 같이, "마이크로캐리어" 세포 배양은 이산된 마이크로미터 스케일 입자(예컨대, 구형 "마이크로캐리어" 또는 "마이크로비드")를 포함하며, 이의 표면은 부착 의존성 세포에 대한 접착 기재로서 기능할 수 있다.
본 발명자들은 세포 배양 백의 내부 표면이, 예를 들어 백 제조(예컨대, 멸균에 의해 초래되는 구조적 변화) 또는 사용(예컨대, 백 지지체 또는 백 로킹(rocking) 디바이스로부터의 불균일하게 인가되는 힘)에 기인하는 기계적 응력에 의해 왜곡될 수 있다는 것에 주목한다. 그러한 왜곡에 기인하는 백 표면 상의 매크로 스케일 특징부는 세포 배양 프로세스 동안 마이크로캐리어의 국소화 또는 "풀링(pooling)"을 야기하여, 백 부피 전체에 걸쳐 마이크로캐리어의 바람직하지 않은 불균일한 분포를 초래할 수 있다. 그러한 특징부는, 또한, 직접적으로(즉, 매크로 스케일 표면 특징부와 마이크로캐리어 사이의 충돌) 및 간접적으로(즉, 불균일하게 분포된 마이크로캐리어 집단의 "풀링된" 영역 내의 마이크로캐리어들 사이의 증가된 충돌) 캐리어 부착 세포(carrier-anchored cell)가 (예컨대, 교반 또는 로킹 동안) 받는 전단 응력 및 충돌 응력의 양을 상당히 증가시킬 수 있다.
유리하게는, 본 발명자들은 외부 중합체 층에 접착된 내부 플루오로중합체 층을 포함하는 산소 투과성 중합체 필름으로부터 형성된 배양 백의 내부 표면이, 바람직하게는, 제조(예컨대, 오토클레이브에서의 멸균) 및 사용(예컨대, 로킹 디바이스 상에서의 인큐베이션(incubation)) 전체에 걸쳐 비교적 왜곡되지 않은 상태로 유지될 수 있다고 결정하였다. 따라서, 세포 배양 프로세스 동안 백 내에 함유된 마이크로캐리어는 비교적 균일하게 분포된 상태로 유지될 수 있고, 전단력 및 충돌력에 대한 부착된 세포의 노출이 상당히 감소될 수 있다. 본 발명자들은, 또한, 그러한 백이, 유리하게는, 세포 배양 동안의 공급 배지의 최소 파괴적 제거 및 보충 및/또는 배양된 세포의 효율적인 회수를 용이하게 하는 하나 이상의 관류 구성요소를 포함할 수 있다고 결정하였다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 (예컨대, 접합되어 백을 형성하는 에지를 가짐으로써) 백의 내부 구획의 경계를 한정하는 하나 이상의 중합체 필름(예컨대, 제1 중합체 필름 및 제2 중합체 필름)을 포함하는 산소 투과성 백이다. 중합체 필름 각각은, 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함한다. 백은, 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트, 및 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트를 포함한다. 그리고, 백은, 내부 구획 내에, 복수의 마이크로캐리어를 함유한다.
상기에 기재된 바와 같이, 다양한 실시 형태에서, 산소 투과성 백은, 접합되어 백의 내부 구획을 형성하는 에지를 갖는 하나 이상의 중합체 필름 - 하나 이상의 중합체 필름 각각은, 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트; 백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및 내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어를 포함하는 산소 투과성 백의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 중합체 필름은, 함께 접합되어 백의 내부 구획 주위에 에지를 형성하는 에지를 갖는 제1 중합체 필름 및 제2 중합체 필름을 포함한다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 단일 중합체 필름이 절첩되고 그 자체에 접합되어 백을 형성할 수 있거나, 또는 튜브형 필름이 2개의 에지 상에 용접되어 백을 형성할 수 있다. 어떤 경우든, 2개의 별개의 필름이 사용될 때, 하나의 중합체 필름만이 본 명세서에서 설명되는 라미네이트 구조를 가질 필요가 있고; 다른 하나의 필름도 라미네이트 구조를 가질 수 있거나, 또는 그는 일부 상이한 구조를 가질 수 있다.
위에서 설명된 바와 같이, 중합체 필름들(즉, 라미네이트 중합체 필름들, 하나의 그러한 필름만이 백에 존재할 필요가 있음을 인식함) 각각은 플루오로중합체를 포함하는 내부 층을 포함한다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 내부 층은 실질적으로 플루오로중합체, 예컨대 적어도 80 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 98 중량%, 또는 적어도 99 중량%의 플루오로중합체를 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 내부 층은 작용화된 중합체-말단 기를 갖는 에틸렌-프로필렌(FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)(PFA), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVF), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌/에틸렌 공중합체(HTE), 클로로트라이플루오로에틸렌/비닐리덴플루오라이드 공중합체, 클로로트라이플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체, 에틸렌/클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체(ECTFE), 에틸렌/트라이플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 공중합체(ETFE), 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 공중합체(TFE/P), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체(FEP/HFP), 헥사플루오로프로필렌/테트라플루오로에틸렌/비닐리덴 공중합체(THV), 및 퍼플루오로(1-부테닐 비닐 에테르) 단일사이클로중합체로부터 선택된 하나 이상의 플루오로중합체를 포함한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 내부 층은 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 내부 층은, 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%)의 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함한다.
다양한 실시 형태에서, 내부 층은 (예를 들어, DSC에 의해 측정되는 경우) 비-결정질이거나, 용융 열이 2 J/g 미만인 비정질, 불소-포함 중합체로부터 선택되는 플루오로중합체를 포함한다. 예를 들어, 그러한 소정 실시 형태에서, 내부 층은 알킬 기가 1 또는 3 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 플루오르화 알킬 비닐 에테르 및 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 플루오로올레핀과 같은 작용성 또는 비작용성 단량체와 테트라플루오로에틸렌의 공중합체를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 비작용성 단량체는 헥사플루오로프로필렌(HFP), 클로로트라이플루오로 에틸렌(CTFE), PEVE, PMVE 및 퍼플루오로-(프로필렌 비닐 에테르)(PPVE) 중 하나 이상을 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 작용성 단량체는 퍼플루오로에틸 비닐 에테르(EVE), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2COOCH3(EVE-카르바메이트), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2SO2F(PSEPVE), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2CN(8CNVE), N3(CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2)3(EVE-트라이아진), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2CN(EVE-CN), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2OH(EVE-OH), CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2PO2(OH)2(EVE-P) CF2=CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2COOH(EVE-COOH), 및 2,2-비스트라이플루오로메틸-4,5-다이플루오로-1,3-다이옥솔(PDD) 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 내부 층은 하나 이상의 구매가능한 비정질 플루오로중합체, 예컨대 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 DuPont으로부터의 것인 TEFLON® SF60(TFE/PMVE/PEVE, 델라웨어주 윌밍턴 소재의 DuPont), TEFLON® SF61(TFE/PMVE/PEVE/EVE-P), TEFLON® SF50(TFE/HFP), Teflon® AF1600(PDD/TFE), 및 TEFLON® AF2130(PDD/CTFE); 일본 도쿄 소재의 Asahi Corporation으로부터의 것인 CYTOP®(CYTOP type A, CYTOP type M, CYTOP type S, 또는 CYTOP NM); 이스라엘 레호보트 소재의 MY Polymers Corporation으로부터의 것인 MY-133; 미국캘리포니아 카핀테리아 소재의 Nusil Corporation으로부터의 것인 LS-233를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, (예컨대, 실질적으로 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하는) 내부 층은 0.001 내지 0.7 mm, 예컨대 0.001 내지 0.4 mm, 또는 0.001 내지 0.1 mm, 또는 0.005 내지 0.7 mm, 또는 0.005 내지 0.4 mm, 또는 0.005 내지 0.1 mm, 또는 0.01 내지 0.7 mm, 또는 0.01 내지 0.4 mm, 또는 0.01 내지 0.1 mm의 두께를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 내부 층은, 적어도 95 중량%의 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하고, 0.01 내지 0.1 mm의 두께를 갖는다.
위에서 설명된 바와 같이, 중합체 필름들(즉, 라미네이트 중합체 필름들, 하나의 그러한 필름만이 백에 존재할 필요가 있음을 인식함) 각각은 중합체를 포함하는 외부 층을 포함한다. 다양한 중합체가 사용될 수 있으며, 당업자는, 특히 가스 투과성 및 주름성과 관련하여, 본 명세서의 개시내용에 기초하여 바람직한 중합체를 선택할 것이다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 외부 층에는 실질적으로 플루오로중합체가 없으며, 예컨대, 5% 초과의 플루오로중합체, 예컨대 1% 이하의 플루오로중합체를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 탄성중합체를 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, "탄성중합체" 또는 "고무"는 점탄성 특성 및 비교적 약한 분자간 힘을 가지면서 탄소, 수소, 산소 및/또는 규소를 포함하는 단량체로부터 형성된 중합체를 포함한다. 탄성중합체는, 전형적으로, 비교적 낮은 영률(Young's modulus) 및 비교적 높은 파괴 변형률을 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 탄성중합체, 예컨대 적어도 80 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 98 중량%, 또는 적어도 99 중량%의 탄성중합체를 포함한다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 천연 고무(NR), 합성 폴리아이소프렌 고무(IR), 폴리부타다이엔 고무(BR), 클로로프렌 고무(CR), 부틸 고무(IIR), 할로겐화 부틸 고무(CIIR, BIIR), 스티렌-부타다이엔 고무(SBR), 니트릴 고무(NBR) 및 수소화 니트릴 고무 (HNBR)와 같이 황 가황에 의해 경화된 불포화 고무를 하나 이상 포함한다. 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 에틸렌 프로필렌 고무(EPM), 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무(EPDM), 에피클로로하이드린 고무(ECO), 폴리아크릴 고무(ACM, ABR), 실리콘 고무(SI, Q, VMQ), 플루오로실리콘 고무(FSR, FVMQ), 플루오로탄성중합체(FKM, FEPM), 퍼플루오로탄성중합체(FFKM), 폴리에테르 블록 아미드(PEBA), 클로로설폰화 폴리에틸렌(CSM), 열가소성 실리콘을 포함하는 열가소성 우레탄(TPU), 예컨대 GENIOMER®, 사이클릭 올레핀 공중합체, 폴리올레핀 탄성중합체, 탄성중합체 PET, 및 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA)와 같은, 황 가황에 의해 비경화성인 불포화 고무를 하나 이상 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 하나 이상의 불포화 고무는 외부 층의 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 99 중량%)의 조합된 양으로 존재한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 하나 이상의 열가소성 폴리우레탄 또는 열경화성 폴리우레탄을 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 외부 층은 폴리올의 폴리에스테르 및 폴리에테르 등급 둘 모두를 포함하는, 메틸렌 다이아이소시아네이트(MDI) 또는 톨루엔 다이아이소시아네이트(TDI)에 기초한 열가소성 폴리우레탄과 같은 열가소성 폴리우레탄(TPU)을 하나 이상 포함한다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 Bayer Materials Science의 상표명 "TEXIN", Lubrizol의 상표명 "ESTANE", Dow Chemical Co.의 상표명 "PELLETHANE", 및 BASF, Inc.의 상표명 "ELASTOLLAN"을 포함하는 구매가능한 "예비중합체"에 기초하는 열가소성 폴리우레탄을 하나 이상 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 하나 이상의 열가소성 폴리우레탄 또는 열경화성 폴리우레탄이 외부 층의 적어도 80 중량%(예를 들어, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 99 중량%)의 조합된 양으로 존재한다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 하나 이상의 열가소성 실리콘, 예컨대 GENIOMER® 140 Silicone TPE, GENIOMER® 200 Silicone TPE Elastomer(90% 폴리다이메틸실록산 및 아이소시아네이트), GENIOMER®, 60 Silicone TPE, GENIOMER® 80 Silicone TPE 또는 GENIOMER® 145 TPE를 포함하고, 이들 모두는 90% 폴리다이메틸실록산 및 아이소시아네이트를 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 하나 이상의 열가소성 실리콘은 외부 층의 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 99 중량%)의 조합된 양으로 존재한다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 외부 층은 폴리메틸펜텐(PMP)(즉, 메틸펜텐 단량체 단위의 열가소성 중합체)을 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 외부 층은, 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%)의 폴리메틸펜텐을 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 실리콘 고무를 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 외부 층은, 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%)의 실리콘 고무를 포함한다.
소정의 그러한 실시 형태에서, 외부 층은, 예를 들어, 다이메틸실록산, 다이에틸실록산, 다이프로필실록산, 메틸에틸실록산, 및 메틸프로필실록산 중 하나 이상으로부터 형성된 폴리알킬실록산을 포함하는 실리콘 중합체 매트릭스를 포함하는 실리콘 고무를 포함한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 실리콘 고무는, 예를 들어, 폴리다이메틸실록산(PDMS)과 같은 폴리다이알킬실록산을 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 실리콘 중합체는 비교적 비극성이며 할라이드 작용기(예를 들어, Cl, Br) 및 페닐 작용기가 실질적으로 없다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 양 말단에서 비닐다이메틸실록시 기로 말단 블로킹된 폴리다이메틸실록산, 양 말단에서 비닐다이메틸실록시 기로 말단 블로킹된 다이메틸실록산-비닐메틸실록산 공중합체, 및 양 말단에서 비닐다이메틸실록시 기로 말단 블로킹된 다이메틸실록산-메틸페닐실록산 공중합체로부터 선택되는 하나 이상의 폴리오르가노실록산을 포함한다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 실리콘 고무는 백금 촉매된 액체 실리콘 고무(LSR) 또는 고주도 검 고무(high consistency gum rubber, HCR)를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 실리콘 고무는 과산화물 촉매된 실리콘 고무(LSR) 또는 고주도 검 고무(HCR), 예컨대, 예를 들어, Saint-Gobain이 생산한 과산화물 기반 실리콘인 SILMEDIC®을 포함한다. HCR 실리콘 고무의 예는 GE Plastics로부터 입수가능한 GE 94506 HCR이다. 그리고 LSR 실리콘 고무의 예에는 미국 미시간주 아드리안 소재의 Wacker Silicone에 의한 Wacker 3003 및 미국 캘리포니아주 벤투라 소재의 Rhodia Silicones에 의한 Rhodia 4360이 포함된다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, (예컨대, 실질적으로 폴리메틸펜텐 또는 실리콘 고무를 포함하는) 외부 층은 0.01 내지 5 mm, 예컨대 0.01 내지 1 mm, 또는 0.01 내지 0.5 mm, 또는 0.05 내지 5 mm, 또는 0.05 내지 1 mm, 또는 0.05 내지 0.5 mm, 또는 0.1 내지 5 mm, 또는 0.1 내지 1 mm, 또는 0.1 내지 0.5 mm의 두께를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 외부 층은, 적어도 95 중량%의 폴리메틸펜텐을 포함하고 0.1 내지 0.5 mm의 두께를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다른 바람직한 실시 형태에서, 외부 층은, 적어도 95 중량%의 실리콘 고무를 포함하고, 0.1 내지 0.5 mm의 두께를 갖는다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 내부 층은 0.001 내지 0.7 mm의 두께를 갖고, 외부 층은 0.01 내지 5 mm의 두께를 갖는다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 내부 층은 0.01 내지 0.4 mm의 두께를 갖고, 외부 층은 0.05 내지 1 mm의 두께를 갖는다. 다른 예를 들면, 다양한 실시 형태에서, 내부 층은 0.01 내지 0.1 mm의 두께를 갖고, 외부 층은 0.1 내지 0.5 mm의 두께를 갖는다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 내부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함한다.
위에서 설명된 바와 같이, 중합체 필름의 내부 층 및 외부 층은 함께 접착된다. 다양한 실시 형태에서, 접착된 층은 코팅 프로세스에 의해 형성된다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 접착된 내부 층 및 외부 층은 중합체 층(예를 들어, 탄성중합체 층) 상에 캐스팅가능한(castable) 플루오로중합체 조성물을 분산시키는 생성물이다. 물론, 다른 그러한 실시 형태에서, 접착된 층은 플루오로중합체 층 상에 캐스팅가능한 중합체 조성물(예를 들어, 캐스팅가능한 탄성중합체 조성물)을 분산시킨 생성물이다. 당업자는 "캐스팅가능한" 중합체(예를 들어, 플루오로중합체 또는 비-플루오로중합체)가 액체 담체 매질에 분산, 용해, 현탁, 유화 또는 달리 분포되어, 지지 재료 상에 침착되어 중합체 층을 형성할 수 있는 중합체 조성물을 제공할 수 있음을 이해할 것이다. 물론, "캐스팅가능한" 중합체는 또한, 용융되거나 그렇지 않으면 액체 상태로 가공된 다음 냉각되거나 그렇지 않으면 (예를 들어, UV, IR, 개시제 또는 전자빔(ebeam)에 의해) 경화되어 고체 중합체 층을 형성할 수 있는 그러한 중합체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 중합체를 캐스팅하기 위한 적합한 담체 액체(예를 들어, DMAC, NMP, 글리콜 에테르, 물) 및 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 접착된 층은 화학 결합을 수반하는 코팅 프로세스에 의해 형성된다. 예를 들어, 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 (예를 들어, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하고, 내부 플루오로중합체 층은 실리콘 고무에 결합할 수 있는 반응성 화합물을 함유한 플루오로중합체 조성물을 캐스팅한 생성물이다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 반응성 화합물은, 예를 들어 실록산 결합을 갖는 화합물, 알콕시실릴 기를 갖는 실란 커플링제, 클로로실릴 기 또는 실라잔을 갖는 작용성 실란, 아미노-실란, 및 실릴화제와 같은 탄화수소 규소-함유 화합물로부터 선택된다. 이들 중, 실록산 결합을 갖는 화합물, 및 알콕시실릴 기를 갖는 실란 커플링제가 바람직하다. 다양한 실시 형태에서, 반응성 화합물은 실록산 결합(예를 들어, 말단-개질된 다이메틸실록산, 축합-유형 또는 첨가-유형 액체 실리콘, 실리케이트 염, 및 아크릴 실리콘 중합체)을 갖는다.
예를 들어, 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 (예를 들어, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하고, 이에 접착된 내부 플루오로중합체 층은 아미노-실란 말단 개질된 플루오로중합체(예를 들어, CYTOP type M) 또는 카르복실 기 말단 개질된 플루오로중합체(예를 들어, CYTOP type A)를 포함하고 선택적으로 커플링제를 포함한 조성물을 캐스팅한 생성물이다. 그러한 실시 형태에서, 화학적 결합에 의한 접착은 축합, 알킬화, 아미드화, 실릴화, 에테르화(예를 들어, 직접 또는 커플링제를 통함) 중 하나 이상에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 내부 플루오로중합체 층은 하이드록실, 아미노, 또는 황 기와 반응하는 아이소시아네이트 화합물을 포함한 조성물을 캐스팅한 생성물이다. 다른 실시 형태에서, 플루오로중합체 층은 수소 결합을 통해 외부 층에 접착된다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다른 실시 형태에서, 내부 층 및 외부 층은 화학 결합, 접착 접합, 열 융착 접합, 용매 접합, 레이저 용접, 표면 처리, 압출, 공압출, 및 라미네이션 중 하나 이상에 의해 접합된다. 예를 들어, 소정의 바람직한 실시 형태에서, (예를 들어, 실질적으로 플루오르화 에틸렌 프로필렌을 포함하는) 내부 층 및 (예를 들어, 실질적으로 실리콘 고무를 포함하는) 외부 층은 C-처리(Saint-Gobain Performance Plastics Corporation, 미국 특허 제6,726,979호), 코로나 방전, 플라즈마 처리, 및 에칭으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 처리에 의해 접합된다. 다른 실시 형태에서, 내부 층 및 외부 층은 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 처리 방법과 함께 사용될 수 있는 첨가제 또는 프라이머를 수반하는 화학적 처리에 의해 접합된다.
예를 들어, 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 내부 층은 실질적으로 (예를 들어, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌-프로필렌(예를 들어, C- 처리된 플루오르화 에틸렌-프로필렌)을 포함하고, 이에 접착된 외부 층은 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 액체 실리콘 고무(LSR) 실리콘으로 (예를 들어, 압출에 의해) 프라이밍 및 코팅한 생성물이다. 다른 실시 형태에서, 내부 층 및 외부 층은 (예컨대, LIGHTSWITCH® 완제품(미국 펜실베이니아주 밸리 포지 소재의 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation)에 대한 것과 유사하게) 함께 사전-라미네이팅된다.
본 발명자들은 본 명세서에 기재된 백의 내부 층이 바람직하게는 낮은 총 유기 탄소(TOC)를 가질 수 있다는 것에 주목하고 있다. 당업자는 "총 유기 탄소"가 유기 화합물 내의 결합된 탄소의 양이고, 무엇보다도 종종 약제학적 제조 장비의 비-특이적 지표로서 사용됨을 이해할 것이다. 총 유기 탄소는 정제 및 분배 시스템을 채용하는 유닛 작업의 성능을 모니터링하기 위한 생명공학 산업에서 공정 제어 속성으로서 이용된다.
총 유기 탄소는 백의 내부 표면적 또는 다른 물품의 표면적으로부터의 추출에 의해 측정된다(그 결과는 표면적의 제곱 센티미터당 총 추출가능한 유기 탄소를 mg/cm2의 단위로 제공함). 주어진 부피의 정제수와 70℃에서 24시간 동안 접촉됨으로써 물질이 추출된다.
플루오르화 에틸렌 프로필렌 백(즉, FEP 필름을 사용함)의 총 유기 탄소 값의 일례는 0.01 mg/cm2 미만이다. 실리콘 배관의 경우, 추출 비는 14.6 cm2/mL(예를 들어, Biosil)일 수 있거나 15.9 cm2/mL(예를 들어, SR139)일 수 있고, 실리콘 Biosil 튜브의 총 유기 탄소 값의 일례는 0.021 mg/cm2이고, 실리콘 SR139 배관의 총 유기 탄소 값의 일례는 0.008 mg/cm2이다. 적어도 소정의 실리콘 배관의 경우, 추출의 부피 및 농도로 인해 값은 기계의 최대 검출을 초과하기 때문에, 샘플을 희석할 수 있다. 희석 및 상이한 추출 비는 중량/면적 값을 제공하기 위해 이들 샘플과 백 샘플의 비교를 필요로 한다.
본 명세서에서 정량화된 바와 같이, 총 유기 탄소는 UV-촉진된 화학적 산화의 고온 습식 산화 반응을 이용하는 장비를 사용하여 미국 약전(USP) 643에 따라 측정된다(문헌[Ultra-Cleaning Technology Handbook: Volume 1: Ultra-Pure Water, Ohmi, Tadahiro; CRC Press, 1993, pp. 497-517]). 3 ㎠의 물품 표면적 대 1 mL의 물의 비로 정제수를 70℃에서 24시간 동안 중합체와 접촉하게 배치한다. 물은 중합체와의 접촉으로부터 제거되고 TOC 분석기에서 시험된다. 적합한 하나의 장비는 TEKMAR DOHRMANN Model Phoenix 8000 TOC 분석기이다.
따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백을 구성하는 중합체 필름들 중 하나 이상(예컨대, 각각)은 가스 투과성이고, 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만, 예컨대 0.5 mg/cm2 미만, 또는 0.1 mg/cm2 미만, 또는 0.01 mg/cm2 미만, 또는 0.001 mg/cm2 미만인 내부 층을 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 중합체 필름 각각은 물 중 총 유기 탄소가 0.001 mg/cm2 내지 0.1 mg/cm2, 예컨대 0.001 mg/cm2 내지 0.075 mg/cm2, 또는 0.001 mg/cm2 내지 0.05 mg/cm2, 또는 0.001 mg/cm2 내지 0.01 mg/cm2인 내부 층을 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하고, 내부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌 프로필렌을 포함하며, 내부 층은 물 중 총 유기 탄소가 0.001 mg/cm2 내지 0.05 mg/cm2, 예컨대 0.001 mg/cm2 내지 0.01 mg/cm2이다.
위에서 설명된 바와 같이, 백은 산소 투과성이다. 본 발명자들은 본 명세서에서 설명되는 산소 투과성 중합체 필름이 세포 배양에 필요한 가스 교환(예컨대, 산소의 보충)을 용이하게 하여, 백으로의 또는 그로부터의 하나 이상의 추가 가스 공급에 대한 필요성을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다는 것에 주목한다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백을 구성하는 중합체 필름들 중 적어도 하나(예컨대, 각각)는 하루에 적어도 100 cc/m2, 예컨대 하루에 적어도 500 cc/m2, 또는 하루에 적어도 1,000 cc/m2, 또는 하루에 적어도 2,000 cc/m2의 가스 투과율(예컨대, 산소 투과율)을 갖는다. 본 명세서에서 정량화된 바와 같이, 산소 투과율은 25℃에서 ASTM D3985에 따라 MOCON Ox-tran 2/21H 산소 분석기로 측정된다. 필름 투과율의 다른 태양에서, 정규화된 단위(cc-mm/m2-day)가 사용되어 임의의 두께의 필름을 보여줄 수 있다. 예를 들어, 5mm 필름에 대한 변환된 범위는 25℃의 온도에서 약 12.7 cc-mm/m2-day 내지 적어도 약 279 cc-mm/m2-day일 것이다. 구조체/복합재의 투과율은 cc/m2 단위로 표현될 수 있는데, 이는 2개의 층으로 구성될 것이기 때문이다.
또한 본 발명자는 본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 백이 바람직하게 (예를 들어, 축적된 이산화탄소의 제거를 용이하게 하기 위해) 이산화탄소에 대해 투과성일 수 있음을 주목한다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 백을 구성하는 중합체 필름들 중 적어도 하나(예컨대, 각각)는 하루에 적어도 5,000 cc/m2, 예컨대 하루에 적어도 10,000 cc/m2, 또는 하루에 적어도 15,000 cc/m2, 또는 하루에 적어도 20,000 cc/m2의 이산화탄소 투과율을 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백을 구성하는 중합체 필름들 중 적어도 하나(예컨대, 각각)는 하루에 10,000 내지 40,000 cc/m2, 예컨대 하루에 15,000 내지 35,000 cc/m2, 또는 하루에 20,000 내지 30,000 cc/m2의 이산화탄소 투과율을 갖는다. 본 명세서에서 정량화된 바와 같이, 이산화탄소 투과율은 필름의 양면 상에서 25℃, 100% CO2, 및 0% 상대 습도에서 ASTM F2476에 따라 MOCON Permatran-C 441 CO2TR 분석기로 측정된다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 외부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하고, 내부 층은 실질적으로 (예컨대, 적어도 80 중량%, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌 프로필렌을 포함하며, 중합체 필름들 중 적어도 하나(예컨대, 각각)는 하루에 1000 내지 25,000 cc/m2의 범위 내의 가스 투과율 및 0.1 mg/cm2 미만의 물 중 총 유기 탄소를 갖는다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 중합체 필름 각각은 물 중 총 유기 탄소가 0.001 mg/cm2 내지 0.1 mg/cm2, 예컨대 0.001 mg/cm2 내지 0.075 mg/cm2, 또는 0.001 mg/cm2 내지 0.05 mg/cm2, 또는 0.001 mg/cm2 내지 0.01 mg/cm2인 내부 층을 포함한다.
위에서 설명된 바와 같이, 백은, 내부 구획 내에, 복수의 마이크로캐리어를 함유한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 백의 내부 구획 내에 함유된 마이크로캐리어는 다공성이고 (예컨대, 수성 세포 배양 배지에서) 비분해성이다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 또는 셀룰로스를 포함한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 마이크로캐리어 표면은 양 또는 음으로 하전된 작용기(예를 들어, 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 셀룰로스 등에 공유 부착됨)를 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 실질적으로 폴리스티렌이고, 산소-함유 작용기(예를 들어, 폴리스티렌에 공유 부착됨)를 포함하는 순-음으로 하전된 표면을 갖는다. 당업자는 그러한 "표면-처리된" 마이크로캐리어가 셀 부착 및/또는 확산을 용이하게 하는 비교적 친수성 표면을 가질 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 달리 기재된 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 하나 이상의 세포외 매트릭스 화합물, 예를 들어 콜라겐 I, 폴리-L-라이신, 피브로넥틴, 레트로넥틴, 히알루론산, 폴리도파민을 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 실질적으로 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 또는 셀룰로스를 포함하는 코어 입자의 표면에 공유 부착된 하나 이상의 세포외 매트릭스 화합물(예를 들어, 콜라겐 또는 폴리도파민)을 포함한다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 다른 실시 형태에서, 마이크로캐리어는, 적어도 90 중량%, 예컨대 적어도 95 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 98 중량%, 또는 적어도 99 중량%, 또는 적어도 99.5 중량%의 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 또는 셀룰로스 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm, 예컨대 100 내지 300 μm, 또는 100 내지 275 μm, 또는 110 내지 400 μm, 또는 110 내지 300 μm, 또는 110 내지 275 μm, 또는 120 내지 400 μm, 또는 120 내지 300 μm, 또는 120 내지 275 μm의 평균 직경을 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 1 내지 1.25 g/mL, 예컨대 1 내지 1.15 g/mL, 또는 1 내지 1.1 g/mL의 평균 밀도를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 0.1 내지 10 cm2/mg, 예컨대 0.1 내지 7.5 cm2/mg, 또는 0.5 내지 10 cm2/mg, 또는 0.5 내지 7.5 cm2/mg, 또는 1 내지 10 cm2/mg, 또는 1 내지 7.5 cm2/mg의 평균 비표면적을 갖는다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 내부 구획 내에 함유된 복수의 마이크로캐리어의 조합 질량(즉, 그램 단위) 대 내부 구획의 부피(즉, 리터 단위)의 비는 1 내지 15 g/L, 예컨대 1 내지 12.5 g/L, 또는 1 내지 10 g/L, 또는 2.5 내지 15 g/L, 또는 2.5 내지 12.5 g/L, 또는 2.5 내지 10 g/L, 또는 5 내지 15 g/L, 또는 5 내지 12.5 g/L, 또는 5 내지 10 g/L이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 마이크로캐리어는 0.1 내지 10 cm2/mg(예컨대, 0.5 내지 10 cm2/mg)의 평균 비표면적을 갖고, 내부 구획 내에 함유된 복수의 마이크로캐리어의 조합 질량 대 내부 구획의 부피의 비는 1 내지 15 g/L(예컨대, 2.5 내지 10 g/L)이다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 내부 구획 내에 함유된 복수의 마이크로캐리어는 백의 내부 구획에 인접한 내부 층의 총 표면적의 적어도 100%, 예컨대 적어도 500%, 또는 적어도 1,000%, 또는 적어도 5,000%, 또는 적어도 10,000%인 총 표면적을 갖는다.
위에서 설명된 바와 같이, 본 명세서에서 설명되는 백은, 유리하게는, 세포 배양 동안 불균일한 마이크로캐리어 분포 및/또는 바람직하지 않은 전단력 및 충돌력에 대한 부착된 세포의 노출을 제한할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 부착 의존성 세포 및 배양 배지를 본 명세서에서 설명되는 백에 추가하는 단계를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 방법이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 세포는 혈액 세포 또는 면역 세포를 포함한다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 세포는 줄기 세포, 다능성 간질 세포, 간세포, 각질세포, 내피 세포, 상피 세포, 뉴런이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 세포는, 예를 들어 연골세포 유사, 조골세포 유사, 또는 지방세포 유사 분화 줄기 세포와 같은 분화 줄기 세포이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 세포는 내피 전구 세포, 중간엽 간질 세포, 또는 예를 들어 단핵구와 같은 느슨하게 부착된 세포이다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다수의 부착 의존성 세포가 백에 추가되어, 1,000개 내지 10,000개의 세포/cm2, 예컨대 1,000개 내지 9,000개의 세포/cm2, 또는 1,000개 내지 7,500개의 세포/cm2, 또는 2,500개 내지 10,000개의 세포/cm2, 또는 2,500개 내지 9,000개의 세포/cm2, 또는 2,500개 내지 7,500개의 세포/cm2, 또는 3,500개 내지 10,000개의 세포/cm2, 또는 3,500개 내지 9,000개의 세포/cm2, 또는 3,500개 내지 7,500개의 세포/cm2의, 복수의 마이크로캐리어의 총 표면적에 대한 세포의 비율을 제공한다.
백은 원하는 인큐베이션 온도로 유지될 수 있고, 교반될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은 백을 로킹하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은, (예컨대, 부착된 세포를 트립신에 노출시킴으로써) 배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계, 및 이어서, (예컨대, 백의 내부 구획 내에 마이크로캐리어를 보유하도록 구성된 필터를 통해) 배양된 세포를 백으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
위에서 설명된 바와 같이, 본 명세서에서 설명되는 백은, 유리하게는, 하나 이상의 관류 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백은 분할되지 않은 내부 구획, 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브, 및 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함한다. 그러한 실시 형태에서, 제1 액체 투과성 튜브는 튜브의 중심 루멘을 한정하는 제1 내부 지지 구조체, 및 제1 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제1 외부 필터 층을 포함한다. 본 발명자들은, 바람직하게는, 공급 배지가, 배지를 제2 튜브로부터 내부 용적부를 통해 그리고 제1 튜브 밖으로 유동시킴으로써, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 백의 내부 구획을 통해 관류될 수 있다는 것에 주목한다. 제1 튜브의 제1 필터 층은 마이크로캐리어가 내부 구획의 내부 용적부를 빠져나가는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 부착 의존성 세포는 공급 배지 공급 제한 및/또는 폐기물 제거 제한 없이 내부 구획 내에서 성장 및 농축될 수 있다. 존재하는 경우, 제3 포트는 배지 샘플링 및 내부 구획 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은, 유리하게는, 세포 배양 프로세스 후에, 배양된 세포가 마이크로캐리어로부터 탈착되고 제1 필터 층(예컨대, 이는 내부 구획 내에 마이크로캐리어를 보유함)을 통해 백으로부터 제거될 수 있다는 것에 주목한다.
그러나, 당업자는 다양한 방식으로 제1 및 제2 포트 중 하나 이상에 대해 필터, 즉 예컨대 마이크로캐리어가 관류 동안 백을 떠나는 것을 방지하기 위해 그를 통해 내부 구획을 빠져나가는 배지를 여과하는 데 적합한 필터를 배열할 수 있다.
특히, 그러한 실시 형태에서, 내부 구획은 분할되지 않을 수 있다(예컨대, 내부 구획을 분할하는 멤브레인 또는 다른 다공성 구조체가 없어서, 제1 튜브 및 제2 튜브가 제1 하위 구획 내에 있게 하고, 제3 포트가 멤브레인 또는 다른 다공성 구조체에 의해 제1 하위 구획으로부터 분할된 제2 하위 구획에 연결되게 함). 본 발명자들은 이것이, 유리하게는, 인큐베이팅 세포와 관류된 배지 사이의 양호한 유체 전달을 허용할 수 있다는 것에 주목한다.
그러한 백의 일 실시 형태가 도 1에 개략적인 평면도(상부) 및 단면도(하부)로 도시되어 있다. 도 1의 백(100)은 장축(132)을 갖는 분할되지 않은 내부 구획(130) 주위에 에지를 형성하도록 그의 에지에서 함께 접합되는 제1 중합체 필름(110) 및 제2 중합체 필름(120)을 포함한다. 백(100)은 둘 모두 내부 구획(130)과 유체 연통하는 제1 포트(140) 및 제2 포트(150)를 추가로 포함한다. 도 1의 특정 실시 형태에서, 제1 포트(140)는 제1 액체 투과성 튜브(170)에 작동식으로 결합되고, 제2 포트(150)는 제2 액체 투과성 튜브(180)에 작동식으로 결합된다. 도 1의 실시 형태에서, 백(100)은 내부 구획(130)과 유체 연통하는 제3 포트(160)를 추가로 포함하지만; 당업자는 제3 포트가 본 명세서에서 고려되는 모든 실시 형태에 존재할 필요가 없다는 것을 인식할 것이다. 마이크로캐리어(135)가 내부 구획(130) 내에 배치될 수 있다.
도 2는 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 백, 예컨대 도 1의 백의 구성에 사용하기에 적합한 중합체 필름의 부분 단면도이다. 여기에서, 중합체 필름(110)은 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 플루오로중합체를 포함하는(예컨대, 플루오로중합체인) 내부 층(111), 및 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 중합체(예컨대, 비-플루오르화 중합체)를 포함하는(예컨대, 중합체인) 외부 층(112)을 갖는다.
본 명세서에서 설명되는 백은 다양한 부피로 제공될 수 있다. 특별히 제한되지는 않지만, 내부 구획의 부피는, 예를 들어, 5 mL 내지 3500 mL, 예컨대 10 mL 내지 500 mL, 또는 10 mL 내지 100 mL, 또는 100 mL 내지 3000 mL, 또는 500 mL 내지 2500 mL, 또는 500 mL 내지 2000 mL의 범위 내에 있을 수 있다. 그러나, 당업자가 인식할 바와 같이, 상이한 부피의 백도 고려된다.
본 명세서에서 설명되는 백은, 바람직하게는, 제1 포트와 제2 포트 사이에서 유동함으로써 내부 용적부의 상당한 부분을 통한 배지의 관류를 허용하도록 구성된다.
예를 들어, 위에서 설명된 도 1의 것과 같은, 제1 튜브 및 제2 튜브를 포함하는 백의 다양한 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브는 백의 제1 측방향 에지에 인접하게 배치되고, 제2 튜브는 백의 제2, 반대편 측방향 에지에 인접하게 배치되며; 다양한 실시 형태에서, 각각은 백의 측방향 에지의 2 cm 내에 있다. 예를 들어, 도 1의 실시 형태에서, 제1 튜브(170)는 제1 측방향 에지(134)에 인접하게 배치되고, 제2 튜브(180)는 제1 측방향 에지(134)로부터 백의 반대편 측부 상에 있는 제2 측방향 에지(136)에 인접하게 배치된다. 튜브는, 예를 들어, 서로 실질적으로 평행할 수 있는데, 예컨대 서로의 20도 내에 또는 심지어 10도 내에 있을 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브 및 제2 튜브는 백의 장축의 방향을 따라 연장된다. 예를 들어, 도 1의 실시 형태에서, 제1 튜브(170) 및 제2 튜브(180)는 백의 장축(132)의 방향을 따라 연장된다. 물론, 튜브는 다른 실시 형태에서 임의의 적합한 방식으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브 및 제2 튜브는 만곡되고, 둥근 백의 측방향 에지를 따라 연장된다.
물론, 다른 실시 형태에서, 튜브는 포함되지 않는다. 다양한 실시 형태에서, 그를 통해 백을 빠져나가는 배지를 여과하도록 구성되는 필터가 제1 포트 및 제2 포트 중 하나 이상에 배치될 수 있다. 필터는 세포가 통과하게 허용하도록 그러나 마이크로캐리어가 백의 외측으로 통과하는 것을 방지하도록 구성될 수 있다.
제1 포트, 제2 포트 및 (존재하는 경우) 제3 포트는 백을 따라 다양한 위치에 위치될 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 제1 포트 및 제2 포트는 백의 에지, 예컨대 백 내로의 튜브의 연장 방향에 직교하게 연장되는 에지에 형성된다. 이는 도 1의 백에 도시된 바와 같이 동일한 에지 내에, 또는 서로 반대편인 에지들 내에 있을 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같은 튜브를 포함하는 실시 형태에서, 이는 제1 포트 및 제2 포트의 상대 위치가 공통 방향을 따른(예컨대, 백의 장축을 따른) 제1 액체 투과성 튜브 및 제2 액체 투과성 튜브의 연장을 용이하게 하도록 허용한다. 제3 포트는, 예를 들어, 제1 포트 및 제2 포트 중 하나 또는 둘 모두와 동일한 에지를 따라 형성될 수 있고; 도 1의 실시 형태에서, 포트(140, 150, 160)는 공통 에지를 따라 있다. 그러나, 제3 포트는, 대안적으로, 제1 포트 및 제2 포트가 형성되는 에지(들)에 직교하는 에지를 따라, 또는 대안적으로 백의 다른 표면을 따라, 예컨대 세포의 중력 보조 제거를 허용하기 위해 하단 표면을 따라 있을 수 있다. 제1 포트 및 제2 포트(및 그에 결합된 제1 튜브 및 제2 튜브)의 상대 위치가 백의 상당한 부피를 통한 관류를 용이하게 한다면, 포트의 위치는 특별히 제한되지 않는다. 당업자는, 본 발명에 기초하여, 예컨대 백 내의 관류 유동의 데드 스폿(dead spot)을 최소화하도록, 그리고/또는 관류 유동이 세포 성장을 방해하지 않는 것을 보장하도록, 제1 포트 및 제2 포트, 및 임의의 구조체(예를 들어, 제1 튜브 및 제2 튜브)를 배열할 것이다. 존재할 때, 제3 포트는, 예컨대 배지 샘플링 및 백의 내부 용적부 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입을 용이하게 하도록 위치될 수 있다.
본 명세서에서 설명되는 바와 같은 백을 형성하기 위해, 하나 이상의 중합체 필름의 에지는 임의의 바람직한 방법, 예를 들어 RF 용접, 열 임펄스 용접, 초음파 용접, 핫 바 용접(hot bar welding), 화학 결합, 접착 접합, 열 융착 접합, 용매 용접, 레이저 용접, 코로나 방전, 방사선, 표면 처리, 극한 열, 벨트, 또는 용융 라미네이션, 에칭, 플라즈마 처리, 압출, 습윤, 접착제, 또는 이들의 조합에 의해 (예컨대, 동일한 중합체 필름의 다른 에지에, 또는 하나 초과의 중합체 필름의 경우 서로) 접합될 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 필름은 열, 레이저, 또는 핫 바 용접에 의해 접합된다.
존재할 때, 제1 튜브 및 제2 튜브는, 칼라 밀봉(collar sealing) 프로세스에 의해(예컨대, RF 용접, 초음파 용접, 열 임펄스 용접, 핫 바 용접, 화학 결합, 접착 접합, 열 융착 접합, 용매 용접, 레이저 용접, 코로나 방전, 방사선, 극한 열 또는 용융 라미네이션, 에칭, 플라즈마 처리, 습윤, 접착제, 또는 이들의 조합에 의해), 백의 하나 이상의 에지 내에 형성된 각자의 제1 포트 및 제2 포트에 부착될 수 있다. 이는 백의 형성 시에 행해질 수 있다. 제1 튜브는 그의 외부 필터 층이 세포가 내부 구획으로부터 튜브를 통해 그리고 제1 포트 밖으로 투과되는 것을 방지할 수 있도록 (예컨대, 칼라 밀봉에 의해) 밀봉될 수 있다. 따라서, 제1 튜브 및/또는 제2 튜브는 백의 외측으로부터 백의 내측으로 연장될 수 있다(이때 그의 다공성 부분은, 바람직하게는, 실질적으로 백 내에서만 연장됨). 물론, 다른 실시 형태에서, 제1 튜브 및/또는 제2 튜브는 백에서 종단될 수 있고, 다른 배관을 통해 유체 시스템에 연결될 수 있으며; 그러한 다른 배관은 제1 유체 투과성 튜브 및 제2 유체 투과성 튜브에 대해 본 명세서에서 설명되는 바와 동일한 재료로부터 제조될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브(예컨대, 도 1의 튜브(170))는 튜브의 중심 루멘을 한정하는 제1 내부 지지 구조체, 및 제1 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제1 외부 필터 층을 포함한다. 본 명세서에서 상세히 설명되는 바와 같이, 제1 내부 지지 구조체는, 예컨대 천공된 또는 달리 다공성인 튜브, 프레임, 또는 나선형 권취 필라멘트와 같이, 다양한 형태를 취할 수 있다. 지지 구조체는 본 명세서의 도면에 도시된 바와 같이 단면이 둥글 수 있거나, 다른 단면 형상, 예컨대 다각형 형상을 가질 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 지지 구조체 및 외부 필터 층의 재료는 친수성, 자가 습윤성, 및/또는 튜브를 통한 액체 유동이 최소 압력으로 개시되거나 유지될 수 있도록 하는 충분한 다공성의 것이다.
그러한 유체 투과성 튜브의 일 실시 형태가 도 3에 절결도로 도시되어 있다. 도 3의 튜브(300)는 나선형 권취 필라멘트(372), 및 필라멘트를 둘러싸는 외부 필터 층(374)을 포함한다. 외부 필터 층(374)은, 적어도 포트(예컨대, 도 1의 포트(140))에서 나선형 권취 필라멘트(372)에 부착되지만, 필라멘트를 따라 하나 이상의 추가 지점에서 나선형 권취 필라멘트(372)에 부착될 수 있다. 외부 필터 층은 (예컨대, 필라멘트(372) 위의 느슨한 백으로서) 나선형 권취 필라멘트를 비교적 느슨하게 둘러쌀 수 있거나, 또는 (예컨대, 필라멘트(372) 위의 밀착(close-fitting) 슬리브로서) 나선형 권취 필라멘트에 대해 더 밀착되어 배치될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 내부 지지 구조체는 나선형 권취 필라멘트를 포함한다. 물론, 필라멘트가 튜브의 중심 루멘을 한정하고 제1 외부 필터 층을 지지할 수 있다면, 필라멘트는 비교적 강성이거나 비교적 가요성일 수 있고 비교적 밀착되어 또는 비교적 느슨하게 권취될 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필라멘트는 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인 중합체를 포함한다(예컨대, 중합체임). 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 필라멘트는 (예컨대, 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인) 플루오로중합체, 폴리메틸펜텐, 또는 이들의 조합을 포함한다(예컨대, 그로 형성됨).
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, (즉, 중심 루멘의 축을 따른) 나선형 권취 필라멘트의 간격은 복수의 마이크로캐리어의 평균 크기와 거의 동등하거나 심지어 그보다 더 크다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 나선형 권취 필라멘트의 간격은 적어도 500 μm, 또는 500 μm 내지 10 mm, 또는 500 μm 내지 7.5 mm, 또는 500 μm 내지 5 mm의 범위 내에 있다. 본 발명자들은 100 μm 초과의 간격을 갖는 튜브가, 유리하게는, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 바람직한 유량으로의 배양 배지 관류를 용이하게 할 수 있다고 결정하였다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다른 실시 형태에서, 지지 구조체는, 예컨대 필라멘트 형상의 재료로부터 형성되지만 나선형으로와는 상이하게 배열되는 프레임으로서 제공될 수 있다. 필라멘트 및 필라멘트의 간격은 나선형 권취 필라멘트에 대해 위에서 설명된 바와 같을 수 있다.
본 명세서에 달리 제공되는 바와 같은 다른 실시 형태에서, 지지 구조체는 다공성 튜브의 형태일 수 있다. (예컨대, 도 1의 튜브(170)로서 사용하기 위한) 하나의 그러한 실시 형태가 도 4에 절결도로 도시되어 있다. 도 4의 튜브(470)는 다공성 튜브(472), 및 다공성 튜브를 둘러싸는 외부 필터 층(474)을 포함한다. 외부 필터 층은, 적어도 포트(예컨대, 도 1의 포트(140))에서 다공성 튜브에 부착되지만, 필라멘트를 따라 하나 이상의 추가 지점에서 다공성 튜브에 부착될 수 있다. 외부 필터 층은 (예컨대, 다공성 튜브(472) 위의 백으로서) 다공성 튜브를 비교적 느슨하게 둘러쌀 수 있거나, 또는 (예컨대, 다공성 튜브(472) 위의 슬리브로서) 다공성 튜브에 대해 더 밀착되어 배치될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 내부 지지 구조체는 제1 다공성 튜브를 포함한다. 물론, 튜브가 제1 외부 필터 층을 지지할 수 있다면, 튜브는 비교적 가요성이거나 비교적 강성일 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인 중합체를 포함한다(예컨대, 그로 형성됨). 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 (예컨대, 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인) 탄성중합체, 플루오로중합체, 폴리메틸펜텐, 또는 이들의 조합을 포함한다(예컨대, 그로 형성됨). 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 (예컨대, 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인) 실리콘 또는 폴리비닐 클로라이드를 포함한다(예컨대, 그로 형성됨). 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 실리콘 탄성중합체를 포함한다. 다른 예에서, 소정의 그러한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 플루오르화 에틸렌 프로필렌을 포함한다. 그러나, 다른 적합한 재료와 마찬가지로, 다양한 플루오르화 중합체 및 비-플루오르화 중합체가 달리 사용될 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 100 μm 내지 5,000 μm의 범위 내의 평균 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브의 평균 기공 크기는 100 내지 2500 μm, 또는 100 내지 1000 μm, 또는 250 내지 5000 μm, 또는 250 내지 2500 μm, 또는 250 내지 1000 μm, 또는 500 내지 5000 μm, 또는 500 내지 2500 μm, 또는 500 내지 1000 μm이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 평균 기공 크기는 편리한 광학 측정에 대해 기공이 너무 작은 경우에 모세관 유동 기공측정법을 통해 측정된다. 당업자는 10 μm 내지 5,000 μm의 범위 내의 기공 크기가 대부분의 마이크로캐리어의 크기와 거의 동등하거나 그보다 더 클 수 있음을 인식할 것이다. 그러나, 본 발명자들은 다공성 튜브가, 유리하게는, 특히 외부 필터 층과 함께 사용될 때, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 바람직한 유량으로의 배양 배지 관류를 용이하게 할 수 있다고 결정하였다.
다공성 튜브는 넓은 범위 내의 다공도를 가질 수 있고; 당업자는 기계적 안정성과 유량의 원하는 조합을 제공하는 다공도를 선택할 것이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브는 10% 내지 90%의 범위 내의 다공도를 갖는다. 당업자는 재료의 총 부피에 대한 물품 내의 기공의 부피의 측정치인 다공도가 다수의 알려진 다공도측정 방법에 의해 측정될 수 있다는 것을 인식할 것이고; 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 편리한 광학 측정에 대해 기공이 너무 작은 경우에 튜브의 다공도를 측정하기 위해 물 증발이 사용된다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브의 다공도는 20% 내지 90%, 또는 30% 내지 90%, 또는 40% 내지 90%, 또는 50% 내지 90%, 또는 10% 내지 80%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70%, 또는 40% 내지 60%의 범위 내에 있다.
다공성 튜브의 다공도는 다수의 당업계에 알려진 방법들, 예컨대 성형, 열 천공, 레이저 드릴링, 전자 빔 드릴링, 전기 방전 기계가공, 기계적 드릴링, 스탬핑 또는 절단 중 임의의 것에 의해 제공될 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 다공성 튜브의 다공도의 대부분은 제2 액체 투과성 튜브의 반대편인 표면(예컨대, 반원통 표면) 상에 국부화된다. 유리하게는, 본 발명자들은 제2 액체 투과성 튜브로부터 멀어지는 튜브의 다공도의 배향이 배양된 세포의 방해 및/또는 제2 액체 투과성 튜브로부터 제1 액체 투과성 튜브로의 배양 배지 관류에 의해 초래되는 마이크로캐리어의 감소를 추가로 최소화할 수 있다고 결정하였다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 다공성 튜브의 다공도의 적어도 65%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%는 제2 액체 투과성 튜브의 반대편인 표면(예컨대, 반원통 표면) 상에 국부화된다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 다공성 튜브의 다공도는, 즉 백의 장축을 따른 균일한 관류를 용이하게 하기 위해, 액체 투과성 튜브의 중심 루멘의 축을 따라 비교적 균일하게 분포된다.
위에서 설명된 바와 같이, 제1 튜브는 제1 내부 지지 구조체 주위에 배치되는 제1 외부 필터 층을 포함할 수 있다. 제1 외부 필터 층은, 마이크로캐리어가 관류 동안 백을 빠져나가는 것을 방지하는 것을 돕도록 선택되는 평균 기공 크기를 갖는 다공성 재료로 형성된다. 다양한 실시 형태에서, 평균 기공 크기는 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 크기보다 더 작도록 선택된다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다. 당업자는 200 μm 이하의 기공 크기가 대부분의 마이크로캐리어와 거의 동등하거나 그보다 더 작을 수 있음을 인식할 것이다 - 놀랍게도, 본 발명자들은 (예컨대, 배양된 세포에 비해 작은 기능적 기공 크기를 갖는) 외부 필터 층과 (예컨대, 배양된 세포에 비해 큰 기능적 기공 크기 또는 간격을 갖는) 내부 지지 구조체의 조합이, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 바람직한 유량으로의 배양 배지의 관류를 용이하게 할 수 있다고 결정하였음. 그러나, 필터 기공 크기가 마이크로캐리어 크기보다 다소 더 클 때에도, 필터는 관류 동안 내부 용적부로부터의 마이크로캐리어의 상당한 손실을 방지하는 데 효과적일 수 있다.
소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 직경의 약 100% 미만, 예컨대 약 75% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만의 평균 기공 크기 및/또는 D99 기공 크기를 갖는다.
당업자는 필터 층의 "기능적" 기공 크기가 층 내의 기공의 평균 크기 및 최대 크기 둘 모두에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필터 층의 D99 기공 크기(즉, 크기가 99번째 백분위수에 있는 기공의 크기)는 필터 층의 평균 기공 크기와 최대 100%, 예컨대 최대 50%, 최대 30%, 또는 최대 10%만큼 상이하다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필터 층의 D99 기공 크기는 500 μm 미만, 예컨대 250 μm 미만, 또는 200 μm 미만, 또는 150 μm 미만이다.
그러나, 당업자가 인식할 바와 같이, 제1 외부 필터 층의 작은 평균 기공 크기는 백을 통한 유동을 늦출 수 있다. 따라서, 당업자는, 원하는 마이크로캐리어에 대한 여과를 제공하기에 충분히 작지만 백을 통한 원하는 유량을 제공하기에 충분히 큰 기공 크기를 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 백 내에 함유된 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm의 평균 직경을 갖고, 제1 외부 필터 층의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm이다(예컨대, 그리고 마이크로캐리어의 평균 직경보다 더 작음).
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인 중합체를 포함한다(예컨대, 그로 형성됨). 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 스테인리스 강을 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제1 외부 필터 층은 중합체 코팅된 스테인리스 강(예컨대, 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅된 스테인리스 강)을 포함한다.
그러나, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 백의 다른 실시 형태에서, 제1 튜브는 지지 구조체와는 별개의 필터 층을 포함하지 않고, 대신에, 제1 외부 필터 층에 대해 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 평균 기공 크기를 갖는 튜브이다. 이는, 예를 들어, (예컨대, 용접에 의해) 다공성 필름 재료를 튜브로 형성함으로써, 또는 원하는 기공 크기를 갖는 강성 튜브형 재료를 제공함으로써 제조될 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브는 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브는, 예컨대 제1 외부 필터 층과 관련하여 위에서 설명된 바와 같이, 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 직경의 약 100% 미만, 예컨대 약 75% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만의 평균 기공 크기 및/또는 D99 기공 크기를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브의 D99 기공 크기(즉, 크기가 99번째 백분위수에 있는 기공의 크기)는 튜브의 평균 기공 크기와 최대 50%, 예컨대 최대 30%, 또는 최대 10%만큼 상이하다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브의 D99 기공 크기는 50 μm 미만, 예컨대 20 μm 미만이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브는 10 μm 미만의 D99 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 튜브의 D99 기공 크기는 500 μm 미만, 예컨대 250 μm 미만, 또는 200 μm 미만, 또는 150 μm 미만이다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제1 튜브는 강성이며, 즉 그를 통해 유동하는 유체의 압력 없이 그의 단면 형상을 유지하기에 충분히 강성이다.
제2 액체 투과성 튜브(예컨대, 도 1의 튜브(180))는, 대체적으로, 백의 내부 구획 내로 배지를 투입하는 데 사용되기 때문에, 많은 실시 형태에서 그는 필터층을 가질 필요가 없다. 따라서, 다양한 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브는, 외부 필터 층 없이, 제1 액체 투과성 튜브의 다공성 튜브 지지 구조체에 대해 위에서 설명된 바와 같을 수 있다. 제2 액체 투과성 튜브는 다양한 다른 튜브형 구조를 취할 수 있다.
그러나, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다른 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브는 튜브의 중심 루멘을 한정하는 제2 내부 지지 구조체, 및 제2 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제2 외부 필터 층을 포함한다. 그리고 다른 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브는 평균 기공 크기가 200 μm 이하인 튜브이다. 그러한 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브는 제1 액체 투과성 튜브에 대해 본 명세서의 임의의 실시 형태에서 달리 설명된 바와 같을 수 있다. 유리하게는, 그러한 백은 위에서 설명된 바와 같은 - 제2 튜브로부터 내부 체적부를 통해 그리고 제1 튜브 밖으로의 - 배지 유동뿐만 아니라 역방향으로의 배지 유동도 허용한다. 본 발명자들은, 그러한 실시 형태에서 관류의 방향을 역전시킴으로써, 세포가 제1 외부 필터 층으로부터 제거될 수 있지만 내부 구획 내에 보유될 수 있다고 결정하였다. 물론, 그러한 "양방향" 백은, 또한, 사용자에 의한 더 편리한 셋업 및 작동을 용이하게 할 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브의 내부 지지 구조체 및 외부 필터 층은 제1 액체 투과성 튜브의 임의의 실시 형태와 관련하여 본 명세서에서 설명되는 바와 같다. 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같은 구조체는 다양한 실시 형태에서 제2 액체 투과성 튜브로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제2 내부 지지 구조체는 나선형 권취 필라멘트(예컨대, 위에서 설명된 나선형 권취 필라멘트)를 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제1 액체 투과성 튜브의 제1 내부 지지 구조체도 나선형 권취 필라멘트를 포함한다. 유사하게, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 다른 실시 형태에서, 제2 내부 지지 구조체는 프레임 구조체를 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제1 액체 투과성 튜브의 제1 내부 지지 구조체도 프레임 구조체를 포함한다.
다른 예에서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제2 내부 지지 구조체는 다공성 튜브(예컨대, 위에서 설명된 바와 같은 다공성 튜브)를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제1 내부 지지 구조체는 제1 다공성 튜브를 포함하고, 제2 내부 지지 구조체는 제2 다공성 튜브를 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제2 다공성 튜브(예컨대, 및 제1 다공성 튜브)는 100 내지 2500 μm, 또는 100 내지 1000 μm, 또는 250 내지 5000 μm, 또는 250 내지 2500 μm, 또는 250 내지 1000 μm, 또는 500 내지 5000 μm, 또는 500 내지 2500 μm, 또는 500 내지 1000 μm의 범위 내의 기능적 기공 크기를 갖는다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제2 다공성 튜브(예컨대, 및 제1 다공성 튜브)는 10% 내지 90%, 또는 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70%의 범위 내의 다공도를 갖는다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 제2 다공성 튜브의 다공도의 적어도 60%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 제1 액체 투과성 튜브의 반대편인 표면(예컨대, 반원통 표면) 상에 국부화된다(예컨대, 그리고 제1 다공성 튜브의 다공도의 적어도 60%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 90%는 제2 액체 투과성 튜브의 반대편인 표면(예컨대, 반원통 표면) 상에 국부화됨). 다양한 실시 형태에서, 제2 다공성 튜브(예컨대, 및 제1 다공성 튜브)는 실리콘 탄성중합체를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 제2 외부 필터 층(예컨대, 및 제1 외부 필터 층)은 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제2 외부 필터 층의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다. 다양한 실시 형태에서, 제2 외부 필터 층(예컨대, 및 제1 외부 필터 층)은 스테인리스 강, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함한다.
그리고 다른 실시 형태에서, 제2 액체 투과성 튜브는 제2 지지 구조체 및 제2 외부 필터 층을 포함하지 않는 튜브이지만, 대신에, 제2 외부 필터 층에 대해 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 기공 크기를 갖는 튜브의 형태이다. 이는, 예를 들어, (예컨대, 용접에 의해) 다공성 필름 재료를 튜브로 형성함으로써, 또는 원하는 기공 크기를 갖는 강성 튜브형 재료를 제공함으로써 제조될 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제2 튜브는 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 제2 튜브의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제2 튜브는, 예컨대 제1 외부 필터 층과 관련하여 위에서 설명된 바와 같이, 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 직경의 약 100% 미만, 예컨대 약 75% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만의 평균 기공 크기 및/또는 D99 기공 크기를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제2 튜브의 D99 기공 크기(즉, 크기가 99번째 백분위수에 있는 기공의 크기)는 제2 튜브의 평균 기공 크기와 최대 50%, 예컨대 최대 30%, 또는 최대 10%만큼 상이하다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 제2 튜브는 강성이며, 즉 그를 통해 유동하는 유체의 압력 없이 그의 단면 형상을 유지하기에 충분히 강성이다.
제2 액체 투과성 튜브가 위에서 설명된 바와 같이 제2 필터 층에 의해 커버되거나 작은 기공 크기를 갖는 경우에, 제3 포트가 백의 내부 용적부 내로의 세포의 도입 및/또는 그로부터의 세포의 제거를 단순화하기 위해 존재하는 것이 바람직할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 제1 및/또는 제2 포트에서의 여과가 본 명세서에 제공된 튜브형 구조체 이외의 것에 의해 제공될 수 있음을 고려한다. 예를 들어, 필터는 제1 포트에 작동식으로 결합될 수 있고/있거나, 또는 필터는 제2 포트에 작동식으로 결합될 수 있다. 다른 예에서, 필터는 포트를 세포 배양 시스템의 다른 부분에 연결하도록 작용하는 커넥터 내로 삽입될 수 있다. 이들 필터는, 대체적으로, 위에서 설명된 것과 동일한 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시 형태에서, 평균 기공 크기는 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 크기보다 더 작도록 선택된다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 필터는 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 필터의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다. 당업자는 200 μm 이하의 기공 크기가 대부분의 마이크로캐리어와 거의 동등하거나 그보다 더 작을 수 있음을 인식할 것이다 - 그러나, 필터 기공 크기가 마이크로캐리어 크기보다 다소 더 클 때에도, 필터는 관류 동안 내부 용적부로부터의 마이크로캐리어의 상당한 손실을 방지하는 데 효과적일 수 있음. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필터는 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 직경의 약 100% 미만, 예컨대 약 75% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만의 평균 기공 크기 및/또는 D99 기공 크기를 갖는다. 당업자는 필터의 "기능적" 기공 크기가 층 내의 기공의 평균 크기 및 최대 크기 둘 모두에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필터의 D99 기공 크기(즉, 크기가 99번째 백분위수에 있는 기공의 크기)는 필터의 평균 기공 크기와 최대 100%, 예컨대 최대 50%, 최대 30%, 또는 최대 10%만큼 상이하다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 필터의 D99 기공 크기는 500 μm 미만, 예컨대 250 μm 미만, 또는 200 μm 미만, 또는 150 μm 미만이다. 그러나, 당업자가 인식할 바와 같이, 필터의 작은 평균 기공 크기는 백을 통한 유동을 늦출 수 있다. 따라서, 당업자는, 원하는 마이크로캐리어에 대한 여과를 제공하기에 충분히 작지만 백을 통한 원하는 유량을 제공하기에 충분히 큰 기공 크기를 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 바람직한 실시 형태에서, 백 내에 함유된 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm의 평균 직경을 갖고, 필터의 평균 기공 크기는 50 내지 200 μm이다(예컨대, 그리고 마이크로캐리어의 평균 직경보다 더 작음).
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 본 명세서에서 설명되는 백이 마이크로캐리어 세포 배양을 통해 배지를 관류시키는 데 유용하다고 결정하였다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은, 내부 구획(예컨대, 내부 구획(130)) 내에 (예컨대, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같이) 배지 및 세포를 포함하는, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 백(예컨대, 도 1의 백(100))을 제공하는 단계, 및 제2 포트(예컨대, 포트(150))를 통해(그리고 제2 액체 투과성 튜브(예컨대, 튜브(180))를 통해) 배지를 추가하고 제1 포트(예컨대, 포트(140))를 통해(존재하는 경우, 제1 액체 투과성 튜브(예컨대, 튜브(170))를 통해) 배지를 제거함으로써 내부 구획을 통해 배지를 유동시키는 단계를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 방법이다. 다양한 그러한 실시 형태에서, 내부 구획 내에 배지 및 세포를 포함하는 백은, 백의 외부 표면 내에 형성되고 백의 내부 구획과 유체 연통하는 제3 포트(예컨대, 포트(160))를 통해 백에 배지 및 세포를 추가함으로써 제공될 수 있다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 특히 제3 포트가 존재하지 않을 때, 제1 또는 제2 포트는 백에 배지 및 세포를 수용하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 0.5 내지 20 mL/분의 범위에서 다양한 유량이 사용될 수 있으며, 유량은, 바람직하게는, 마이크로캐리어가 배양 배지 중에 현탁된 상태로 유지되도록 허용하기에 충분히 낮다. 물론, 정상 작동 과정에 걸쳐, 유량은 (예컨대, 우발적으로, 또는 세포 활성에 기초하여) 변할 수 있거나, 심지어 불연속적일 수 있다. 따라서, 다른 예에서, 유량은 하루에 0.2 내지 2개의 백 부피 대체물의 범위 내에 있을 수 있다. 백은 관류 동안 원하는 인큐베이션 온도로 유지될 수 있고, 로킹되거나 달리 교반될 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은, (예컨대, 마이크로캐리어 부착 세포의 수를 원하는 제1 레벨로 증가시키기에 충분한) 인큐베이션 기간 후에, (예컨대, 배양된 세포에 이용가능한 접착 기재의 총 면적을 증가시키기 위해) 추가의 복수의 마이크로캐리어를 백에 추가하는 단계를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 추가의 복수의 마이크로캐리어(예컨대, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 마이크로캐리어를 포함함)는, 백의 외부 표면 내에 있고 백의 내부 구획과 유체 연통하는 제3 포트(예컨대, 포트(160))를 통해.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은, (예컨대, 마이크로캐리어 부착 세포의 수가 원하는 최종 레벨로 증가한 후에) 배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계, 및 이어서, 배양된 세포를 백의 내부 구획으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 마이크로캐리어로부터 부착 세포를 분리하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계는 (예컨대, 제2 포트를 통해 유동되는) 공급 배지에 트립신을 추가하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은, 유리하게는, 마이크로캐리어가, 예를 들어 제1 튜브 주위에 배치된 제1 외부 필터 층이든, 제1 다공성 튜브든, 어떤 다른 필터든, 제1 포트에 작동식으로 결합된 필터에 의해, 내부 구획 내에 보유되는 동안, 배양된 세포가 제1 포트(예컨대, 포트(140))를 통해(존재하는 경우, 제1 액체 투과성 튜브(예컨대, 튜브(170))를 통해) 백의 내부 구획으로부터 제거될 수 있다는 것에 주목한다.
그러나, 본 발명자들은 제1 포트 또는 제2 포트에 대해 작동식으로 결합되는 필터가 본 발명의 시스템 및 방법에서 요구되지 않는다는 것에 주목한다. 일부 실시 형태에서, 유동은 마이크로캐리어의 상당한 부분을 백 밖으로 밀어내는 것을 회피하도록 제어될 수 있다. 그러나, 다른 실시 형태에서, 마이크로캐리어가 배치되는 내부 구획의 용적부로부터 제1 포트 및 제2 포트를 연통시키는 내부 구획의 용적부(들)를 분리하는 데 다공성 멤브레인이 사용될 수 있다. 멤브레인의 기공 크기가 마이크로캐리어의 크기보다 다소 더 클 때에도, 멤브레인은, 제1 포트와 제2 포트 사이의 유동이 마이크로캐리어를 방해하고 가져가 버리도록 허용하지 않고서, 구획들 사이의 배지의 교환을 허용할 수 있다.
따라서, 다른 예에서, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 백은 관류 멤브레인을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백은 내부 구획의 제1 부분을 내부 구획의 제2 부분으로부터 분리하는 제1 다공성 멤브레인 - 제2 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -, 및 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함한다. 그러한 실시 형태에서, 제1 포트 및 제2 포트는 각각 내부 구획의 제1 부분과 유체 연통하고, 제3 포트는 내부 구획의 제2 부분과 유체 연통한다. 본 발명자들은, 바람직하게는, 공급 배지가, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 내부 구획의 제2 부분 내에 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 백의 내부 구획의 제1 부분을 통해 관류될 수 있다는 것에 주목한다. 본 발명자들은, 바람직하게는, 공급 배지가, 제1 포트와 제2 포트 사이의 내부 용적부를 통해 배지를 유동시킴으로써, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 백의 내부 구획을 통해 관류될 수 있다는 것에 주목한다. 내부 구획을 분할하는 다공성 멤브레인은 마이크로캐리어가 내부 구획의 제2 부분을 빠져나가는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 부착 의존성 세포는 공급 배지 공급 제한 및/또는 폐기물 제거 제한 없이 제2 부분 내에서 성장 및 농축될 수 있다. 제3 포트는 배지 샘플링 및 내부 구획의 제2 부분 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은, 유리하게는, 세포 배양 프로세스 후에, 배양된 세포가 마이크로캐리어로부터 탈착되고 다공성 멤브레인(즉, 이는 내부 구획 내에 마이크로캐리어를 보유함)을 통해 백으로부터 제거될 수 있다는 것에 주목한다. 다른 실시 형태에서, 제3 포트는 제1 포트 및 제2 포트와 관련하여 위에서 설명된 바와 같이 그에 작동식으로 결합되는 필터를 가질 수 있으며, 이는 백으로부터의 마이크로캐리어의 제거 없이 세포가 수확되도록 허용할 수 있다.
그러한 백의 일 실시 형태가 도 5에 개략적인 평면도(상부) 및 단면도(하부)로 도시되어 있다. 도 5의 백(500)은 내부 구획 주위에 에지를 형성하도록 그의 에지에서 함께 접합되는 제1 중합체 필름(510) 및 제2 중합체 필름(520)을 포함하고, 내부 구획은 다공성 멤브레인(530)에 의해 제1 부분(540) 및 제2 부분(550)으로 분리된다. 백(500)은, 각각 내부 구획의 제1 부분(540)과 유체 연통하는 제1 포트(560) 및 제2 포트(570), 및 내부 구획의 제2 부분(550)과 유체 연통하는 제3 포트(580)를 추가로 포함한다.
백은, 바람직하게는, 제1 포트와 제2 포트 사이에서 유동함으로써 내부 용적부의 상당한 부분을 통한 배지의 관류를 허용하도록 구성된다. 당업자는, 본 발명에 기초하여, 예컨대 백 내의 관류 유동의 데드 스폿을 최소화하도록, 그리고/또는 관류 유동이 세포 성장을 방해하지 않는 것을 보장하도록, 제1 포트 및 제2 포트를 배열할 것이다. 제3 포트는, 예컨대 배지 샘플링 및 백의 제2 부분 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입을 용이하게 하도록 위치될 수 있다.
다른 예(도시되지 않음)에서, 백은, 제1 부분 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제1 포트에 작동식으로 결합되는 (예컨대, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은) 제1 액체 투과성 튜브, 및 제1 부분 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 (예컨대, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은) 제2 액체 투과성 튜브를 포함한다. 소정의 그러한 실시 형태에서, 튜브는, 예를 들어, 서로 실질적으로 평행하고 백의 서로 반대편인 에지들에 인접하게 배치될 수 있다(예컨대, 다공성 멤브레인에 걸친 유동 배지의 분포를 증가시킴).
도 5의 실시 형태에서, 내부 구획은 제1 중합체 필름(510) 및 다공성 멤브레인(520)에 의해 경계지어지는 제1 부분(540), 및 제2 중합체 필름(520) 및 다공성 멤브레인(530)에 의해 경계지어지는 제2 부분(550)으로 분할된다. 물론, 내부 구획은 그렇게 균일하게 분할될 필요는 없다. 예를 들어, 도 6의 실시 형태에서, 백(600)은 내부 구획 주위에 에지를 형성하도록 그의 에지에서 함께 접합되는 제1 중합체 필름(610) 및 제2 중합체 필름(620), 및 제2 중합체 필름(620)에 접합되는 에지를 갖는, 내부 구획을 제1 부분(640) 및 제2 부분(650)으로 분리하는 다공성 멤브레인(630)을 포함한다. 다른 예에서, 도 7의 실시 형태에서, 백은 내부 구획 주위에 에지를 형성하도록 그의 에지에서 함께 접합되는 제1 중합체 필름(710) 및 제2 중합체 필름(720), 및 절첩되고 그의 에지에서 접합되어 내부 구획을 제1 부분(740) 및 제2 부분(750)으로 분리하는 다공성 멤브레인(730)을 포함한다. 그러한 실시 형태에서, 당업자는, 예컨대 백 내의 관류 유동의 데드 스폿을 최소화하도록, 관류 유동이 세포 성장을 방해하지 않는 것을 보장하도록, 백의 제2 부분으로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입을 용이하게 하도록, 그리고/또는 백 내의 유체 샘플링 또는 모니터링의 원하는 위치를 제공하도록, 본 명세서에서 설명되는 제1 포트, 제2 포트, 및 제3 포트를 위치시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 백은 내부 구획의 제1 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제1 다공성 멤브레인, 내부 구획의 제2 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제2 다공성 멤브레인 - 중심 부분은 마이크로캐리어를 함유함 -, 및 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함한다. 그러한 실시 형태에서, 제1 포트는 내부 구획의 제1 부분과 유체 연통하고, 제2 포트는 내부 구획의 제2 부분과 유체 연통하며, 제3 포트는 내부 구획의 중심 부분과 유체 연통한다. 본 발명자들은, 바람직하게는, 공급 배지가, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 내부 구획의 중심 부분 내에 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 백의 내부 구획의 중심 부분을 통해 관류될 수 있다는 것에 주목한다. 본 발명자들은, 바람직하게는, 공급 배지가, 배지를 제2 튜브로부터 내부 용적부를 통해 그리고 제1 튜브 밖으로 유동시킴으로써, 부착된 세포를 눈에 띄게 방해하고/하거나 함유된 마이크로캐리어의 수를 감소시키지 않고서, 백의 내부 구획을 통해 관류될 수 있다는 것에 주목한다. 내부 구획을 분할하는 다공성 멤브레인은 마이크로캐리어가 내부 구획의 중심 부분을 빠져나가는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 부착 의존성 세포는 공급 배지 공급 제한 및/또는 폐기물 제거 제한 없이 중심 부분 내에서 성장 및 농축될 수 있다. 제3 포트는 배지 샘플링 및 내부 구획의 중심 부분 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은, 유리하게는, 세포 배양 프로세스 후에, 배양된 세포가 마이크로캐리어로부터 탈착되고 다공성 멤브레인(즉, 이는 중심 구획 내에 마이크로캐리어를 보유함)을 통해 백으로부터 제거될 수 있다는 것에 주목한다.
그러한 백의 일 실시 형태가 도 8에 개략적인 평면도로 도시되어 있다. 도 8의 백(800)은 내부 구획 주위에 에지를 형성하도록 그의 에지에서 함께 접합되는 제1 중합체 필름(810) 및 제2 중합체 필름(도시되지 않음)을 포함하며, 내부 구획은 제1 다공성 멤브레인(820)에 의해 제1 측방향 부분(840) 및 중심 부분(850)으로 분리되고, 제2 다공성 멤브레인(830)에 의해 제2 측방향 부분(860) 및 중심 부분(850)으로 분리된다. 백(800)은 내부 구획의 제1 측방향 부분(840)과 유체 연통하는 제1 포트(870), 제2 측방향 부분(860)과 유체 연통하는 제2 포트(880), 및 내부 구획의 중심 부분(850)과 유체 연통하는 제3 포트(890)를 추가로 포함한다.
백은, 바람직하게는, 제2 포트로부터 제1 포트로 유동함으로써 내부 용적부의 상당한 부분을 통한 배지의 관류를 허용하도록 구성된다. 당업자는, 본 발명에 기초하여, 예컨대 백 내의 관류 유동의 데드 스폿을 최소화하도록, 그리고/또는 관류 유동이 세포 성장을 방해하지 않는 것을 보장하도록, 제1 포트 및 제2 포트를 배열할 것이다. 제3 포트는, 예컨대 배지 샘플링 및 백의 중심 부분 내로의 세포 및/또는 마이크로캐리어의 도입을 용이하게 하도록 위치될 수 있다.
내부 구획을 분할하는 하나 이상의 멤브레인을 포함하는 백을 형성하기 위해, 하나 이상의 중합체 필름 및 하나 이상의 다공성 멤브레인의 에지는 임의의 바람직한 방법, 예를 들어 RF 용접, 열 임펄스 용접, 초음파 용접, 핫 바 용접(hot bar welding), 화학 결합, 접착 접합, 열 융착 접합, 용매 용접, 레이저 용접, 코로나 방전, 방사선, 표면 처리, 극한 열, 벨트, 또는 용융 라미네이션, 에칭, 플라즈마 처리, 압출, 습윤, 접착제, 또는 이들의 조합에 의해 접합될 수 있다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 중합체 필름은 열, 레이저, 또는 핫 바 용접에 의해 함께 접합된다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 물 중 총 유기 탄소가 0.1 mg/cm2 미만인 중합체를 포함한다(예컨대, 그로 형성됨). 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 (예컨대, 하나 이상의 중합체 필름의 내부 층과 관련하여 위에서 설명된 바와 같이) 실질적으로 플루오로중합체, 예컨대 적어도 80 중량%, 또는 적어도 85 중량%, 또는 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%, 또는 적어도 97.5 중량%, 또는 적어도 98 중량%, 또는 적어도 99 중량%의 플루오로중합체를 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로, 작용화된 중합체-말단 기를 갖는 에틸렌-프로필렌(FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)(PFA), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVF), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌/에틸렌 공중합체(HTE), 클로로트라이플루오로에틸렌/비닐리덴플루오라이드 공중합체, 클로로트라이플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체, 에틸렌/클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체(ECTFE), 에틸렌/트라이플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 공중합체(ETFE), 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 공중합체(TFE/P), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체(FEP/HFP), 헥사플루오로프로필렌/테트라플루오로에틸렌/비닐리덴 공중합체(THV), 및 퍼플루오로(1-부테닐 비닐 에테르) 단일사이클로중합체로부터 선택된 하나 이상의 플루오로중합체를 포함한다. 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로, 적어도 80 중량%(예컨대, 적어도 90 중량%, 또는 적어도 95 중량%)의 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 스테인리스 강을 포함한다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 플루오로중합체 코팅된 기재를 포함한다. 예를 들어, 소정의 그러한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 플루오로중합체 코팅된 스테인리스 강(예컨대, 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅된 스테인리스 강)을 포함한다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, (예컨대, 실질적으로 플루오로중합체를 포함하는) 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 0.001 내지 0.7 mm, 예컨대 0.001 내지 0.4 mm, 또는 0.001 내지 0.1 mm, 또는 0.005 내지 0.7 mm, 또는 0.005 내지 0.4 mm, 또는 0.005 내지 0.1 mm, 또는 0.01 내지 7 mm, 또는 0.01 내지 0.4 mm, 또는 0.01 내지 0.1 mm의 두께를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로, 적어도 95 중량%의 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하고, 0.01 내지 0.1 mm의 두께를 갖는다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은, 각각, 마이크로캐리어가 관류 동안 제2 부분 또는 중심 부분을 빠져나가는 것을 방지하는 것을 돕도록 선택되는 평균 기공 크기를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 평균 기공 크기는 200 μm 미만, 예컨대 150 μm 미만이다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 평균 기공 크기는 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm이다.
소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 백 내에 함유된 마이크로캐리어의 평균 직경의 약 100% 미만, 예컨대 약 75% 미만, 또는 약 50% 미만, 또는 약 40% 미만, 또는 약 30% 미만, 또는 약 25% 미만의 평균 기공 크기 및/또는 D99 기공 크기를 갖는다.
하나 이상의 다공성 멤브레인은 넓은 범위 내의 다공도를 가질 수 있고; 당업자는 기계적 안정성과 유량의 원하는 조합을 제공하는 다공도를 선택할 것이다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 10% 내지 90%의 범위 내의 다공도를 갖는다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 다공성 튜브의 다공도는 20% 내지 90%, 또는 30% 내지 90%, 또는 40% 내지 90%, 또는 50% 내지 90%, 또는 10% 내지 80%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70%, 또는 40% 내지 60%의 범위 내에 있다.
다공성 멤브레인의 다공도는 다수의 당업계에 알려진 방법들, 예컨대 성형, 열 천공, 레이저 드릴링, 전자 빔 드릴링, 전기 방전 기계가공, 기계적 드릴링, 스탬핑 또는 절단 중 임의의 것에 의해 제공될 수 있다.
당업자는 다공성 멤브레인의 "기능적" 기공 크기가 멤브레인 내의 기공의 평균 크기 및 최대 크기 둘 모두에 의존한다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 D99 기공 크기(즉, 크기가 99번째 백분위수에 있는 기공의 크기)는 하나 이상의 다공성 멤브레인의 평균 기공 크기와 최대 100%, 예컨대 최대 50%, 최대 30%, 또는 최대 10%만큼 상이하다. 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 D99 기공 크기는 500 μm 미만, 예컨대 250 μm 미만, 또는 200 μm 미만, 또는 150 μm 미만이다.
그러나, 당업자가 인식할 바와 같이, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 작은 평균 기공 크기는 백을 통한 유동을 늦출 수 있고/있거나, 배지가 관통 관류되는 내부 구획의 일부분과 마이크로캐리어가 배치되는 내부 구획의 일부분 사이의 교환을 늦출 수 있다. 따라서, 당업자는, 원하는 마이크로캐리어에 대한 여과를 제공하기에 충분히 작지만 백을 통한 원하는 유량을 제공하기에 충분히 큰 기공 크기를 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 소정의 바람직한 실시 형태에서, 백 내에 함유된 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm의 평균 직경을 갖고, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 평균 기공 크기는 50 내지 200 μm이다(예컨대, 그리고 마이크로캐리어의 평균 직경보다 더 작음). 그러나, 다른 실시 형태(예컨대, 도 5 내지 도 7의 실시 형태와 유사한 실시 형태)에서, 하나 이상의 다공성 멤브레인의 평균 기공 직경은 마이크로캐리어의 평균 직경보다 다소 더 클 수 있다. 그러한 경우에, 멤브레인은, 그럼에도 불구하고, 마이크로캐리어의 상당한 비율이 빠져나가는 것을 방지할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 본 명세서에서 설명되는 백이 세포 배양을 통해 배지를 관류시키는 데 유용하다고 결정하였다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 백(예컨대, 도 5의 백(500) 또는 도 8의 백(800))의 내부 구획 내에 마이크로캐리어와 함께 부착 의존성 세포 및 배지를 제공하는 단계, 및 제1 포트와 제2 포트 사이에서 내부 구획을 통해 배지를 유동시키는 단계를 포함하는, 세포를 배양하기 위한 방법이다. 필터가 제1 포트에 작동식으로 결합되는 경우에, 유동은, 예컨대, 제2 포트로부터 제1 포트로 이루어질 수 있다. 하나 이상의 멤브레인이 내부 구획을 다양한 구획으로 분할하는 경우에, 마이크로캐리어를 백에 수용하기 위해 제3 포트가 사용될 수 있고; 세포 및 배지가 또한 제3 포트를 통해 추가될 수 있다.
예를 들어 0.5 내지 20 mL/분의 범위에서 다양한 유량이 사용될 수 있으며, 유량은, 바람직하게는, 마이크로캐리어가 배양 배지 중에 현탁된 상태로 유지되도록 허용하기에 충분히 낮다. 물론, 정상 작동 과정에 걸쳐, 유량은 (예컨대, 우발적으로, 또는 세포 활성에 기초하여) 변할 수 있거나, 심지어 불연속적일 수 있다. 따라서, 다른 예에서, 유량은 하루에 0.2 내지 2개의 백 부피 대체물의 범위 내에 있을 수 있다. 백은 관류 동안 원하는 인큐베이션 온도로 유지될 수 있고, 로킹되거나 달리 교반될 수 있다.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은, (예컨대, 마이크로캐리어 부착 세포의 수를 원하는 제1 레벨로 증가시키기에 충분한) 인큐베이션 기간 후에, (예컨대, 배양된 세포에 이용가능한 접착 기재의 총 면적을 증가시키기 위해) 추가의 복수의 마이크로캐리어를 백에 추가하는 단계를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 추가의 복수의 마이크로캐리어(예컨대, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 마이크로캐리어를 포함함)는 제3 포트를 통해, 또는 필터가 제1 포트에 작동식으로 결합되는 실시 형태에서, 제2 포트를 통해.
본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 본 방법은, (예컨대, 마이크로캐리어 부착 세포의 수가 원하는 최종 레벨로 증가한 후에) 배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계, 및 이어서, 배양된 세포를 백의 내부 구획으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 당업자가 인식할 바와 같이, 마이크로캐리어로부터 부착 세포를 분리하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 달리 설명되는 바와 같은 다양한 실시 형태에서, 배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계는 (예컨대, 제2 포트를 통해 유동되는) 공급 배지에 트립신을 추가하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은, 유리하게는, 상당한 양의 마이크로캐리어가 백을 빠져나가는 것을 방지하기 위해 필터 또는 다공성 멤브레인을 사용하여, 배양된 세포가 백의 내부 구획으로부터 제거될 수 있다는 것에 주목한다. 즉, 마이크로캐리어는 다공성 멤브레인 또는 필터에 의해 내부 구획 내에 보유된다.
실시예
일례에서, 산소 및 이산화탄소 투과성 백 A를 내부 플루오르화 에틸렌-프로필렌 층 및 외부 실리콘 고무 층을 포함하는 중합체 필름으로부터 형성하였다. 백 A 및 비교용의 구매가능한 플루오로중합체 백 C를 유사한 표준 조건(30분 동안 121℃, 이어서 60분의 건조 시간) 하에서 오토클레이브에서 멸균하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 백 C는 상당히 수축되어서(도시된 바와 같은 수직 방향인 필름 압출 "기계 방향"으로 2 내지 5%, 도시된 바와 같은 수평 방향인 필름 압출 "횡방향"으로 1 내지 3%), 백의 내부 표면이 가시적으로 주름지게 하였다. 대조적으로, 백 A는, 도 10에 도시된 바와 같이, 바람직하게 매끄럽게 유지되었다.
폴리스티렌 마이크로캐리어, 배지 및 부착 세포를 멸균된 백에 추가한 다음에, 로킹 디바이스 상에서 인큐베이션하였다. 초기 인큐베이션 기간 후에, 마이크로캐리어 분포는 백 C(이는 백의 내부 표면의 주름들 사이에서의 마이크로캐리어의 상당한 "풀링"을 보여주었음)보다 백 A의 부피 전체에 걸쳐 더 균일하게 분포되었다. 그리고 (즉, 마이크로캐리어로부터의 분리 후) 백 A로부터의 (배양 부피당) 배양된 세포의 총 수율은 백 C의 것보다 상당히 높았다. 이론에 의해 구애됨이 없이, 본 발명자들은 백 A 내의 마이크로캐리어(및 그에 따라, 부착된 세포)가 백 C 내의 것보다 상당히 작은 전단력 및 충돌력을 받을 수 있다는 것에 주목하며, 여기에서 마이크로캐리어는 백 C의 표면 내의 주름과 충돌할 수 있고, 백 A의 균일한 분포에서의 것보다 상당히 더 높은 비율로 다른 "풀링된" 마이크로캐리어와 충돌할 수 있다.
본 발명의 추가적인 태양은 하기의 비제한적인 열거된 실시 형태에 의해 제공되며, 이는 임의의 수로 그리고 기술적으로 또는 논리적으로 일관성 있는 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
실시 형태 1. 산소 투과성 백으로서,
백의 내부 구획의 경계를 한정하는 하나 이상의 중합체 필름 - 하나 이상의 중합체 필름 각각은,
백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층; 및
내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -;
백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트;
백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및
내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어를 포함하는, 백.
실시 형태 2. 실시 형태 1에 있어서, 산소 투과성 백은,
접합되어 백의 내부 구획을 형성하는 에지를 갖는 하나 이상의 중합체 필름 - 하나 이상의 중합체 필름 각각은, 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -;
백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트;
백의 외부 표면 내에 형성되고 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및
내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어를 포함하는 산소 투과성 백인, 백.
실시 형태 3. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 내부 층은 작용화된 중합체-말단 기를 갖는 플루오르화 에틸렌-프로필렌(FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)(PFA), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVF), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌/에틸렌 공중합체(HTE), 클로로트라이플루오로에틸렌/비닐리덴플루오라이드 공중합체, 클로로트라이플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체, 에틸렌/클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체(ECTFE), 에틸렌/트라이플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 공중합체(ETFE), 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 공중합체(TFE/P), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체(FEP/HFP), 헥사플루오로프로필렌/테트라플루오로에틸렌/비닐리덴 공중합체(THV), 또는 퍼플루오로(1-부테닐 비닐 에테르) 단일사이클로중합체 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 4. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서, 내부 층은 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하는, 백.
실시 형태 5. 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 내부 층은 0.001 내지 0.7 mm(예컨대, 0.01 내지 0.1 mm)의 두께를 갖는, 백.
실시 형태 6. 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 외부 층은 탄성중합체를 포함하는, 백.
실시 형태 7. 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 외부 층은 천연 폴리아이소프렌 고무(NR), 합성 폴리아이소프렌 고무(IR), 폴리부타다이엔 고무(BR), 클로로프렌 고무(CR), 부틸 고무(IIR), 할로겐화 부틸 고무(CIIR, BIIR), 스티렌-부타다이엔 고무(SBR), 니트릴 고무(NBR) 및 수소화 니트릴 고무(HNBR), 에틸렌 프로필렌 고무(EPM), 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무(EPDM), 에피클로로하이드린 고무(ECO), 폴리아크릴 고무(ACM, ABR), 실리콘 고무(SI, Q, VMQ), 플루오로실리콘 고무(FSR, FVMQ), 플루오로탄성중합체(FKM, FEPM), 퍼플루오로탄성중합체(FFKM), 폴리에테르 블록 아미드(PEBA), 클로로설폰화 폴리에틸렌(CSM), 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA), 사이클릭 올레핀 공중합체, 폴리올레핀 탄성중합체, 및 탄성중합체 PET 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 8. 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 외부 층은 폴리메틸펜텐 중합체(PMP)를 포함하는, 백.
실시 형태 9. 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 외부 층은 실리콘 고무(예컨대, 고주도 고무(HCR), 플루오로실리콘 고무(FSR), 액체 실리콘 고무(LSR), 실온 가황 고무(RTV), 열가소성 실리콘 고무(TPE), 백금 경화 실리콘 고무, 및 과산화물 경화 실리콘 고무로부터 선택됨)를 포함하는, 백.
실시 형태 10. 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 외부 층은 0.01 내지 5 mm(예컨대, 0.05 내지 1 mm)의 두께를 갖는, 백.
실시 형태 11. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2에 있어서,
내부 층은 0.001 내지 0.7 mm(예컨대, 0.01 내지 0.1 mm)의 두께를 갖고 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하며;
외부 층은 0.01 내지 5 mm(예컨대, 0.1 내지 0.5 mm)의 두께를 갖고 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하는, 백.
실시 형태 12. 실시 형태 1 내지 실시 형태 11 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 내부 층 및 외부 층은 (예컨대, 화학 결합, 접착 접합, 열 융착 접합, 용매 접합, 레이저 용접, 표면 처리, 압출, 공압출, 코팅, 및 라미네이션 중 하나 이상에 의해) 접합되는, 백.
실시 형태 13. 실시 형태 1 내지 실시 형태 12 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm(예컨대, 110 내지 300 μm, 또는 120 내지 275 μm)의 평균 직경을 갖는, 백.
실시 형태 14. 실시 형태 1 내지 실시 형태 13 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 마이크로캐리어는 1 내지 1.25 g/mL(예컨대 1 내지 1.15 g/mL, 또는 1 내지 1.1 g/mL)의 평균 밀도를 갖는, 백.
실시 형태 15. 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 마이크로캐리어는 0.1 내지 10 cm2/mg(예컨대, 0.5 내지 7.5 cm2/mg, 또는 1 내지 7.5 cm2/mg)의 평균 비표면적을 갖는, 백.
실시 형태 16. 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 마이크로캐리어는 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 또는 셀룰로스를 포함하는, 백.
실시 형태 17. 실시 형태 1 내지 실시 형태 16 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 마이크로캐리어는 하나 이상의 세포외 매트릭스 화합물(예를 들어, 콜라겐 I, 폴리-L-라이신, 피브로넥틴, 레트로넥틴, 히알루론산, 및 폴리도파민으로부터 선택됨)을 포함하고, 세포외 매트릭스 화합물은 마이크로캐리어의 표면의 적어도 일부를 구성하는, 백.
실시 형태 18. 실시 형태 1 내지 실시 형태 17 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 내부 구획 내에 함유된 복수의 마이크로캐리어는 백의 내부 구획의 총 표면적의 적어도 100%(예컨대, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%)인 총 표면적을 갖는, 백.
실시 형태 19. 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
분할되지 않은 내부 구획;
내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제1 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및
내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고,
제1 액체 투과성 튜브는 튜브의 중심 루멘을 한정하는 제1 내부 지지 구조체, 및 제1 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제1 외부 필터 층을 포함하는, 백.
실시 형태 20. 실시 형태 19에 있어서, 백의 외부 표면 내에 형성되고 백의 내부 구획과 유체 연통하는 제3 포트를 포함하는, 백.
실시 형태 21. 실시 형태 19 또는 실시 형태 20에 있어서, 제1 내부 지지 구조체는 제1 다공성 튜브를 포함하는, 백.
실시 형태 22. 실시 형태 21에 있어서, 제1 다공성 튜브는 100 내지 5,000 μm의 평균 기공 크기 및 10 내지 90%의 다공도를 갖는, 백.
실시 형태 23. 실시 형태 19 또는 실시 형태 20에 있어서, 제1 내부 지지 구조체는 나선형 권취 필라멘트를 포함하는, 백.
실시 형태 24. 실시 형태 19 내지 실시 형태 23 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제1 외부 필터 층은 스테인리스 강, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 25. 실시 형태 19 내지 실시 형태 24 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제1 외부 필터 층은 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
실시 형태 26. 실시 형태 19 내지 실시 형태 25 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제2 액체 투과성 튜브는 튜브의 중심 루멘을 한정하는 제2 내부 지지 구조체, 및 제2 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제2 외부 필터 층을 포함하는, 백.
실시 형태 27. 실시 형태 26에 있어서, 제2 내부 지지 구조체는 나선형 권취 필라멘트 또는 제2 다공성 튜브를 포함하는, 백.
실시 형태 28. 실시 형태 26 또는 실시 형태 27에 있어서, 제2 외부 필터 층은 스테인리스 강, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 29. 실시 형태 26 내지 실시 형태 28 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제2 외부 필터 층은 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
실시 형태 30. 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
분할되지 않은 내부 구획;
백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및
백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고,
제1 액체 투과성 튜브는 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
실시 형태 31. 실시 형태 30에 있어서, 제1 액체 투과성 튜브는 스테인리스 강, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 폴리에스테르, 나일론, 및 플루오르화 에틸렌-프로필렌 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 32. 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
내부 구획의 제1 부분을 내부 구획의 제2 부분으로부터 분리하는 다공성 멤브레인 - 제2 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및
백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고,
제1 포트 및 제2 포트는 각각 내부 구획의 제1 부분과 유체 연통하고, 제3 포트는 내부 구획의 제2 부분과 유체 연통하는, 백.
실시 형태 33. 실시 형태 32에 있어서, 다공성 멤브레인은 플루오로중합체를 포함하는, 백.
실시 형태 34. 실시 형태 32에 있어서, 다공성 멤브레인은 작용화된 중합체-말단 기를 갖는 플루오르화 에틸렌-프로필렌(FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)(PFA), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVF), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌/에틸렌 공중합체(HTE), 클로로트라이플루오로에틸렌/비닐리덴플루오라이드 공중합체, 클로로트라이플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체, 에틸렌/클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체(ECTFE), 에틸렌/트라이플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 공중합체(ETFE), 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 공중합체(TFE/P), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체(FEP/HFP), 헥사플루오로프로필렌/테트라플루오로에틸렌/비닐리덴 공중합체(THV), 또는 퍼플루오로(1-부테닐 비닐 에테르) 단일사이클로중합체 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 35. 실시 형태 32 내지 실시 형태 34 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 다공성 멤브레인은 10 내지 200 μm, 예컨대 20 내지 200 μm, 또는 30 내지 200 μm, 또는 75 내지 200 μm, 또는 10 내지 150 μm, 또는 20 내지 150 μm, 또는 30 내지 150 μm, 또는 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
실시 형태 36. 실시 형태 32 내지 실시 형태 35 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 다공성 멤브레인은 10 내지 90%(예컨대, 20 내지 70%, 또는 30 내지 50%)의 다공도를 갖는, 백.
실시 형태 37. 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
내부 구획의 제1 측방향 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제1 다공성 멤브레인;
내부 구획의 제2 측방향 부분을 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제2 다공성 멤브레인 - 중심 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및
백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고,
제1 포트는 내부 구획의 제1 측방향 부분과 유체 연통하고, 제2 포트는 내부 구획의 제2 측방향 부분과 유체 연통하며, 제3 포트는 내부 구획의 중심 부분과 유체 연통하는, 백.
실시 형태 38. 실시 형태 37에 있어서, 제1 다공성 멤브레인 및 제2 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 플루오로중합체를 포함하는, 백.
실시 형태 39. 실시 형태 37에 있어서, 제1 다공성 멤브레인 및 제2 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로, 작용화된 중합체-말단 기를 갖는 플루오르화 에틸렌-프로필렌(FEP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 테트라플루오로에틸렌-퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)(PFA), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVF), 폴리클로로트라이플루오로에틸렌(PCTFE), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌/에틸렌 공중합체(HTE), 클로로트라이플루오로에틸렌/비닐리덴플루오라이드 공중합체, 클로로트라이플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체, 에틸렌/클로로트라이플루오로에틸렌 공중합체(ECTFE), 에틸렌/트라이플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌/테트라플루오로에틸렌 공중합체(ETFE), 테트라플루오로에틸렌/프로필렌 공중합체(TFE/P), 테트라플루오로에틸렌/헥사플루오로프로필렌 공중합체(FEP/HFP), 헥사플루오로프로필렌/테트라플루오로에틸렌/비닐리덴 공중합체(THV), 또는 퍼플루오로(1-부테닐 비닐 에테르) 단일사이클로중합체 중 하나 이상을 포함하는, 백.
실시 형태 40. 실시 형태 37 내지 실시 형태 39 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제1 다공성 멤브레인 및 제2 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
실시 형태 41. 실시 형태 37 내지 실시 형태 40 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 제1 다공성 멤브레인 및 제2 다공성 멤브레인은 각각 개별적으로 10 내지 90%(예컨대, 20 내지 70%, 또는 30 내지 50%)의 다공도를 갖는, 백.
실시 형태 42. 세포를 배양하기 위한 방법으로서, 실시 형태 1 내지 실시 형태 41 중 어느 한 실시 형태의 백의 내부 구획 내에 마이크로캐리어와 함께 부착 의존성 세포 및 배지를 제공하는 단계, 및 제1 포트와 제2 포트 사이에서 내부 구획을 통해 배지를 유동시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 43. 실시 형태 42에 있어서, (예컨대, 로킹에 의해) 백을 교반하는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 44. 실시 형태 42 또는 실시 형태 43에 있어서, 인큐베이션 기간 후에, (예컨대, 백의 외부 표면 내에 형성된 제3 포트를 통해) 추가의 복수의 마이크로캐리어를 백의 내부 구획에 추가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시 형태 45. 실시 형태 42 내지 실시 형태 44 중 어느 한 실시 형태에 있어서,
배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계; 및 이어서,
배양된 세포를 백으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시 형태 46. 실시 형태 42 내지 실시 형태 45 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 백은 실시 형태 19 내지 실시 형태 31 중 어느 한 실시 형태에 따른 백이고, 배지는, 제2 포트를 통해 그리고 제2 액체 투과성 튜브를 통해 배지를 추가하고 제1 액체 투과성 튜브를 통해 그리고 제1 포트를 통해 배지를 제거함으로써 내부 구획을 통해 유동되는, 세포를 배양하기 위한 방법.
실시 형태 47. 실시 형태 46에 있어서, 백을 제공하는 것은, 백의 외부 표면 내에 형성된 제3 포트를 통해, 복수의 마이크로캐리어 및 배지를 추가하는 것을 포함하는, 방법.
실시 형태 48. 실시 형태 46 또는 실시 형태 47에 있어서,
배양된 세포를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계; 및 이어서,
배양된 세포를 백의 내부 구획으로부터 제1 액체 투과성 튜브를 통해 그리고 제1 포트를 통해 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시 형태 49. 실시 형태 42 내지 실시 형태 45 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 백은 실시 형태 32 내지 실시 형태 36 중 어느 한 실시 형태에 따른 백이고, 배지 및 부착 의존성 세포가 내부 구획의 제2 부분 내에 제공되며; 배지는, 제2 포트를 통해 배지를 추가하고 제1 포트를 통해 배지를 제거함으로써 내부 구획을 통해 유동되는, 세포를 배양하기 위한 방법.
실시 형태 50. 실시 형태 42 내지 실시 형태 45 중 어느 한 실시 형태에 있어서, 백은 내부 구획의 중심 부분 내에 배지 및 부착 의존성 세포를 포함하는, 실시 형태 37 내지 실시 형태 41 중 어느 한 실시 형태에 따른 백이고; 배지는, 제2 포트를 통해 배지를 추가하고 제1 포트를 통해 배지를 제거함으로써 내부 구획을 통해 유동되는, 세포를 배양하기 위한 방법.
실시 형태 51. 실시 형태 49 또는 실시 형태 50에 있어서, 복수의 마이크로캐리어는 제3 포트를 통해 내부 구획에 제공되는, 방법.

Claims (15)

  1. 산소 투과성 백으로서,
    상기 백의 내부 구획의 경계를 한정하는 하나 이상의 중합체 필름 - 상기 하나 이상의 중합체 필름 각각은,
    상기 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층; 및
    상기 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -;
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되고 상기 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트;
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되고 상기 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및
    상기 내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어(microcarrier)를 포함하는, 백.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산소 투과성 백은,
    접합되어 상기 백의 내부 구획을 형성하는 에지를 갖는 하나 이상의 중합체 필름 - 상기 하나 이상의 중합체 필름 각각은, 상기 백의 내부 구획에 인접하고 플루오로중합체를 포함하는 내부 층, 및 상기 내부 층에 접착되고 중합체를 포함하는 외부 층을 포함함 -;
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되고 상기 내부 구획과 유체 연통하는 제1 포트;
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되고 상기 내부 구획과 유체 연통하는 제2 포트; 및
    상기 내부 구획 내에 함유되는 복수의 마이크로캐리어를 포함하는 산소 투과성 백인, 백.
  3. 제1항에 있어서, 상기 내부 층은 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하는, 백.
  4. 제1항에 있어서, 상기 외부 층은 탄성중합체를 포함하는, 백.
  5. 제1항에 있어서, 상기 외부 층은 실리콘 고무(예컨대, 고주도 고무(high consistency rubber, HCR), 플루오로실리콘 고무(FSR), 액체 실리콘 고무(LSR), 실온 가황 고무(RTV), 열가소성 실리콘 고무(TPE), 백금 경화 실리콘 고무, 및 과산화물 경화 실리콘 고무로부터 선택됨)를 포함하는, 백.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 내부 층은 0.001 내지 0.7 mm(예컨대, 0.01 내지 0.1 mm)의 두께를 갖고 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 플루오르화 에틸렌-프로필렌을 포함하며;
    상기 외부 층은 0.01 내지 5 mm(예컨대, 0.1 내지 0.5 mm)의 두께를 갖고 실질적으로 (예컨대, 적어도 95 중량%의) 실리콘 고무를 포함하는, 백.
  7. 제1항에 있어서, 상기 마이크로캐리어는 100 내지 400 μm(예컨대, 110 내지 300 μm, 또는 120 내지 275 μm)의 평균 직경을 갖는, 백.
  8. 제1항에 있어서, 상기 마이크로캐리어는 폴리스티렌, 가교결합된 덱스트란, 또는 셀룰로스를 포함하는, 백.
  9. 제1항에 있어서, 상기 내부 구획 내에 함유된 상기 복수의 마이크로캐리어는 상기 백의 내부 구획의 총 표면적의 적어도 100%(예컨대, 적어도 500%, 또는 적어도 1000%)인 총 표면적을 갖는, 백.
  10. 제1항에 있어서,
    분할되지 않은 내부 구획;
    상기 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 상기 제1 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및
    상기 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 상기 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고,
    상기 제1 액체 투과성 튜브는 상기 튜브의 중심 루멘(lumen)을 한정하는 제1 내부 지지 구조체, 및 상기 제1 내부 지지 구조체를 둘러싸는 제1 외부 필터 층을 포함하는, 백.
  11. 제1항에 있어서,
    분할되지 않은 내부 구획;
    상기 백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 상기 포트에 작동식으로 결합되는 제1 액체 투과성 튜브; 및
    상기 백의 내부 구획 내로 연장되고 그와 유체 연통하며 상기 제2 포트에 작동식으로 결합되는 제2 액체 투과성 튜브를 포함하고,
    상기 제1 액체 투과성 튜브는 50 내지 200 μm(예컨대, 50 내지 150 μm, 또는 75 내지 150 μm)의 평균 기공 크기를 갖는, 백.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 내부 구획의 제1 부분을 상기 내부 구획의 제2 부분으로부터 분리하는 다공성 멤브레인 - 상기 제2 부분은 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고,
    상기 제1 포트 및 상기 제2 포트는 각각 상기 내부 구획의 제1 부분과 유체 연통하고, 상기 제3 포트는 상기 내부 구획의 제2 부분과 유체 연통하는, 백.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 내부 구획의 제1 측방향 부분을 상기 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제1 다공성 멤브레인;
    상기 내부 구획의 제2 측방향 부분을 상기 내부 구획의 중심 부분으로부터 분리하는 제2 다공성 멤브레인 - 상기 중심 부분은 상기 복수의 마이크로캐리어를 함유함 -; 및
    상기 백의 외부 표면 내에 형성되는 제3 포트를 포함하고,
    상기 제1 포트는 상기 내부 구획의 제1 측방향 부분과 유체 연통하고, 상기 제2 포트는 상기 내부 구획의 제2 측방향 부분과 유체 연통하며, 상기 제3 포트는 상기 내부 구획의 중심 부분과 유체 연통하는, 백.
  14. 세포를 배양하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 백의 내부 구획 내에 상기 마이크로캐리어와 함께 부착 의존성 세포(anchorage-dependent cell) 및 배지를 제공하는 단계, 및 상기 제1 포트와 상기 제2 포트 사이에서 상기 내부 구획을 통해 배지를 유동시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    배양된 세포를 상기 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계; 및 이어서,
    상기 배양된 세포를 상기 백으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
KR1020237026200A 2020-12-30 2021-12-29 세포 배양 시스템 KR20230135601A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063132291P 2020-12-30 2020-12-30
US63/132,291 2020-12-30
PCT/US2021/065509 WO2022147121A1 (en) 2020-12-30 2021-12-29 Cell culture system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230135601A true KR20230135601A (ko) 2023-09-25

Family

ID=82116870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237026200A KR20230135601A (ko) 2020-12-30 2021-12-29 세포 배양 시스템

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220204901A1 (ko)
EP (1) EP4271790A1 (ko)
JP (1) JP2024502960A (ko)
KR (1) KR20230135601A (ko)
CN (1) CN116848226A (ko)
WO (1) WO2022147121A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4537860A (en) * 1982-12-08 1985-08-27 Monsanto Company Static cell culture maintenance system
CA2772070A1 (en) * 2009-08-26 2011-03-03 Xcellerex, Inc. Continuous recovery harvest bag
US10655097B2 (en) * 2014-12-22 2020-05-19 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation T-cell culture double bag assembly
US9926524B2 (en) * 2014-12-22 2018-03-27 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation Gas permeable material
SG10202110861VA (en) * 2017-03-28 2021-11-29 Corning Inc Aseptic bioprocess package

Also Published As

Publication number Publication date
EP4271790A1 (en) 2023-11-08
US20220204901A1 (en) 2022-06-30
WO2022147121A1 (en) 2022-07-07
CN116848226A (zh) 2023-10-03
JP2024502960A (ja) 2024-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11142736B2 (en) Gas permeable material
KR102613876B1 (ko) 일회용 교번 접방향 유동 여과 유닛
EP3237598B1 (en) T-cell culture double bag assembly
RU2687577C2 (ru) Молокоотсос и набор для сцеживания для молокоотсоса
JP5126680B2 (ja) 細胞シート搬送治具
KR102551102B1 (ko) 중공사막 모듈 및 중공사막 모듈의 제조 방법
JP2000509329A (ja) 液体のガス化及び脱ガス化法
JP2010253355A (ja) 膜分離活性汚泥処理装置
CN107208027B (zh) 在受控环境中培养细胞的系统
CN113767165A (zh) 高耐久性可渗透性含氟聚合物细胞培养袋
US20220204901A1 (en) Cell Culture System
JPWO2013047775A1 (ja) 中空糸膜モジュールの親水化方法
US11959056B2 (en) Cell culture system
JP2015142886A (ja) カートリッジ式中空糸膜モジュールおよび中空糸膜カートリッジのポッティング部成形用治具およびカートリッジ式中空糸膜モジュールの製造方法
JPWO2019054500A1 (ja) マイクロ流路チップ
CN219709492U (zh) 细胞培养装置
WO2022149606A1 (ja) 細胞培養器及び並列フィルター接続器
JP2009120775A (ja) フッ素樹脂多孔質体の表面改質方法