WO2022149606A1 - 細胞培養器及び並列フィルター接続器 - Google Patents

細胞培養器及び並列フィルター接続器 Download PDF

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WO2022149606A1
WO2022149606A1 PCT/JP2022/000286 JP2022000286W WO2022149606A1 WO 2022149606 A1 WO2022149606 A1 WO 2022149606A1 JP 2022000286 W JP2022000286 W JP 2022000286W WO 2022149606 A1 WO2022149606 A1 WO 2022149606A1
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WO
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filter
incubator
opening
cell incubator
parallel
Prior art date
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PCT/JP2022/000286
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English (en)
French (fr)
Inventor
俊介 渡部
聡一朗 草野
Original Assignee
Ｊｃｒファーマ株式会社
帝人ファーマ株式会社
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Publication date
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Priority to US18/260,906 priority patent/US20240076600A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/46—Means for fastening

Definitions

  • the present invention relates to a cell incubator (hereinafter, also simply referred to as "incubator”) which is a container for injecting cells and a liquid medium for cell culture, and in particular, an inner gas phase and an outer gas phase.
  • the present invention relates to a cell incubator in which two different types of filters are attached in parallel to the boundary of the cell incubator, and a parallel filter connector for attaching these filters in parallel to the main body of the cell incubator.
  • Mass culture of cells is generally performed for the production of biopharmaceuticals such as vaccines, recombinant protein preparations, and cell medicines.
  • the cells to be cultured include cells that can be cultured in a floating state in a liquid medium (hereinafter, also referred to as “floating cells”) and cells that can be cultured in a state of being adhered to the surface of some support that serves as a scaffold.
  • floating cells a liquid medium
  • adhered to the surface of some support that serves as a scaffold There are two types of cells that are practically needed (hereinafter also referred to as “adhesive cells”).
  • mass culture can be performed in a relatively small occupied area by shaking culture using a flask or by stirring culture using a stirring blade installed inside the incubator.
  • the medium cannot be agitated.
  • a medium is used to promote gas exchange between the gas phase and the liquid phase. It is necessary to increase the surface area per volume of the medium and make the liquid depth of the medium shallow.
  • the incubator for adhesive cells is provided with an opening for taking in and out of cells, exchanging medium, and the like. This opening is closed with a cap during the culture period so that the inside of the incubator is not contaminated.
  • the components of the gas phase in the incubator will gradually change as the cells metabolize.
  • Sufficient gas exchange needs to be ensured between the inside and outside of the incubator to prevent such changes.
  • the incubator is fitted with a cap equipped with a filter (membrane filter) that allows the gas phase to pass through to some extent, and through this filter, the inner gas phase and the outer gas phase of the incubator are attached. Gas exchange takes place.
  • a multi-layer incubator which is a cell incubator in which a plurality of trays having a support surface to which cells adhere are laminated and integrated, has been developed (Patent Document 1).
  • This type of incubator takes the form of a laminate of those chambers, with a common opening with a cap that is removed during cell loading and unloading into each tray and medium replacement, as well as internal and external gas phases.
  • a common opening (to which a cap with a membrane filter is attached) for phase exchange is provided at the top of each laminate.
  • the medium is added to the incubator so that the gas phase is secured and the upper surface of the flat support provided on each tray is immersed in the liquid medium. In this way, cells can adhere to the surface of the support of each tray and survive and proliferate.
  • the present inventors make the incubator dented and fresh when the medium is discharged (natural flow due to height difference through a tube or suction by a pump).
  • the incubator deforms to swell, and those deformations often cause damage such as cracks in the incubator. I found a new one. If such damage occurs, the culture cannot be continued and all the various preparations and operations up to that point are wasted. In addition, even if it is not damaged, careful work with the utmost care to avoid damage is required for medium replacement. These have a non-negligible adverse effect on the efficiency of the entire process of mass culture of adhesive cells.
  • the problems are that the pressure inside the incubator is reduced due to the expansion of the gas phase capacity in the incubator when the medium is discharged from the incubator, and the gas phase capacity in the incubator is reduced when the fresh medium is injected. Due to the compression of the gas phase. It seems that the membrane filter installed for exchanging the gas phase inside the incubator and the gas phase outside does not have sufficient air permeability to eliminate the change in air pressure inside the incubator that occurs during the medium exchange. Is done.
  • the present inventors tried to solve this problem, and when a depth filter capable of rapidly allowing gas to permeate in the presence of a pressure difference was adopted instead of the membrane filter, the incubator was deformed when the medium was replaced. We have newly found that it can be avoided and there is no concern about damage.
  • the present invention has an advantage that it is possible to prevent deformation of the incubator in the operation of moving cells in and out and exchanging the medium, and to prevent an increase in carbon dioxide concentration and a decrease in the pH of the medium during cell culture.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention has been completed by further studying based on the results obtained above, and includes the following.
  • a cell incubator which is provided with two different types of filters in parallel so as to demarcate between the inner gas phase and the outer gas phase of the cell incubator.
  • At least one of the two types of filters is provided in the form of a filter unit that has a penetrating flow path and holds the filter so as to divide the flow path back and forth, and the filter unit is provided on one side of the flow path.
  • the cell incubator according to 1 above which is connected to a corresponding opening provided in the gas phase region of the main body of the cell incubator at the opening of the cell incubator.
  • Each of the two types of filters is provided in the form of a filter unit having a penetrating flow path and holding the filter so as to separate the flow path back and forth, and each of the filter units is provided in the flow path.
  • Each of the two filters so as to separate each of the parallel channels through two of the three openings of the parallel filter connector having an internal space having three openings communicating with each other back and forth.
  • the parallel filter connector is connected to the corresponding opening provided in the gas phase region of the main body of the cell incubator at the remaining opening.
  • the cell incubator according to.
  • At least one of the two types of filters is provided in the form of a filter unit having a penetrating flow path and holding the filter so as to divide the flow path back and forth, and the filter unit is provided in the form of the flow path.
  • the cell incubator according to 4 above which is connected to the corresponding opening provided in the parallel filter connector at the opening on one side of the above.
  • Each of the two types of filters is provided in the form of a filter unit having a penetrating flow path and holding the filter so as to divide the flow path back and forth, and each of the filter units is provided with the flow. 4.
  • the cell incubator according to 4 above which is connected to a corresponding opening provided in the parallel filter connector at an opening on one side of the path.
  • the filter unit and the main body of the cell incubator are provided with a corresponding male-threaded portion and a female-threaded portion or corresponding male-type and female-type tapered fitting surfaces in a pair of openings connected to each other.
  • the cell incubator according to 2 or 3 above.
  • the body of the cell incubator and the parallel filter connector are provided with corresponding male and female threads or corresponding male and female tapered fitting surfaces at the paired openings that are interconnected.
  • the filter unit, the main body of the cell incubator, and the parallel filter connector are connected to each other in a pair of openings, and the corresponding male and female threads or the corresponding male and female tapered fittings.
  • the cell incubator according to any one of 5 or 6 above, which comprises a mating surface, respectively.
  • a parallel filter connector for connecting to the main body of the cell incubator, which has an internal space having three openings communicating with each other, and one of the three openings is the main body of the cell incubator. It is configured to be connected to the corresponding opening provided in the, and the other two openings are (1) Whether one or the other of two different filters is provided so as to separate the internal space from the outside. (2) One opening is provided with one of two different filters so that the internal space is separated from the outside, and the other opening is provided with a penetrating flow path to separate the flow path back and forth. Two types are configured to be connected to the corresponding opening of the filter unit holding the other of the two different filters, or (3) provided with a penetrating flow path to separate the flow path back and forth. It is configured to be connected to the corresponding openings of two filter units, each holding one or the other of different filters. Parallel filter connector.
  • the opening joined to the opening of the main body of the cell incubator is provided with a male or female thread corresponding to the opening of the main body of the cell incubator or a male or female tapered fitting surface.
  • kit (1) or (2) for assembling the parallel filter connector according to 23 (1) A kit including a parallel filter connector having one of the two different filters and a filter unit having the other of the two different filters; (2) A kit including a parallel filter connector, a filter unit having one of the two different filters, and a filter unit having the other of the two different filters.
  • the present invention it is possible to prevent deformation such as swelling and denting of the cell incubator that occurs during the medium exchange operation in the cell incubator and damage to the cell incubator due to them, and accumulation of carbon dioxide gas in the cell incubator. It is possible to provide a cell incubator capable of preventing the above-mentioned problems and maintaining the pH of the medium in an appropriate range during the culture period.
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of the pH of the medium during the culture period performed in the incubator using only one of the depth filter and the membrane filter obtained in Example 1 and Example 2 as an average value. ..
  • FIG. 3 shows the tests obtained in Example 5 in which only the depth filter, only the membrane filter, or both the depth filter and the membrane filter via the parallel filter connector were used in the incubator. , It is a graph which shows the measurement result of pCO 2 (%) of each medium.
  • the vertical axis shows the pCO 2 (%) of the medium, and the horizontal axis shows the elapsed time (time) from the start of the test.
  • FIG. 4 shows the test obtained in Example 5 in which only the depth filter, only the membrane filter, or both the depth filter and the membrane filter via the parallel filter connector were used in the incubator. , It is a graph which shows the measurement result of the pH of each medium. The vertical axis shows the pH of the medium, and the horizontal axis shows the elapsed time (time) from the start of the test. ⁇ indicates the result with only the depth filter, ⁇ indicates the result with only the membrane filter, and ⁇ indicates the result with both filters used together.
  • a schematic cross-sectional view of a parallel filter connector in one embodiment of the present invention is shown.
  • a schematic cross-sectional view of an incubator main body in which the parallel filter connector of FIG. 5 is attached to the first main body opening and a cap with a tube is attached to the second main body opening is shown.
  • a membrane filter unit is attached to the second opening of the parallel filter connector, and a depth filter unit is attached to the third opening.
  • a schematic cross-sectional view of an incubator body having an opening is shown.
  • a membrane filter unit is connected to the first main body opening, a depth filter unit is connected to the second main body opening, and a cap with a tube is connected to the third main body opening.
  • a schematic cross-sectional view of an incubator comprising a membrane filter and a depth filter as an embodiment of the present invention and having an opening to which a cap with a tube is attached is shown.
  • cell incubator refers to a container capable of culturing animal cells, plant cells, etc. while maintaining a state in which foreign substances such as microorganisms do not invade from the outside. That means.
  • cell incubator body or “incubator body” refers to a container in which the medium and cells are held during the culture period, and the “filter” is excluded from the “cell incubator” or “incubator”. Means a part.
  • a multi-layer incubator is included as an embodiment of the cell incubator of the present invention.
  • the multi-layer incubator is for enabling mass culture in shallow liquid depth while ensuring a large adhesion area for cells, and the adhesion surface of cells and multiple trays formed in a shallow tray are vertical. It is a multi-layered incubator that is stacked in the direction and fixed integrally.
  • the support surface (upper surface) of each tray has a space for accommodating the medium and the gas phase in contact with the medium directly above the lower surface of the tray, and provides an adhesive surface for the cells, so that it corresponds to the number of trays.
  • a large cell adhesion area can be secured.
  • the multi-layer incubator has, for example, a multi-layer structure consisting of trays of 2 to 40 layers, 10 to 40 layers, 10 to 20 layers, 2 layers, 10 layers, 20 layers, 30 layers, and 40 layers.
  • the adhesion surface of cells inside the incubator may be referred to as the culture surface of the incubator or simply the culture surface.
  • the embodiment of the incubator of the present invention includes not only the above-mentioned multi-layer incubator but also an incubator for single-layer culture having a large area, for example, an adhesion area of 500 cm 2 or more, and can be suitably carried out.
  • the bonding area may be, for example, 500 to 2000 cm 2 , 1000 to 2000 cm 2 , and the like.
  • the term "incubator” includes both a multi-layer incubator and a single-layer incubator.
  • the material of the incubator is not particularly limited, but for example, all or at least a part thereof is formed of a polycarbonate resin, a polyester resin, a polystyrene resin, or an acrylic resin.
  • the incubator has a strength that does not damage the incubator due to the strain of the incubator that occurs when the inside of the incubator is depressurized or pressurized. Operations such as medium exchange can be performed without pressurizing. That is, according to the present invention, since the strength required for the incubator can be reduced, the outer wall of the incubator can be thinned to reduce the material required for manufacturing the incubator.
  • the incubator body of the present invention has two or more openings, for example, two openings (first and second body openings) and three openings (first to third body openings). ).
  • One of these openings functions as (1) below and the rest as (2) below.
  • (2) A vent that allows gas to be exchanged between the internal gas phase and the outside air without contaminating the inside of the incubator.
  • the openings used for injecting and discharging cells and medium should be covered so that they are airtight during culture, and when injecting or discharging cells or medium, the openings should be covered.
  • This lid is removed.
  • a cap with a flexible tube that penetrates hereinafter referred to as "cap with tube”
  • the tube of the cap with the tube is closed by clipping or the like during cell culture.
  • the medium and the cell injection port and the opening used for the discharge may be a cap with a tube fixed integrally to the container body.
  • the membrane filter is a film-like filter in which circular holes (“holes”) having an inner diameter of substantially submicron order, which penetrates substantially perpendicular to the surface thereof, are formed over the entire surface. ..
  • the pore size of the membrane filter is not particularly limited as long as it can prevent the passage of microorganisms and allow oxygen molecules and carbon dioxide molecules to pass through, but for example, 0.15 to 1.0 ⁇ m, 0.15 to 0.8 ⁇ m, 0.2 to It is 0.8 ⁇ m, 0.2 to 0.5 ⁇ m, 0.15 to 0.22 ⁇ m, 0.2 ⁇ m, 0.22 ⁇ m.
  • the thickness of the membrane filter is not particularly limited, but is, for example, 120 to 180 ⁇ m and 100 to 200 ⁇ m.
  • the material of the membrane filter is not particularly limited, but hydrophobic materials such as polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride resin (PVDF), and polyester, and hydrophilic materials such as nylon and cellulose can be preferably used.
  • a hydrophilic material obtained by subjecting a hydrophobic material to a hydrophilic treatment can also be suitably used as a material for a membrane filter.
  • Hydrophobic materials are particularly suitable as materials for membrane filters.
  • a membrane filter whose material is hydrophobic is called a hydrophobic membrane filter, and a membrane filter whose material is hydrophilic is called a hydrophilic membrane filter.
  • the partial pressure of carbon dioxide (pCO 2 (%)) in the culture medium be maintained at about 5%.
  • the “gas phase region” of the incubator refers to the region of the incubator that is in contact with the gas phase above the medium liquid surface during cell culture.
  • the partial pressure of carbon dioxide in a culture solution is a measurement of the amount of dissolved carbon dioxide in the culture solution, and the amount of the dissolved carbon dioxide in the environment (temperature, pressure, etc.) in which the culture solution is placed. It is the concentration of carbon dioxide in the gas phase in contact with the culture solution, which is obtained from the value.
  • the exchange of carbon dioxide between the culture solution and the gas phase is in equilibrium.
  • the depth filter is a filter in which the internal filter medium is made of a porous material, or a filter having a three-dimensional network structure inside.
  • the material of the depth filter is not particularly limited, and examples thereof include filter cloth, filter paper, porous synthetic resin, porous metal, and asbestos.
  • As an example of the depth filter there is a filter manufactured by compacting glass fiber, cellulose fiber, or the like.
  • a hydrophobic glass fiber laminate having a three-layer structure of polyester, glass fiber, and polyester can be suitably used as a depth filter.
  • a filter with a smaller ventilation resistance per membrane area than the membrane filter is used as the depth filter.
  • the minimum diameter of the pores in the porous material of the depth filter or the minimum dimension of the gap in the three-dimensional network structure is not particularly limited as long as the ventilation resistance per membrane area of the depth filter is smaller than that of the membrane filter.
  • those having a pore size equal to or larger than the pore size of the membrane filter attached directly in parallel with the incubator or simultaneously with the parallel filter connector can be preferably used.
  • Depth filters in which the minimum diameter in the porous material of the depth filter or the minimum dimension of the gap in the three-dimensional network structure is larger than the pore size of the membrane filter can be particularly preferably used.
  • the minimum diameter of the hole of the depth filter or the minimum dimension of the gap is, for example, 0.5 to 1.5 ⁇ m, 0.8 to 1.2 ⁇ m, 0.8 to 1.0 ⁇ m, and 1.0 ⁇ m.
  • the minimum diameter of the pores of the depth filter or the minimum size of the gap is, for example, 0.8 to 1.2 ⁇ m or 0.5 to 1.5 ⁇ m.
  • the thickness of the depth filter in the gas permeation direction is not particularly limited as long as the ventilation resistance per membrane area of the depth filter is smaller than that of the membrane filter, but is equal to or less than the thickness of the membrane filter. Thick ones can be preferably used. Depth filters that are thicker than membrane filters can be used particularly favorably.
  • the thickness of the depth filter is, for example, 210 to 800 ⁇ m and 230 to 770 ⁇ m. For example, when the thickness of the membrane filter is 120 to 180 ⁇ m, the thickness of the depth filter is 210 to 800 ⁇ m.
  • Some depth filters are configured so that the pore diameter becomes smaller toward one side along the gas passage direction.
  • a depth filter having such a structure is referred to as a directional depth filter.
  • the filter surface on the side where the gas of the depth filter flows in at this time is called the inflow surface, and the filter surface on the side where the gas flows out is called the outflow surface.
  • a directional depth filter when a directional depth filter is adopted, it is usually arranged so that the inflow surface is on the outside air side, but there is no problem even if the inflow surface is on the gas phase side of the incubator. .. Further, in the present invention, a depth filter having no directionality can also be preferably used.
  • the present invention for example, when the incubator body has three openings, as shown in FIGS. 7 and 8, of two openings other than the openings used for injecting and discharging the medium or cells.
  • a membrane filter can be attached to one side and a depth filter can be attached to the other side in an appropriate manner.
  • the membrane filter and the depth filter can be directly attached to their openings by appropriate means such as fixing the peripheral edge portion with a heat seal, adhesive, or a ring-shaped member (FIG. 8).
  • one or both of these two types of filters can be airtightly connected to the main body of the incubator in the form of a filter unit, which is a component having a filter inside (FIG. 7).
  • the filter unit is a component that has a penetrating flow path and holds a filter arranged so as to divide the flow path back and forth.
  • the filter unit has an opening in at least one opening of the flow path that can be airtightly connected to a corresponding opening that is a connection partner such as an incubator main body. That is, the openings forming the pair each have a corresponding form (eg, male and female threaded portions, male or female tapered fitting surfaces) that achieves an airtight connection.
  • a connection partner such as an incubator main body.
  • the openings forming the pair each have a corresponding form (eg, male and female threaded portions, male or female tapered fitting surfaces) that achieves an airtight connection.
  • the connection partner that can be attached to the opening provided on the top surface or the side surface of the incubator body.
  • the non-filter portion of the filter unit may be made of polyvinyl chloride or any other suitable synthetic resin and / or metal.
  • a parallel filter connector can be used by connecting to one of the openings.
  • the incubator body has only two openings, use the opening (ventilation opening) that is not for injecting / discharging the medium or cells, and use the membrane filter in the incubator body. And a depth filter can be attached.
  • the incubator of the present invention is provided with a "parallel filter connector" that is airtightly connected to the ventilation opening, to which the membrane filter and depth filter are directly connected or in the form of each of these filter units. It is attached so as to be parallel to the gas phase in the incubator.
  • a "parallel filter connector” is a component with an internal space having three openings, one of which is airtightly connected to the corresponding form of opening provided in the incubator body. It is configured to be.
  • the other two openings of the parallel filter connector (which communicate with the opening connected to the incubator body) are directly (independent of each other) with the membrane filter on one side and the depth filter on the other side. It is attached by an airtight connection in the form of a heat seal, adhesive, etc.) or a filter unit.
  • the opening of the parallel filter connector connected to the filter unit has a form corresponding to an airtight connection with the opening of the filter unit (for example, a male-threaded portion and a female-threaded portion, a male-type or female-type taper). With fitting surface).
  • the overall shape of the parallel filter connector is, for example, the shape of a branch tube having two openings at the ends other than the opening connected to the incubator body, and two openings other than the opening connected to the incubator. It can be formed arbitrarily, such as a box shape or a dome shape.
  • FIGS. 6 to 7 show a cap type filter unit equipped with a membrane filter and a coma type filter unit provided with a depth filter.
  • these overall shapes and the shapes of the connection portions are merely those corresponding to the shapes of the openings of the connection partners shown as examples in FIGS. 6 to 7, and as long as they can correspond to the shapes of the openings of the connection partners.
  • Each can be either a coma type or a cap type independently.
  • the filter unit holding the membrane filter and the filter unit holding the depth filter are referred to as "membrane filter unit” and "depth filter unit", respectively.
  • a parallel filter connector can be connected to one of the openings for use.
  • a plurality of parallel filter connectors can be used by connecting a plurality of parallel filter connectors to a plurality of openings in the main body of the incubator.
  • the parallel filter connector is a branched tubular portion as a whole, and has a main body portion and a branched portion extending from the side surface thereof.
  • the main body portion has a first opening portion and a second opening portion, and the branch portion communicates with the main body portion at one end and has a third opening portion at the other end portion.
  • the first opening is for connecting to the main body opening (other than the cell and medium loading / unloading) provided in the incubator, and the second opening is for connecting to the first filter unit.
  • the opening and the third opening are openings for connection with the second filter unit.
  • the angle between the main body and the origin of the branch is sufficient for the first filter unit and the second filter unit to perform their respective functions physically or in their functions without causing interference with each other. It is arbitrary as long as it can be exerted, and may be, for example, a right angle or another angle. Further, the inner diameters of the two flow paths of the main body portion and the branch portion may be the same or different.
  • the first opening of the parallel filter connector When the first opening of the parallel filter connector is connected to the incubator body, it is horizontally oriented in the gas phase region of the incubator, depending on the arrangement of the corresponding openings (side surface, top surface) in the incubator body.
  • the opening may be downward, and the second opening and the third opening may be formed in an overall shape so as to open horizontally or upward.
  • the membrane filter unit is connected to one of the second opening and the third opening of the parallel filter connector, and the depth filter unit is connected to the other.
  • the second opening and the first opening of the parallel filter connector are preferably provided at both ends of the main body in opposite directions.
  • a membrane filter unit is preferably attached to the second opening for ventilation inside and outside the incubator in a stationary state, but the present invention is not limited to this, and a depth filter unit may be attached.
  • the first to third openings of the parallel filter connector correspond to the shape of the opening of each filter unit so that they can be connected to the incubator or the filter unit, for example, female threaded portion, male threaded portion, male type or female. Has a tapered fitting surface for the mold.
  • the shape of the opening for mutual connection may be a shape other than these as long as the airtight connection with each other is achieved.
  • the opening at the end of the parallel filter connector and filter unit can be pushed into a flexible and elastic tube-shaped connector made of synthetic resin such as soft polyvinyl chloride, or made of other synthetic resin or metal. It may be connected via a connector such as. The same applies to the connection between the parallel filter connector and the incubator body.
  • each filter unit and the incubator body or them When connecting a parallel filter connector to a membrane filter unit and / or a depth filter unit via such a connector, when the parallel filter connector is connected to the incubator body, each filter unit and the incubator body or them
  • the shape of the connector can be adjusted to a linear shape, a curved shape, an L shape, or any other appropriate shape so that the filter units of the above do not physically interfere with each other.
  • connection between the parallel filter connector and each filter unit via the connector may be performed by forming male and female screws that screw together at the connection site between the connector and the parallel filter connector and each filter unit. , Or welding or other appropriate fixing means may be used.
  • the parallel filter connector that can be connected to the incubator body is supposed to be used in a sterile environment. Therefore, it is necessary to sterilize it before use.
  • the material of all the parts is gamma ray sterilization, dry heat sterilization, high pressure steam sterilization, EOG (methylene oxide) sterilization, or low temperature gas. It must be durable against at least one such as plasma sterilization.
  • Synthetic resins such as heat-resistant synthetic resins, rubber, stainless steel, etc., as long as they do not cause deformation, melting, expansion, shrinkage, alteration, deterioration, tearing, decomposition, disintegration, corrosion, ignition, explosion, etc. before and after sterilization.
  • the material may be made of metal, glass, ceramics, or the like. However, the material must be able to guarantee the airtightness of each connection so that the sterility is maintained as a whole when the parallel filter connector to which the filter unit is connected is connected to the incubator.
  • Parallel filter connectors can be supplied as individually packaged.
  • the parallel filter connector has an internal space with three openings communicating with each other, one of which is connected to the corresponding opening provided in the body of the cell incubator. In the other two openings, one opening comprises one of two different filters such that the internal space is separated from the outside, and the other opening is a penetrating flow.
  • a parallel filter connector is configured to provide a path and connect to the corresponding opening of the filter unit holding the other of the two different filters so as to separate the flow path back and forth.
  • Packaged with the filter unit i.e. can be supplied as a kit. In this case, if the parallel filter connector is equipped with a membrane filter, the filter unit included in the kit holds the depth filter.
  • the filter unit included in the kit holds the membrane filter.
  • a lid that separates the inside and the outside of the parallel filter connector from the side of the parallel filter connector that is not equipped with one of the filter units, that is, the opening for mounting the other filter unit. It may be attached. The lid is removed when attaching the other filter unit.
  • the parallel filter connector has an internal space with three openings communicating with each other, one of which is connected to the corresponding opening provided in the body of the cell incubator.
  • the parallel filter connector can be packaged with the two filter units, i.e. supplied as a kit.
  • a lid that separates the inside and the outside of the parallel filter connector may be attached to the opening for attaching the filter unit of the parallel filter connector. The lid is removed when the filter unit is attached.
  • a membrane filter having a sufficiently large effective filtration area can be used instead of the depth filter.
  • the membrane filter having a sufficiently large effective filtration area means that the aeration resistance generated in the membrane when the culture solution is discharged from the cell incubator is equal to or less than the aeration resistance generated in the depth filter. .. That is, in one embodiment of the present invention, the second opening and the third opening of the parallel filter connector have a membrane filter unit on one of them and a membrane filter having a sufficiently large effective filtration area on the other. The membrane filter unit is connected.
  • a suitable example of a membrane filter having a sufficiently large effective filtration area is the LABODISC (registered trademark) disposable membrane filter unit (pore diameter 0.2 ⁇ m, effective filtration area 19.6 cm 2 , Advantech Toyo Co., Ltd.).
  • Example 1 Cell culture using an incubator equipped with a depth filter CellSTACK (registered trademark) (10 chambers, Corning), which is a multi-layer incubator having two openings, has a screw cap with a tube in one opening. And a cap with a depth filter (Bacterial Air Vent 37 mm, nominal pore size 1 ⁇ m, effective filtration area 7.5 cm 2 , PALL) was attached to the other opening (incubator with depth filter).
  • Bacterial Air Vent 37 mm is a depth filter with a polyester / glass fiber / polyester three-layered hydrophobic glass fiber laminated film, and the flow rate when air is passed through it at a differential pressure of 40 kPa is 40 L. / Minutes.
  • CellSTACK (10 chambers) is an incubator with a 6360 cm 2 adhesive surface on which cells can adhere and proliferate.
  • a suspension of dental pulp-derived cells suspended in a medium was added to this adhesive surface so that the number of cells per unit area was about 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the amount of medium at this time was 1500 mL.
  • the medium used was DMEM Low Glucose (glucose concentration 5.56 mM, GE healthcare) supplemented with FBS (fetal bovine serum, GE healthcare) so that the final concentration was 10%.
  • the incubator was placed in a CO 2 incubator in which the CO 2 concentration in the chamber was set to 5%, and culturing was started at 37 ° C. under moist conditions. During the culture period, the tube opening of the cap with tube was closed tightly with a clip. The experiment was performed using two incubators.
  • CellSTACK (Corning) was used as the multi-layer incubator, but the same applies to other commercially available multi-layer incubators such as Cell Factory TM (Thermo Fisher SCIENTIFIC) and BioFactory TM (Wuxi NEST Biotechnology). Experiments can be performed.
  • Cell Factory TM Thermo Fisher SCIENTIFIC
  • BioFactory TM Wang NEST Biotechnology
  • Example 2 Cell culture using an incubator equipped with a membrane filter A cap with a tube is attached to one opening of CellSTACK (10 chambers, Corning), which is a multi-layer incubator having two openings, and the other. A membrane filter (33 mm vent cap for cell stack, pore diameter 0.2 ⁇ m, Corning) was attached to the opening of the cell (incubator with membrane filter). The 33 mm vent cap for cell stack is a membrane filter made of high density polyethylene.
  • the same dental pulp-derived cells used in Example 1 suspended in a medium so that the number of cells per unit area was about 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 with respect to the adhesive surface of CellSTACK (10 chambers). Suspension was added. The amount of medium at this time was 1500 mL.
  • the medium used was DMEM Low Glucose (glucose concentration 5.56 mM, GE healthcare) supplemented with FBS (fetal bovine serum) (GE healthcare) to a final concentration of 10%.
  • the incubator was placed in a CO 2 incubator in which the CO 2 concentration in the chamber was set to 5%, and culturing was started at 37 ° C. under moist conditions. During the culture period, the tube opening of the cap with tube was closed tightly with a clip. The experiment was performed using 4 incubators.
  • Example 3 Measurement of carbon dioxide partial pressure and pH of the medium
  • the start of the culture was set to Day 0, and 2 days after the start of the culture (Day 2), 4 days after the start of the culture (Day 4), and 5 of the same.
  • the measurement was performed according to the instruction manual of Bioprofile Fox. Since the measured values of carbon dioxide partial pressure (pCO 2 (%)) and pH change greatly depending on the temperature of the measured sample, the measured sample is constant depending on the heat source in the pH / PCO 2 / PO 2 analyzer Bioprofile Fox. The temperature was maintained at the above temperature for measurement, and the set temperature was set to 37 ° C. The measurement was performed on all the incubators used in the experiment, and the average of the measured values was calculated.
  • the carbon dioxide partial pressure measures the amount of dissolved carbon dioxide in the culture solution, and is obtained from the measured value of the amount of dissolved carbon dioxide in the environment (temperature, pressure, etc.) where the culture solution is placed. It is the concentration of carbon dioxide in the gas phase that comes into contact with.
  • the pH of the measurement results of pCO 2 (%) of the medium in the cell culture of Example 1 (using an incubator with a depth filter) and the cell culture of Example 2 (using an incubator with a membrane filter) is shown in FIG.
  • the measurement results of are shown in FIG. 2, respectively.
  • the pCO 2 (%) of the medium cultured using the incubator with the depth filter and the medium cultured using the incubator with the membrane filter was about 5%, which are almost the same. rice field.
  • the pCO 2 (%) of the medium continued to rise, reaching about 9% on Day 6.
  • the pCO 2 (%) of the medium increased slightly, but it was about 6% even on Day 6.
  • the pH of the medium cultivated using the incubator with a depth filter and the medium cultivated using the incubator with a membrane filter were about 7.6, which were almost the same.
  • the pH of the medium cultivated using the incubator with a depth filter was lower than that of the medium cultivated using the incubator with a membrane filter, and on Day 6, the former The pH was about 7.23, and the pH of the latter was about 7.40.
  • a correlation was found between the pCO 2 (%) and pH values of the medium, and the pH decreased as the pCO 2 (%) of the medium increased. This is because some of CO 2 forms carbonate ions and the like in an aqueous solution.
  • the CO 2 concentration in the gas phase in the incubator should be about 5%. Need to be maintained.
  • the gas phase in the incubator is between the gas phase in the CO 2 incubator and the gas phase in the CO 2 incubator because the oxygen contained in the gas phase is consumed by the cells and the CO 2 produced by the cells is released from the liquid surface of the medium. If gas exchange (static gas exchange) is not sufficiently performed, the CO 2 concentration in the gas phase will increase, and the increase in pCO 2 (%) of the medium in equilibrium with this will not be prevented.
  • the pCO 2 (%) in the medium during the culturing period is maintained at 5 to 6%.
  • pCO 2 (%) in the medium increased to about 9% during the culturing period. It is considered that this is because the gas exchange between the gas phase in the CO 2 incubator and the gas phase in the incubator, at least the carbon dioxide gas exchange, was not sufficiently performed by the depth filter.
  • the depth filter is suitable as a filter that can ensure sufficient gas exchange between the space inside the incubator and the space inside the CO 2 incubator. It shows that it is necessary to use a membrane filter.
  • Example 4 Medium recovery operation In the cell culture of Examples 1 and 2, 6 days after the start of culture, the incubator was taken out from the CO 2 incubator chamber, the tube clip was removed, and the end of the tube was used for medium recovery. Connected to the container.
  • the incubator with a depth filter of Example 1 was tilted and lifted, and the medium was discharged into a container for collecting the medium by natural flow and collected. It was possible to drain the medium from the incubator at a rate of approximately 290 mL / min (calculated by dividing the total amount of the medium by the time spent on the solution).
  • the incubator with a membrane filter of Example 2 when the medium was discharged from the incubator in the same manner, the incubator cracked, so that it was practically impossible to discharge the medium by natural flow. It was possible.
  • the gas phase volume in the incubator increases by the amount of the discharged liquid. Therefore, if the same volume of outside air does not flow into the incubator, the inside of the incubator is in a depressurized state, and pressure from the outside acts on the outer wall of the incubator.
  • the cause of the damage in the incubator with the membrane filter is that it is not possible to inflow the outside air at the above-mentioned natural flow medium discharge rate through the membrane filter, so the inside of the incubator becomes excessively negative pressure and the outside It is considered that a large load due to the pressure was applied to the incubator and the incubator was distorted beyond the limit.
  • the membrane filter is not suitable as a filter to be attached to the incubator, and the depth filter is suitable from the viewpoint of aseptic and smooth recovery of the medium and prevention of damage to the incubator.
  • Example 5 Evaluation of an incubator equipped with both a depth filter and a membrane filter Based on the above results, a parallel filter having both of them attached to the opening of the incubator main body to which the depth filter or the membrane filter was attached.
  • a parallel filter having both of them attached to the opening of the incubator main body to which the depth filter or the membrane filter was attached.
  • the evaluation of the incubator equipped with both the depth filter and the membrane filter was different from Examples 1 and 2, and the incubator to which only the medium was added without using cells was used with these filters attached. gone.
  • CellSTACK (10 chambers, Corning), which is a multi-layer incubator with two openings, has DMEM Low Glucose (glucose concentration 5.56 mM, GE healthcare) and FBS (fetal bovine serum) (GE healthcare), respectively. The medium was added so that the final concentration was 10%, and 1500 mL each was added. Next, a cap with a tube was attached to one of the openings of each CellSTACK and connected to another container. In the other opening, (i) Depth filter (Bacterial Air Vent 37 mm, nominal hole diameter 1 ⁇ m, cap with PALL), (ii) Membrane filter (33 mm vent cap for cell stack, hole diameter 0.2), respectively. ⁇ m, Corning), or (iii) A parallel filter connector in which both the depth filter and the membrane filter are connected was attached.
  • the incubator to which the depth filter is attached, the incubator to which the membrane filter is attached, and the incubator to which the parallel filter connector to which both the depth filter and the membrane filter are attached are connected are the first incubator and the first incubator, respectively. It is called a second incubator and a third incubator.
  • CellSTACK was stored in a wet CO 2 incubator with the CO 2 concentration in the refrigerator set to 5%.
  • a 30 mL syringe (with lock, Terumo) that was sterile-bonded to the tube of the cap with tube at 0 hours, 1 hour, 3 hours, 18 hours, 21 hours, and 42 hours after storage. ) was used to sample 5 mL of the medium, and the pH / PCO 2 / PO 2 analyzer Bioprofile Fox (Nova Biomedical) was used to measure the carbon dioxide partial pressure (pCO 2 ) and pH of the medium. The measurements were generally performed according to the Bioprofile Fox instruction manual.
  • the measured sample is constant depending on the heat source in the pH / PCO 2 / PO 2 analyzer Bioprofile Fox.
  • the temperature was maintained at the above temperature for measurement, and the set temperature was set to 37 ° C.
  • the measurement results of pCO 2 (%) of the medium added to the first to third incubators are shown in FIG. 3, and the measurement results of pH are shown in FIG. 4, respectively.
  • pCO 2 (%) decreased and pH increased by 2 hours. It is considered that this is because the CO 2 contained in the medium was degassed after the incubator was allowed to stand in the incubator.
  • pCO 2 (%) increased and the pH decreased, which was caused by CO 2 from the outside air (gas phase in the incubator) through the membrane filter. It is probable that was supplied.
  • the CellSTACK was taken out from the incubator, a container for collecting the medium was connected to the cap with a tube attached to the CellSTACK, and the medium was discharged by natural flow.
  • the first incubator at a rate of about 290 mL / min (calculated by dividing the total amount of medium by the time spent on the solution), and in the third incubator, at a rate of about 280 mL / min, respectively. While it was possible to drain the medium, in the second incubator equipped with only the membrane filter, the inside of the incubator was decompressed when the medium was drained, and it can be visually confirmed on the incubator body. Distortion and breakage occurred, and it was impossible to discharge the medium normally.
  • FIG. 5 shows a schematic cross-sectional view of the parallel filter connector used in the fifth embodiment.
  • the parallel filter connector (1) is a branched tubular as a whole and has a first opening (3), a second opening (4), and a third opening (5).
  • the parallel filter connector (1) includes a main body portion (1a) and a branch portion (2) provided in the middle of the side wall of the main body portion.
  • the branch portion (2) communicates with the inside of the main body portion (1a).
  • the main body portion (1a) has a first opening portion (3) for connecting the main body portion (1a) to the opening portion of the incubator main body, and a second opening portion (4) for attaching a membrane filter.
  • the first opening (3) is provided with a female thread (6) for hermetically screwing the parallel filter connector to the opening of the incubator body.
  • the second opening (4) is provided with a male screw portion (7) for hermetically screwing the membrane filter unit.
  • the third opening (5) at the branch (2) is female so that it can be airtightly fitted to the depth filter unit (which has a male tapered fitting surface for connection). It has a tapered fitting surface.
  • FIG. 6 shows a schematic cross-sectional view of the parallel filter connector (1) attached to the incubator main body (10) used in Example 5.
  • the parallel filter connector (1) is provided in the first main body opening (8) in which the female screw portion (6) provided in the first opening (3) is provided in the incubator main body (10). It is airtightly connected to the incubator body (10) by being screwed into the male screw part (29).
  • the structure of the incubator body (10) as a multi-layer incubator is omitted.
  • the membrane filter unit (9) is airtightly connected to the second opening (4) of the parallel filter connector (1).
  • the membrane filter unit (9) is a flat cylindrical lid, and the membrane filter (9a) is attached to the opening provided on the top surface thereof, through which the outside air and the parallel filter connector are connected.
  • the gas phase in (1) and then the gas phase in the incubator body (10) can be distributed.
  • the airtight connection between the parallel filter connector (1) and the membrane filter unit (9) is the female screw portion (11) provided in the lower opening of the membrane filter unit (9) and the parallel filter connector (1). It is made by screwing with a male screw portion (7) provided in the second opening (4) of the above.
  • the depth filter unit (12) is airtightly connected to the third opening (5) of the parallel filter connector (1).
  • the depth filter unit (12) is a coma type, has a depth filter (12a) in the flow path, has one opening (13a and 13b) at the top and bottom, and an opening at the lower end. Complementary fitting surface whose outer shape is tapered toward the portion (13b) and narrows downward toward the inside of the third opening (5) of the parallel filter connector (1). It is tightly fitted with a good fitting surface. Through this depth filter (12a), the outside air, the gas phase in the parallel filter connector (1), and then the gas phase in the incubator body (10) can be distributed.
  • a cap with a tube (16) is airtightly connected to the opening (14) of the second main body of the incubator.
  • the tube (17) of the cap (16) with a tube extends through the top surface of the cap and communicates the inside and the outside of the incubator body (10).
  • the connection between the second main body opening (14) and the cap with tube (16) of the incubator is made to the male screw part (15) and the cap with tube (16) provided in the second main body opening (14). It is made by screwing with the provided female threaded portion (18).
  • the opening at the outer end of the tube (17) is closed by clipping during cell culture.
  • the medium can also be drained by hanging the tube (17).
  • FIG. 7 shows another embodiment of the incubator.
  • the incubator body (19) comprises a first body opening (20), a second body opening (21), and a third body opening (22), the first opening (20). ),
  • the membrane filter unit (9) is attached, and the depth filter unit (12) is attached to the second opening (21).
  • the first opening (20) is provided with a male thread for connecting the membrane filter unit (9)
  • the second opening (21) is a female type for connecting the depth filter unit (12).
  • the one provided with the tapered fitting surface is shown as an example.
  • the form of these connecting portions can be selected according to various forms that the connecting portion of each filter unit can take.
  • the incubator (19) shown in FIG. 7 has a third body opening (22), which is similar to that shown as the second body opening (14) in FIG. It is an opening for injection and discharge, and similarly, a cap (16) with a tube (17) is airtightly connected.
  • the form of the connecting portion of the third opening (22) can also be selected according to various forms that the connecting portion of the cap with a tube can take.
  • FIG. 8 shows a further embodiment of the present invention.
  • the membrane filter and the depth filter are integrally attached to the incubator (24) as a part thereof.
  • both the membrane filter (27) and the depth filter (28) are in parallel so that gas can be exchanged between the internal gas phase and the outside air. It is attached to (24).
  • the opening (25) of the incubator (24) is an opening for injecting and draining cells and medium similar to that shown as the second opening (14) in FIG. 26) is provided, and the cap (16) with the tube (17) is airtightly connected in the same manner.
  • the form of the connection portion of the opening (25) can also be selected according to various forms that the connection portion of the cap with a tube can take.
  • the present invention it is possible to prevent deformation such as swelling and denting of the incubator and damage to the incubator due to the deformation caused during the work of exchanging the medium in the incubator, and to prevent the accumulation of carbon dioxide gas in the incubator. It is possible to provide a cell incubator having the advantage of being able to prevent and maintain the pH of the medium in an appropriate range during the culture period. Further, the parallel filter connector of the present invention is used as a means for updating the incubator having the same advantages as described above even if the incubator body has only one gas exchange opening. be able to.

Abstract

細胞の出し入れや培地交換の操作における培養器の変形を防止し且つ細胞培養中における経時的な炭酸ガス濃度上昇や培地のｐＨ低下を防止できる，という利点を備えた細胞培養器及びこれを構成するための並列フィルター接続器が開示されている。当該細胞培養器は，該細胞培養器の内側の気相と外側の空気との間をそれぞれが画するよう並列に，異なる２種のフィルターを備え，これを構成するための並列フィルター接続器は，該細胞培養器の本体と接続される開口部とそれら２種の異なるフィルターのをそれぞれ備えることができる２つの開口部を有する。

Description

細胞培養器及び並列フィルター接続器
　本発明は，細胞及び液体培地を投入して細胞培養を行うための容器である細胞培養器（以下，単に「培養器」ともいう。）に関し，特に，内側の気相と外側の気相との境界に２種の異なるタイプのフィルターが並列に取り付けられている細胞培養器，及びそれらのフィルターを細胞培養器の本体に並列に取り付けるための並列フィルター接続器に関する。
　ワクチン，組換え蛋白質製剤，細胞医薬品等のようなバイオ医薬品の製造のためには一般に細胞の大量培養が行われる。培養される細胞には，液体培地中に浮遊した状態で培養できる細胞（以下，「浮遊性細胞」ともいう。）と，足場となる何等かの支持体表面に接着した状態で培養することが実際上必要である細胞（以下，「接着性細胞」ともいう。）の２つのタイプがある。浮遊性細胞であれば，フラスコを用いた振盪培養により，もしくは培養器内部に設置した撹拌翼等を用いた撹拌培養により，比較的小さな占有面積で大量培養を行うことが可能である。一方，接着性細胞の培養にあっては，培地の撹拌を行うことができない。このため，接着性細胞の培養において，細胞の生存と増殖に必要な酸素の供給と産生された二酸化炭素の除去を十分に行うには，気相－液相間のガス交換を促すよう，培地の体積あたりの表面積を大きくし培地の液深を浅くする必要がある。
　接着性細胞の培養においては，古くなった液体培地を適当な間隔で除去し新しい培地を加える操作である培地交換が一般に行われる。そのため，接着性細胞用の培養器には，細胞の出し入れと培地交換等を行うための開口部が設けられている。この開口部は，培養器の内部が汚染されることのないよう，培養期間中はキャップで閉じられている。但し，培養器内部の気相が外気から完全に遮断されると，細胞の代謝に伴い培養器中の気相の成分が徐々に変化してしまうので，上記のキャップが閉じられた状態でもそのような変化を防止するに足りるだけのガス交換が，培養器の内側と外側との間で確保される必要がある。この目的で，培養器には，ある程度気相が通過できるフィルター（メンブレンフィルター）を備えたキャップが取り付けられようになっており，このフィルターを通じて培養器の内側の気相と外側の気相とのガス交換が行われる。
　接着性細胞を培養する場合，培養できる細胞の数は，培養器内の細胞が接着可能な表面の面積と正の相関を有する。従って，接着細胞を効率的に大量培養するには，培養器内の細胞が接着可能な表面の面積を増大させる必要がある。この目的で，細胞が接着する支持体面を備えたトレイの複数を積層一体化した細胞培養器である多層培養器（CELLSTACK：登録商標）が開発されている（特許文献１）。このタイプの培養器は，それらのチャンバーの積層体の形をとり，各トレイへの細胞の投入及び取り出しや培地交換時に外されるキャップ付きの共通の開口部及び内部の気相と外部の気相の交換のための共通の開口部（メンブレンフィルター付きキャップが取り付けられる）を，それぞれ積層体の上部に備えている。細胞培養の実施に際して，気相を確保し且つ各トレイにも設けられた平坦な支持体の上面が液体培地に浸漬するように培養器に培地が加えられる。こうして，それぞれのトレイの支持体表面に細胞が接着して生存，増殖することが可能となる。
米国２００９／０２９８１６４号公報
　本発明者らは，接着性細胞用の培養器内の培地を交換する際，培地の排出時（チューブを介した高低差による自然流下やポンプ吸引）には培養器が凹むように，また新鮮な培地の注入時（チューブを介した高低差による自然流下による注入やポンプ注入）には培養器が膨らむように変形すること，及びそれらの変形がしばしば培養器のひび割れ等の破損をもたらすことを新たに見出した。そのような破損が起こると培養は続けられず，それまでの様々な準備及び操作の全てが無駄となる。また破損しないまでも破損回避のための細心の注意を伴う慎重な作業が培地交換には必要となる。これらのことが，接着性細胞の大量培養の工程全体の効率に無視できない悪影響を及ぼしている。
　この問題は，培養器からの培地の排出時の培養器内の気相容量拡大に起因して培養器内部が減圧になること，及び新鮮な培地の注入時に培養器内の気相容量の縮小に起因して気相が圧縮されることによる。培養器内の気相と外部の気相との交換のために取り付けられているメンブレンフィルターでは，培地交換に際して発生する培養器内の気圧変化を解消させる程の十分な通気性がないものと思われる。
　本発明者らは，この問題の解決を試み，圧力差の存在下に迅速に気体を透過させることのできるデプスフィルターをメンブレンフィルターの代わりに，採用したところ，培地交換時の培養器の変形が回避でき破損の懸念がないことを新たに見出した。
　しかしながら更なる検討において，デプスフィルターをメンブレンフィルターの代わりに取り付けた培養器で細胞培養を行うと，経時的に培地のｐＨが低下しこれと平行して気相中の炭酸ガス濃度が上昇することが確認され，気相中の炭酸ガスのデプスフィルターを介した外部への拡散が極度に阻害されていることが判明した。上記のように，メンブレンフィルターに比べてデプスフィルターは，培地交換時に培養器の内外に圧力差を殆ど生じさせない程大きな通気性を有するにも拘わらず，内外の気圧差がない状態で気相中の炭酸ガスの外部への透過性を実質的に示さないことは，全く予想外であった。
　従って本発明は，細胞の出し入れや培地交換の操作における培養器の変形を防止し且つ細胞培養中における経時的な炭酸ガス濃度上昇や培地のｐＨ低下を防止できる，という利点を備えた細胞培養器の提供を目的とする。
　本発明は上記で得られた結果に基づき更に検討を加えて完成させたものであり，以下のものを含む。
　１．細胞培養器であって，該細胞培養器の内側の気相と外側の気相との間をそれぞれが画するよう並列に，異なる２種のフィルターを備えるものである，細胞培養器。
　２．該２種のフィルターの少なくとも一方が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられ，該フィルターユニットは該流路の片側の開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，上記１に記載の細胞培養器。
　３．該２種のフィルターの各々が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられ，該フィルターユニットの各々は該流路の片側の開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，上記１に記載の細胞培養器。
　４．該２種のフィルターの各々が，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備えた並列フィルター接続器の該３つの開口部のうち２つを通る並列な流路の各々を前後に区切るように，それぞれ備えられており，該並列フィルター接続器が，残りの開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，上記１に記載の細胞培養器。
　５．該２種のフィルターの少なくとも一方が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられており，該フィルターユニットは該流路の片側の開口部において，該並列フィルター接続器に設けられた対応する開口部と接続されているものである，上記４に記載の細胞培養器。
　６．該２種のフィルターの各々が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられており，該フィルターユニット各々は，該流路の片側の開口部において，該並列フィルター接続器に設けられた対応する開口部と接続されているものである，上記４に記載の細胞培養器。
　７．該フィルターユニットと該細胞培養器の本体が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，上記２または３に記載の細胞培養器。
　８．該細胞培養器の本体と該並列フィルター接続器が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，上記４に記載の細胞培養器。
　９．該フィルターユニットと該細胞培養器の本体，及び該並列フィルター接続器が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，上記５または６の何れかに記載の細胞培養器。
　１０．チューブ付きキャップが取り付けられた開口部が本体に更に設けられているものである，上記１～９の何れかに記載の細胞培養器。
　１１．該並列フィルター接続器が，該３つの開口部を各末端に備えた全体として分岐管状の形態である，上記４～６，８，及び９の何れかに記載の細胞培養器。
　１２．該２種のフィルターの一方がメンブレンフィルターであり他方がデプスフィルターである，上記１～１１の何れかに記載の細胞培養器。
　１３．該メンブレンフィルターの厚さが１００～２００μｍであり，該デプスフィルターの厚さが２１０～８００μｍである，上記１２に記載の細胞培養器。
　１４．該メンブレンフィルターの厚さが１２０～１８０μｍであり，該デプスフィルターの厚さが，２３０～７７０μｍである，上記１２に記載の細胞培養器。
　１５．該細胞培養器の素材が合成樹脂である，上記１～１４の何れかの細胞培養器。
　１６．該細胞培養器の素材が，ポリカーボネート樹脂，ポリエステル樹脂，ポリスチレン樹脂，及びアクリル樹脂からなる群から選択されるものである，上記１～１４の何れかの細胞培養器。
　１７．細胞培養器の本体に接続されるための並列フィルター接続器であって，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備え且つ該３つの開口部のうちの１つが，該細胞培養器の本体に設けられた対応する開口部と接続されるように構成されており，他の２つの開口部が，
（１）該内部空間を外部と区切るように，２種の異なるフィルターの一方又は他方をそれぞれ備えるか，
（２）一方の開口部が，該内部空間が外部と区切られるように２種の異なるフィルターの一方を備え，他方の開口部が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該２種の異なるフィルターの他方を保持したフィルターユニットの対応する開口部と接続されるように構成されているか，又は
（３）貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように２種の異なるフィルターの一方又は他方をそれぞれ保持した２つのフィルターユニットの対応する開口部とそれぞれ接続されるように構成されているものである，
　並列フィルター接続器。
　１８．該細胞培養器の本体の開口部と接合される開口部に，該細胞培養器の本体の開口部に対応する雄ねじ部若しくは雌ねじ部又は雄型若しくは雌型のテーパ付き嵌合面を備えるものである，上記１７に記載の並列フィルター接続器。
　１９．該並列フィルター接続器が，該３つの開口部を各末端に備えた全体として分岐管状の形態である，上記１７又は１８に記載の並列フィルター接続器。
　２０．該２種のフィルターの一方がメンブレンフィルターであり他方がデプスフィルターである，上記１７～１９の何れかに記載の並列フィルター接続器。
　２１．該メンブレンフィルターの厚さが１００～２００μｍであり，該デプスフィルターの厚さが２１０～８００μｍである，上記２０に記載の並列フィルター接続器。
　２２．該メンブレンフィルターの厚さが１２０～１８０μｍであり，該デプスフィルターの厚さが，２３０～７７０μｍである，上記２１に記載の並列フィルター接続器。
　２３．該３つの開口部のうちの１つ又は２つに該フィルターユニットが接続されているものである，上記１７～２２の何れかに記載の並列フィルター接続器。
　２４．上記２３に記載の並列フィルター接続器を組み立てるための，以下の（１）又は（２）のキット：
（１）該２種の異なるフィルターの一方を備えた並列フィルター接続器，及び該２種の異なるフィルターの他方を備えたフィルターユニットを含むキット；
（２）並列フィルター接続器，該２種の異なるフィルターの一方を備えたフィルターユニット，及び該２種の異なるフィルターの他方を備えたフィルターユニットを含むキット。
　本発明によれば，細胞培養器中の培地交換作業中に生じる細胞培養器の膨らみや凹みという変形やそれらに伴う細胞培養器の破損の防止ができ，且つ細胞培養器内の炭酸ガスの蓄積を防止して培地のｐＨを培養期間中適切な範囲に維持できる細胞培養器を提供することができる。
図１は，実施例１及び実施例２で得られた，デプスフィルター又はメンブレンフィルターの一方のみを使用した培養器で行った培養期間中の各培地のpCO2(%)の測定結果を平均値で示すグラフである。縦軸は培地のpCO2(%)を示し，横軸は培養を開始してからの経過日数（日）を示す。●はデプスフィルターでの結果（ｎ＝２）を，▲はメンブレンフィルターでの結果（ｎ＝４）を示す。 図２は，実施例１及び実施例２で得られた，デプスフィルター又はメンブレンフィルターの一方のみを使用した培養器で行った培養期間中の培地のpHの測定結果を平均値で示すグラフである。縦軸は培地のpHを示し，横軸は培養を開始してからの経過日数（日）を示す。●はデプスフィルターでの結果（ｎ＝２）を示し，▲はメンブレンフィルターでの結果の平均（ｎ＝４）を示す。 図３は，実施例５で得られた，デプスフィルターのみを，メンブレンフィルターのみを，又は並列フィルター接続器を介してデプスフィルターとメンブレンフィルターの両方を，それぞれ使用した培養器で行った試験での，各培地のpCO2(%)の測定結果を示すグラフである。縦軸は培地のpCO2(%)を示し，横軸は試験を開始してからの経過時間（時間）を示す。●はデプスフィルターのみでの結果を示し，▲はメンブレンフィルターのみでの結果を示し，×は両方のフィルターの併用での結果を，それぞれ示す。 図４は，実施例５で得られた，デプスフィルターのみを，メンブレンフィルターのみを，又は並列フィルター接続器を介してデプスフィルターとメンブレンフィルターの両方を，それぞれ使用した培養器で行った試験での，各培地のpHの測定結果を示すグラフである。縦軸は培地のpHを示し，横軸は試験を開始してからの経過時間（時間）を示す。●はデプスフィルターのみでの結果を示し，▲はメンブレンフィルターのみでの結果を示し，×は両方のフィルターの併用での結果を示す。 本発明の一実施形態における，並列フィルター接続器の模式的断面図を示す。 第一の本体開口部に図５の並列フィルター接続器が，第二の本体開口部にチューブ付きキャップが取り付けられた培養器本体の模式的断面図を示す。並列フィルター接続器の第二の開口部にはメンブレンフィルターユニットが，第三の開口部にはデプスフィルターユニットが，それぞれ取り付けられている。 本発明の他の一実施形態としての，メンブレンフィルターユニットを取り付けるための第一の本体開口部，デプスフィルターを取り付けるための第二の本体開口部，及びチューブ付きキャップを取り付けるための第三の本体開口部とを有する培養器本体の模式的断面図を示す。第一の本体開口部にはメンブレンフィルターユニットが，第二の本体開口部にはデプスフィルターユニットが，及び第三の本体開口部にはチューブ付きキャップが，それぞれ接続されている。 本発明の一実施形態としての，メンブレンフィルター及びデプスフィルターを備え，チューブ付きキャップが取り付けられた開口部を有する培養器の模式的断面図を示す。
　本明細書において，「細胞培養器」又は「培養器」の語は，外部から微生物等の異物が侵入しないような状態に保持しつつ，動物細胞，植物細胞等を培養することのできる容器のことをいう。「細胞培養器の本体」又は「培養器本体」の語は、培養期間中培地及び細胞が保持される器のことをいい、「細胞培養器」又は「培養器」から「フィルター」を除いた部分を意味する。
　本発明の細胞培養器の一実施形態として多層培養器が含まれる。多層培養器は，細胞のための広い接着面積を確保しつつ浅い液深での大量培養を可能にするためのものであり，細胞の接着面と浅い盆状に形成された複数のトレイが垂直方向に積み重ねられ一体に固定されてなる多層構造の培養器である。各トレイの支持体面（上面）は，その直上のトレイの下面との間に培地を及びこれに接する気相を収容するスペースを有し細胞に接着面を提供するので，トレイの枚数に対応した広い細胞接着面積が確保できる。多層培養器は，例えば，2～40層，10～40層，10～20層，2層，10層，20層，30層,40層のトレイからなる多層構造を有する。なお，本明細書において，培養器の内部の細胞の接着面のことを，培養器の培養面又は単に培養面ということもある。
　本発明の培養器の実施形態には，上記の多層培養器に限らず，大面積，例えば500 cm2以上の接着面積を有する単層培養用の培養器も含まれ，好適に実施できる。接着面積は，例えば，500～2000 cm2，1000～2000 cm2等であってよい。以下，本明細書おいて，特に記載のない場合，「培養器」の語は，多層培養器と単層培養器の何れも包含する。培養器の素材に特に限定はないが，例えばその全部又は少なくとも一部が，ポリカーボネート樹脂，ポリエステル樹脂，ポリスチレン樹脂，又はアクリル樹脂で形成されたものである。
　一般に培養器は，培養器内が減圧又は加圧状態になったときに生じる培養器のひずみによって破損しない程度の強度があることが好ましいが，本発明によれば，培養器内をほとんど減圧又は加圧状態にすることなく培地交換等の操作を行うことができる。つまり，本発明によれば，培養器に要求される強度を引き下げることができるので，培養器の外壁を薄くして培養器の製造に必要な素材を減じることもできる。
　一実施形態において本発明の培養器本体は，２つ以上の開口部，例えば２つの開口部（第一及び第二の本体開口部），３つの開口部（第一～第三の本体開口部）を有する。これら開口部のうち１つは下記（１）として，また残りは下記（２）として機能する。
　（１）培養器に培地及び細胞を添加するための注入口，並びに培養器から培地及び細胞等を排出させるための排出口。
　（２）培養器内部を汚染することなく内部の気相と外気との間での気体の交換を行わせる通気口。
　培養器本体の開口部のうち，細胞及び培地の注入及び排出に用いられる開口部には，培養中は気密となるように蓋をしておき，細胞や培地の注入又は排出の際には，この蓋は取外される。当該蓋の代わりに，貫通した柔軟なチューブを備えたキャップ（以下，「チューブ付きキャップ」という。）を取り付けることもできる。その場合，チューブ付きキャップのチューブは，細胞の培養中は，クリップ留め等により閉じられている。細胞又は培地の注入や排出は，対応する培地又は懸濁細胞を含んだ培地の入った容器又は空の容器にチューブの末端を接続し，上記のクリップを外し，チューブを介して（例えば，蠕動ポンプ又は重力により）行われる。これらの容器の内部とチューブ末端を外気に対し気密に接続した状態で，細胞や培地の無菌的な注入及び排出を容易に行うこともできる。なお，本発明において，培地及び細胞の注入口及び排出のために用いられる開口部は，これにチューブ付きキャップが容器本体に一体として固定されたものであることもできる。
　培養器本体にある他の１又は２つの開口部には，気体は通過できるが異物の混入は防止できる適切なフィルターを用いて上記（２）の機能が与えられる。この機能のため，本発明においてメンブレンフィルター及びデプスフィルターの双方が培養器内の気相と外気との間に並列な流路を構成するように取り付けられる。ここに，「並列な流路を構成する」とは，物理的に左右に並んだ形態の流路を構成することに限られず，２つのフィルターの各々が，他方のフィルターを介することなしに，培養器内の気相と外部の気相との間の流路を構成することをいう。従って，フィルターの各々が培養器内外の気相に接しているかぎり，その具体的な形態は問わない。これにより，本発明の培養器本体の内部は，それらの相互に独立したフィルターの各々を介して外部とガス交換できる。
　本発明において，メンブレンフィルターは，その表面に対しほぼ垂直に貫通した概ねサブミクロンオーダーの内径のほぼ均一な円形の穴（「孔」）が全面に亘って形成されている膜状のフィルターである。
　メンブレンフィルターの孔径は，微生物等の通過を防止し，酸素分子及び二酸化炭素分子を通過させることができるものである限り特に限定はないが，例えば，0.15～1.0 μm，0.15～0.8 μm，0.2～0.8 μm，0.2～0.5 μm，0.15～0.22 μm，0.2 μm，0.22 μmである。また，メンブレンフィルターの厚さに特に限定はないが，例えば120～180 μm，100～200 μmである。
　メンブレンフィルターの素材に特に限定はないが，ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）やポリフッ化ビニリデン樹脂（PVDF），及びポリエステル等の疎水性素材や，ナイロン及びセルロースなどの親水性素材が好適に使用できる。疎水性素材に親水性処理を施してなる親水性素材もメンブレンフィルターの素材として好適に使用できる。疎水性素材はメンブレンフィルターの素材として特に好適である。なお，素材が疎水性であるメンブレンフィルターは疎水性メンブレンフィルター，素材が親水性であるメンブレンフィルターは親水性メンブレンフィルターという。
　多層培養器に限らず，細胞培養用のシャーレやフラスコ等の単層培養器を用いた場合でも，細胞の培養時には代謝に伴い細胞からCO2が持続的に放出される。従って，完全に気密にした培養器で培養を行うと，培養器内にCO2が蓄積し，培地中の溶存CO2濃度の上昇に伴い培地のpHが低下する。メンブレンフィルターを培養器の気相領域にある開口部に設けておくことにより，培養器の内部と外部の間のガス交換が起こり培養器内のCO2蓄積が防止され，培地のpH低下も防止される。
　細胞が哺乳動物細胞である場合，一般に，培養液の二酸化炭素分圧(pCO2(%))は約5%に維持されることが好ましい。なお，本明細書において培養器の「気相領域」とは，細胞培養中に培地液面より上方の気相に接する培養器の領域をいう。また本明細書において，培養液の二酸化炭素分圧とは，培養液の溶存二酸化炭素量を測定し，その培養液が置かれた環境（温度，気圧等）において，その溶存二酸化炭素量の測定値から求められる，その培養液と接する気相の二酸化炭素の濃度のことである。なお，ここで培養液と気相間での二酸化炭素の交換は平衡状態にある。
　デプスフィルターは，内部のろ材が多孔質の素材で形成されたフィルター，又は内部に三次元網目状構造を有するフィルターである。デプスフィルターの素材に特に制限はないが，例えば，濾布，濾紙，多孔質合成樹脂，多孔質金属，石綿等である。デプスフィルターの一例として，ガラス繊維やセルロース繊維等を押し固めて製造されたものが挙げられる。ポリエステル，グラスファイバー，及びポリエステルの三層構造を有する疎水性のグラスファイバーラミネートは，デプスフィルターとして好適に使用できる。
　デプスフィルターとしては，メンブレンフィルターよりも膜面積あたりの通気抵抗が小さいものが用いられる。デプスフィルターの多孔質素材内の孔の最小径又は三次元網目状構造内の間隙の最小寸は，メンブレンフィルターよりもデプスフィルターの膜面積あたりの通気抵抗が小さくなるものである限り特に制限はないが，培養器に直接並列に，又は並列フィルター接続器に同時に，取り付けられているメンブレンフィルターの孔径と同等か若しくはこれよりも大きいものが好適に使用できる。デプスフィルターの多孔質素材内の最小径又は三次元網目状構造内の間隙の最小寸が，メンブレンフィルターの孔径よりも大きいデプスフィルターは特に好適に使用できる。デプスフィルターの孔の最小径又は間隙の最小寸は，例えば，0.5～1.5 μm，0.8～1.2 μm，0.8～1.0 μm，1.0 μmである。例えば，メンブレンフィルターの孔径が0.2～0.5 μm又は0.15～0.22μmであるときのデプスフィルターの孔の最小径又は間隙の最小寸は例えば0.8～1.2 μm又は0.5～1.5 μmである。
　気体の透過方向におけるデプスフィルターの厚さは，メンブレンフィルターよりもデプスフィルターの膜面積あたりの通気抵抗が小さくなるようなものである限り特に制限はないが，メンブレンフィルターの厚さと同等か若しくはこれよりも厚いものが好適に使用できる。メンブレンフィルターよりも厚いデプスフィルターは特に好適に使用できる。デプスフィルターの厚さは，例えば，210～800 μm，230～770 μmである。例えば，メンブレンフィルターの厚さが120～180 μmであるときのデプスフィルターの厚さは210～800 μmである。
　デプスフィルターには，孔径が，気体の通過方向に沿った一方の側に向かって小さくなるように構成されたものがある。本明細書においてこのような構造を有するデプスフィルターを，方向性を有するデプスフィルターという。このときのデプスフィルターの気体が流入する側のフィルター面を流入面，気体が流出する側のフィルター面を流出面という。本発明において，方向性を有するデプスフィルターが採用される場合，通常，流入面が外気側となるように配置されるが，流入面が培養器の気相側となるようにしても支障はない。また，本発明において，方向性のないデプスフィルターも好適に使用できる。
　他の実施形態において，本発明は，例えば図７及び８に示すように培養器本体が３つの開口部を備える場合，培地や細胞の注入及び排出に用いる開口部以外の２つの開口部のうち一方にメンブレンフィルターが，他方にデプスフィルターが，適宜の仕方でそれぞれ取り付けられることができる。例えば，メンブレンフィルター及びデプスフィルターは，それらの開口部に周縁部をヒートシールや接着，又はリング状の部材により固定する等，適宜の手段で直接取り付けられることができる（図８）。また，それら２種のフィルターの一方又は両方が，それぞれ，内部にフィルターを備えた部品であるフィルターユニットの形で，培養器本体に気密に接続されていることもできる（図７）。フィルターユニットは，貫通した流路を備え且つ当該流路を前後に区切るように配置されたフィルターを保持した部品である。フィルターユニットは，当該流路の少なくとも一方の開口部に，培養器本体等の接続相手である対応する開口部に気密に接続可能な開口部を有する。即ち，それら対を形成する開口部は，気密な接続を達成する対応した形態（例えば，雄ねじ部と雌ねじ部，雄型又は雌型のテーパ付き嵌合面）をそれぞれに有する。接続相手の開口部の形状に対応し得るという以外には，フィルターユニットの全体形状に制限はなく，例えば，培養器本体の天面又は側面に設けられた開口部に取り付けることのできる，接続相手の開口部に被せられるものであるキャップ型や，流路の中間に幅広のフィルターが配置され流路の両端側は内径が絞られているコマ型等，適宜の形状であってよい。フィルターユニットのフィルター以外の部分は，ポリ塩化ビニルその他の適宜の合成樹脂及び／又は金属によって形成されていることができる。但し，培養器本体が３つの開口部を備えるものであっても,並列フィルター接続器をその一つの開口部に接続して用いることができる。
　また，培養器本体に開口部が２つしか設けられていない場合には，培地や細胞の注入・排出用ではない方の開口部（通気用開口部）を用いて，培養器本体にメンブレンフィルター及びデプスフィルターが取り付けられることができる。この場合，本発明の培養器は，当該通気用開口部に気密に接続された「並列フィルター接続器」を備え，これにメンブレンフィルター及びデプスフィルターが直接，又はそれらの各フィルターユニットの形で，培養器内の気相に対し並列になるように取り付けられる。「並列フィルター接続器」は，３つの開口部を有する内部空間を備えた部品であり，それらの開口部のうち１つは，培養器本体に設けられた対応した形態の開口部と気密に接続されるように構成されている。また並列フィルター接続器の他の２つの開口部（培養器本体に接続される開口部と連通している）は，一方にメンブレンフィルターが，他方にデプスフィルターが，互いに独立して，直接に（ヒートシールや接着等）又はフィルターユニットの形で，気密な接続により取り付けられている。このために，フィルターユニットと接続される並列フィルター接続器の開口部は，当該フィルターユニットの開口部との気密な接続に対応した形態（例えば，雄ねじ部と雌ねじ部，雄型又は雌型のテーパ付き嵌合面）を有する。これらの特徴を備える限り培養器の気相と外気との間に，２種のフィルターを並列に介した通気が図られるから，並列フィルター接続器の具体的形状に特段の限定はない。従って，並列フィルター接続器の全体形状は，例えば，培養器本体と接続する開口部以外に２つの開口部を末端に有する分岐管の形状，培養器と接続する開口部以外に２つの開口部を有する箱状若しくはドーム状等，任意に形成できる。
　例として，図６～図７に，メンブレンフィルターを備えたフィルターユニットとしてキャップ型のものが，またデプスフィルターを備えたフィルターユニットとしてコマ型のものが，それぞれ示されている。但しこれらの全体形状及び接続部位の形状は，図６～図７に一例として示された接続相手の開口部の形状と対応したものに過ぎず，接続相手の開口部の形状に対応できる限り，それぞれ独立して，コマ型とキャップ型の何れであることもできる。なお，本明細書において，メンブレンフィルターを保持したフィルターユニット及びデプスフィルターを保持したフィルターユニットを，それぞれ「メンブレンフィルターユニット」及び「デプスフィルターユニット」という。
　なお，培養器本体が３つ以上の開口部を備えるものであっても，並列フィルター接続器をその一つの開口部に接続して用いることができる。また，並列フィルター接続器は，培養器本体の複数の開口部に，複数個を接続して用いることもできる。
　本発明の一実施形態において，並列フィルター接続器は，全体として分岐管状であり，本体部とその側面から延びる分岐部を有する。該本体部は第一の開口部及び第二の開口部を有し，分岐部は本体部と一端で連通しており他端に第三の開口部を有する。第一の開口部は培養器に設けられた（細胞及び培地の出し入れ以外の）本体開口部との接続のための開口部，第二の開口部は第一のフィルターユニットとの接続のための開口部，及び該第三の開口部は第二のフィルターユニットとの接続のための開口部である。
　本体部と分岐部の起始部との間の角度は，第一のフィルターユニット及び第二のフィルターユニットが物理的に，もしくはそれらの機能において，互いに干渉を起こすことなくそれぞれの機能を十分に発揮できる限り，任意であり，例えば直角でもそれ以外の角度であってもよい。また，本体部と分岐部の２つの流路のそれぞれの内径は，同一であっても異なっていてもよい。
　並列フィルター接続器の第一の開口部は培養器本体に接続したときに，培養器本体における対応する開口部の配置（側面，天面）に応じて，培養器の気相領域において水平方向に又は下方に向かって開口し，また第二の開口部及び第三の開口部は，水平方向に又は上方に開口するように，全体形状を形成したものであることができる。
　並列フィルター接続器の第二の開口部及び第三の開口部は，いずれか一方にメンブレンフィルターユニットが，他方にデプスフィルターユニットが接続される。並列フィルター接続器の第二の開口部と第一の開口部は，好ましくはそれぞれ本体部の両端に逆方向に設けられている。静置状態での培養器内外の通気のために，第二の開口部に好ましくはメンブレンフィルターユニットが取り付けられるが，これに限らず，デプスフィルターユニットが取り付けられてもよい。
　並列フィルター接続器の第一～第三の開口部は，培養器又はフィルターユニットと接続できるように，各フィルターユニットの開口部の形状に対応して，例えば雌ねじ部，雄ねじ部，雄型又は雌型のテーパ付き嵌合面を有する。但し，相互の接続のための開口部の形状は，互いに気密な接続が達成される限り，これら以外の形状であることもできる。例えば，並列フィルター接続器とフィルターユニットの末端の開口部は，軟質ポリ塩化ビニル等のような柔軟で弾性も有する合成樹脂製のチューブ形状のコネクタに押し込むことや，他の合成樹脂製もしくは金属製等のコネクタを介して接続してもよい。並列フィルター接続器と培養器本体との接続についても同様である。
　そのようなコネクタを介して並列フィルター接続器とメンブレンフィルターユニット及び／又はデプスフィルターユニットを接続する場合，並列フィルター接続器を培養器本体に接続したときに，各フィルターユニットと培養器本体が又はそれらのフィルターユニット同士が，物理的に干渉しないよう，コネクタの形状は，直線状，曲線状，Ｌ字状その他適宜の形状に調整できる。
　コネクタを介した並列フィルター接続器と各フィルターユニットの接続は，コネクタと並列フィルター接続器及び各フィルターユニットとの接続部位に，互いに螺合する雌雄のねじを形成しておくことによって行ってもよく，また溶着その他適宜の固着手段によってもよい。
　培養器本体に接続することのできる並列フィルター接続器は，無菌環境下での使用が想定されている。そのため，使用前には滅菌処理をする必要がある。並列フィルター接続器が材質の異なる複数の部品から構成されている場合には，その全ての部品の材質は，ガンマ線滅菌，乾熱滅菌，高圧蒸気滅菌，ＥＯＧ（酸化メチレンガス）滅菌，又は低温ガスプラズマ滅菌等の少なくとも何れかに対して耐久性のものでなければならない。滅菌処理の前後を通じて変形，溶融，膨張，収縮，変質，劣化，断裂，分解，崩壊，腐食，発火，爆発等を起こさないものである限り，耐熱性合成樹脂等の合成樹脂やゴム，ステンレス等の金属，ガラス又はセラミック類等であってもよい。但し，フィルターユニットを接続した並列フィルター接続器を培養器と接続した時に，全体として無菌状態が保たれるように，各接続部の気密性が保証できる材質でなくてはならない。
　並列フィルター接続器は，個別に包装されたものとして供給されることができる。並列フィルター接続器が，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備え且つ該３つの開口部のうちの１つは，該細胞培養器の本体に設けられた対応する開口部と接続されるように構成されており，他の２つの開口部において，一方の開口部が，該内部空間が外部と区切られるように２種の異なるフィルターの一方を備え，他方の開口部が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該２種の異なるフィルターの他方を保持したフィルターユニットの対応する開口部と接続されるように構成されているものである場合，並列フィルター接続器は，該フィルターユニットとともに包装されたもの，すなわちキットとして供給されることができる。この場合，並列フィルター接続器がメンブレンフィルターを備えるものである場合，キットに同包されるフィルターユニットはデプスフィルターを保持したものとなる。一方，並列フィルター接続器がデプスフィルターを備えるものである場合，キットに同包されるフィルターユニットはメンブレンフィルターを保持したものとなる。このようなキットとする場合において，並列フィルター接続器のフィルターユニットの一方を備えた側でない、すなわち他方のフィルターユニットを取り付けるための開口部には，並列フィルター接続器の内部と外部を区切る蓋が取り付けられていてもよい。該蓋は，他方のフィルターユニットを取り付ける際に取り外される。
　並列フィルター接続器が，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備え且つ該３つの開口部のうちの１つは，該細胞培養器の本体に設けられた対応する開口部と接続されるように構成されており，他の２つの開口部が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように２種の異なるフィルターの一方又は他方をそれぞれ保持した２つのフィルターユニットの対応する開口部とそれぞれ接続されるように構成されているものである場合，並列フィルター接続器は，該２つのフィルターユニットとともに包装されたもの，すなわちキットとして供給されることができる。このようなキットとする場合において，並列フィルター接続器のフィルターユニットを取り付けるための開口部には，並列フィルター接続器の内部と外部を区切る蓋が取り付けられていてもよい。該蓋は，フィルターユニットを取り付ける際に取り外される。
　なお，本発明において，デプスフィルターに代えて，有効ろ過面積が十分に大きいメンブレンフィルターを代わりに用いることもできる。ここで，有効ろ過面積が十分に大きいメンブレンフィルターとは，細胞培養器から培養液を排出させるときに当該膜に生じる通気抵抗が，デプスフィルターに生じる通気抵抗と同等若しくはそれ以下であるものをいう。すなわち，本発明の一実施形態において，並列フィルター接続器の第二の開口部及び第三の開口部は，いずれか一方にメンブレンフィルターユニットが，他方に有効ろ過面積が十分に大きいメンブレンフィルターを有するメンブレンフィルターユニットが接続される。有効ろ過面積が十分に大きいメンブレンフィルターの好適な例として，LABODISC（登録商標）ディスポーザブルメンブレンフィルターユニット（孔径0.2 μm，有効ろ過面積19.6 cm2，アドバンテック東洋社）がある。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕デプスフィルターを備えた培養器を使用した細胞培養
　２つの開口部を有する多層培養器であるCellSTACK（登録商標）（10チャンバー，Corning社）の一方の開口部にチューブ付きねじキャップを取り付け，もう一方の開口部にデプスフィルター（Bacterial Air Vent 37 mm，公称孔径1 μm，有効ろ過面積7.5 cm2，PALL社）を備えたキャップを取り付けた（デプスフィルター付き培養器）。Bacterial Air Vent 37 mmは，ポリエステル／グラスファイバー／ポリエステルの三層構造の疎水性のグラスファイバーラミネート膜を有するデプスフィルターであり，これに差圧40 kPaで空気を通過させたときの流量は40 L/分である。CellSTACK（10チャンバー） は，細胞が接着，増殖することのできる6360 cm2の接着面を有する培養器である。この接着面に対し単位面積当たりの細胞数が約1.6×104 個/cm2となるように，培地に懸濁させた歯髄由来細胞の懸濁液を加えた。このときの培地の量は1500 mLとした。培地には，DMEM Low Glucose（グルコース濃度5.56 mM，GE healthcare社）にFBS (ウシ胎児血清，GE healthcare社) を終濃度が10%となるように添加したものを用いた。培養器を庫内のCO2濃度を5%に設定したCO2インキュベーター内に静置し，湿潤条件下，37℃で培養を開始した。培養期間中，チューブ付きキャップのチューブの開口部はクリップで気密に閉じた。実験は２個の培養器を用いて行った。
　多層培養器として，CellSTACK（Corning社）を用いたが，Cell FactoryTM（Thermo Fisher SCIENTIFIC社），BioFactoryTM（Wuxi NEST Biotechnology社）等の，市販されている他の多層培養器を用いても同様の実験を行うことができる。
〔実施例２〕メンブレンフィルターを備えた培養器を使用した細胞培養
　２つの開口部を有する多層培養器であるCellSTACK（10チャンバー，Corning社）の一方の開口部にチューブ付きキャップを取り付け，もう一方の開口部にメンブレンフィルター（セルスタック用33 mmベントキャップ，孔径0.2 μm，Corning社）を取り付けた（メンブレンフィルター付き培養器）。セルスタック用33 mmベントキャップは，材質が高密度ポリエチレンであるメンブレンフィルターである。CellSTACK（10チャンバー）の接着面に対し単位面積当たりの細胞数が約1.6×104 個/cm2となるように，培地に懸濁させた実施例１で用いたのと同じ歯髄由来細胞の懸濁液を加えた。このときの培地の量は1500 mLとした。培地には，DMEM Low Glucose（グルコース濃度5.56 mM，GE healthcare社）にFBS(ウシ胎児血清)(GE healthcare社) を終濃度が10%となるように添加したものを用いた。培養器を庫内のCO2濃度を5%に設定したCO2インキュベーター内に静置し，湿潤条件下，37℃で培養を開始した。培養期間中，チューブ付きキャップのチューブの開口部はクリップで気密に閉じた。実験は4個の培養器を用いて行った。
〔実施例３〕培地の二酸化炭素分圧及びpHの測定
　実施例１及び２の細胞培養において，培養開始時をDay0とし，そして培養開始2日後（Day2），同4日後（Day4），同5日後（Day 5），及び同6日後（Day6）として，Day2，及びDay4～Day6のそれぞれの時点で，チューブ付きキャップのチューブに無菌接合した30 mLシリンジ（ロック付，テルモ社）を用いて培地を5 mLサンプリングし，pH/PCO2/PO2分析装置バイオプロファイル フォックス(登録商標)(ノバ・バイオメディカル社) を用いて培地の二酸化炭素分圧（pCO2(%)）及びpHを測定し，これらの値の経時変化を観察した。測定はバイオプロファイル フォックス の取扱説明書に準じて実施した。二酸化炭素分圧（pCO2(%)）及びpHの測定値は，測定サンプルの温度に依存して大きく変化するため，pH/PCO2/PO2分析装置バイオプロファイル フォックス では測定サンプルが熱源により一定の温度に保持されて測定が行われるが，その設定温度は37℃に設定した。測定は，実験に供した全ての培養器について行い，測定値の平均を求めた。なお，二酸化炭素分圧は，培養液の溶存二酸化炭素量を測定し，その培養液が置かれた環境（温度，気圧等）において，その溶存二酸化炭素量の測定値から求められる，その培養液と接する気相の二酸化炭素の濃度のことである。
　実施例１の細胞培養（デプスフィルター付き培養器を使用）と，実施例２の細胞培養（メンブレンフィルター付き培養器を使用）における，培地のpCO2(%)の測定結果を図１に，pHの測定結果を図２に，それぞれ示す。Day2まではデプスフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地とメンブレンフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地のpCO2(%)は何れも約5%でありほぼ同等であった。しかし，デプスフィルター付き培養器を使用して培養を行った場合には，培地のpCO2(%)が上昇を続け，Day6では約9%に達した。一方，メンブレンフィルター付き培養器を使用して培養を行った場合には，若干培地のpCO2(%)は上昇するものの，Day6においても約6%であった。
　また，Day2まではデプスフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地とメンブレンフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地のpHは何れも約7.6でありほぼ同等であった。しかし，Day4以降は，デプスフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地のpHは，メンブレンフィルター付き培養器を使用して培養を行った培地と比較して低くなり，Day6では，前者のpHは約7.23であり，後者のpHは約7.40となった。培地のpCO2(%)とpHの値には相関が認められ，培地のpCO2(%)が上昇するとpHは低下する関係にある。CO2は水溶液中でその一部が炭酸イオン等を形成するためである。
　以上の結果は，デプスフィルター付き培養器を使用して細胞培養を行った場合には，培地のpCO2(%）の上昇が抑止できずpHの低下が大きいことを示す。CO2インキュベーター庫内のCO2濃度は5%であるので，培養開始時においては，培養器内の気相のCO2濃度も5%であり，従って，培地のpCO2(%）は約5%となる。細胞培養期間中，細胞が呼吸をすることにより，継続的にCO2が産生されて培地中に放出されるので，培養開始時と比較して培地のpCO2(%）は上昇する傾向にある。このような培地のpCO2(%)の上昇を抑制し，培地のpCO2(%）を5～6%程度に維持するためには，培養器内の気相のCO2濃度を約5%に維持する必要がある。培養器内の気相は，これに含まれる酸素が細胞により消費される一方，細胞の生産するCO2が培地の液面から放出されるため，CO2インキュベーター庫内の気相との間でガス交換（静的ガス交換）が十分に行われないと，気相のCO2濃度が上昇しこれと平衡関係にある培地のpCO2(%)上昇が防げないことになる。
　図１に示されるように，メンブレンフィルターのみを取り付けた培養器を使用して培養を行った場合には，培養期間中の培地中のpCO2(%）は5～6%に維持されているが，これは，メンブレンフィルターを通じて，CO2インキュベーター内の気相と培養器内の気相との間でガス交換が十分に行われ，培養器内のCO2濃度が，5～6%に維持されていることによると考えられる。一方，予想外なことに，デプスフィルターのみを取り付けた培養器を使用して培養を行った場合には，培養期間中に培地中のpCO2(%）が約9%にまで上昇した。このことは，CO2インキュベーター庫内の気相と培養器内の気相との間のガス交換，少なくとも炭酸ガス交換が，デプスフィルターでは十分に行われなかったためと考えられる。
　以上の結果は，培地のpCO2(%)を維持するという観点から，培養器内とCO2インキュベーター庫内の空間との間の十分なガス交換を確保できるフィルターとして，デプスフィルターは適しておらず，メンブレンフィルターを用いる必要があることを示す。
〔実施例４〕培地の回収操作
　実施例１及び２の細胞培養において，培養開始6日後に，CO2インキュベーター庫内から培養器を取り出し，チューブのクリップを取り外してチューブの末端を培地回収用の容器に接続した。
　実施例１のデプスフィルター付き培養器を傾けて持ち上げ，培地を自然流下により培地回収用の容器に排出させて回収した。約290 mL/分（培地総量を送液に費やした時間で除することにより算出）の速度で培地を培養器から排出させることが可能であった。これに対し， 実施例２のメンブレンフィルター付き培養器では，同様にして培地を培養器から排出させようとすると，培養器に亀裂が生じたため，自然流下によって培地を排出させることが実質的に不可能であった。
　培地を培養器から排出すると排出された液量分だけ培養器内の気相体積が増大する。従って，同体積の外気が培養器内に流入しない場合は培養器内は減圧状態となり，培養器の外壁には外側からの圧力が作用する。メンブレンフィルター付き培養器で破損が生じた原因は，メンブレンフィルターを介しては上記の自然流下の培地排出速度での外気流入が不可能で，そのため培養器内が過度に陰圧となって外部の気圧による大きな負荷が培養器にかかり，培養器が限度を超えて歪んだことにあると考えられる。これに対し，デプスフィルター付きの培養器では，自然流下による培地の排出時に，培養器内の減圧化を防ぐに十分な速度で外気が培養器内へ流入したものと考えられる。
　以上の結果は，培地の無菌的かつ円滑な回収と培養器破損防止の観点から，培養器に取り付けるフィルターとして，メンブレンフィルターは不適当であり，デプスフィルターが好適であることを示している。
　総合すると，実施例１～４の結果から，デプスフィルター又はメンブレンフィルターの何れか一方のみを培養器内外の気相間のフィルターとして用いて細胞培養を行った場合，培養期間中における培地のpCO2(%)とpHを一定範囲に維持することと培養器からの培地の円滑な排出を可能にすること，という２つの要請を両立させることができないという，これらフィルターについて今まで知られていなかった使用上における未知の欠点があることがわかった。
〔実施例５〕デプスフィルター及びメンブレンフィルターの両方を取り付けた培養器の評価
　上記の結果に基づき，デプスフィルター又はメンブレンフィルターを取り付けていた培養器本体の開口部に，それらの両方を取り付けた並列フィルター接続器を接続した培養器を準備し，メンブレンフィルターとデプスフィルターの欠点を互いに補完することができるかを検証した。この培養器については実施例６において詳説する。なお，デプスフィルター及びメンブレンフィルターの両方を取り付けた培養器の評価は，実施例１及び２と異なり，細胞を用いずに培地のみを加えた多層培養器に，これらフィルターを取り付けたものを用いて行った。
　２つの開口部を有する多層培養器であるCellSTACK（10チャンバー，Corning社）の３個に，それぞれDMEM Low Glucose（グルコース濃度5.56 mM，GE healthcare社）にFBS (ウシ胎児血清)(GE healthcare社) を終濃度が10%となるように添加した培地を1500 mLずつ加えた。次いで，それぞれのCellSTACK の開口部の一方にチューブ付きキャップを取り付けて別容器と接続した。他方の開口部には，それぞれ，(i) デプスフィルター（Bacterial Air Vent 37 mm，公称孔径1 μm，PALL社を備えたキャップ），(ii) メンブレンフィルター（セルスタック用33 mmベントキャップ，孔径0.2 μm，Corning社），又は，(iii) 前記デプスフィルター及び前記メンブレンフィルターの両方を接続した並列フィルター接続器，のいずれかを取り付けた。
　ここで，デプスフィルターを取り付けた培養器，メンブレンフィルターを取り付けた培養器，及びデプスフィルター及びメンブレンフィルターの両方を取り付けた並列フィルター接続器を接続した培養器を，それぞれ，第１の培養器，第２の培養器，及び第３の培養器という。
　庫内のCO2濃度を5%に設定した湿式CO2インキュベーターにCellSTACK を格納した。格納してから0時間後，1時間後，3時間後，18時間後，21時間後，及び42時間後の時点で，チューブ付きキャップのチューブに無菌接合した30 mLシリンジ（ロック付，テルモ社）を用いて培地を5 mLサンプリングし，pH/PCO2/PO2分析装置バイオプロファイル フォックス（ノバ・バイオメディカル社）を用いて培地の二酸化炭素分圧（pCO2）及びpHを測定した。測定は概ねバイオプロファイル フォックスの取扱説明書に従って実施した。二酸化炭素分圧（pCO2(%)）及びpHの測定値は，測定サンプルの温度に依存して大きく変化するため，pH/PCO2/PO2分析装置バイオプロファイル フォックス では測定サンプルが熱源により一定の温度に保持されて測定が行われるが，その設定温度は37℃に設定した。
　第１～第３の培養器内に加えた培地のpCO2(%)の測定結果を図３に，pHの測定結果を図４に，それぞれ示す。何れの培地においても，2時間経過までにpCO2(%)が低下し，pHが上昇した。これは，培地中に含まれていたCO2が，培養器をインキュベーター内に静置した後に脱気されたことによるものと考えられる。その後，メンブレンフィルターを有する第２及び第３の培養器内の培地では，pCO2(%)が上昇し，pHが低下したが，これはメンブレンフィルターを通じて外気（インキュベーター内の気相）からCO2が供給されたためと考えられる。一方，デプスフィルターのみを取り付けた第１の培養器内の培地は，pCO2(%)はほとんど上昇することなく，またpHは測定開始18時間後まで上昇し続けその後も低下することはなかった。これはデプスフィルターを通じては培養器内の気相と外気との間で，自然な気流によるガス交換が行われず，外気からのCO2の供給が少なかったため，培地中に含まれていたCO2の脱気による効果が持続したことによるものと考えられる。
　次に，インキュベーターからCellSTACK を取り出し，CellSTACK に取り付けたチューブ付きキャップに培地回収用の容器を接続し，培地を自然流下により排出させた。第１の培養器では約290 mL/分（培地総量を送液に費やした時間で除することにより算出）の速度で，また，第３の培養器では約280 mL/分の速度で，それぞれ培地を排出させることが可能であったのに対し，メンブレンフィルターのみを取り付けた第２の培養器では，培地を排出させたときに培養器内が減圧状態となり，培養器本体に目視により確認できる歪み及び破損が生じ，正常に培地の排出を行うことが不可能であった。
　以上の結果は，デプスフィルター及びメンブレンフィルターの両方を取り付けた並列フィルター接続器を，培養器本体の開口部の一方に取り付けることにより，培養期間中における培地のpCO2(%)及びpHを一定範囲に維持することと無菌的に培地を培養器から円滑に排出させること，という２つの要請を両立させることができることを示す。
〔実施例６〕並列フィルター接続器の一実施形態
　図５に，実施例５で用いた並列フィルター接続器の模式的断面図を示す。並列フィルター接続器(1)は全体として分岐管状であり，第１の開口部(3)，第２の開口部(4)，及び第３の開口部(5)を有する。並列フィルター接続器(1)は，本体部(1a)と本体部の側壁の途中に設けられた分岐部(2)を含んでなる。分岐部(2)は本体部(1a)の内部と連通している。本体部(1a)は，これを培養器本体の開口部に接続するための第一の開口部(3)と，メンブレンフィルターを取り付けるための第二の開口部(4)とを有する。第一の開口部(3)には，並列フィルター接続器を培養器本体の開口部に気密に螺着するための雌ねじ部 (6)が設けられている。第二の開口部(4)には，メンブレンフィルターユニットを気密に螺着するための雄ねじ部 (7)が設けられている。分岐部(2)にある第３の開口部(5)は，デプスフィルターユニット（接続のための雄型のテーパ状嵌合面を備える）に気密に嵌合させることができるよう，雌型のテーパ状嵌合面を備えている。
〔実施例７〕並列フィルター接続器
　図６に，実施例５で用いた培養器本体(10)に取り付けられた状態の並列フィルター接続器(1)の模式的断面図を示す。並列フィルター接続器(1)は，その第一の開口部(3) に設けられた雌ねじ部 (6)が培養器本体(10)に備えられた第一の本体開口部(8)に備えられた雄ねじ部 (29)と螺合されることにより，培養器本体(10)と気密に接続されている。なお，図において，培養器本体(10)の内部の多層培養器としての構造は省略されている。
　並列フィルター接続器(1) の第二の開口部(4)には，メンブレンフィルターユニット(9)が気密に接続されている。本実施例においてメンブレンフィルターユニット(9)は，平たい円筒状の蓋であり，その天面に設けられた開口部にメンブレンフィルター(9a)が取り付けられており，これを通して外気と，並列フィルター接続器(1)内の気相，次いで培養器本体（10）内の気相とが流通可能となっている。並列フィルター接続器(1)とメンブレンフィルターユニット(9)との気密の接続は，メンブレンフィルターユニット(9)の下側の開口部に設けられた雌ねじ部(11)と並列フィルター接続器(1)の第二の開口部(4)に設けられた雄ねじ部(7)との螺合によりなされている。
　並列フィルター接続器(1)の第三の開口部(5)には，デプスフィルターユニット(12) が気密に接続されている。本実施例においてデプスフィルターユニット(12)は，コマ型で，流路内にデプスフィルター(12a)を備え，上下にそれぞれ１つの開口部(13a及び13b)を有し，下側の末端の開口部(13b)に向かってテーパ状に細くなった外形の嵌合面が，並列フィルター接続器(1) の第三の開口部(5)の内側の下方に向かってテーパ状に狭まった相補的な嵌合面と気密に嵌合している。このデプスフィルター(12a)を通して，外気と，並列フィルター接続器(1)内の気相，次いで培養器本体（10）内の気相とが流通可能となっている。
　培養器の第二の本体開口部(14)には，チューブ付きキャップ(16)が気密に接続されている。チューブ付きキャップ(16)のチューブ(17)は，キャップの天面を貫通して延びており，培養器本体(10)の内部と外部を連通している。培養器の第二の本体開口部(14)とチューブ付きキャップ(16)との接続は，第二の本体開口部(14)に備えられた雄ねじ部(15)とチューブ付きキャップ(16) に備えられた雌ねじ部(18)との螺着によりなされている。
　チューブ(17)の外側の末端にある開口部は，細胞の培養中はクリップ止めにより閉じられる。培養器から培地を回収する際には，このクリップを外し，培養器を水平面に対し90度～180度傾けることによりチューブの開口部から自然流下により培地を排出させることができ，また蠕動ポンプにチューブ(17)を懸けて培地を排出させることもできる。
〔実施例８〕
　図７に，培養器の別の実施例を示す。培養器本体(19) は，第一の本体開口部(20)，第二の本体開口部(21)，及び第三の本体開口部(22)を備えており，第一の開口部(20)にメンブレンフィルターユニット(9)が，第二の開口部(21)にデプスフィルターユニット(12)が取り付けられている。図では第一の開口部(20)はメンブレンフィルターユニット(9)を接続させるための雄ねじ部を備え，第二の開口部(21)はデプスフィルターユニット(12)を接続させるための雌型のテーパ状嵌合面を備えたものが例として示されている。但し，これらの接続部の形態は，各フィルターユニットの接続部がとり得る種々の形態に対応して選択することができる。
　図７に示す培養器 (19)は，第三の本体開口部(22)を有し，これは図６において第二の本体開口部(14)として示したのと同様の，細胞及び培地の注入及び排出のための開口部であり，同様にしてチューブ(17)付きキャプ(16)が気密に接続されている。但し，第三の開口部(22)の接続部の形態も，チューブ付きキャップの接続部がとり得る種々の形態に応じて選択することができる。
〔実施例９〕
　図８に本発明の更なる実施例を示す。本実施例において，メンブレンフィルター及びデプスフィルターは，培養器(24)にその一部として一体に取り付けられている。培養器(24)には，内部の気相と外気との間でのガス交換がそれぞれで可能なように，メンブレンフィルター(27)とデプスフィルター(28)の両方が並列の関係で培養器本体(24)に取り付けられている。培養器(24)の開口部(25)は，図６において第二の開口部(14)として示したのと同様の，細胞及び培地の注入及び排出のための開口部であり，雄ねじ部(26)を備え，同様にしてチューブ(17)付きキャプ(16)が気密に接続されている。この開口部(25)は接続部の形態も，チューブ付きキャップの接続部がとり得る種々の形態に応じて選択することができる。
　本発明によれば，培養器中の培地を交換する作業中に生じる，培養器の膨らみや凹みという変形やそれらに伴う培養器の破損の防止ができ，且つ培養器内の炭酸ガスの蓄積を防止して培地のｐＨを培養期間中適切な範囲に維持できるという利点を備えた細胞培養器を提供することができる。また本発明の並列フィルター接続器は，培養器本体に設けられたガス交換用の開口部が１つのみである場合でも，これを上記と同じ利点を備えた培養器に更新する手段として利用することができる。
１　　並列フィルター接続器
１ａ　本体部
２　　分岐部
３　　第一の開口部
４　　第二の開口部
５　　第三の開口部
６　　雌ねじ部
７　　雄ねじ部
８　　第一の本体開口部
９　　メンブレンフィルターユニット
９ａ　メンブレンフィルター
１０　培養器本体
１１　雌ねじ部
１２　デプスフィルターユニット
１２ａ　デプスフィルター
１３ａ　開口部
１３ｂ　開口部
１４　第二の本体開口部
１５　雄ねじ部
１６　チューブ付きキャップ
１７　チューブ
１８　雌ねじ部
１９　培養器本体
２０　第一の本体開口部
２１　第二の本体開口部
２２　第三の本体開口部
２３　係止ネジ
２４　培養器
２５　開口部
２６　雄ねじ部
２７　メンブレンフィルター
２８　デプスフィルター
２９　雄ねじ部

Claims (24)

  1. 　細胞培養器であって，該細胞培養器の内側の気相と外側の気相との間をそれぞれが画するよう並列に，異なる２種のフィルターを備えるものである，細胞培養器。
  2. 　該２種のフィルターの少なくとも一方が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられ，該フィルターユニットは該流路の片側の開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，請求項１に記載の細胞培養器。
  3. 　該２種のフィルターの各々が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられ，該フィルターユニットの各々は該流路の片側の開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，請求項１に記載の細胞培養器。
  4. 　該２種のフィルターの各々が，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備えた並列フィルター接続器の該３つの開口部のうち２つを通る並列な流路の各々を前後に区切るように，それぞれ備えられており，該並列フィルター接続器が，残りの開口部において，該細胞培養器の本体の気相領域に設けられた対応する開口部と接続されているものである，請求項１に記載の細胞培養器。
  5. 　該２種のフィルターの少なくとも一方が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられており，該フィルターユニットは該流路の片側の開口部において，該並列フィルター接続器に設けられた対応する開口部と接続されているものである，請求項４に記載の細胞培養器。
  6. 　該２種のフィルターの各々が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該フィルターを保持したものであるフィルターユニットの形で備えられており，該フィルターユニット各々は，該流路の片側の開口部において，該並列フィルター接続器に設けられた対応する開口部と接続されているものである，請求項４に記載の細胞培養器。
  7. 　該フィルターユニットと該細胞培養器の本体が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，請求項２又は３に記載の細胞培養器。
  8. 　該細胞培養器の本体と該並列フィルター接続器が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，請求項４に記載の細胞培養器。
  9. 　該フィルターユニットと該細胞培養器の本体，及び該並列フィルター接続器が，相互に接続される対となる開口部に，対応する雄ねじ部と雌ねじ部又は対応する雄型及び雌型のテーパ付き嵌合面をそれぞれ備えるものである，請求項５又は６に記載の細胞培養器。
  10. 　チューブ付きキャップが取り付けられた開口部が本体に更に設けられているものである，請求項１～９の何れかに記載の細胞培養器。
  11. 　該並列フィルター接続器が，該３つの開口部を各末端に備えた全体として分岐管状の形態である，請求項４～６，８，及び９の何れかに記載の細胞培養器。
  12. 　該２種のフィルターの一方がメンブレンフィルターであり他方がデプスフィルターである，請求項１～１１の何れかに記載の細胞培養器。
  13. 　該メンブレンフィルターの厚さが１００～２００μｍであり，該デプスフィルターの厚さが２１０～８００μｍである，請求項１２に記載の細胞培養器。
  14. 　該メンブレンフィルターの厚さが１２０～１８０μｍであり，該デプスフィルターの厚さが，２３０～７７０μｍである，請求項１２に記載の細胞培養器。
  15. 　該細胞培養器の素材が合成樹脂である，請求項１～１４の何れかの細胞培養器。
  16. 　該細胞培養器の素材が，ポリカーボネート樹脂，ポリエステル樹脂，ポリスチレン樹脂，及びアクリル樹脂からなる群から選択されるものである，請求項１～１４の何れかの細胞培養器。
  17. 　細胞培養器の本体に接続されるための並列フィルター接続器であって，互いに連通する３つの開口部を有する内部空間を備え且つ該３つの開口部のうちの１つが，該細胞培養器の本体に設けられた対応する開口部と接続されるように構成されており，他の２つの開口部が， 
    （１）該内部空間を外部と区切るように，２種の異なるフィルターの一方又は他方をそれぞれ備えるか， 
    （２）一方の開口部が，該内部空間が外部と区切られるように２種の異なるフィルターの一方を備え，他方の開口部が，貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように該２種の異なるフィルターの他方を保持したフィルターユニットの対応する開口部と接続されるように構成されているか，又は
    （３）貫通した流路を備え該流路を前後に区切るように２種の異なるフィルターの一方又は他方をそれぞれ保持した２つのフィルターユニットの対応する開口部とそれぞれ接続されるように構成されているものである，
    　並列フィルター接続器。
  18. 　該細胞培養器の本体の開口部と接合される開口部に，該細胞培養器の本体の開口部に対応する雄ねじ部若しくは雌ねじ部又は雄型若しくは雌型のテーパ付き嵌合面を備えるものである，請求項１７に記載の並列フィルター接続器。
  19. 　該並列フィルター接続器が，該３つの開口部を各末端に備えた全体として分岐管状の形態である，請求項１７又は１８に記載の並列フィルター接続器。
  20. 　該２種のフィルターの一方がメンブレンフィルターであり他方がデプスフィルターである，請求項１７～１９の何れかに記載の並列フィルター接続器。
  21. 　該メンブレンフィルターの厚さが１００～２００μｍであり，該デプスフィルターの厚さが２１０～８００μｍである，請求項２０に記載の並列フィルター接続器。
  22. 　該メンブレンフィルターの厚さが１２０～１８０μｍであり，該デプスフィルターの厚さが，２３０～７７０μｍである，請求項２１に記載の並列フィルター接続器。
  23. 　該３つの開口部のうちの１つ又は２つに該フィルターユニットが接続されているものである，請求項１７～２２の何れかに記載の並列フィルター接続器。
  24. 　請求項２３に記載の並列フィルター接続器を組み立てるための，以下の（１）又は（２）のキット：
    （１）該２種の異なるフィルターの一方を備えた並列フィルター接続器，及び該２種の異なるフィルターの他方を備えたフィルターユニットを含むキット；
    （２）並列フィルター接続器，該２種の異なるフィルターの一方を備えたフィルターユニット，及び該２種の異なるフィルターの他方を備えたフィルターユニットを含むキット。

     
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