JP2021185877A - 細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞生育状態の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養培地中の培養成分の使用量を低減でき、かつ閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給することができる細胞培養容器を提供することを主目的とする。【解決手段】本発明の細胞培養容器は、細胞を培養する培養室と、流体を貯留する貯留室と、上記培養室及び上記貯留室を区画し、上記細胞を透過せず所定の物質を選択的に透過する物質交換膜と、上記培養室又は上記貯留室と外部を隔てるガス交換膜と、を備え、上記培養室及び上記貯留室はそれぞれ流体を流入出可能な開口部を有することを特徴とする。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養容器、その細胞培養容器を用い細胞を培養する細胞培養方法、及びその細胞培養方法で細胞の生育状態を評価する細胞生育状態の評価方法に関する。

医療や製薬等を用途とする細胞培養に自動培養装置を用いる細胞製造技術の開発が進んでいる。自動培養装置は、従来の人の手技による培養と比較して、培養場の拡大による大量培養が容易である点、及び閉鎖系を構築することで細胞培養時の汚染リスクを大幅に低減できる点で有利である。

こうした自動培養装置及びその関連技術は種々開発されており、例えば、特許文献１には、培養槽での懸濁培養方式の自動培養装置が提案されている。また、特許文献２には、自動培養装置に適用可能なバック型の培養容器が提案されている。

さらに、特許文献３には、透析膜で区切られた培地画室及び培養画室を有する細胞培養容器を備える細胞培養装置が記載されている。この細胞培養装置の細胞培養容器では、培地画室が培養画室の上に存在し、培養画室及び培地画室に細胞懸濁液及び培地をそれぞれ分けて供給することで、培地交換をせずに細胞の長期培養が可能である。

特開２０１５−２１６８８０号公報 特開２００９−１３６１５６号公報 特開昭６１−１０８３７３号公報

一般に細胞培養に使用する培地は、細胞が生育時に消費する栄養成分の他に、培地環境を安定化させる成分や少量で細胞の増殖や分化に影響する生理活性物質成分等のようなタンパク質成分などの培養成分を含んでいる。これらの培養成分は、生体由来の成分も多く、血清や精製タンパク等の添加又は培養中の細胞自身の分泌等により培地に存在している。

細胞は培養中に培養培地に含まれる栄養成分を消費し老廃物を排出する。従って、細胞の生育に伴い培地の劣化が進行するので、一般的な細胞培養では、使用済みの培養培地の新鮮な培養培地への定期的な交換が必要となる。一方で、この培地交換の際に、培養培地に残存する培養成分が不要に廃棄されている。そのため、従来の細胞培養方法では、培養成分を効率的に利用できていない点に問題がある。特に産業用途の自動培養装置では、培養場の拡大に伴う培地消費量が増大しているため、この問題による培養成分の損失を無視することができない。

これに対し、特許文献３に記載された細胞培養装置の細胞培養容器では、培養画室に血清を含む培養培地を添加し、培地画室には血清を含まない栄養培地を添加することで細胞を培養している。しかしながら、この細胞培養容器は培地交換をせずに細胞の長期培養を行うための構成であり、細胞の生育状態に応じて培地を適切に供給する運用や閉鎖系で細胞を培養する運用に適用することができない。

さらに、近年では、三次元培養による細胞の大量培養や高機能を発現する三次元組織の培養による作製が必要となっている。これらの培養では、従来の平面培養と比較して細胞密度が非常に増大するため、それに応じて培地の劣化速度も増大する。そのため、大量の培地を貯留し供給するために、培地容量の制約を受けない構造や迅速かつ頻繁に新鮮な培地を供給可能な構造が求められている。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、培養培地中の培養成分の使用量を低減でき、かつ閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給することができる細胞培養容器、その細胞培養容器を用い細胞を培養する細胞培養方法、及びその細胞培養方法で細胞の生育状態を評価する細胞生育状態の評価方法を提供することを主目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の細胞培養容器は、細胞を培養する培養室と、流体を貯留する貯留室と、上記培養室及び上記貯留室を区画し、上記細胞を透過せず所定の物質を選択的に透過する物質交換膜と、上記培養室又は上記貯留室と外部を隔てるガス交換膜と、を備え、上記培養室及び上記貯留室はそれぞれ流体を流入出可能な開口部を有することを特徴とする。

また、上記課題を解決するために、本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養容器を用い、上記培養室で上記細胞を培養する細胞培養方法であって、上記開口部を介して上記培養室及び上記貯留室に成分又は成分濃度が異なる培地を供給することを特徴とする。

さらに、上記課題を解決するために、本発明の細胞生育状態の評価方法は、上記細胞培養方法で上記細胞を培養する過程において、上記細胞の生育状態を評価する細胞生育状態の評価方法であって、上記貯留室に供給される上記培地及び上記貯留室から排出される上記培地のグルコース濃度の差を測定し、当該グルコース濃度の差からグルコース消費速度を算出し、上記グルコース消費速度から上記培養室内の細胞数を推定することを特徴とする。

本発明によれば、培養培地中の培養成分の使用量を低減でき、かつ閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給することができる。

以上に説明した内容以外の本発明の課題、構成、及び効果は、以下の発明を実施するための形態の説明により明らかにされる。

実施形態の細胞培養容器の一例の要部を示す概略断面図である。 図１に示すＡ−Ａ線における概略断面図である。 実施形態の細胞培養容器の変形例の要部を示す図であって、図２に示される断面に対応する断面を示す概略断面図である。 実施形態の細胞培養容器の他の変形例の要部を示す概略断面図である。 （ａ）は、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）におけるグルコース濃度の経時変化を示すグラフであり、（ｂ）は、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）における乳酸濃度の経時変化を示すグラフである。 実施例１で設計した細胞培養容器を示す概略断面図である。

以下、本発明の細胞培養容器、細胞培養方法、及び細胞生育状態の評価方法に係る実施形態について説明する。

最初に、実施形態の細胞培養容器の一例について、図１及び図２に沿って説明する。図１は、実施形態の細胞培養容器の一例の要部を示す概略断面図である。図２は、図１に示すＡ−Ａ線における概略断面図である。

図１に示されるように、本例の細胞培養容器１は、筐体５を備え、筐体５の内部に細胞Ｃを培養する培養室１０及び流体を貯留する貯留室２０を有している。細胞培養容器１は、培養室１０及び貯留室２０を区画し、所定の物質を選択的に透過する物質交換膜３０と、培養室１０及び貯留室２０と外気をそれぞれ隔てるガス交換膜４０と、をさらに備えている。培養室１０は、側面側が筐体５により外気と隔てられ、下面側がガス交換膜４０により外気と隔てられ、上面側が物質交換膜３０により貯留室２０と隔てられている。貯留室２０は、側面側が筐体５により外気と隔てられ、上面側がガス交換膜４０により外気と隔てられ、下面側が物質交換膜３０により培養室１０と隔てられている。物質交換膜３０は、貯留室２０に供給される栄養培地に含まれる栄養成分及び培養室１０に培養で生じる老廃物等の低分子量の成分を透過し、培養室１０に供給される培養培地に含まれる生理活性物質成分等のような高分子量のタンパク質成分を透過しない選択的透過性を有する膜である。ガス交換膜４０は酸素を透過し、培地を透過しない膜である。

そして、培養室１０の側面の対向する２箇所にはポート５１、５２（流体を流入出可能な開口部）がそれぞれ設けられ、ポート５１、５２のそれぞれに開閉機構（図示せず）が設けられている。貯留室２０の側面の対向する２箇所にはポート６１、６２（流体を流入出可能な開口部）がそれぞれ設けられ、ポート６１、６２のそれぞれに開閉機構（図示せず）が設けられている。

これに続いて、実施形態の細胞培養方法の一例として、図１に示す細胞培養容器１を用い、培養室１０で細胞Ｃを培養する細胞培養方法について説明する。

本例の細胞培養方法では、事前に、細胞培養容器１の培養室１０に培養足場８０（細胞を接着又は包埋可能な構造体）及び培養足場８０に接着させた細胞Ｃを導入する。さらに、培養室１０のポート５１に配管（図示せず）を接続し当該配管のポート５１とは反対側を培養培地供給源（図示せず）等に接続することで流入路を構築し、培養室１０のポート５２に配管（図示せず）を接続し当該配管のポート５２とは反対側を回収タンク等に接続することで流出路を構築する。また、貯留室２０のポート６１に配管（図示せず）を接続し当該配管のポート６１とは反対側を栄養培地供給源（図示せず）等に接続することで流入路を構築し、貯留室２０のポート６２に配管（図示せず）を接続し当該配管のポート６２とは反対側を貯留タンク等に接続することで流出路を構築する。そして、貯留室２０に接続する流入路及び流出路のそれぞれにサンプリングポートＳ１又は成分分析用センサーＳ２を設置する。これにより、細胞培養容器１、培養培地供給源及び栄養培地供給源、流入路及び流出路、回収タンク及び貯留タンク、並びにサンプリングポートＳ１又は成分分析用センサーＳ２から構成される閉鎖系の細胞培養装置を構築する。この細胞培養装置では、流入路及び流出路を介し貯留室２０又は培養室１０に培地やガス等を灌流することによって、細胞を連続培養することができる。

続いて、細胞培養容器１をインキュベータ（図示せず）内に設置し、細胞培養容器１の培養室１０で細胞を培養する。この際には、まず、細胞培養容器１の貯留室２０のポート６１、６２を開閉機構で開放することで、貯留室２０からポート６２を介して流出路に空気を押し出しながら、栄養培地供給源からポート６１を介して貯留室２０に新鮮な栄養培地を供給することで貯留室２０を新鮮な栄養培地で満たした後に、ポート６１、６２を開閉機構で閉鎖する。次に、培養室１０のポート５１、５２を開閉機構で開放することで、培養室１０からポート５２を介して流出路に空気を押し出しながら、培養培地供給源からポート５１を介して培養室１０に液体の培養培地を供給することで培養室１０を培養培地で満たした後に、ポート５１、５２を開閉機構で閉鎖する。次に、貯留室２０のポート６１、６２を開閉機構で連続的に開放することで、栄養培地供給源からポート６１を介して貯留室２０に栄養成分を含む新鮮な液体の栄養培地を連続的に供給し、貯留室２０からポート６２を介して培養で生じる老廃物を含む使用済みの栄養培地を連続的に回収タンクに排出する。これにより、貯留室２０に供給される栄養培地に含まれる栄養成分が物質交換膜３０を透過することで培養室１０に供給され、培養室１０に培養で生じる老廃物が物質交換膜３０を透過することで貯留室２０に移動する。一方、培養室１０に供給される培養培地に含まれるタンパク質成分が培養室１０内に保持される。このような透析の結果、閉鎖系の細胞培養装置において、培養培地供給源から貯留室２０への新鮮な栄養培地の連続的な供給及び貯留室２０から回収タンクへの使用済みの栄養培地の連続的な排出を行うことによって、培養室１０内の培養培地の劣化を防止することができ、かつ培養室１０内に培養培地に含まれるタンパク質成分を保持することができる。そのため、閉鎖系の細胞培養装置において、培養室１０内の培養培地を交換することなく培養室１０で細胞を培養することができる。よって、培養培地中のタンパク質成分の使用量を低減し細胞Ｃの製造コストを抑制することができ、かつ閉鎖系で培地を供給することができる。

これに続いて、実施形態の細胞生育状態の評価方法の一例として、上記細胞培養方法の一例において、細胞Ｃの生育状態を評価する細胞生育状態の評価方法について説明する。

本例の細胞生育状態の評価方法では、上記例の細胞培養方法で細胞培養容器１の培養室１０で細胞Ｃを培養する過程において、貯留室２０の流入路及び流出路のそれぞれに設置したサンプリングポートＳ１又は成分分析用センサーＳ２を用いて、貯留室２０に供給される栄養培地及び貯留室２０から排出される栄養培地のグルコース濃度の差を測定した後に、グルコース濃度の差からグルコース消費速度を算出し、グルコース消費速度から培養室１０内の細胞数を推定する。さらに、貯留室２０から排出される栄養培地の乳酸濃度を測定した後に、乳酸濃度から乳酸産生速度を算出し、グルコース消費速度及び乳酸産生速度から培養室１０内の細胞の代謝挙動を推定する。そして、上記例の細胞培養方法では、このように推定した培養室１０内の細胞数及び細胞の代謝挙動から、細胞の生育状態を評価し、その評価結果に基づいて、貯留室２０又は培養室１０に供給する栄養培地の成分を調整することができる。よって、細胞培養容器１は、閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給する細胞培養装置に適用することができる。

従って、実施形態の細胞培養容器は、上記例のように、培養培地中の培養成分の使用量を低減し細胞の製造コストを抑制することができ、かつ閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給することができる。また、実施形態の細胞培養方法によれば、実施形態の胞培養容器を用い、培養室で細胞を培養することで、培養培地中の培養成分の使用量を低減し細胞の製造コストを抑制することができ、かつ閉鎖系で細胞の生育状態に応じて適切に培地を供給することができる。さらに、実施形態の細胞生育状態の評価方法によれば、実施形態の細胞培養方法で細胞を培養する過程において、培養室内の細胞数及び細胞の代謝挙動を推定し、細胞の生育状態を評価することができる。

以下、実施形態の細胞培養容器の構成並びに実施形態の細胞培養方法及び細胞生育状態の評価方法について、詳細に説明する。

１．物質交換膜
物質交換膜は、上記培養室及び上記貯留室を区画し、所定の物質を選択的に透過する膜である。物質交換膜としては、ガスや溶液などの所定の物質を選択的に透過する選択的透過性を有する膜であれば特に限定されないが、栄養培地に含まれる栄養成分及び培養で生じる老廃物等の低分子量の成分を透過し、培養培地に含まれる生理活性物質成分等のような標的となる高分子量のタンパク質成分を透過しない選択的透過性を有するものが好ましい。このような選択的透過性を有する物質交換膜を用いることにより、栄養培地に含まれる栄養成分及び培養で生じる老廃物を貯留室及び培養室の間で交換することができ、培養培地に含まれるタンパク質成分を培養室内に保持することができる。

物質交換膜は、例えば、上記のように栄養成分及び老廃物等の低分子量の成分を透過する必要があり、標的となる高分子量のタンパク質成分を透過しない必要がある。栄養成分としては、例えば、グルコース（分子量：１８０．９６）及び乳酸（分子量：９０．０８）等が挙げられ、標的となる高分子量のタンパク質成分としては、例えば、タンパク安定化剤であるウシ血清アルブミン（分子量：６６０００）及び成長因子であるＦＧＦ２（分子量：１７４００）等が挙げられる。そのため、物質交換膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、物質交換膜を上記のような選択的透過性を有する膜とするものであれば特に限定されないが、例えば、５００以上６００００以下の範囲内が好ましく、中でも１０００以上１５０００以下の範囲内が好ましい。培養室内に、例えば、これらのような標的となる高分子量のタンパク質成分を保持することができるからである。なお、ウシ血清アルブミン及びＦＧＦ２以外のタンパク質成分が標的となる場合も、適切な分画分子量の物質交換膜を用いることにより、培養室内に標的となるタンパク質成分を保持することができる。ここで、「分画分子量」とは、複数種類の低濃度の球状溶質を物質交換膜に透過させ、阻止率が９０％以上となるときの球状溶質の分子量を指す。

物質交換膜は、上記のような選択的透過性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、半透膜等である。半透膜としては、例えば、セルロース系膜（例えば、再生セルロース膜、表面化改質再生セルロース膜、及びセルロースアセテート等）、合成高分子系膜（例えば、ポリアクリロニトリール、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリスルホン、ポリアミド、ポリエステル系ポリマーアロイ、及びフッ素系樹脂等）等が挙げられる。さらに、物質交換膜は、細胞非接着性の膜が好ましい。

２．ガス交換膜
ガス交換膜は、酸素を透過する膜である。細胞の三次元培養では細胞密度が高くなるため、細胞の生育に必要な酸素の不足が課題となる。そこで、培養室内の培養足場の近傍にガス交換膜を設置することで、外気から効率良く酸素を供給することが可能となる。ガス交換膜としては、細胞非接着性の膜が好ましい。細胞非接着性の膜を使用することで、培養足場から底面に細胞が脱離し遊走することを防ぐことができるからである。

ガス交換膜は、酸素を透過する膜であれば特に限定されないが、例えば、シリコーン、ポリトリメチルシリルプロピン、含フッ素アクリル樹脂、フッ素系樹脂、ポリメチルペンテン、及び天然ゴムのいずれかを主成分とするもの等が好ましい。

３．細胞培養容器
細胞培養容器は、細胞を培養する培養室と、流体を貯留する貯留室と、上記培養室及び上記貯留室を区画し、上記細胞を透過せず所定の物質を選択的に透過する物質交換膜と、上記培養室又は上記貯留室と外部を隔てるガス交換膜と、を備え、上記培養室及び上記貯留室はそれぞれ流体を流入出可能な開口部を有することを特徴とする。

細胞培養容器の筐体は、特に限定されないが、例えば、（ａ）生体適合性を有し、（ｂ）滅菌可能であり、（ｃ）耐食性を有し、（ｄ）成形可能であるものが好ましく、中でも、ガラス、市販の培養容器に使用されているポリスチレン、ポリカーボネート、及びポリエチレンテレフタレート等の樹脂、ＭＥＤ６１０等の医療用樹脂、ＳＵＳ３１６等のステンレス、並びにチタン等が好ましい。

上記培養室及び上記貯留室はそれぞれ培地などの流体を流入出可能な開口部を有する。これらのポートを介し培地やガス等の流体及び細胞を流入させ、かつ流出させることができる。培養室が有する開口部は、例えば、図１に示すポート５１、５２のように、流体を外部に流入出可能な少なくとも２つの開口部でよく、流体を外部に流入出可能な３つ以上の開口部でもよい。同様に、貯留室が有する開口部は、例えば、図１に示すポート６１、６２のように、流体を外部に流入出可能な少なくとも２つの開口部でよく、流体を外部に流入出可能な３つ以上の開口部でもよい。貯留室又は培養室は、各開口部に設けられた開閉機構をさらに備えていてもよい。開口部の開閉機構により、貯留室又は培養室への流体の供給及び貯留室又は培養室からの流体の排出を連続的又は逐次的に行うことを設定することができる。なお、物質交換膜を介した貯留室及び培養室間の物質交換は液体間の界面で生じるために、物質交換膜の表面に空気が残存すると物質交換膜を介した物質交換の効率が低下することがある。そこで、貯留室及び培養室の各室に少なくとも２つの開口部を設けることにより、各室に培地の液体や細胞を含む液体等を流入させる際に空気を押し出すことができ、培地の液体や細胞を含む液体等の流路（例えば、物質交換膜の表面等）に空気を残存させずに各室を培地で簡便に満たすことができるので、物質交換の効率の低下を抑制することができる。これに対し、貯留室及び培養室の各室に１つだけ開口部を設ける場合には、各室に培地の液体や細胞を含む液体等を流入させる際に空気を残存させずに各室を培地で満たすことが困難である。

ここで、図３は、実施形態の細胞培養容器の変形例の要部を示す図であって、図２に示される断面に対応する断面を示す概略断面図である。図３に示すように、本例の細胞培養容器１の貯留室２０は、ポート６１、６２（開口部）とは別に空気抜き用のポート６３（開口部）を有していてもよい。同様に、培養室１０は、ポート５１、５２（開口部）とは別に空気抜き用のポート５３（開口部）を有していてもよい。

貯留室又は培養室は、流体を外部から流入可能な複数の開口部及び流体を外部に流出可能な複数の開口部を有していてもよい。この場合には、貯留室又は培養室は、各開口部に設けられた開閉機構をさらに備えていてもよい。これにより、異なる複数の培地供給元を準備し、貯留室又は培養室が有する複数の開口部に異なる複数の培地供給元をそれぞれ接続することにより、貯留室又は培養室に導入する培地の種類を連続的に切り替えることができ、貯留室又は培養室に複数種類の培地を流入させ混合することで導入する培地の成分を調整することができる。無論、貯留室又は培養室の一つの開口部に接続し、当該開口部の反対側を分岐させ複数の培地供給元にそれぞれ接続する流路を配管等で構築してもよい。この場合にも、同様に、培地の種類を連続的な切り替えや培地の成分の調整が可能である。

ここで、図４は、実施形態の細胞培養容器の他の変形例の要部を示す概略断面図である。図４に示すように、本例の細胞培養容器１は、筐体５の内部に細胞Ｃを培養する培養室１０並びに流体をそれぞれ貯留する第１貯留室２１及び第２貯留室２２を有する三段構造でもよい。この場合には、細胞培養容器１は、培養室１０及び第１貯留室２１を区画し、所定の物質を選択的に透過する第１物質交換膜３１と、培養室１０及び第２貯留室２２を区画し、所定の物質を選択的に透過する第２物質交換膜３２と、第１貯留室２１と外気を隔てる第１ガス交換膜４１と、第２貯留室２２と外気を隔てる第２ガス交換膜４２と、をさらに備えている。培養室１０は、側面側が筐体５により外気と隔てられ、上面側が第１物質交換膜３１により第１貯留室２１と隔てられ、下面側が第２物質交換膜３２により第２貯留室２２と隔てられている。第１貯留室２１は、側面側が筐体５により外気と隔てられ、上面側が第１ガス交換膜４１により外気と隔てられ、下面側が第１物質交換膜３１により培養室１０と隔てられている。第２貯留室２２は、側面側が筐体５により外気と隔てられ、上面側が第２物質交換膜３２により外気と隔てられ、下面側が第２ガス交換膜４２により外気と隔てられている。そして、培養室１０の側面の対向する２箇所にはポート５１、５２（流体を流入出可能な開口部）がそれぞれ設けられている。第１貯留室２１の側面の対向する２箇所にはポート６１、６２（流体を流入出可能な開口部）がそれぞれ設けられている。第２貯留室２２の側面の対向する２箇所にはポート６１、６２（流体を流入出可能な開口部）がそれぞれ設けられている。

細胞培養容器１がこのような三段構造である場合には、第１貯留室２１及び第２貯留室２２がそれぞれ第１物質交換膜３１及び第２物質交換膜３２を介して培養室１０に隣接するので、物質交換の有効面積が増大し、より効率的に物質交換可能となる。例えば、第１物質交換膜３１及び第２物質交換膜３２が、同一範囲の低分子量の成分を透過し、同一範囲の高分子量のタンパク質成分を透過しないという同一の選択的透過性を有する場合において、第１貯留室２１及び第２貯留室２２の両方に同一の栄養培地を供給するときには、培養室１０に栄養成分をより効率的に供給することができ、培養室１０から老廃物をより効率的に排出することができる。一方、第１物質交換膜３１及び第２物質交換膜３２が、異なる範囲の分子量の成分を透過するという互いに異なる選択的透過性を有する場合には、複数種類の物質を選択的に交換する物質交換を行うことができる。例えば、第１物質交換膜３１を栄養成分及び老廃物等の低分子量の成分を透過する透析膜とし、第２物質交換膜３２をガス交換膜とする場合には、第１貯留室２１に栄養培地を供給し、第２貯留室２２に酸素濃度を調整したガスを供給することで、培養室１０に酸素を効率的に供給しつつ、栄養成分及び老廃物を第１貯留室２１及び培養室１０の間で交換することができる。

４．細胞培養方法及び細胞生育状態の評価方法
細胞培養方法は、上記細胞培養容器を用い、上記培養室で上記細胞を培養する細胞培養方法であって、上記開口部を介して上記培養室及び上記貯留室に成分又は成分濃度が異なる培地を供給することを特徴とする。

培養室で培養する細胞は、接着細胞及び浮遊細胞のどちらでもよく、一種の細胞でもよいし、複数種の細胞でもよい。さらに、培養室で培養する細胞は、分散して存在する単一の細胞に限定されず、スフェロイドでもよいし、細胞及び細胞外マトリックスを含有する組織でもよい。

培養室で培養する細胞が接着細胞である場合には、培養室に培養足場を導入することが好ましい。培養足場は、細胞を接着又は包埋可能な構造体である。培養足場の材料としては、細胞を接着又は包埋可能な生体適合性材料であれば特に限定されないが、例えば、シリコーン、樹脂、ガラス、多糖類、又はタンパク質等から構成される多孔質体、ゲル、フィルム、ディスク、及びビーズ等が挙げられる。

培養室に細胞又は培養足場を導入する方法としては、例えば、図１に示すポート５１、５２のような開口部を介して培養室に細胞又は培養足場を流入させる方法等が挙げられる。培養室を組み立て式とする場合には、組立て前の培養室に予め細胞又は培養足場を導入した後に培養室を組み立てることにより、培養室に細胞又は培養足場を導入することができる。

培養室に導入する培地は、貯留室に供給する培地と成分又は成分濃度が異なるものであれば特に限定されないが、例えば、細胞の培養に必要なタンパク質成分などの培養成分を含む培養培地等が挙げられる。細胞の培養には同化又は異化の対象となる栄養成分の他に、例えば、少量で細胞の増殖や分化に影響する生理活性物質成分や培地環境を安定化させる成分等のようなタンパク質成分などの培養成分が必要である。生理活性物質成分としては、例えば、サイトカインやホルモン等の成長因子及び医薬品等が挙げられる。これらの細胞の培養に必要なタンパク質成分などの培養成分は、血清や精製タンパク等の添加又は培養中の細胞自身の分泌等により培地に含ませることができる。

貯留室に供給する培地は、培養室に供給する培地と成分又は成分濃度が異なるものであれば特に限定されないが、例えば、細胞が生育時に消費する栄養成分を含む栄養培地等が挙げられる。中でも、タンパク質成分の濃度が１％以下である栄養培地等が好ましい。栄養成分としては、例えば、グルコース等の糖質、アミノ酸、脂質、ペプチド、並びに核酸等が挙げられる。栄養培地としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、又はグルコース等を含む基本培地等が好ましい。

細胞培養方法としては、上記開口部を介して上記貯留室に連続的又は逐次的に上記培地を供給し、上記貯留室から上記開口部を介して連続的又は逐次的に上記培地を排出しながら、上記培養室で上記細胞を培養する方法が好ましい。これにより、細胞を連続培養することができる。この方法の中でも、上記貯留室の上記開口部又は当該開口部に接続する流路にサンプリングポート又は成分分析用センサーを設置した状態において、上記培養室で上記細胞を培養する方法が好ましい。特に、上記サンプリングポート又は上記成分分析用センサーを用い、上記培地に含まれるグルコース、乳酸、アンモニア、グルタミン、グルタミン酸、酸素、及び二酸化炭素（上記二酸化炭素は、炭酸、炭酸イオン、又は炭酸水素イオンを含む）の少なくとも一種の成分の濃度を連続的又は逐次的に測定しながら、上記培養室で上記細胞を培養する方法が好ましい。これにより、貯留室に供給される培地及び貯留室から排出される培地の成分を分析し培養室内の細胞数や細胞の代謝を推定することで、細胞生育状態を評価することができる。その上で、細胞生育状態の評価結果に基づき、フィードバック制御により、貯留室又は培養室に培地を供給する方法を制御することができる。

以下、本発明の細胞培養方法で効果が得られる根拠を理論的に説明する。以下では、細胞治療で最も注目されている細胞の一種であるｈＭＳＣ（human mesenchymal stem cells）の高密度培養への本発明の細胞培養方法の適用可能性を検証した結果を詳述することで、その根拠を理論的に説明する。この適用可能性の検証では、ｈＭＳＣの一般的な平面培養でのコンフルエント状態における細胞密度が１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２程度であるため、細胞密度の到達目標をその１０倍の１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。この適用可能性の検証は、物質交換膜として市販の透析膜Spectra/Por 7（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ）を用い、グルコース及び乳酸についての透析膜の透析特性を調査することで行った。

グルコース及び乳酸についての透析膜の透析特性を調査するために、最初に、透析膜を袋状にしたもの（以下、「袋状透析膜」という）の内部を乳酸濃度（溶質濃度）が２．０ｇ／Ｌの内部溶液で満たし、袋状透析膜の外部をグルコース濃度（溶質濃度）が４．５ｇ／Ｌの外部溶液で満たし、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）におけるグルコース濃度及び乳酸濃度の経時変化を測定した。ここで、図５（ａ）は、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）におけるグルコース濃度の経時変化を示すグラフであり、図５（ｂ）は、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）における乳酸濃度の経時変化を示すグラフである。

一般に、透析膜を介した物質の移動は、拡散に由来するものである。そのため、透析膜を隔てて接触している２種類の溶液において、一方の溶液及び他方の溶液の間の透析膜を介した溶質の移動速度ｄ（Ｃ_１Ｖ_１）／ｄｔ〔ここで、Ｃ_１は上記一方の溶液の溶質濃度であり、Ｖ_１は上記一方の溶液の体積である〕は、上記一方の溶液及び上記他方の溶液の溶質濃度の差ΔＣ〔ここで、ΔＣ＝Ｃ_１−Ｃ_０であり、Ｃ_０は上記他方の溶液の溶質濃度である〕、透析膜の面積Ｓ_{ｍｅｍｂｒａｎｅ}、及び透析膜固有の透過係数ｋに比例し、下記式（１）の微分方程式で表記することができる。

これに対し、図５（ａ）に示すグルコース濃度の経時変化では、袋状透析膜を隔てて接触している袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）におけるグルコース濃度（溶質濃度）の差ΔＣ_ｇｌｕｃが、指数関数的な時間依存性を示している。同様に、図５（ｂ）に示す乳酸濃度の経時変化では、袋状透析膜を隔てて接触している袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）における乳酸濃度（溶質濃度）の差ΔＣ_ｌａｃが、指数関数的な時間依存性を示している。そのため、袋状透析膜の内部（内部溶液）に着目した際に、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）の間の透析膜を介したグルコース（溶質）の移動速度ｄ（Ｃ_ｇｌｕｃＶ_{ｉｎｓｉｄｅ}）／ｄｔ〔ここで、Ｃ_ｇｌｕｃは袋状透析膜の内部（内部溶液）におけるグルコース濃度であり、Ｖ_{ｉｎｓｉｄｅ}は袋状透析膜の内部（内部溶液）の体積である〕が、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）におけるグルコース濃度の差ΔＣ_ｇｌｕｃに比例すること、並びに袋状透析膜の内部（内部溶液）及び外部（外部溶液）の間の透析膜を介した乳酸（溶質）の移動速度ｄ（Ｃ_ｌａｃＶ_{ｉｎｓｉｄｅ}）／ｄｔ〔ここで、Ｃ_ｌａｃは袋状透析膜の内部（内部溶液）における乳酸濃度であり、Ｖ_{ｉｎｓｉｄｅ}は袋状透析膜の内部（内部溶液）の体積である〕が、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）における乳酸濃度の差ΔＣ_ｌａｃに比例することが示唆されている。そして、グルコース濃度及び乳酸濃度は袋状透析膜の外部（外部溶液）でほぼ一定であり、袋状透析膜の内部（内部溶液）及び外部（外部溶液）の体積はほぼ一定である。そのため、袋状透析膜の外部（外部溶液）及び内部（内部溶液）の間の透析膜を介したグルコース（溶質）の移動速度ｄ（Ｃ_ｇｌｕｃＶ_{ｉｎｓｉｄｅ}）／ｄｔをグルコースの透過係数をｋ_ｇｌｕｃとして上記式（１）で表記する場合には、下記式（２）で近似して表記することができる。同様に、袋状透析膜の内部（内部溶液）及び外部（外部溶液）の間の透析膜を介した乳酸（溶質）の移動速度ｄ（Ｃ_ｌａｃＶ_{ｉｎｓｉｄｅ}）／ｄｔを乳酸の透過係数をｋ_ｌａｃとして上記式（１）で表記する場合には、下記式（３）で近似して表記することができる。

上記式（２）に従って、図５（ａ）に示すグルコース濃度の経時変化について、グルコース濃度の差ΔＣ_ｇｌｕｃの時間依存性を指数関数でフィッティングすることにより、グルコースの透過係数ｋ_ｇｌｕｃは２．２×１０^−４Ｌ／ｃｍ^２／ｈと算出される。同様に、上記式（３）に従って、図５（ｂ）に示す乳酸濃度の経時変化について、乳酸濃度の濃度差ΔＣ_ｌａｃの時間依存性を指数関数でフィッティングすることにより、乳酸の透過係数ｋ_ｌａｃは２．６×１０^−４Ｌ／ｃｍ^２／ｈと算出される。

続いて、これらの透過係数を用い到達細胞数Ｎ_ｍａｘを算出し、到達細胞密度Ｎ_ｍａｘ／Ｓ_{ｃｕｌｔｕｒｅ}及び到達乳酸濃度Ｃ_ｌａｃを推定する。

透析培養方式における培養終期では、一定濃度のグルコースを含み乳酸を含まない透析液（上記外部溶液に相当）が、グルコースが枯渇し一定濃度の乳酸を含む培養液（上記内部溶液に相当）と透析膜を隔てて接触している状態において、透析液から培養液への透析膜を介したグルコースの供給速度がｈＭＳＣによるグルコース消費量と釣り合った状態になり、かつ培養液から透析液への透析膜を介した乳酸の排出速度がｈＭＳＣによる乳酸産生量と釣り合った状態になると考えられる。そのため、ｒ_ｇｌｕｃをｈＭＳＣのグルコース消費速度、ｒ_ｌａｃをｈＭＳＣの乳酸産生速度、透析液のグルコース濃度をＣ_Ｇ、培養液の到達乳酸濃度をＣ_Ｌとすると、下記式（４）及び（５）が成立すると考えられる。

ここで、単純のため、円筒状の細胞室を用いる条件、すなわち透析膜の面積Ｓ_{ｍｅｍｂｒａｎｅ}及び培養室の細胞接地面積Ｓ_{ｃｕｌｔｕｒｅ}が同一になる条件を想定し、透析液のグルコース濃度Ｃ_Ｇを一般的に培養で用いられる１．０ｇ／Ｌ（低グルコース培地）と仮定する。また、ｈＭＳＣは一般的に３〜７×１０^−１１ｇ／ｃｅｌｌ／ｈ程度の速度でグルコースを消費すると知られている。そこで、ｈＭＳＣのグルコース消費速度ｒ_ｇｌｕｃを多めに見積もって８×１０^−１１ｇ／ｃｅｌｌ／ｈとする。さらに、完全嫌気呼吸を仮定することで、ｈＭＳＣの乳酸産生速度ｒ_ｌａｃをｈＭＳＣのグルコース消費速度ｒ_ｇｌｕｃと同一とする。以上の設定により、上記式（４）から到達細胞密度Ｎ_ｍａｘ／Ｓ_{ｃｕｌｔｕｒｅ}は２．８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２と推定される。この値は、細胞密度の到達目標（１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）を超える値である。さらに、上記式（５）から培養液の到達乳酸濃度Ｃ_Ｌは０．８５ｇ／Ｌと推定される。よって、培養液の乳酸濃度が１．０ｇ／ＬであるとするとｈＭＳＣを培養可能であることからすれば、本調査での透析膜Spectra/Por 7（ＭＷＣＯ：１０ｋＤａ）を用いた透析により、ｈＭＳＣを培養するのに十分なだけ乳酸を除去することができると考えられる。

従って、本発明の細胞培養方法の適用により、従来の一般的な平面培養の１０倍以上の密度でｈＭＳＣを培養可能であると考えられる。なお、上述した本発明の細胞培養方法の適用可能性の検証では、ｈＭＳＣの高密度培養への適用可能性を検証したが、本発明の細胞培養方法の適用対象は、ｈＭＳＣの高密度培養に限定されず、本発明の細胞培養方法は、例えば、他の種類の細胞の培養や増殖以外の分化や維持等を目的とする培養にも適用可能である。

以下、実施例及び参考例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に挙げる実施例及び参考例に限定されるものではない。

［実施例１］
本発明の細胞培養容器を設計した。図６は、実施例１で設計した細胞培養容器を示す概略断面図である。以下、図６に示す細胞培養容器１の設計に基づく作製方法について、具体的に説明する。

細胞培養容器１の作製において筐体５を作製する場合には、例えば、医療用樹脂（ＭＥＤ６１０）を材料として用い３Ｄプリンタを使用する方法、又はステンレス（ＳＵＳ３１６）を切削加工する方法を用いる。また、筐体５の上部分である筐体上部５Ｕ及び筐体５の下部分である筐体下部５Ｌを別々に作製する。筐体上部５Ｕの上面に設けられた開口部５Ｕａ及び筐体下部５Ｌの下面に設けられた開口部５Ｌａにはそれらを塞ぐようにガス交換膜４０を設置する。そして、筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌをそれらの間に物質交換膜３０を挟みこむように組み立てることで細胞培養容器１を作製する。

細胞培養容器１の作製方法では、筐体下部５Ｌの内部の空間である培養室１０内に三次元の培養足場８０を予め導入した状態で細胞培養容器１を組み立てることができる。そのため、培養足場８０は、培養室１０内に収まるサイズのものであれば特に限定されず、形状及び性状を適宜選択することができる。無論、培養足場８０が流動性や分散性が高い培養足場である場合には、ポート５１、５２を使用することにより、培養足場８０を培養室１０内に流体として流し込む方法を用いることができる。細胞培養容器１では、培養室１０内に導入した培養足場８０の構造により、簡便に三次元の培養足場を用いた細胞培養を行うことができる。

筐体上部５Ｕを作製する場合には、筐体上部５Ｕの内部の空間である貯留室２０内に流路方向と垂直な方向に沿って仕切り板２４を設置する。このような筐体上部５Ｕの構造により、培地をポート６１から貯留室２０内に流入させる場合に、培地を貯留室２０の下面に設置された物質交換膜３０の近傍に流すことができる。これにより、貯留室２０及び培養室１０の間で効率よく物質交換を行うことができる。

筐体下部５Ｌを作製する場合には、培養室１０内の上側に空気貯め１６を形成する。この構造により、培地を培養室１０内に供給する場合に空気が残存したとしても、空気を空気貯め１６に貯めることにより、物質交換膜３０に気泡が付くことによる物質交換の効率の低下を抑制することができる。

以下、細胞培養容器１を用いる細胞培養方法の一例について説明する。
本例の細胞培養方法では、まず、細胞培養容器１の組み立ての前に予め筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌ並びにガス交換膜４０及び物質交換膜３０を滅菌する。そして、細胞培養容器１の組み立て及び細胞播種を無菌環境下で実施する。

次に、筐体上部５Ｕのポート６１、６２及び筐体下部５Ｌのポート５１、５２にチューブを接続し、ルアーロックコネクタ又はクランプ等で密閉する。また、三次元の培養足場８０を筐体下部５Ｌの培養室１０内に開口部５Ｌｂから導入する。この際、同時に細胞及び培養培地を培養室１０内に導入してもよい。

次に、筐体下部５Ｌの開口部５Ｌｂに物質交換膜３０に設置し、筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌをそれらの間に物質交換膜３０を挟み込むように組み立てることで細胞培養容器１を作製する。筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌは、筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌの組み立て時に開口部５Ｕｂ及び開口部５Ｌｂの周囲の壁面が密着する寸法となっている。

次に、細胞培養容器１の組み立て後、筐体上部５Ｕのポート６１、６２を開放し、細胞の生育時に消費する栄養成分を含んだ培地である栄養培地を導入する。その後、筐体上部５Ｕのポート６１、６２を閉鎖する。

次に、筐体下部５Ｌのポート５１、５２を開放し、細胞及び細胞の培養に必要なタンパク質成分等を含有した培地である培養培地を導入する。その際、気泡が物質交換膜３０に接して残存した場合、細胞培養容器１の全体を傾けることで、気泡を空気貯め１６へ逃がす。その後、筐体下部５Ｌのポート５１、５２を閉鎖する。必要であれば、筐体下部５Ｌのポート５１を流入路、筐体下部５Ｌのポート５２を流出路として培養培地の流路を構築することにより、培養培地を灌流してもよい。この段階で、細胞培養容器１をインキュベータ内に設置することで細胞を培養してもよい。

次に、筐体上部５Ｕのポート６１を流入路、筐体上部５Ｕのポート６２を流出路として栄養培地の流路を構築する。そして、筐体上部５Ｕのポート６１を貯留室２０内へ新鮮な栄養培地を供給する栄養培地供給源に接続する。また、筐体上部５Ｕのポート６２を使用済みの栄養培地を貯留するタンクに接続する。次に、細胞培養容器１をインキュベータ内に設置することで細胞を培養する。

本例の細胞培養方法では、細胞培養時において、貯留室２０への新鮮な栄養培地の連続供給又は逐次供給を行うことができる。貯留室２０へ供給する栄養培地は、栄養成分等の低分子量の成分が含まれていればよい。低分子量の成分としては、例えば、糖質、アミノ酸、脂質、ペプチド、及び核酸等の栄養成分、塩、並びに緩衝剤等が挙げられる。これらの成分は、物質交換膜３０を介して、拡散により貯留室２０から培養室１０へ供給される。また、細胞培養時に発生する老廃物は、培養室１０から貯留室２０へ拡散し回収されることで除去される。老廃物は、細胞の代謝産物であり、例えば、乳酸等である。従って、細胞培養容器１では、貯留室２０へ供給する栄養培地がタンパク質成分を添加していない培地であったとしても、細胞培養を行うことができる。

本例の細胞培養方法では、細胞培養後に細胞を回収する。具体的には、まず、筐体下部５Ｌのポート５１、５２を開放し、洗浄液を導入することで培地を除去する。次に、細胞剥離酵素を導入し、作用させることで培養足場８０から細胞を剥離させる。次に、細胞回収用の培地をポート５１から流入させ、ポート５２からの流出液を回収し、細胞を回収できる。他の方法として、無菌環境下で、細胞培養容器１を筐体上部５Ｕ及び筐体下部５Ｌ等に分解し、培養室１０から培養足場８０ごと細胞を回収する方法を用いることができる。この方法の場合、単一細胞での回収に限定されず、組織様の構造体として細胞を回収することも可能である。

［参考例１］
本発明に適用される透析方式により、ポリスチレン製多孔質担体（３Ｄ Ｂｉｏｔｅｋ社製ＰＳ３０４０１２−６）を培養足場としてｈＭＳＣを培養する場合における血清消費量の試算を示す。

血清消費量を試算する際には、予め、上記多孔質担体にｈＭＳＣを８．０×１０^４ｃｅｌｌｓ播種したときにｈＭＳＣがコンフルエント相当の１．９×１０^６ｃｅｌｌｓになるまでに必要とされるグルコース量を、実験により２．７ｍｇと求めた。そして、これを血清消費量の試算でｈＭＳＣの培養に必要なグルコース量として用いた。さらに、血清消費量の試算では、栄養培地及び培養培地として、グルコースを含み血清成分を含まない基本培地及び上記基本培地に血清を１０体積％添加した培地をそれぞれ想定し、栄養培地及び培養培地のグルコース濃度を一般的に培養で用いられる１．０ｇ／Ｌ（低グルコース培地）と仮定する。これらを前提として、ｈＭＳＣの培養に必要な栄養培地及び培養培地の合計量が２．７ｍＬと試算される。

その上で、透析方式により、上記多孔質担体を培養足場としてｈＭＳＣを培養する方法として、培養培地を多孔質担体が１２ウェルプレートのウェルで完全に浸漬される１ｍＬの初期の培地としてだけ使用し、培養培地に透析膜を介して栄養培地を接触させることでグルコースを供給することで良好な培養環境を維持する方法を想定する。これにより、上記多孔質担体を培養足場としてｈＭＳＣを培養する場合における血清消費量が０．１ｍＬと試算される。

［参考例２］
従来の培地交換方式により、ポリスチレン製多孔質担体（３Ｄ Ｂｉｏｔｅｋ社製ＰＳ３０４０１２−６）を培養足場としてｈＭＳＣを培養する場合における血清消費量の試算を示す。この血清消費量の試算で用いるｈＭＳＣの培養に必要なグルコース量、この血清消費量の試算で想定する栄養培地及び培養培地、並びにこの血清消費量の試算で仮定する栄養培地及び培養培地のグルコース濃度は、参考例１と同一である。そのため、参考例１と同様に、ｈＭＳＣの培養に必要な栄養培地及び培養培地の合計量が２．７ｍＬと試算される。

その上で、培地交換方式により、上記多孔質担体を培養足場としてｈＭＳＣを培養する方法として、培養培地を、多孔質担体を１２ウェルプレートのウェルで完全に浸漬可能な１ｍＬの培地として使用し、当該培地の全量を定期的に未使用の培養培地で交換することで良好な培養環境を維持する方法を想定する。これにより、上記多孔質担体を培養足場としてｈＭＳＣを培養する場合における血清量が０．３ｍＬと試算される。なお、培地交換方式により、上記多孔質担体を培養足場としてｈＭＳＣを培養する場合における血清消費量の最小量は、０．２７ｍＬと試算可能である。

本発明は、上記実施形態及び上記実施例に限定されるものではなく、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含され、様々な変形例が含む。例えば、上記実施形態及び上記実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態及び実施例の構成の一部を他の実施形態及び実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態及び実施例の構成に他の実施形態及び実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施形態及び各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１ 細胞培養容器
５ 筐体
５Ｕ 筐体上部
５Ｕａ 開口部
５Ｕｂ 開口部
５Ｌ 筐体下部
５Ｌａ 開口部
５Ｌｂ 開口部
１０ 培養室
１６ 空気貯め
２０ 貯留室
２１ 第１貯留室
２２ 第２貯留室
２４ 仕切り板
３０ 物質交換膜
３１ 第１物質交換膜
３２ 第２物質交換膜
４０ ガス交換膜
４１ 第１ガス交換膜
４２ 第２ガス交換膜
５１、５２ ポート
５３ 空気抜き用のポート
６１、６２ ポート
６３ 空気抜き用のポート
８０ 培養足場
Ｃ 細胞

Claims (14)

1. 細胞を培養する培養室と、
   流体を貯留する貯留室と、
   前記培養室及び前記貯留室を区画し、前記細胞を透過せず所定の物質を選択的に透過する物質交換膜と、
   前記培養室又は前記貯留室と外部を隔てるガス交換膜と、
   を備え、
   前記培養室及び前記貯留室はそれぞれ流体を流入出可能な開口部を有することを特徴とする細胞培養容器。
2. 前記物質交換膜の分画分子量は５００以上６００００以下の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
3. 前記物質交換膜の分画分子量は１０００以上１５０００以下の範囲内であることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養容器。
4. 前記ガス交換膜は、シリコーン、ポリトリメチルシリルプロピン、含フッ素アクリル樹脂、フッ素系樹脂、ポリメチルペンテン、及び天然ゴムのいずれかを主成分とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養容器。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養容器を用い、前記培養室で前記細胞を培養する細胞培養方法であって、前記開口部を介して前記培養室及び前記貯留室に成分又は成分濃度が異なる培地を供給することを特徴とする細胞培養方法。
6. 前記培養室及び前記貯留室にそれぞれ生理活性物質を含む培養培地及び栄養培地を供給することを特徴とする請求項５に記載の細胞培養方法。
7. 前記生理活性物質は成長因子であることを特徴とする請求項６に記載の細胞培養方法。
8. 前記培養室に前記細胞を接着又は包埋可能な構造体である培養足場を導入し、前記培養足場で前記細胞を培養することを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
9. 前記開口部を介して前記貯留室に連続的又は逐次的に前記培地を供給し、前記貯留室から前記開口部を介して連続的又は逐次的に前記培地を排出しながら、前記培養室で前記細胞を培養することを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
10. 前記貯留室の前記開口部又は当該開口部に接続する流路にサンプリングポート又は成分分析用センサーを設置した状態において、前記培養室で前記細胞を培養することを特徴とする請求項９に記載の細胞培養方法。
11. 前記サンプリングポート又は前記成分分析用センサーを用い、前記培地に含まれるグルコース、乳酸、アンモニア、グルタミン、グルタミン酸、酸素、及び二酸化炭素（前記二酸化炭素は、炭酸、炭酸イオン、又は炭酸水素イオンを含む）の少なくとも一種の成分の濃度を連続的又は逐次的に測定しながら、前記培養室で前記細胞を培養することを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養方法。
12. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養方法で前記細胞を培養する過程において、前記細胞の生育状態を評価する細胞生育状態の評価方法であって、
    前記貯留室に供給される前記培地及び前記貯留室から排出される前記培地のグルコース濃度の差を測定し、当該グルコース濃度の差からグルコース消費速度を算出し、前記グルコース消費速度から前記培養室内の細胞数を推定することを特徴とする細胞生育状態の評価方法。
13. さらに前記貯留室から排出される前記培地の乳酸濃度を測定し、当該乳酸濃度から乳酸産生速度を算出し、前記グルコース消費速度及び前記乳酸産生速度から前記培養室内の細胞の代謝挙動を推定することを特徴とする請求項１２に記載の細胞生育状態の評価方法。
14. 請求項１２又は１３に記載の細胞生育状態の評価方法を用い、前記細胞の生育状態を評価し、前記細胞の生育状態の評価結果に基づき前記貯留室又は前記培養室に前記培地を供給する方法を制御することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。

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