CN116848226A - 细胞培养体系 - Google Patents

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Abstract

本公开整体涉及一种细胞培养装置和一种细胞培养方法。本公开的一个方面是一种氧气可渗透袋，该氧气可渗透袋包括一个或多个聚合物膜，该一个或多个聚合物膜限定该袋的内部隔室的边界，该一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括与该袋的该内部隔室相邻的内层以及附着到该内层的外层，该内层包含含氟聚合物，该外层包含聚合物；第一端口，该第一端口形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；第二端口，该第二端口形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；以及多个微载体，其容纳在该内部隔室中。

Description

细胞培养体系
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月30日提交的美国临时专利申请第63/132291号的优先权的权益，该申请全文特此以引用方式并入本文。
背景技术
本发明的领域
本公开整体涉及一种细胞培养装置和一种细胞培养方法。
技术背景
细胞培养和细胞分离是许多应用中的重要过程。例如，在治疗应用(例如，免疫疗法、再生医学等)中使用的某些细胞通常在体外进行分离和培养。例如，诸如祖细胞和间充质干细胞的细胞和单核细胞以及其他免疫细胞以相对低的浓度存在于血液中，因此通常从血液中分离，并在体外进行培养。类似地，神经元细胞、心肌细胞、上皮细胞和用于再生医学(例如，骨修复、皮肤修复、胰岛再生等)的其他细胞能够在体外进行培养。
可商购获得的袋形式的细胞培养设备是用于细胞培养的常规形式。细胞培养袋具有一次性的优点，减少了准备和清理时间。另外，细胞培养袋是能够预先灭菌的、廉价的、易于使用的并且需要最小的储存和使用空间。一次性用品还有助于降低细胞培养和环境污染的风险。
然而，此类袋的表面对于贴壁依赖性细胞来说通常是较差的粘附底物，其需要与其天然细胞生态位相当的环境才能生存。此外，此类袋的内部表面积相对有限(例如，与袋的总体积相比)。
因此，仍然需要便于贴壁依赖性细胞的改良培养的细胞培养和分离制品。
发明内容
本公开的一个方面是一种氧气可渗透袋，其包括一个或多个聚合物膜，该一个或多个聚合物膜的边缘粘结在一起以形成该袋的内部隔室，该一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括与该袋的该内部隔室相邻的内层以及附着到该内层的外层，该内层包含含氟聚合物，该外层包含聚合物；第一端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；第二端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；以及多个微载体，其容纳在该内部隔室中。
本公开的另一方面是一种袋(例如，根据本文所述的任何实施方案)，其包括未分隔的内部隔室；第一液体可渗透管，其延伸到该内部隔室中并且与该内部隔室流体连通，该第一液体可渗透管操作地联接到第一端口；以及第二液体可渗透管，其延伸到该内部隔室中并且与该内部隔室流体连通，该第二液体可渗透管操作地联接到第二端口；其中该第一液体可渗透管包括限定该管的中心管腔的第一内支撑结构和围绕该第一内支撑结构的第一外过滤层。
本公开的另一方面是一种袋(例如，根据本文所述的任何实施方案)，其包括未分隔的内部隔室；第一液体可渗透管，其延伸到该袋的该内部隔室中并且与该袋的该内部隔室流体连通，该第一液体可渗透管操作地联接到端口；以及第二液体可渗透管，其延伸到该袋的该内部隔室中并且与该袋的该内部隔室流体连通，该第二液体可渗透管操作地联接到第二端口；其中该第一液体可渗透管具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
本公开的另一方面是一种袋(例如，根据本文所述的任何实施方案)，其包括将内部隔室的第一部分与该内部隔室的第二部分分离的多孔膜，该第二部分容纳多个微载体；以及第三端口，其形成在该袋的外部表面中；其中该第一端口和该第二端口各自与该内部隔室的该第一部分流体连通，并且该第三端口与该内部隔室的该第二部分流体连通。
本公开的另一方面是一种袋(例如，根据本文所述的任何实施方案)，其包括将内部隔室的第一侧向部分与该内部隔室的中心部分分离的第一多孔膜；第二多孔膜，其将该内部隔室的第二侧向部分与该内部隔室的该中心部分分离，该中心部分容纳多个微载体；以及第三端口，其形成在该袋的外部表面中；其中该第一端口与该内部隔室的该第一侧向部分流体连通，该第二端口与该内部隔室的该第二侧向部分流体连通，并且该第三端口与该内部隔室的该中心部分流体连通。
本公开的另一方面是一种用于培养细胞的方法，其包括向袋中添加贴壁依赖性细胞和培养基(例如，根据本文所述的任何实施方案)。
附图说明
图1是根据本公开的一个实施方案的袋的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)。
图2是适用于本文所述的袋的构造的聚合物膜的局部剖视图。
图3是根据本公开的一个实施方案的液体可渗透管的示意性剖面图。
图4是根据本公开的一个实施方案的液体可渗透管的示意性剖面图。
图5是根据本公开的一个实施方案的袋的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)。
图6是根据本公开的一个实施方案的袋的示意性剖视图。
图7是根据本公开的一个实施方案的袋的示意性剖视图。
图8是根据本公开的一个实施方案的袋的示意性俯视图。
图9是对比的可商购获得的含氟聚合物袋在高压釜中处理后的照片(参见实施例1)。
图10是根据本公开的一个实施方案的氧气可渗透袋在高压釜中处理后的照片(参见实施例1)。
具体实施方式
本公开涉及用于在细胞培养袋中培养和分离贴壁依赖性细胞的制品和方法。本发明人注意到，常规的细胞培养袋——其表面通常为不适合贴壁依赖性细胞的底物——还可能不适合微载体细胞培养。如本领域普通技术人员应理解的，“微载体”细胞培养物包含离散的微米级颗粒(例如，球状“微载体”或“微珠”)，其表面可作为贴壁依赖性细胞的附着底物。
本发明人注意到，细胞培养袋的内表面可能因由例如袋制备(例如，由灭菌引起的结构变化)或使用(例如，来自袋支撑或摇袋设备的不均匀施加的力)而产生的机械应力而变形。由此类畸变导致的袋表面上的宏观特征可能会在细胞培养过程期间导致微载体的局部化或“汇集”，从而导致微载体在整个袋体积中不期望的、不均匀的分布。此类特征还能够显著增加载体锚定细胞所受到的剪切应力和碰撞应力的量(例如，在搅拌或摇动期间)，该剪切应力和碰撞应力的量包括直接的(即，宏观表面特征和微载体之间的碰撞)和间接的(即，在不均匀分布的微载体群体的“汇集”区域中增加微载体之间的碰撞)两者。
有利的是，本发明人已经确定，由氧气可渗透聚合物膜形成的培养袋的内表面能够有利地在整个制备(例如，在高压釜中灭菌)和使用(例如，在摇动设备上温育)过程中保持相对不变形，该氧气可渗透聚合物膜包括附着到外聚合物层的内含氟聚合物层。因此，在细胞培养过程期间容纳在袋中的微载体能够保持相对均匀的分布，并且锚定细胞对剪切力和碰撞力的暴露可显著减少。此外，本发明人已经确定，此类袋可以有利地包含一种或多种灌注组分，其有利于在细胞培养和/或培养细胞的高效回收期间的最小破坏性移除和补充补料培养基。
因此，本公开的一个方面是一种氧气可渗透袋，其包括一个或多个聚合物膜(例如，第一聚合物膜和第二聚合物膜)，该一个或多个聚合物膜限定袋的内部隔室的边界(例如，通过使边缘粘结在一起以形成袋)。聚合物膜中的每个聚合物膜包括与袋的内部隔室相邻的内层以及附着到内层的外层，该内层包含含氟聚合物，该外层包含聚合物。该袋包括形成在袋的外部表面中并且与内部隔室流体连通的第一端口，和形成在袋的外部表面中并且与内部隔室流体连通的第二端口。并且该袋在内部隔室中容纳多个微载体。
如上所述，在各种实施方案中，氧气可渗透袋可以是包括一个或多个聚合物膜的氧气可渗透袋的形式，该一个或多个聚合物膜的边缘粘结在一起以形成袋的内部隔室，该一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括与袋的内部隔室相邻的内层以及附着到内层的外层，该内层包含含氟聚合物，该外层包含聚合物；第一端口，其形成在袋的外部表面中并且与内部隔室流体连通；第二端口，其形成在袋的外部表面中并且与内部隔室流体连通；以及多个微载体，其容纳在内部隔室中。
在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个聚合物膜包括第一聚合物膜和第二聚合物膜，其边缘粘结在一起以形成围绕袋的内部隔室的边缘。然而，在其他实施方案中，单个聚合物膜能够翻折并且自身粘结以形成袋，或者可以将管状膜焊接在两个边缘上以形成袋。在任何情况下，当使用两个单独的膜时，仅一个聚合物膜需要具有本文所述的层合结构；另一个膜也可以具有层合结构，或者它可以具有一些不同的结构。
如上所述，聚合物膜(即层合聚合物膜，认识到袋中只需要存在一个此类膜)中的每个聚合物膜包括内层，该内层包含含氟聚合物。在如本文另外描述的各种实施方案中，内层基本上包含含氟聚合物，例如至少80重量％、或至少85重量％、或至少90重量％、或至少95重量％、或至少97.5重量％、或至少98重量％或至少99重量％的含氟聚合物。
在如本文另外描述的各种实施方案中，内层包含选自以下的一种或多种含氟聚合物：乙烯-丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物(HTE)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯共聚物、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(ETFE)、四氟乙烯/丙烯共聚物(TFE/P)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(FEP/HFP)、六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(THV)和具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均环聚合物。在某些期望的实施方案中，内层包含氟化乙烯-丙烯。例如，在某些此类实施方案中，内层包含至少80重量％(例如，至少90重量％或至少95重量％)的氟化乙烯-丙烯。
在各种实施方案中，内层包含选自无定形含氟聚合物的含氟聚合物，该含氟聚合物是非晶态的(例如，当通过DSC测量时)，或具有小于2J/g的熔化热。例如，在某些此类实施方案中，内层包含四氟乙烯与官能或非官能单体的共聚物，该官能或非官能单体为诸如具有2至8个碳原子的氟代烯烃和氟化烷基乙烯基醚，其中烷基含有1个或3至5个碳原子。在各种实施方案中，非官能单体包括六氟丙烯(HFP)、三氟氯乙烯(CTFE)、PEVE、PMVE和全氟(丙烯乙烯基醚)(PPVE)中的一者或多者。在各种实施方案中，官能单体包括以下中的一者或多者：全氟乙基乙烯基醚(EVE)、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2COOCH3(EVE-氨基甲酸酯)、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2SO2F ( PSEPVE ) 、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2CN ( 8CNVE ) 、N3(CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2)3 (EVE-三嗪) 、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2CN ( EVE-CN ) 、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2OH ( EVE-OH ) 、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2PO2(OH)2 ( EVE-P )、CF2＝CFOCF2CFCF3OCF2CF2CH2COOH(EVE-COOH)和2,2-双三氟甲基-4,5-二氟-1,3-间二氧杂环戊烯(PDD)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，内层可以包含一种或多种可商购获得的无定形含氟聚合物，诸如来自特拉华州威尔明顿的杜邦(DuPont)公司的SF60(TFE/PMVE/PEVE，杜邦，特拉华州威尔明顿)、/>SF61(TFE/PMVE/PEVE/EVE-P)、SF50(TFE/HFP)、/>AF 1600(PDD/TFE)和/>AF2130(PDD/CTFE)；来自日本东京的朝日(Asahi)公司的/>(CYTOP A型、CYTOP M型、CYTOP S型或CYTOP NM)；来自以色列雷霍沃特的MY聚合物公司(MY Polymers Corporation)(MY-133)；或来自加利福尼亚州卡平特里亚的诺稀尔(Nusil)公司(LS-233)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，内层(例如，基本上包含氟化乙烯-丙烯)具有0.001mm至0.7mm，例如，0.001mm至0.4mm、或0.001mm至0.1mm、或0.005mm至0.7mm、或0.005mm至0.4mm、或0.005mm至0.1mm、或0.01mm至0.7mm、或0.01mm至0.4mm或0.01mm至0.1mm的厚度。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，内层包含至少95重量％的氟化乙烯-丙烯并且具有0.01mm至0.1mm的厚度。
如上所述，聚合物膜(即层合聚合物膜，认识到袋中只需要存在一个此类膜)中的每个聚合物膜包括外层，该外层包含聚合物。可以使用多种聚合物，并且本领域普通技术人员将基于本文的公开内容，尤其是关于气体渗透性和褶皱性方面，选择期望的聚合物。在某些期望的实施方案中，外层基本上不含含氟聚合物，例如不包含超过5％的含氟聚合物，例如不超过1％的含氟聚合物。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含弹性体。如本领域普通技术人员应理解的，“弹性体”或“橡胶”包括由包括碳、氢、氧和/或硅的单体形成的具有粘弹性和相对较弱的分子间力的聚合物。弹性体通常具有相对较低的杨氏模量和相对较高的失效应变。在如本文另外描述的各种实施方案中，外层基本上包含弹性体，例如至少80重量％、或至少85重量％、或至少90重量％、或至少95重量％、或至少97.5重量％、或至少98重量％或至少99重量％的弹性体。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含一种或多种通过硫硫化固化的不饱和橡胶，诸如天然橡胶(NR)、合成聚异戊二烯橡胶(IR)、聚丁二烯橡胶(BR)、氯丁二烯橡胶(CR)、丁基橡胶(IIR)、卤化丁基橡胶(CIIR、BIIR)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)、丁腈橡胶(NBR)和氢化丁腈橡胶(HNBR)。在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含一种或多种不能通过硫硫化固化的不饱和橡胶，诸如乙丙橡胶(EPM)、三元乙丙橡胶(EPDM)、表氯醇橡胶(ECO)、聚丙烯酸橡胶(ACM、ABR)、硅橡胶(SI、Q、VMQ)、氟硅橡胶(FSR、FVMQ)、含氟弹性体(FKM、FEPM)、全氟弹性体(FFKM)、聚醚嵌段酰胺(PEBA)、氯磺化聚乙烯(CSM)、热塑性聚氨酯(TPU)，包括热塑性硅氧烷，诸如环烯烃共聚物、聚烯烃弹性体、弹性体PET和乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)。在某些此类实施方案中，一种或多种不饱和橡胶以外层的至少80重量％(例如，至少90重量％、或至少97.5重量％或至少99重量％)的组合量存在。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含一种或多种热塑性聚氨酯或热固性聚氨酯。在某些此类实施方案中，外层包含一种或多种热塑性聚氨酯(TPU)，诸如基于亚甲基二异氰酸酯(MDI)或甲苯二异氰酸酯(TDI)的热塑性聚氨酯，包括聚酯和聚醚等级的多元醇两者。例如，在各种实施方案中，外层包含一种或多种基于可商购获得的“预聚物”的热塑性聚氨酯，包括“TEXIN”(拜耳材料科技公司(Bayer Materials Science)的商品名)、“ESTANE”(路博润公司(Lubrizol)的商品名)、“PELLETHANE”(陶氏化学公司(Dow ChemicalCo.)的商品名)和“ELASTOLLAN”(巴斯夫公司(BASF,Inc.)的商品名)。在某些此类实施方案中，一种或多种热塑性聚氨酯或热固性聚氨酯以外层的至少80重量％(例如，至少90重量％、或至少97.5重量％或至少99重量％)的组合量存在。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含一种或多种热塑性硅氧烷，诸如140硅氧烷TPE、/>200硅氧烷TPE弹性体(90％聚二甲基硅氧烷和异氰酸酯)、/>60硅氧烷TPE、/>80硅氧烷TPE或145TPE，所有这些都包括90％聚二甲基硅氧烷和异氰酸酯。在某些此类实施方案中，一种或多种热塑性硅氧烷以外层的至少80重量％(例如，至少90重量％、或至少97.5重量％或至少99重量％)的组合量存在。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，外层包含聚甲基戊烯(PMP)(即，甲基戊烯单体单元的热塑性聚合物)。例如，在某些此类实施方案中，外层包含至少80重量％(例如，至少90重量％或至少95重量％)的聚甲基戊烯。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含硅橡胶。例如，在某些此类实施方案中，外层包含至少80重量％(例如，至少90重量％或至少95重量％)的硅橡胶。
在某些此类实施方案中，外层包含硅橡胶，该硅橡胶包含硅氧烷聚合物基体，该硅氧烷聚合物基体包含由例如二甲基硅氧烷、二乙基硅氧烷、二丙基硅氧烷、甲基乙基硅氧烷和甲基丙基硅氧烷中的一者或多者形成的聚烷基硅氧烷。在某些期望的实施方案中，硅橡胶包括聚二烷基硅氧烷，诸如，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在某些此类实施方案中，硅氧烷聚合物是相对非极性的并且基本上不含卤化物官能团(例如，Cl、Br)和苯基官能团。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层包含一种或多种聚有机硅氧烷，该一种或多种聚有机硅氧烷选自两端被乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的聚二甲基硅氧烷、两端被乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的二甲基硅氧烷-乙烯基甲基硅氧烷共聚物和两端被乙烯基二甲基甲硅烷氧基封端的二甲基硅氧烷-甲基苯基硅氧烷共聚物。
在如本文另外描述的各种实施方案中，硅橡胶包括铂催化液体硅橡胶(LSR)或高稠度橡胶(HCR)。在各种实施方案中，硅橡胶包括过氧化物催化的硅橡胶(LSR)或高稠度橡胶(HCR)，诸如，例如由圣戈班集团(Saint-Gobain)生产的基于过氧化物的硅氧烷。HCR硅橡胶的示例是购自通用电气塑料(GE Plastics)的GE 94506HCR。LSR硅橡胶的示例包括密歇根州艾德里安市的瓦克硅树脂公司(Wacker Silicone)的Wacker 3003和加利福尼亚州凡吐拉市的罗地亚硅树脂公司(Rhodia Silicones)的Rhodia 4360。
在如本文另外描述的各种实施方案中，外层(例如，基本上包含聚甲基戊烯或硅橡胶)具有0.01mm至5mm，例如，0.01mm至1mm、或0.01mm至0.5mm、或0.05mm至5mm、或0.05mm至1mm、或0.05mm至0.5mm、或0.1mm至5mm、或0.1mm至1mm或0.1mm至0.5mm的厚度。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，外层包含至少95重量％的聚甲基戊烯并且具有0.1mm至0.5mm的厚度。在如本文另外描述的其他期望的实施方案中，外层包含至少95重量％的硅橡胶并且具有0.1mm至0.5mm的厚度。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，内层具有0.001mm至0.7mm的厚度，并且外层具有0.01mm至5mm的厚度。例如，在各个实施方案中，内层具有0.01mm至0.4mm的厚度，并且外层具有0.05mm至1mm的厚度。在另一示例中，在各种实施方案中，内层具有0.01mm至0.1mm的厚度，并且外层具有0.1mm至0.5mm的厚度。在某些此类实施方案中，内层基本上包含(例如，至少95重量％)氟化乙烯-丙烯。在某些此类实施方案中，外层基本上包含(例如，至少95重量％)硅橡胶。
如上所述，聚合物膜的内层和外层附着在一起。在各种实施方案中，附着层通过涂覆过程形成。在某些此类实施方案中，附着的内层和外层是将能够浇铸的含氟聚合物组合物分散到聚合物层(例如，弹性体层)上的产物。当然，在其他此类实施方案中，附着层是将能够浇铸的聚合物组合物(例如，能够浇铸的弹性体组合物)分散到含氟聚合物层上的产物。本领域普通技术人员应理解的是，“能够浇铸的”聚合物(例如，含氟聚合物或非含氟聚合物)能够分散、溶解、悬浮、乳化或以其他方式分布在液体载体介质中，以提供能够沉积在支撑材料上以形成聚合物层的聚合物组合物。当然，“能够浇铸的”聚合物也可以包括那些能够熔融或以其他方式在液态下加工，然后冷却或以其他方式固化(例如，通过UV、IR、引发剂或电子束)以形成固体聚合物层的聚合物。合适的载体液体(例如DMAC、NMP、乙二醇醚、水)和用于浇铸本文所述的聚合物的方法是本领域已知的。
在如本文另外描述的各种实施方案中，附着层通过涉及化学粘合的涂覆工艺形成。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，外层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)硅橡胶，并且附着到其上的内含氟聚合物层是浇铸含氟聚合物组合物的产物，该含氟聚合物组合物容纳能够粘合到硅橡胶上的反应性化合物。在某些此类实施方案中，反应性化合物选自含烃硅化合物，诸如，例如具有硅氧烷键的化合物、具有烷氧基甲硅烷基的硅烷偶联剂、具有氯甲硅烷基或硅氮烷的官能硅烷、氨基硅烷和甲硅烷基化剂。其中优选具有硅氧烷键的化合物和具有烷氧基甲硅烷基的硅烷偶联剂。在各种实施方案中，反应性化合物具有硅氧烷键(例如，末端改性的二甲基硅氧烷、缩合型或加成型液体硅氧烷、硅酸盐和丙烯酸硅氧烷聚合物)。
例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，外层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)硅橡胶，并且附着到其上的内含氟聚合物层是浇铸组合物的产物，该组合物包含具有氨基硅烷末端改性的含氟聚合物(例如，CYTOP M型)或具有羧基末端改性的含氟聚合物(例如，CYTOP A型)，并且可选地包含偶联剂。在此类实施方案中，通过化学粘合的附着能够通过缩合、烷基化、酰胺化、甲硅烷基化、醚化中的一者或多者(例如，直接地或通过偶联剂)发生。例如，在某些此类实施方案中，内含氟聚合物层是浇铸组合物的产物，该组合物包含与羟基、氨基或硫基团反应的异氰酸酯化合物。在其他实施方案中，含氟聚合物层通过氢键合附着到外层。
在如本文另外描述的其他实施方案中，内层和外层通过化学粘合、粘合剂粘合、热熔粘合、溶剂粘合、激光焊接、表面处理、挤出、共挤出和层合中的一者或多者粘结。例如，在某些期望的实施方案中，内层(例如，基本上包含氟化乙烯丙烯)和外层(例如，基本上包含硅橡胶)通过选自C处理(圣戈班高性能塑料公司(Saint-Gobain Performance PlasticsCorporation)，美国专利第6,726,979号)、电晕放电、等离子体处理和蚀刻的一种或多种表面处理粘结。在其他实施方案中，内层和外层通过涉及能够单独使用或与本文所述的处理方法结合使用的添加剂或底漆的化学处理来粘结。
例如，在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，内层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)氟化乙烯-丙烯(例如，C处理的氟化乙烯-丙烯)，并且附着到其上的外层是用液体硅橡胶(LSR)硅氧烷(例如，通过挤出)涂底漆和涂覆氟化乙烯-丙烯的产物。在其他实施方案中，内层和外层预层合在一起(例如，类似于Complete产品(圣戈班高性能塑料公司，宾夕法尼亚州福吉谷))。
本发明人注意到，本文所述的袋的内层可以有利地具有低的总有机碳(TOC)。本领域普通技术人员应理解的是，“总有机碳”是结合在有机化合物中的碳的量并且通常用作药物制造装备的非特异性指标等。总有机碳在生物技术工业中被用作过程控制属性，以监测采用净化和分配系统的单元操作的性能。
通过从袋的内表面区域或另一物品的表面区域提取来测量总有机碳(结果以mg/cm2，每平方厘米表面区域的总可提取有机碳为单位提供)。通过在70℃下与给定体积的纯化水接触24小时来对材料进行提取。
氟化乙烯丙烯袋(即，使用FEP膜)的总有机碳值的一个示例是<0.01mg/cm2。对于硅氧烷管材，提取率可以是14.6cm2/mL(例如，Biosil)或可以是15.9cm2/mL(例如，SR139)，并且硅氧烷Biosil管的总有机碳值的一个示例是0.021mg/cm2，并且硅氧烷SR139管的总有机碳值的一个示例是0.008mg/cm2。至少对于某些硅氧烷管材，样品可能会被稀释，因为提取的体积和浓度会导致该值高于机器的最大检测值。稀释和不同提取率要求将这些样品与袋样品进行比较，以提供重量/面积值。
如本文所量化的，总有机碳根据美国药典(US Pharmacopeia，USP)643使用利用UV促进的化学氧化的高温湿氧化反应的装备来测量(超净技术手册(Ultra-CleanTechnology Handbook)：第1卷：超纯水，近江精机(Ohmi)，Tadahiro；CRC出版社，1993年，第497-517页)。在70℃下，纯化水被放置为与聚合物接触24小时，比率为3cm2的制品表面积与1mL的水。去除与聚合物接触的水并在TOC分析仪中进行测试。合适的装备是TEKMARDOHRMANN型Phoenix 8000TOC分析仪。
因此，在如本文另外描述的各种实施方案中，构成袋的聚合物膜中的一个或多个聚合物膜(例如，每个聚合物膜)是气体可渗透的并且包括内层，该内层具有小于0.1mg/cm2，例如，或小于0.5mg/cm2、或小于0.1mg/cm2、或小于0.01mg/cm2或小于0.001mg/cm2的水中总有机碳。例如，在某些此类实施方案中，聚合物膜中的每个聚合物膜包括内层，该内层具有0.001mg/cm2至0.1mg/cm2，例如0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.05mg/cm2或0.001mg/cm2至0.01mg/cm2的水中总有机碳。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，外层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)硅橡胶，内层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)氟化乙烯丙烯，并且内层具有0.001mg/cm2至0.05mg/cm2，例如0.001mg/cm2至0.01mg/cm2的水中总有机碳。
如上所述，袋是氧气可渗透的。本发明人注意到，本文所述的氧气可渗透聚合物膜可有利于细胞培养所必需的气体交换(例如，氧气补充)，减少或甚至消除对进出袋的一种或多种额外气体补料的需要。因此，在如本文另外描述的各种实施方案中，构成袋的聚合物膜中的至少一个聚合物膜(例如，每个聚合物膜)具有至少100cc/m2/天，例如，至少500cc/m2/天、或至少1,000cc/m2/天或至少2,000cc/m2/天的气体渗透性(例如，透氧性)。如本文所量化的，透氧性是用MOCON Ox-tran 2/21H氧气分析仪，遵循ASTM D3985，在25℃下测量的。在膜渗透性的另一方面，标准化单位(cc-mm/m2-天)能够用于示出任何厚度的膜。例如，在25℃的温度下，5mm膜的转换范围将为约12.7cc-mm/m2-天至至少约279cc-mm/m2-天。结构体/复合材料的渗透性能够用cc/m2术语表示，因为它将由两层组成。
此外，本发明人注意到，如本文中另外描述的那样，袋可以有利地是二氧化碳可渗透的(例如，以便于去除积聚的二氧化碳)。因此，在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，构成袋的聚合物膜中的至少一个聚合物膜(例如，每个聚合物膜)具有至少5,000cc/m2/天，例如至少10,000cc/m2/天、或至少15,000cc/m2/天或至少20,000cc/m2/天的二氧化碳渗透性。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，构成袋的聚合物膜中的至少一个聚合物膜(例如，每个聚合物膜)具有10,000cc/m2/天至40,000cc/m2/天，例如15,000cc/m2/天至35,000或20,000cc/m2/天至30,000cc/m2/天的二氧化碳渗透性。如本文所量化的，二氧化碳渗透性是使用MOCON Permatran-C 441CO2TR分析仪，遵循ASTM F2476，在25℃、100％ CO2和膜两侧0％相对湿度下测量的。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，外层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)硅橡胶，内层基本上包含(例如，至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％)氟化乙烯丙烯，并且聚合物膜中的至少一个聚合物膜(例如，每个聚合物膜)具有在1000cc/m2/天至25,000cc/m2/天范围内的气体渗透性和小于0.1mg/cm2的水中总有机碳。在某些此类实施方案中，聚合物膜中的每个聚合物膜包括内层，该内层具有0.001mg/cm2至0.1mg/cm2，例如0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.05mg/cm2或0.001mg/cm2至0.01mg/cm2的水中总有机碳。
如上所述，袋在内部隔室中容纳多个微载体。在某些期望的实施方案中，容纳在袋的内部隔室中的微载体是多孔且不可降解的(例如，在水性细胞培养基中)。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖或纤维素。在某些理想的实施方案中，微载体表面包含带正电或带负电的官能团(例如，共价附接到聚苯乙烯、交联葡聚糖、纤维素等)。例如，在某些此类实施方案中，微载体基本上是聚苯乙烯，并且具有包含含氧官能团(例如，共价附接到聚苯乙烯)的净负电荷表面。本领域普通技术人员应理解的是，此类“表面处理的”微载体可以具有便于细胞附接和/或扩散的相对亲水性表面。
在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体包含一种或多种细胞外基质化合物，例如胶原蛋白I、聚-L-赖氨酸、纤粘蛋白、纤维连接蛋白(retronectin)、透明质酸、聚多巴胺。例如，在某些此类实施方案中，微载体包含共价附接到基本上包括聚苯乙烯、交联葡聚糖或纤维素的核心颗粒表面的一种或多种细胞外基质化合物(例如，胶原蛋白或聚多巴胺)。在本文所述的其他实施方案中，微载体包含至少90重量％，例如至少95重量％、或至少97.5重量％、或至少98重量％、或至少99重量％或至少99.5重量％的聚苯乙烯、交联葡聚糖或纤维素中的一者或多者。
在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体具有100μm至400μm，例如100μm至300μm、或100μm至275μm、或110μm至400μm、或110μm至300μm、或110μm至275μm、或120μm至400μm、或120μm至300μm或120μm至275μm的平均直径。在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体具有1g/mL至1.25g/mL，例如1g/mL至1.15g/mL或1g/mL至1.1g/mL的平均密度。在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体具有0.1cm2/mg至10cm2/mg，例如0.1cm2/mg至7.5cm2/mg、或0.5cm2/mg至10cm2/mg、或0.5cm2/mg至7.5cm2/mg、或1cm2/mg至10cm2/mg或1cm2/mg至7.5cm2/mg的平均比表面积。
在如本文另外描述的各种实施方案中，容纳在内部隔室中的多个微载体的组合质量(即，以克计)与内部隔室的体积(即，以升计)之比为1g/L至15g/L，例如，1g/L至12.5g/L、或1g/L至10g/L、或2.5g/L至15g/L、或2.5g/L至12.5g/L、或2.5g/L至10g/L、或5g/L至15g/L、或5g/L至12.5g/L或5g/L至10g/L。在如本文另外描述的各种实施方案中，微载体具有0.1cm2/mg至10cm2/mg(例如，0.5cm2/mg至10cm2/mg)的平均比表面积，并且容纳在内部隔室中的多个微载体的组合质量与内部隔室的体积之比为1g/L至15g/L(例如，2.5g/L至10g/L)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，容纳在内部隔室中的多个微载体的总表面积为与袋的内部隔室相邻的内层的总表面积的至少100％，例如至少500％、或至少1,000％、或至少5,000％或至少10,000％。
如上所述，本文所述的袋能够有利地限制不均匀的微载体分布和/或在细胞培养期间锚定细胞暴露于不期望的剪切力和碰撞力。因此，本公开的另一方面是一种用于培养细胞的方法，其包括向本文所述的袋中添加贴壁依赖性细胞和培养基。在如本文另外描述的各种实施方案中，细胞包括血细胞或免疫细胞。在如本文另外描述的各种实施方案中，细胞是干细胞、多潜能基质细胞、肝细胞、角质细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元。在如本文另外描述的各种实施方案中，细胞是分化的干细胞，诸如，例如软骨细胞样、成骨细胞样或脂肪细胞样分化的干细胞。在如本文另外描述的各种实施方案中，细胞是内皮祖细胞、间充质基质细胞或松散粘附细胞，诸如，例如单核细胞。
在如本文另外描述的各种实施方案中，将多个贴壁依赖性细胞添加袋中，以提供1,000个细胞/cm2至10,000个细胞/cm2，例如1,000个细胞/cm2至9,000个细胞/cm2、或1,000个细胞/cm2至7,500个细胞/cm2、或2,500个细胞/cm2至10,000个细胞/cm2、或2,500个细胞/cm2至9,000个细胞/cm2、或2,500个细胞/cm2至7,500个细胞/cm2、或3,500个细胞/cm2至10,000个细胞/cm2、或3,500个细胞/cm2至9,000个细胞/cm2或3,500个细胞/cm2至7,500个细胞/cm2的细胞与多个微载体总表面积之比。
该袋可以保持在期望的温育温度下，并且能够被搅动。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法包括摇动袋。
在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法还包括从微载体分离培养的细胞(例如，通过将锚定细胞暴露于胰蛋白酶)，并且随后从袋中移除培养的细胞(例如，通过被配置为将微载体保留在袋的内部隔室中的过滤器)。
如上所述，本文所述的袋可以有利地包含一种或多种灌注组分。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，袋包括未分隔的内部隔室、第一液体可渗透管和第二液体可渗透管，该第一液体可渗透管延伸到内部隔室中并且与内部隔室流体连通，该第一液体可渗透管操作地联接到端口，该第二液体可渗透管延伸到内部隔室中并且与内部隔室流体连通，该第二液体可渗透管操作地联接到第二端口。在此类实施方案中，第一液体可渗透管包括限定管的中心管腔的第一内支撑结构和围绕该第一内支撑结构的第一外过滤层。本发明人注意到，有利地，通过使培养基从第二管中流出，经过内部体积，并且流出第一管，可以通过袋的内部隔室灌注补料培养基，而不会明显干扰锚定细胞和/或减少所容纳的微载体的数量。第一管的第一过滤层能够防止微载体逸出内部隔室的内部体积。因此，贴壁依赖性细胞能够在内部隔室中生长和浓缩，而没有补料培养基供应限制和/或废物移除限制。当存在时，第三端口能够用于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入内部隔室。此外，本发明人注意到，有利地，在细胞培养过程之后，可以将培养的细胞从微载体上分离并且通过第一过滤层(例如，其将微载体保留在内部隔室中)从袋中移除。
但是本领域普通技术人员可以以多种方式相对于第一端口和第二端口中的一者或多者来布置过滤器，即，适于过滤通过其离开内部隔室的培养基，以例如防止微载体在灌注期间离开袋。
值得注意的是，在此类实施方案中，内部隔室可以是未分隔的(例如，不存在分隔内部隔室的膜或其他多孔结构，使得第一管和第二管在第一子隔室中而第三端口连接到通过膜或其他多孔结构与第一子隔室分隔开的第二子隔室)。本发明人注意到，这能够有利地实现温育细胞和灌注培养基之间良好的流体转移。
在图1的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)中示出了此类袋的一个实施方案。图1的袋100包括第一聚合物膜110和第二聚合物膜120，第一聚合物膜和第二聚合物膜在其边缘处粘结在一起以形成围绕具有长轴132的未分隔的内部隔室130的边缘。袋100还包括第一端口140和第二端口150，两者均与内部隔室130流体连通。在图1的特定实施方案中，第一端口140操作地联接到第一液体可渗透管170，并且第二端口150操作地联接到第二液体可渗透管180。在图1的实施方案中，袋100还包括与内部隔室130流体连通的第三端口160；然而，本领域普通技术人员应理解的是，第三端口不需要存在于本文考虑的所有实施方案中。微载体135可以设置在内部隔室130中。
图2是适用于本文所述的袋(例如图1的袋)的构造的聚合物膜的局部剖视图。本文中，聚合物膜110具有内层111和外层112，内层包含(例如，是)本文另外描述的含氟聚合物，外层包含(例如，是)本文另外描述的聚合物(例如，非氟化聚合物)。
本文所述的袋可以以多种体积提供。尽管没有特别限制，内部隔室的体积可以在例如5mL至3500mL的范围内，例如从10mL到500mL，或从10mL到100mL，或从100mL到3000mL，或从500mL到2500mL，或从500mL到2000mL。但是如本领域普通技术人员应理解的，也可以考虑不同体积的袋。
本文所述的袋有利地被配置为允许培养基通过在第一端口和第二端口之间流动而灌注通过内部体积的相当大部分。
例如，在包括第一管和第二管的袋的各种期望的实施方案中，类似于如上所述的图1中的袋，第一管与袋的第一侧向边缘相邻地设置，并且第二管与袋的第二相对侧向边缘相邻地设置；在各种实施方案中，每个管都在袋的侧向边缘的2cm内。例如，在图1的实施方案中，第一管170与第一侧向边缘134相邻地设置，并且第二管180与第二侧向边缘136相邻地设置，第二侧向边缘位于袋的与第一侧向边缘134相对的一侧。这些管可以例如基本上彼此平行，例如彼此在20度以内或者甚至在10度以内。在某些期望的实施方案中，第一管和第二管沿袋的长轴的方向延伸。例如，在图1的实施方案中，第一管170和第二管180沿袋的长轴132的方向延伸。当然，在其他实施方案中，管可以以任何合适的方式布置。例如，在各种实施方案中，第一管和第二管是弯曲的，并且沿圆形袋的侧向边缘延伸。
当然，在其他实施方案中，不包括管。在各种实施方案中，过滤器可以设置在第一端口和第二端口中的一者或多者处，并被配置为过滤通过其离开袋的培养基。过滤器可被配置为允许细胞通过，但阻止微载体从袋外通过。
第一端口、第二端口和第三端口(如果存在的话)可位于沿袋的多个位置处。例如，在各种实施方案中，第一端口和第二端口形成在袋的边缘，例如正交于管延伸到袋中的方向延伸的边缘。其可以位于与如图1的袋中所示的相同边缘，或位于相对的边缘。在包括如图1中所示的管的实施方案中，这允许第一端口和第二端口的相对位置便于第一液体可渗透管和第二液体可渗透管沿共同的方向(例如，沿着袋的长轴)延伸。第三端口可以例如沿与第一端口和第二端口中的一者或两者相同的边缘形成；在图1的实施方案中，端口140、150和160沿共同的边缘。但是第三端口能够替代地沿与形成第一端口和第二端口的边缘正交的边缘，或替代地沿袋的另一表面(例如沿底部表面)，以允许细胞的重力辅助移除。端口的位置没有特别限制，只要第一端口和第二端口(以及与其联接的第一管和第二管)的相对位置便于通过袋的大部分体积进行灌注。本领域普通技术人员将基于本公开布置第一端口和第二端口以及任何结构(诸如第一管和第二管)，例如，以最小化袋内灌注流中的死点，以及/或者确保灌注流不干扰细胞生长。当存在时，第三端口可以被定位成例如便于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入袋的内部体积。
为了形成本文所述的袋，一个或多个聚合物膜的边缘可以通过任何期望的方法(诸如RF焊接、热脉冲焊接、超声焊接、热棒焊接、化学粘合、粘合剂粘合、热熔粘合、溶剂焊接、激光焊接、电晕放电、辐射、表面处理、极热、带式或熔融层合、蚀刻、等离子体处理、挤出、润湿、粘合剂或它们的组合)粘结(例如，粘结到相同聚合物膜的其他边缘，或在多于一个聚合物膜的情况下彼此粘结)。在某些期望的实施方案中，一个或多个膜通过热焊接、激光焊接或热棒焊接来粘结。
当存在时，第一管和第二管能够通过套环密封过程(例如，通过RF焊接、超声焊接、热脉冲焊接、热棒焊接、化学粘合、粘合剂粘合、热熔粘合、溶剂焊接、激光焊接、电晕放电、辐射、极热或熔融层合、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂或它们的组合)附接到形成在袋的一个或多个边缘中的相应的第一端口和第二端口。这可以在形成袋的时候完成。第一管能够被密封(例如，通过套环密封)，使得它的外过滤层可以防止细胞从内部隔室通过管传输出第一端口。因此，第一管和/或第二管能够从袋的外部延伸到袋的内部(其多孔部分有利地基本上仅在袋中延伸)。当然，在其他实施方案中，第一管和/或第二管能够在袋处终止，并且通过其他管材连接到流体系统；此类其他管材可以由与本文所述的用于第一液体可渗透管和第二液体可渗透管的相同材料制成。
如上所述，在各种实施方案中，第一管(例如，图1的管170)包括限定管的中心管腔的第一内支撑结构和围绕该第一内支撑结构的第一外过滤层。如本文详细描述的，第一内支撑结构可以采取多种形式，例如穿孔的或其他多孔的管、框架或螺旋缠绕的长丝。支撑结构的横截面可以是圆形的，如本文的附图中所示，或可以具有其他横截面形状，例如多边形。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，支撑结构和外过滤层的材料是亲水的、自润湿的和/或具有足够的孔隙率，使得可以用最小的压力启动或维持液体流过管。
此类液体可渗透管的实施方案在图3中以剖面图示出。图3的管300包括螺旋缠绕的长丝372和围绕该长丝的外过滤层374。外过滤层374至少在端口(例如，图1的端口140)处附接到螺旋缠绕的长丝372，但是能够在沿长丝的一个或多个另外的点处附接到螺旋缠绕的长丝372。外过滤层可以相对松散地围绕螺旋缠绕的长丝(例如，作为长丝372上的松散的袋)，或者可以更紧密地抵靠螺旋缠绕的长丝设置(例如，作为长丝372上的紧密配合的套筒)。
因此，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一内支撑结构包括螺旋缠绕的长丝。长丝可以是相对刚性的或相对柔性的并且可以相对紧密或相对松散地缠绕，当然，前提是该长丝限定了管的中心管腔并且可以支撑第一外过滤层。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，长丝包括(例如，是)水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物。在如本文另外描述的各种实施方案中，长丝包含含氟聚合物、聚甲基戊烯或它们的组合(例如，由其形成)(例如，具有小于0.1mg/cm2的水中总有机碳)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，螺旋缠绕的长丝的间距(即，沿中心管腔的轴线)约等于或者甚至大于多个微载体的平均尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，螺旋缠绕的长丝的间距为至少500μm，或在500μm至10mm、或500μm至7.5mm、或500μm至5mm的范围内。本发明人已确定，间距大于100μm的管能够有利地便于培养基以所需流速灌注，而不会明显干扰锚定的细胞和/或减少所容纳的微载体的数量。
在如本文另外描述的其他实施方案中，支撑结构可以作为框架提供，例如由丝状材料形成，但是以不同于螺旋的方式布置。长丝和长丝的间距可以与如上所述的螺旋缠绕的长丝相同。
在如本文另外提供的其他实施方案中，支撑结构可以是多孔管的形式。一个此类实施方案(例如，用作图1的管170)在图4中以剖面图示出。图4的管470包括多孔管472和围绕该多孔管的外过滤层474。外过滤层至少在端口(例如，图1的端口140)处附接到多孔管，但是可以在沿管的一个或多个另外的点处附接到多孔管。外过滤层可以相对松散地围绕多孔管(例如，作为多孔管472上的袋)，或者可以更紧密地抵靠多孔管设置(例如，作为多孔管472上的套筒)。
因此，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一内支撑结构包括第一多孔管。该管可以是相对柔性的或相对刚性的，当然，前提是该管可以支撑第一外过滤层。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，多孔管包含水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物(例如，由其形成)。在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管包含弹性体、含氟聚合物、聚甲基戊烯或它们的组合(例如，由其形成)(例如，具有小于0.1mg/cm2的水中总有机碳)。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，多孔管包含硅氧烷或聚氯乙烯(例如，由其形成)(例如，具有小于0.1mg/cm2的水中总有机碳)。例如，在某些此类实施方案中，多孔管包含硅氧烷弹性体。在另一示例中，在某些此类实施方案中，多孔管包含氟化乙烯丙烯。但是也可以使用多种氟化和非氟化聚合物，以及其他合适的材料。
在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管具有在100μm至5,000μm的范围内的平均孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管的平均孔尺寸为100μm至2500μm、或100μm至1000μm、或250μm至5000μm、或250μm至2500μm、或250μm至1000μm、或500μm至5000μm、或500μm至2500μm或500μm至1000μm。如本文所用，在孔太小而无法方便地进行光学测量的情况下，经由毛细管流动孔测定法测量平均孔尺寸。本领域普通技术人员将会认识到，在10μm至5,000μm范围内的孔尺寸可以约等于或大于大多数微载体的尺寸。然而，本发明人已确定多孔管可有利地便于培养基以期望的流速灌注，而不会明显干扰锚定的细胞和/或减少所容纳的微载体的数量，特别是当与外过滤层一起使用时。
多孔管可具有宽范围内的孔隙率；本领域普通技术人员将选择提供期望的机械稳定性和流速组合的孔隙率。在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管具有在10％至90％的范围内的孔隙率。本领域普通技术人员应理解的是，孔隙率是制品中孔的体积相对于材料总体积的度量，能够通过多种已知的孔隙率测定法来测量；如本文所用，在孔太小而无法方便地进行光学测量的情况下，使用水蒸发来测量管的孔隙率。在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管的孔隙率在20％至90％、或30％至90％、或40％至90％、或50％至90％、或10％至80％、或10％至70％、或10％至60％、或10％至50％、或20％至80％、或30％至70％或40％至60％的范围内。
多孔管的孔隙率能够通过多种本领域公认的方法中的任一种方法来提供，例如，模制、热穿孔、激光钻孔、电子束钻孔、放电加工、机械钻孔、冲压或切割。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第一多孔管的大部分孔隙位于与第二液体可渗透管相对的表面(例如，半圆柱形表面)上。有利地是，本发明人已经确定，管的孔隙率在远离第二液体可渗透管的取向上可以进一步最小化由从第二液体可渗透管到第一液体可渗透管的培养基灌注所影响的对培养的细胞的干扰和/或微载体的减少。因此，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一多孔管的至少65％、或至少75％、或至少85％或至少90％的孔隙位于与第二液体可渗透管相对的表面(例如，半圆柱形表面)上。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第一多孔管的孔隙沿液体可渗透管的中心管腔的轴线相对均匀地分布，即，便于沿袋的长轴均匀灌注。
如上所述，第一管可以包括设置在第一内支撑结构周围的第一外过滤层。第一外过滤层由多孔材料形成，该多孔材料的平均孔尺寸被选择为有助于防止微载体在灌注期间从袋中逸出。在各种实施方案中，平均孔尺寸选择为小于袋中所容纳的微载体的平均尺寸。在如本文另外描述的各种实施方案中，第一外过滤层具有小于200μm，例如小于150μm的平均孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一外过滤层的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。本领域普通技术人员将认识到，200μm或更小的孔尺寸可约等于或小于大多数微载体——令人惊讶地，本发明人已确定外过滤层(例如，相对于培养的细胞具有小的官能孔尺寸)和内支持结构(例如，相对于培养的细胞具有大的官能孔尺寸或间距)的组合可便于培养基以期望的流速灌注，而不会明显干扰锚定的细胞和/或减少所容纳的微载体的数量。但即使当过滤器孔尺寸一定程度地大于微载体尺寸时，过滤器也能有效防止灌注期间微载体从内部体积中显著损失。
在某些期望的实施方案中，第一外过滤层的平均孔尺寸和/或D99孔尺寸小于袋中所容纳的微载体的平均直径的约100％，例如小于约75％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％或小于约25％。
本领域普通技术人员应理解的是，过滤层的“官能”孔尺寸取决于该层中孔的平均尺寸和最大尺寸两者。因此，在如本文中另外描述的某些期望的实施方案中，过滤层的D99孔尺寸(即，处于尺寸的第99百分位的孔的尺寸)与过滤层的平均孔尺寸相差至多100％，例如至多50％、至多30％或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，过滤层的D99孔尺寸小于500μm，例如小于250μm、或小于200μm或小于150μm。
然而，如本领域普通技术人员应理解的，第一外过滤层的小平均孔尺寸会减缓通过袋的流速。因此，本领域普通技术人员可选择足够小的孔尺寸以提供期望的微载体的过滤，但又足够大以提供期望的通过袋的流速。例如，在如本文中另外描述的某些期望的实施方案中，袋中所容纳的微载体具有100μm至400μm的平均直径，并且第一外过滤层的平均孔尺寸为10μm至200μm(例如，并且小于微载体的平均直径)。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第一外过滤层包含水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物(例如，由其形成)。在如本文另外描述的各种实施方案中，第一外过滤层包含聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。在如本文另外描述的各种实施方案中，第一外过滤层包含不锈钢。在某些此类实施方案中，第一外过滤层包含聚合物涂覆的不锈钢(例如，聚四氟乙烯涂覆的不锈钢)。
然而，在如本文另外描述的袋的其他实施方案中，第一管不包括与支撑结构分离的过滤层，而是具有如本文针对第一外过滤层描述的平均孔尺寸的管。这可以例如通过将多孔膜材料形成为管(例如，通过焊接)或通过提供具有期望孔尺寸的刚性管状材料来实现。在如本文另外描述的各种实施方案中，第一管具有小于200μm，例如小于150μm的平均孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一管的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。在某些期望的实施方案中，第一管的平均孔尺寸和/或D99孔尺寸小于袋中所容纳的微载体平均直径的约100％，例如，小于约75％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％或小于约25％，例如，如上文关于第一外过滤层所描述的。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第一管的D99孔尺寸(即，处于尺寸的第99百分位的孔的尺寸)与管的平均孔尺寸相差至多50％，例如，至多30％或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第一管的D99孔尺寸小于50μm，例如小于20μm。在如本文另外描述的各种实施方案中，第一管具有小于10μm的D99孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一管的D99孔尺寸小于500μm，例如小于250μm、或小于200μm或小于150μm。在某些期望的实施方案中，第一管是刚性的，即，足够刚性以在没有流过其中的流体的压力的情况下维持其横截面形状。
由于第二液体可渗透管(例如，图1的管180)通常用于将培养基输入袋的内部隔室，在许多实施方案中，它不需要过滤层。因此，在各种实施方案中，第二液体可渗透管可以是如上所述的第一液体可渗透管的多孔管支撑结构，而没有外过滤层。第二液体可渗透管可采取多种其他管状结构。
然而，在如本文另外描述的其他实施方案中，第二液体可渗透管包括限定管的中心管腔的第二内支撑结构和围绕该第二内支撑结构的第二外过滤层。并且在其他实施方案中，第二液体可渗透管是平均孔尺寸不超过200μm的管。在此类实施方案中，第二液体可渗透管可以是在本文的任何实施方案中针对第一液体可渗透管所描述的那样。有利地是，此类袋允许如上所述的培养基流动——从第二管，通过内部体积，并且流出第一管——以及相反。本发明人已经确定，通过在此类实施方案中反转灌注方向，细胞可以从第一外过滤层中清除，但是保留在内部隔室中。当然，此类“双向”袋也能够便于用户更方便地设置和操作。在某些期望的实施方案中，第二液体可渗透管的内支撑结构和外过滤层如本文关于第一液体可渗透管的任何实施方案所描述的。在各种实施方案中，如图3和图4中所示的结构可以用作第二液体可渗透管。
例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第二内支撑结构包括螺旋缠绕的长丝(例如，如上所述的螺旋缠绕的长丝)。在某些此类实施方案中，第一液体可渗透管的第一内支撑结构也包括螺旋缠绕的长丝。类似地，在如本文另外描述的某些其他实施方案中，第二内支撑结构包括框架结构。在某些此类实施方案中，第一液体可渗透管的第一内支撑结构也包括框架结构。
在另一示例中，在如本文另外描述的各种实施方案中，第二内支撑结构包括多孔管(例如，如上所述的多孔管)。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第一内支撑结构包括第一多孔管并且第二内支撑结构包括第二多孔管。在某些此类实施方案中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)具有在100μm至2500μm、或100μm至1000μm、或250μm至5000μm、或250μm至2500μm、或250μm至1000μm、或500μm至5000μm、或500μm至2500μm或500μm至1000μm的范围内的官能孔尺寸。在某些此类实施方案中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)具有在10％至90％、或20％至80％或30％至70％的范围内的孔隙率。在某些此类实施方案中，第二多孔管的至少60％、或至少75％或至少90％的孔隙位于与第一液体可渗透管相对的表面(例如，半圆柱形表面)上(例如，并且第一多孔管的至少60％、或至少75％或至少90％的孔隙位于与第二液体可渗透管相对的表面(例如，半圆柱形表面)上)。在各种实施方案中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)包含硅氧烷弹性体。在各种实施方案中，第二外过滤层(例如，和第一外过滤层)具有小于200μm，例如小于150μm的平均孔尺寸。在如本文另外描述的各种实施方案中，第二外过滤层的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。在各种实施方案中，第二外过滤层(例如，和第一外过滤层)包含不锈钢、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。
并且在其他实施方案中，第二液体可渗透管是不包括第二支撑结构和第二外过滤层的管，而是具有如本文针对第二外过滤层所描述的孔尺寸的管的形式。这可以例如通过将多孔膜材料形成为管(例如，通过焊接)或通过提供具有期望孔尺寸的刚性管状材料来实现。在如本文另外描述的各种实施方案中，第二管具有小于200μm，例如小于150μm的平均孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，第二管的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。在某些期望的实施方案中，第二管的平均孔尺寸和/或D99孔尺寸小于袋中所容纳的微载体平均直径的约100％，例如，小于约75％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％或小于约25％，例如，如上文关于第一外过滤层所描述的。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，第二管的D99孔尺寸(即，处于尺寸的第99百分位的孔的尺寸)与第二管的平均孔尺寸相差至多50％，例如，至多30％或至多10％。在某些期望的实施方案中，第二管是刚性的，即，足够刚性以在没有流过其中的流体的压力的情况下维持其横截面形状。
在第二液体可渗透管被第二过滤层覆盖或具有如上所述的小孔尺寸的情况下，可能期望存在第三端口，以简化将细胞引入袋的内部体积和/或从袋的内部体积移除细胞。
如上所述，本发明人设想第一端口和/或第二端口处的过滤可以由不同于本文提供的管状结构来提供。例如，过滤器可以操作地联接到第一端口，和/或过滤器可以操作地联接到第二端口。在其他示例中，过滤器可以插入连接器中，该连接器用于将端口连接到细胞培养体系的其他部分。这些过滤器通常可以具有与如上所述的过滤器相同的特性。例如，在各种实施方案中，平均孔尺寸选择为小于袋中所容纳的微载体的平均尺寸。在如本文另外描述的各种实施方案中，过滤器具有小于200μm，例如小于150μm的平均孔尺寸。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，过滤器的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。本领域普通技术人员将认识到，200μm或更小的孔尺寸可约等于或小于大多数微载体——但即使当过滤器孔尺寸一定程度地大于微载体尺寸时，过滤器也能有效防止灌注期间微载体从内部体积中显著损失。在某些期望的实施方案中，过滤器的平均孔尺寸和/或D99孔尺寸小于袋中所容纳的微载体的平均直径的约100％，例如小于约75％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％或小于约25％。本领域普通技术人员应理解的是，过滤器的“官能”孔尺寸取决于层中孔的平均尺寸和最大尺寸两者。因此，在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，过滤器的D99孔尺寸(即，处于尺寸的第99百分位的孔的尺寸)与过滤器的平均孔尺寸相差至多100％，例如至多50％、至多30％或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，过滤器的D99孔尺寸小于500μm，例如小于250μm、或小于200μm或小于150μm。然而，如本领域普通技术人员应理解的，过滤器的小平均孔尺寸会减缓通过袋的流速。因此，本领域普通技术人员可选择足够小的孔尺寸以提供期望的微载体的过滤，但又足够大以提供期望的通过袋的流速。例如，在本文中另外描述的各种期望的实施方案中，袋中所容纳的微载体具有100μm至400μm的平均直径，并且过滤器的平均孔尺寸为50μm至200μm(例如，并且小于微载体的平均直径)。
如上所述，本发明人已确定本文所述的袋可用于通过微载体细胞培养物灌注培养基。因此，本公开的另一方面是一种用于培养细胞的方法，该方法包括提供如本文另外描述的袋(例如，图1的袋100)，包含在内部隔室(例如，内部隔室130)中的培养基和细胞(例如，如本文另外描述的)，和经由通过第二端口(例如，端口150)(和通过第二液体可渗透管(例如，管180))添加培养基而使培养基流过内部隔室，并且从第一端口(例如，端口140)(如果存在的话，经由第一液体可渗透管(例如，管170))移除培养基。在各种此类实施方案中，在内部隔室中包含培养基和细胞的袋可以通过经由形成在袋的外部表面中并且与袋的内部隔室流体连通的第三端口(例如，端口160)向袋中添加培养基和细胞来提供。然而，在其他实施方案中，特别是当不存在第三端口时，第一端口或第二端口可用于允许培养基和细胞进入袋中。可以使用多种流速，例如，在0.5mL/min至20mL/min的范围内；流速有利地足够低以允许微载体保持悬浮在培养基中。当然，在正常操作过程中，流速可以是变化的，或者甚至可以是不连续的(例如，附带地，或者基于细胞活性)。因此，在另一示例中，流速可以在每天0.2袋体积替换/天至2袋体积替换/天的范围内。在灌注期间，袋可以保持在期望的温育温度，并且可以摇动或以其他方式搅动。
在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法包括在温育期(例如，足以将微载体粘附的细胞的数量增加到期望的第一水平)后，向袋中添加另外的多个微载体(例如，以增加能够用于培养的细胞的粘附底物的总面积)。在各种实施方案中，该另外的多个微载体(例如，包括如本文中另外描述的微载体)通过袋的外部表面中的第三端口并且与袋的内部隔室流体连通(例如，端口160)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法还包括从微载体分离培养的细胞(例如，在微载体粘附的细胞的数量增加到期望的最终水平之后)并且然后从袋的内部隔室移除培养的细胞。如本领域普通技术人员应理解的，用于将贴壁细胞与微载体分离的方法是本领域已知的。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，从微载体中分离培养的细胞包括向补料培养基中添加胰蛋白酶(例如，流过第二端口)。
本发明人注意到，有利地，培养的细胞可以通过第一端口(例如，端口140)(如果存在的话，通过第一液体可渗透管(例如，管170))从袋的内部隔室移除，而微载体例如通过操作地联接到第一端口的过滤器保留在内部隔室中，该过滤器可以是设置在第一管、第一多孔管或一些其他过滤器周围的第一外过滤层。
然而，本发明人注意到，在本公开的体系和方法中不需要相对于第一端口或第二端口操作地联接的过滤器。在一些实施方案中，可以控制流动以避免将相当大部分微载体推出袋外。然而，在其他实施方案中，可以使用多孔膜将连通第一端口和第二端口的内部隔室的体积与其中放置微载体的内部隔室的体积分离。即使当膜的孔尺寸一定程度地大于微载体的尺寸时，膜也能够允许隔室之间的培养基交换，而不允许第一端口和第二端口之间的流动干扰和带走微载体。
因此，在另一示例中，本文所述的袋可以包括灌注膜。在如本文另外描述的各种实施方案中，该袋包括将内部隔室的第一部分与该内部隔室的第二部分分离的第一多孔膜，该第二部分容纳多个微载体，以及在袋的外部表面中形成的第三端口。在此类实施方案中，第一端口和第二端口各自与内部隔室的第一部分流体连通，并且第三端口与内部隔室的第二部分流体连通。本发明人注意到，有利地，可以通过袋的内部隔室的第一部分灌注补料培养基，而不会明显干扰锚定的细胞和/或减少内部隔室的第二部分中所容纳的微载体的数量。本发明人注意到，有利地，通过使培养基流过第一端口和第二端口之间的内部体积，可以通过袋的内部隔室灌注补料培养基，而不会明显干扰锚定细胞和/或减少所容纳的微载体的数量。分隔内部隔室的多孔膜能够防止微载体逸出内部隔室的第二部分。因此，贴壁依赖性细胞可以在第二部分中生长和浓缩，而没有补料培养基供应限制和/或废物移除限制。第三端口能够用于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入内部隔室的第二部分。此外，本发明人注意到，有利地，在细胞培养过程之后，培养的细胞可以从微载体上分离并且通过多孔膜(即，其将微载体保留在内部隔室中)从袋中移除。在另一实施方案中，第三端口可以具有如上文关于第一端口和第二端口所描述的操作地联接到其上的过滤器，该过滤器可以允许在不从袋中移除微载体的情况下收获细胞。
在图5的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)中示出了此类袋的实施方案。图5的袋500包括第一聚合物膜510和第二聚合物膜520，它们在其边缘处粘结在一起以形成围绕内部隔室的边缘，内部隔室被多孔膜530分成第一部分540和第二部分550。袋500还包括第一端口560和第二端口570，每个端口与内部隔室的第一部分540流体连通，和与内部隔室的第二部分550流体连通的第三端口580。
该袋有利地被配置为允许培养基通过在第一端口和第二端口之间流动而灌注通过相当大部分的内部体积。本领域普通技术人员将基于本公开布置第一端口和第二端口，例如，以最小化袋内灌注流中的死点，以及/或确保灌注流不干扰细胞生长。第三端口能够被定位成例如便于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入袋的第二部分。
在另一示例中(未示出)，袋包括延伸到第一部分中并且与第一部分流体连通的第一液体可渗透管(例如，如本文中另外描述的)，该第一液体可渗透管操作地联接到第一端口，以及延伸到第一部分中并且与第一部分流体连通的第二液体可渗透管(例如，如本文中另外描述的)，该第二液体可渗透管操作地联接到第二端口。在某些此类实施方案中，例如，管可以基本上彼此平行并且与袋的相对边缘相邻地设置(例如，增加流动培养基在多孔膜上的分布)。
在图5的实施方案中，内部隔室被分成由第一聚合物膜510和多孔膜520界定的第一部分540和由第二聚合物膜520和多孔膜530界定的第二部分550。当然，内部隔室不需要如此均匀地分隔。例如，在图6的实施方案中，袋600包括第一聚合物膜610和第二聚合物膜620，它们在其边缘处粘结在一起以形成围绕内部隔室的边缘；和多孔膜630，其具有粘结到第二聚合物膜620的边缘，将内部隔室分成第一部分640和第二部分650。在另一示例中，在图7的实施方案中，袋包括第一聚合物膜710和第二聚合物膜720，它们在其边缘处粘结在一起以形成围绕内部隔室的边缘，和多孔膜730，该多孔膜翻折并且在其边缘处粘结以将内部隔室分成第一部分740和第二部分750。在此类实施方案中，本领域普通技术人员能够将本文所述的第一端口、第二端口和第三端口定位成例如用于最小化袋内灌注流中的死点、确保灌注流不干扰细胞生长、便于将细胞和/或微载体引入袋的第二部分、以及/或者在袋中提供流体采样或监测的期望位置。
在仍另一示例中，在如本文另外描述的各种实施方案中，袋包括将内部隔室的第一部分与内部隔室的中心部分分离的第一多孔膜、将内部隔室的第二部分与内部隔室的中心部分分离的第二多孔膜，该中心部分容纳微载体，以及在袋的外部表面中形成的第三端口。在此类实施方案中，第一端口与内部隔室的第一部分流体连通，第二端口与内部隔室的第二部分流体连通，并且第三端口与内部隔室的中心部分流体连通。本发明人注意到，有利地，可以通过袋的内部隔室的中心部分灌注补料培养基，而不会明显干扰锚定的细胞和/或减少内部隔室的中心部分中所容纳的微载体的数量。本发明人注意到，有利地，通过使培养基从第二管中流出，经过内部体积，并且流出第一管，可以通过袋的内部隔室灌注补料培养基，而不会明显干扰锚定细胞和/或减少所容纳的微载体的数量。分隔内部隔室的多孔膜能够防止微载体逸出内部隔室的中心部分。因此，贴壁依赖性细胞可以在中心部分中生长和浓缩，而没有补料培养基供应限制和/或废物移除限制。第三端口能够用于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入内部隔室的中心部分。此外，本发明人注意到，有利地，在细胞培养过程之后，培养的细胞可以从微载体上分离并且通过多孔膜(即，其将微载体保留在中心隔室中)从袋中移除。
在图8的示意性俯视图中示出了此类袋的实施方案。图8的袋800包括第一聚合物膜810和第二聚合物膜(未示出)，它们在其边缘处粘结在一起以形成围绕内部隔室的边缘，内部隔室被第一多孔膜820分成第一侧向部分840和中心部分850，并且被第二多孔膜830分成第二侧向部分860和中心部分850。袋800还包括与内部隔室的第一侧向部分840流体连通的第一端口870、与第二侧向部分860流体连通的第二端口880和与内部隔室的中心部分850流体连通的第三端口890。
该袋有利地被配置为允许通过从第二端口流向第一端口来灌注培养基通过相当大部分的内部体积。本领域普通技术人员将基于本公开布置第一端口和第二端口，例如，以最小化袋内灌注流中的死点，以及/或者确保灌注流不干扰细胞生长。第三端口可以被定位成例如用于对培养基进行采样以及将细胞和/或微载体引入袋的中心部分。
为了形成包括一个或多个分隔内部隔室的膜的袋，一个或多个聚合物膜和一个或多个多孔膜的边缘可以通过任何期望的方法粘结，诸如RF焊接、热脉冲焊接、超声焊接、热棒焊接、化学粘合、粘合剂粘合、热熔粘合、溶剂焊接、激光焊接、电晕放电、辐射、表面处理、极热、带或熔融层合、蚀刻、等离子体处理、挤出、润湿、粘合剂或它们的组合。在某些期望的实施方案中，聚合物膜通过热焊接、激光焊接或热棒焊接而粘结在一起。
在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜包含水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物(例如，由其形成)。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜各自单独基本上包含含氟聚合物，例如至少80重量％、或至少85重量％、或至少90重量％、或至少95重量％、或至少97.5重量％、或至少98重量％或至少99重量％的含氟聚合物(例如，如上文关于一个或多个聚合物膜的内层所描述的)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜各自单独包含选自以下的一种或多种含氟聚合物：乙烯-丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物(HTE)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯共聚物、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(ETFE)、四氟乙烯/丙烯共聚物(TFE/P)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(FEP/HFP)、六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(THV)和具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均环聚合物。在某些期望的实施方案中，该一个或多个多孔膜各自单独包含至少80重量％(例如，至少90重量％或至少95重量％)的氟化乙烯-丙烯。
在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜各自单独包含聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜包含不锈钢。在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜包含含氟聚合物涂覆的底物。例如，在某些此类实施方案中，一个或多个多孔膜包含含氟聚合物涂覆的不锈钢(例如，聚四氟乙烯涂覆的不锈钢)。
在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜(例如，基本上包含含氟聚合物)各自单独具有0.001mm至0.7mm，例如，0.001mm至0.4mm、或0.001mm至0.1mm、或0.005mm至0.7mm、或0.005mm至0.4mm、或0.005mm至0.1mm、或0.01mm至7mm、或0.01mm至0.4mm或0.01mm至0.1mm的厚度。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜各自单独包含至少95重量％的氟化乙烯-丙烯，并且具有0.01mm至0.1mm的厚度。
在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜各自具有被选择为帮助防止微载体在灌注期间逸出第二部分或中心部分的平均孔尺寸。在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜的平均孔尺寸小于200μm，例如小于150μm。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜的平均孔尺寸为10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm。
在某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜的平均孔尺寸和/或D99孔尺寸小于袋中所容纳的微载体的平均直径的约100％，例如小于约75％、或小于约50％、或小于约40％、或小于约30％或小于约25％。
一个或多个多孔膜可具有宽范围内的孔隙率；本领域普通技术人员将选择提供期望的机械稳定性和流速组合的孔隙率。在如本文另外描述的各种实施方案中，一个或多个多孔膜各自单独具有在10％至90％的范围内的孔隙率。在如本文另外描述的各种实施方案中，多孔管的孔隙率在20％至90％、或30％至90％、或40％至90％、或50％至90％、或10％至80％、或10％至70％、或10％至60％、或10％至50％、或20％至80％、或30％至70％或40％至60％的范围内。
多孔膜的孔隙率能够通过多种本领域公认的方法中的任一种方法来提供，例如，模制、热穿孔、激光钻孔、电子束钻孔、放电加工、机械钻孔、冲压或切割。
本领域普通技术人员应理解的是，多孔膜的“官能”孔尺寸取决于膜中孔的平均尺寸和最大尺寸两者。因此，在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜的D99孔尺寸(即，处于尺寸的第99百分位的孔的尺寸)与一个或多个多孔膜的平均孔尺寸相差至多100％，例如至多50％、至多30％或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施方案中，一个或多个多孔膜的D99孔尺寸小于500μm，例如小于250μm、或小于200μm或小于150μm。
然而，如本领域普通技术人员应理解的，一个或多个多孔膜的小平均孔尺寸会减缓通过袋的流速和/或减缓通过其灌注培养基的内部隔室的部分和其中放置微载体的内部隔室的部分之间的交换。因此，本领域普通技术人员可选择足够小的孔尺寸以提供期望的微载体的过滤，但又足够大以提供期望的通过袋的流速。例如，在如本文中另外描述的某些期望的实施方案中，袋中所容纳的微载体具有100μm至400μm的平均直径，并且一个或多个多孔膜的平均孔尺寸为50μm至200μm(例如，并且小于微载体的平均直径)。但在其他实施方案(例如，与图5至图7的实施方案类似的实施方案)中，一个或多个多孔膜的平均孔尺寸可以一定程度地大于微载体的平均直径。在此类情况下，膜仍然能够防止相当大部分的微载体逸出。
如上所述，本发明人已确定本文所述的袋可用于通过细胞培养物灌注培养基。因此，本公开的另一方面是一种用于培养细胞的方法，该方法包括在如本文中另外描述的袋(例如，图5的袋500或图8的袋800)的内部隔室中提供贴壁依赖性细胞和培养基以及微载体，并且使培养基流过第一端口和第二端口之间的内部隔室。在过滤器操作地联接到第一端口的情况下，流动可以是例如从第二端口到第一端口。在一个或多个膜将内部隔室分成多个隔室的情况下，第三端口可以于允许微载体进入袋中；细胞和培养基也可以通过第三端口添加。
可以使用多种流速，例如，在0.5mL/min至20mL/min的范围内；流速有利地足够低以允许微载体保持悬浮在培养基中。当然，在正常操作过程中，流速可以是变化的，或者甚至可以是不连续的(例如，附带地，或者基于细胞活性)。因此，在另一示例中，流速可以在每天0.2袋体积替换/天至2袋体积替换/天的范围内。在灌注期间，袋可以保持在期望的温育温度，并且可以摇动或以其他方式搅动。
在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法包括在温育期(例如，足以将微载体粘附的细胞的数量增加到期望的第一水平)后，向袋中添加另外的多个微载体(例如，以增加能够用于培养的细胞的粘附底物的总面积)。在各种实施方案中，该另外的多个微载体(例如，包括如本文中另外描述的微载体)通过第三端口，或者在其中过滤器操作地联接到第一端口的实施方案中，通过第二端口。
在如本文另外描述的各种实施方案中，该方法还包括从微载体分离培养的细胞(例如，在微载体粘附的细胞的数量增加到期望的最终水平之后)并且然后从袋的内部隔室移除培养的细胞。如本领域普通技术人员应理解的，用于将贴壁细胞与微载体分离的方法是本领域已知的。例如，在如本文另外描述的各种实施方案中，从微载体中分离培养的细胞包括向补料培养基中添加胰蛋白酶(例如，流过第二端口)。
本发明人注意到，有利地是，培养的细胞能够从袋的内部隔室中移除，使用过滤器或多孔膜来防止显著量的微载体从袋中流出。也就是说，微载体通过多孔膜或过滤器保留在内部隔室中。
实施例
在一个实施例中，氧气和二氧化碳可渗透的袋A由聚合物膜形成，该聚合物膜包括氟化乙烯-丙烯内层和硅橡胶外层。袋A和对比的可商购获得的含氟聚合物袋C在类似的标准条件下(121℃下30分钟，然后干燥60分钟)在高压釜中灭菌。如图9所示，袋C显著收缩(在膜挤出“加工方向”(如图所示的竖直方向)上收缩2％至5％；膜挤出“横向方向”上收缩1％至3％，如图所示的水平方向)，导致袋的内表面变得明显起皱。相比之下，如图10中所示，袋A保持期望的平滑。
将聚苯乙烯微载体、培养基和贴壁细胞添加到灭菌袋中，然后将灭菌袋在摇动设备上温育。在初始温育期后，微载体分布在袋A的整个体积中比在袋C中更均匀(这显示在袋的内表面的褶皱之间微载体的显著“汇集”)。并且来自袋A(即，从微载体分离后)的培养的细胞的总产量(每培养体积)显著高于袋C。不受理论的约束，本发明人注意到袋A中的微载体(以及相应的粘附细胞)可能比袋C中的微载体(以及相应的粘附细胞)受到显著更小的剪切力和碰撞力，其中微载体能够与袋C的表面中的褶皱碰撞，并且能够以比袋A中均匀分布的微载体显著更高的速率与其他“汇集”的微载体碰撞。
本公开的另外的方面由以下非限制性枚举的实施方案提供，这些实施方案能够在技术上或逻辑上一致的情况下以任何数量和任意组合进行组合。
实施方案1.一种氧气可渗透袋，该氧气可渗透袋包括
一个或多个聚合物膜，所述一个或多个聚合物膜限定该袋的内部隔室的边界，该一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括
与该袋的该内部隔室相邻的内层，该内层包含含氟聚合物；
以及
附着到该内层的外层，该外层包含聚合物；
第一端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；
第二端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；以及
多个微载体，其容纳在该内部隔室中。
实施方案2.根据实施方案1所述的袋，其中该氧气可渗透袋是包括以下的氧气可渗透袋：
一个或多个聚合物膜，所述一个或多个聚合物膜的边缘粘结在一起以形成该袋的内部隔室，该一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括与该袋的该内部隔室相邻的内层以及附着到该内层的外层，该内
层包含含氟聚合物，该外层包含聚合物；
第一端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连通；
第二端口，其形成在该袋的外部表面中并且与该内部隔室流体连
通；以及
多个微载体，其容纳在该内部隔室中。
实施方案3.根据实施方案1至2中任一项所述的袋，其中内层包含以下中的一者或多者：氟化乙烯-丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物(HTE)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯共聚物、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(ETFE)、四氟乙烯/丙烯共聚物(TFE/P)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(FEP/HFP)、六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(THV)或具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均环聚合物。
实施方案4.根据实施方案1至2中任一项所述的袋，其中该内层包含氟化乙烯-丙烯。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的袋，其中该内层具有0.001mm至0.7mm(例如，0.01mm至0.1mm)的厚度。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的袋，其中该外层包含弹性体。
实施方案7.根据实施方案1至5中任一项所述的袋，其中该外层包含以下中的一者或多者：天然聚异戊二烯橡胶(NR)、合成聚异戊二烯橡胶(IR)、聚丁二烯橡胶(BR)、氯丁二烯橡胶(CR)、丁基橡胶(IIR)、卤化丁基橡胶(CIIR、BIIR)、苯乙烯-丁二烯橡胶(SBR)、丁腈橡胶(NBR)和氢化丁腈橡胶(HNBR)、乙丙橡胶(EPM)、三元乙丙橡胶(EPDM)、表氯醇橡胶(ECO)、聚丙烯酸橡胶(ACM、ABR)、硅橡胶(SI、Q、VMQ)、氟硅橡胶(FSR、FVMQ)、含氟弹性体(FKM、FEPM)、全氟弹性体(FFKM)、聚醚嵌段酰胺(PEBA)、氯磺化聚乙烯(CSM)、乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)、环烯烃共聚物、聚烯烃弹性体和弹性体PET。
实施方案8.根据实施方案1至5中任一项所述的袋，其中该外层包含聚甲基戊烯聚合物(PMP)。
实施方案9.根据实施方案1至5中任一项所述的袋，其中该外层包含硅橡胶(例如，选自高稠度橡胶(HCR)、氟硅橡胶(FSR)、液体硅橡胶(LSR)、室温硫化橡胶(RTV)、热塑性硅橡胶(TPE)、铂固化硅橡胶和过氧化物固化硅橡胶)。
实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的袋，其中该外层具有0.01mm至5mm(例如，0.05mm至1mm)的厚度。
实施方案11.根据实施方案1至2中任一项所述的袋，其中
该内层具有0.001mm至0.7mm(例如，0.01mm至0.1mm)的厚度，并且基本上包含(例如，至少95重量％)氟化乙烯-丙烯；并且
该外层具有0.01mm至5mm(例如，0.1mm至0.5mm)的厚度，
并且基本上包含(例如，至少95重量％)硅橡胶。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的袋，其中该内层和该外层粘结在一起(例如，通过化学粘合、粘合剂粘合、热熔粘合、溶剂粘合、激光焊接、表面处理、挤出、共挤出、涂覆和层合中的一者或多者)。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的袋，其中该微载体具有100μm至400μm(例如，110μm至300μm或120μm至275μm)的平均直径。
实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的袋，其中该微载体具有1g/mL至1.25g/mL(例如，1g/mL至1.15g/mL或1g/mL至1.1g/mL)的平均密度。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的袋，其中该微载体具有0.1cm2/mg至10cm2/mg(例如，0.5cm2/mg至7.5cm2/mg或1cm2/mg至7.5cm2/mg)的平均比表面积。
实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的袋，其中该微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖或纤维素。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一项所述的袋，其中该微载体包含一种或多种细胞外基质化合物(例如，选自胶原蛋白I、聚-L-赖氨酸、纤粘蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸和聚多巴胺)，该细胞外基质化合物构成该微载体表面的至少一部分。
实施方案18.根据实施方案1至17中任一项所述的袋，其中容纳在该内部隔室中的该多个微载体的总表面积为该袋的该内部隔室的总表面积的至少100％(例如，至少500％或至少1000％)。
实施方案19.根据实施方案1至18中任一项所述的袋，该袋包括
未分隔的内部隔室；
第一液体可渗透管，其延伸到该内部隔室中并且与该内部隔室流体连通，该第一液体可渗透管操作地联接到该第一端口；以及
第二液体可渗透管，其延伸到该内部隔室中并且与该内部隔室流
体连通，该第二液体可渗透管操作地联接到该第二端口；
其中该第一液体可渗透管包括限定该管的中心管腔的第一内支撑结构和围绕该第一内支撑结构的第一外过滤层。
实施方案20.根据实施方案19所述的袋，该袋包括第三端口，该第三端口形成在该袋的外部表面中并且与该袋的该内部隔室流体连通。
实施方案21.根据实施方案19或实施方案20所述的袋，其中该第一内支撑结构包括第一多孔管。
实施方案22.根据实施方案21所述的袋，其中该第一多孔管具有100μm至5,000μm的平均孔尺寸和10％至90％的孔隙率。
实施方案23.根据实施方案19或实施方案20所述的袋，其中该第一内支撑结构包括螺旋缠绕的长丝。
实施方案24.根据实施方案19至23中任一项所述的袋，其中该第一外过滤层包含不锈钢、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。
实施方案25.根据实施方案19至24中任一项所述的袋，其中该第一外过滤层具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
实施方案26.根据实施方案19至25中任一项所述的袋，其中该第二液体可渗透管包括限定该管的中心管腔的第二内支撑结构和围绕该第二内支撑结构的第二外过滤层。
实施方案27.根据实施方案26所述的袋，其中该第二内支撑结构包括螺旋缠绕的长丝或第二多孔管。
实施方案28.根据实施方案26或实施方案27所述的袋，其中该第二外过滤层包含不锈钢、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。
实施方案29.根据实施方案26至28中任一项所述的袋，其中该第二外过滤层具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
实施方案30.根据实施方案1至18中任一项所述的袋，该袋包括
未分隔的内部隔室；
第一液体可渗透管，其延伸到该袋的该内部隔室中并且与该袋的该内部隔室流体连通，该第一液体可渗透管操作地联接到端口；以及
第二液体可渗透管，其延伸到该袋的该内部隔室中并且与该袋的该内部隔室流体连通，该第二液体可渗透管操作地联接到该第二端口；其中该第一液体可渗透管具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
实施方案31.根据实施方案30所述的袋，其中该第一液体可渗透管包含不锈钢、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、尼龙和氟化乙烯-丙烯中的一者或多者。
实施方案32.根据实施方案1至18中任一项所述的袋，该袋包括
多孔膜，其将该内部隔室的第一部分与该内部隔室的第二部分分离，该第二部分容纳该多个微载体；以及
第三端口，其形成在该袋的外部表面中；
其中该第一端口和该第二端口各自与该内部隔室的该第一部分流体连通，并且该第三端口与该内部隔室的该第二部分流体连通。
实施方案33.根据实施方案32所述的袋，其中该多孔膜包含含氟聚合物。
实施方案34.根据实施方案32所述的袋，其中该多孔膜包括以下中的一者或多者：氟化乙烯-丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物(HTE)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯共聚物、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(ETFE)、四氟乙烯/丙烯共聚物(TFE/P)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(FEP/HFP)、六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(THV)或具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均环聚合物。
实施方案35.根据实施方案32至34中任一项所述的袋，其中该多孔膜具有10μm至200μm，例如20μm至200μm、或30μm至200μm、或75μm至200μm、或10μm至150μm、或20μm至150μm、或30μm至150μm、或50μm至150μm或75μm至150μm的平均孔尺寸。
实施方案36.根据实施方案32至35中任一项所述的袋，其中该多孔膜具有10％至90％(例如，20％至70％或30％至50％)的孔隙率。
实施方案37.根据实施方案1至18中任一项所述的袋，该袋包括
第一多孔膜，其将该内部隔室的第一侧向部分与该内部隔室的中
心部分分离；
第二多孔膜，其将该内部隔室的第二侧向部分与该内部隔室的该
中心部分分离，该中心部分容纳该多个微载体；以及
第三端口，其形成在该袋的外部表面中；
其中该第一端口与该内部隔室的该第一侧向部分流体连通，该第二端口与该内部隔室的该第二侧向部分流体连通，并且该第三端口与该内部隔室的该中心部分流体连通。
实施方案38.根据实施方案37所述的袋，其中该第一多孔膜和该第二多孔膜各自单独包含含氟聚合物。
实施方案39.根据实施方案37所述的袋，其中该第一多孔膜和该第二多孔膜各自单独包含以下中的一者或多者：氟化乙烯-丙烯(FEP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVF)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物(HTE)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯共聚物、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ECTFE)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(ETFE)、四氟乙烯/丙烯共聚物(TFE/P)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(FEP/HFP)、六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(THV)或具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均环聚合物。
实施方案40.根据实施方案37至39中任一项所述的袋，其中该第一多孔膜和该第二多孔膜各自单独具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
实施方案41.根据实施方案37至40中任一项所述的袋，其中该第一多孔膜和该第二多孔膜各自单独具有10％至90％(例如，20％至70％或30％至50％)的孔隙率。
实施方案42.一种用于培养细胞的方法，该方法包括在根据实施方案1至41中任一项所述的袋的内部隔室中提供贴壁依赖性细胞和培养基以及微载体，并且使该培养基流过第一端口与第二端口之间的该内部隔室。
实施方案43.根据实施方案42所述的方法，该方法包括搅动袋(例如，通过摇动)。
实施方案44.根据实施方案42至43中任一项所述的方法，该方法还包括在温育期后，向该袋的该内部隔室中添加另外的多个微载体(例如，通过形成于该袋的外部表面中的第三端口)。
实施方案45.根据实施方案42至44中任一项所述的方法，该方法还包括
从该微载体中分离培养的细胞；并且随后
从该袋中移除该培养的细胞。
实施方案46.根据实施方案42至45中任一项所述的用于培养细胞的方法，其中该袋是根据实施方案19至31中任一项所述的袋，并且其中经由通过第二端口和通过第二液体可渗透管添加培养基以及通过第一液体可渗透管和通过第一端口移除该培养基来使该培养基流过该内部隔室。
实施方案47.根据实施方案46所述的方法，其中提供该袋包括通过形成在该袋的外部表面中的第三端口添加该多个微载体和该培养基。
实施方案48.根据实施方案46或实施方案47所述的方法，该方法还包括
从该微载体中分离培养的细胞；并且随后
通过第一液体可渗透管和通过第一端口从该袋的该内部隔室移除该培养的细胞。
实施方案49.根据实施方案42至45中任一项所述的培养细胞的方法，其中该袋是根据实施方案32至36中任一项所述的袋，并且其中在该内部隔室的第二部分中提供培养基和贴壁依赖性细胞；并且其中经由通过第二端口添加该培养基并且通过第一端口移除该培养基来使该培养基流过该内部隔室。
实施方案50.根据实施方案42至45中任一项所述的用于培养细胞的方法，其中该袋是根据实施方案37至41中任一项所述的袋，其包含在内部隔室的中心部分中的培养基和贴壁依赖性细胞；并且其中经由通过第二端口添加该培养基并且通过第一端口移除该培养基来使该培养基流过该内部隔室。
实施方案51.根据实施方案49或实施方案50所述的方法，其中该多个微载体通过第三端口提供给内部隔室。

Claims (15)

1.一种氧气可渗透袋，所述氧气可渗透袋包括
一个或多个聚合物膜，所述一个或多个聚合物膜限定所述袋的内部隔室的边界，所述一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括
与所述袋的所述内部隔室相邻的内层，所述内层包含含氟聚合物；以及
附着到所述内层的外层，所述外层包含聚合物；
第一端口，所述第一端口形成在所述袋的外部表面中并且与所述内部隔室流体连通；
第二端口，所述第二端口形成在所述袋的外部表面中并且与所述内部隔室流体连通；以及
多个微载体，所述多个微载体容纳在所述内部隔室中。
2.根据权利要求1所述的袋，其中所述氧气可渗透袋为包括以下的氧气可渗透袋：
一个或多个聚合物膜，所述一个或多个聚合物膜的边缘粘结在一起以形成所述袋的内部隔室，所述一个或多个聚合物膜中的每个聚合物膜包括与所述袋的所述内部隔室相邻的内层以及附着到所述内层的外层，所述内层包含含氟聚合物，所述外层包含聚合物；
第一端口，所述第一端口形成在所述袋的外部表面中并且与所述内部隔室流体连通；
第二端口，所述第二端口形成在所述袋的外部表面中并且与所述内部隔室流体连通；以及
多个微载体，所述多个微载体容纳在所述内部隔室中。
3.根据权利要求1所述的袋，其中所述内层包含氟化乙烯-丙烯。
4.根据权利要求1所述的袋，其中所述外层包含弹性体。
5.根据权利要求1所述的袋，其中所述外层包含硅橡胶(例如，选自高稠度橡胶(HCR)、氟硅橡胶(FSR)、液体硅橡胶(LSR)、室温硫化橡胶(RTV)、热塑性硅橡胶(TPE)、铂固化硅橡胶和过氧化物固化硅橡胶)。
6.根据权利要求1所述的袋，其中
所述内层具有0.001mm至0.7mm(例如，0.01mm至0.1mm)的厚度，并且基本上包含(例如，至少95重量％)氟化乙烯-丙烯；并且
所述外层具有0.01mm至5mm(例如，0.1mm至0.5mm)的厚度，并且基本上包含(例如，至少95重量％)硅橡胶。
7.根据权利要求1所述的袋，其中所述微载体具有100μm至400μm(例如，110μm至300μm或120μm至275μm)的平均直径。
8.根据权利要求1所述的袋，其中所述微载体包含聚苯乙烯、交联葡聚糖或纤维素。
9.根据权利要求1所述的袋，其中容纳在所述内部隔室中的所述多个微载体的总表面积为所述袋的所述内部隔室的总表面积的至少100％(例如，至少500％或至少1000％)。
10.根据权利要求1所述的袋，所述袋包括
未分隔的内部隔室；
第一液体可渗透管，所述第一液体可渗透管延伸到所述内部隔室中并且与所述内部隔室流体连通，所述第一液体可渗透管操作地联接到所述第一端口；以及
第二液体可渗透管，所述第二液体可渗透管延伸到所述内部隔室中并且与所述内部隔室流体连通，所述第二液体可渗透管操作地联接到所述第二端口；
其中所述第一液体可渗透管包括限定所述管的中心管腔的第一内支撑结构和围绕所述第一内支撑结构的第一外过滤层。
11.根据权利要求1所述的袋，所述袋包括
未分隔的内部隔室；
第一液体可渗透管，所述第一液体可渗透管延伸到所述袋的所述内部隔室中并且与所述袋的所述内部隔室流体连通，所述第一液体可渗透管操作地联接到所述端口；以及
第二液体可渗透管，所述第二液体可渗透管延伸到所述袋的所述内部隔室中并且与所述袋的所述内部隔室流体连通，所述第二液体可渗透管操作地联接到所述第二端口；
其中所述第一液体可渗透管具有50μm至200μm(例如，50μm至150μm或75μm至150μm)的平均孔尺寸。
12.根据权利要求1所述的袋，所述袋包括
多孔膜，所述多孔膜将所述内部隔室的第一部分与所述内部隔室的第二部分分离，所述第二部分容纳所述多个微载体；以及
第三端口，所述第三端口形成在所述袋的外部表面中；
其中所述第一端口和所述第二端口各自与所述内部隔室的所述第一部分流体连通，并且所述第三端口与所述内部隔室的所述第二部分流体连通。
13.根据权利要求1所述的袋，所述袋包括
第一多孔膜，所述第一多孔膜将所述内部隔室的第一侧向部分与所述内部隔室的中心部分分离；
第二多孔膜，所述第二多孔膜将所述内部隔室的第二侧向部分与所述内部隔室的所述中心部分分离，所述中心部分容纳所述多个微载体；以及
第三端口，所述第三端口形成在所述袋的外部表面中；
其中所述第一端口与所述内部隔室的所述第一侧向部分流体连通，所述第二端口与所述内部隔室的所述第二侧向部分流体连通，并且所述第三端口与所述内部隔室的所述中心部分流体连通。
14.一种用于培养细胞的方法，所述方法包括在根据权利要求1至13中任一项所述的袋的所述内部隔室中提供贴壁依赖性细胞和培养基以及所述微载体，以及使培养基流过所述第一端口与所述第二端口之间的所述内部隔室。
15.根据权利要求14所述所述的方法，所述方法还包括
从所述微载体中分离培养的细胞；并且随后
从所述袋中移除所述培养的细胞。
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