JP2024502960A - 細胞培養システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本開示は全般に、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。本開示の一態様は、酸素透過性バッグであって、バッグの内部区画の境界を画定する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する、フルオロポリマーを含む内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグである。【選択図】図１
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２２９１号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２２９１号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は全般に、細胞培養装置及び細胞培養方法に関する。
細胞培養及び細胞単離は、多くの用途において重要なプロセスである。例えば、治療用途（例えば、免疫療法、再生医療など）において使用するための特定の細胞は、典型的には単離され、インビトロで培養される。例えば、前駆細胞及び間葉系幹細胞などの細胞、並びに単球及び他の免疫細胞は、血液中に比較的低濃度で存在し、したがって、典型的には血液から単離され、インビトロで培養される。同様に、神経細胞、心筋細胞、上皮細胞、及び再生医療（例えば、骨修復、皮膚修復、膵島再生など）のための他の細胞は、インビトロで培養され得る。
バッグの形態の市販の細胞培養デバイスは、細胞培養に使用される従来の形式である。細胞培養バッグは、使い捨て式であるという利点を有し、これは、調製及び洗浄時間を減少させる。更に、細胞培養バッグは、予備滅菌可能であり、安価であり、使用が容易であり、保管及び使用のために最小限の空間しか必要としない。使い捨て式品はまた、細胞培養及び環境に対する夾雑のリスクを低減するのに役立つ。
しかしながら、そのようなバッグの表面は、典型的には、足場依存性細胞のための接着基質が乏しく、それは生存するためにそれらの天然の細胞ニッチに匹敵する環境を必要とする。更に、そのようなバッグの内部表面積は、（例えば、総バッグ体積と比較して）比較的限られている。
したがって、足場依存性細胞の改善された培養を容易にする細胞培養及び単離物品が依然として必要とされている。
本開示の一態様は、酸素透過性バッグであって、バッグの内部区画を形成するように結合された縁部を有する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグである。
本開示の別の態様は、分割されていない内部区画と、内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、第１のポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、第１の液体透過性チューブは、チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える、（例えば、本明細書に記載される任意の実施形態による）バッグである。
本開示の別の態様は、分割されていない内部区画と、バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、ポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、第１の液体透過性チューブは、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、（例えば、本明細書に記載される任意の実施形態による）バッグである。
本開示の別の態様は、内部区画の第１の部分を内部区画の第２の部分から分離する多孔質膜であって、第２の部分は複数のマイクロキャリアを含有する、多孔質膜と、バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、第１のポート及び第２のポートは各々、内部区画の第１の部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の第２の部分と流体連通する、（例えば、本明細書に記載される任意の実施形態による）バッグである。
本開示の別の態様は、内部区画の第１の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第１の多孔質膜と、内部区画の第２の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第２の多孔質膜であって、中央部分は複数のマイクロキャリアを含有する、第２の多孔質膜と、バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、第１のポートは、内部区画の第１の側方部分と流体連通し、第２のポートは、内部区画の第２の側方部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の中央部分と流体連通する、（例えば、本明細書に記載される任意の実施形態による）バッグである。
本開示の別の態様は、細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培地を（例えば、本明細書に記載される任意の実施形態による）バッグに追加するステップを含む、方法である。
本開示は、足場依存性細胞を細胞培養バッグ中で培養及び単離する物品及び方法に関する。本発明者らは、従来の細胞培養バッグは、その表面が典型的には足場依存性細胞にとって不適切な基材であり、更にマイクロキャリア細胞培養にとっても不適切であり得ることに注目する。当業者が理解するように、「マイクロキャリア」細胞培養は、離散したマイクロメートルスケールの粒子（例えば、回転楕円体「マイクロキャリア」又は「マイクロビーズ」）を含み、その表面は、足場依存性細胞のための接着基質として機能することができる。
本発明者らは、細胞培養バッグの内面が、例えば、バッグ調製（例えば、滅菌によってもたらされる構造変化）又は使用（例えば、バッグ支持体又はバッグ揺動デバイスから不均一に加えられた力）に由来する機械的応力によって歪められ得ることに注目する。そのような歪みから生じるバッグ表面上のマクロスケールの特徴は、細胞培養プロセス中にマイクロキャリアの局在化又は「プーリング」を引き起こすことがあり、バッグ体積全体にわたるマイクロキャリアの望ましくない不均一な分布をもたらす。そのような特徴はまた、直接的（すなわち、マクロスケール表面特徴とマイクロキャリアとの間の衝突）及び間接的（すなわち、不均一に分布したマイクロキャリア集団の「プールされた」領域におけるマイクロキャリア間の衝突の増加）の両方で、キャリア固定細胞が（例えば、撹拌又は揺動中に）受ける剪断応力及び衝突応力の量を顕著に増加させることができる。
有利なことに、本発明者らは、外側ポリマー層に接着された内側フルオロポリマー層を含む酸素透過性ポリマーフィルムから形成された培養バッグの内面が、望ましくは、調製（例えば、オートクレーブ内での滅菌）及び使用（例えば、揺動デバイス上でのインキュベーション）を通して比較的歪みのないままであり得ると判定した。したがって、細胞培養プロセス中にバッグに含まれるマイクロキャリアは、比較的均一に分布したままであることができ、固定された細胞の剪断力及び衝突力への曝露を顕著に低減することができる。本発明者らは更に、そのようなバッグが、細胞培養及び／又は培養された細胞の効率的な回収中のフィード培地の最小限の破壊的除去及び補充を容易にする１つ以上の灌流成分を有利に含み得ると判定した。
したがって、本開示の一態様は、（例えば、縁部を結合してバッグを形成することによって）バッグの内部区画の境界を画定する１つ以上のポリマーフィルム（例えば、第１のポリマーフィルム及び第２のポリマーフィルム）を含む酸素透過性バッグである。ポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む。バッグは、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、を含む。そして、バッグは、内部区画に複数のマイクロキャリアを含む。
上述のように、様々な実施形態では、酸素透過性バッグは、バッグの内部区画を形成するように結合された縁部を有する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグの形態であり得る。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上のポリマーフィルムは、バッグの内部区画の周りに縁部を形成するように共に結合された縁部を有する、第１のポリマーフィルム及び第２のポリマーフィルムを含む。しかしながら、他の実施形態では、単一のポリマーフィルムを折り重ねてそれ自体に結合してバッグを形成することができ、又は管状フィルムを２つの縁部で溶着してバッグを形成することができる。いずれにしても、２つの別個のフィルムが使用される場合、１つのポリマーフィルムのみが本明細書に記載の積層構造を有する必要がある。他のフィルムも積層構造を有してもよいし、いくらか異なる構造を有してもよい。
上述したように、ポリマーフィルムの各々（すなわち、積層ポリマーフィルムであり、このようなフィルムが１つだけバッグの中に存在する必要があることを認識している）は、フルオロポリマーを含む内層を含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内層は、実質的にフルオロポリマー、例えば、少なくとも８０重量％、又は少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％のフルオロポリマーを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内層は、エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、及び官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーから選択される１つ以上のフルオロポリマーを含む。特定の望ましい実施形態では、内層は、フッ素化エチレン－プロピレンを含む。例えば、特定のこのような実施形態では、内層は、少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）のフッ素化エチレン－プロピレンを含む。
様々な実施形態では、内層は、非結晶性（例えば、ＤＳＣによって測定される場合）であるか、又は２Ｊ／ｇ未満の融解熱を有する非晶質フッ素含有ポリマーから選択されるフルオロポリマーを含む。例えば、特定のこのような実施形態では、内層は、テトラフルオロエチレンと、２～８個の炭素原子を有するフルオロオレフィン及びアルキル基が１個又は３～５個の炭素原子を含有するフッ素化アルキルビニルエーテルなどの官能性又は非官能性モノマーとのコポリマーを含む。様々な実施形態では、非官能性モノマーは、ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）、クロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）、ＰＥＶＥ、ＰＭＶＥ、及びペルフルオロ－（プロピレンビニルエーテル）（ＰＰＶＥ）のうちの１つ以上を含む。様々な実施形態では、官能性モノマーは、ペルフルオロエチルビニルエーテル（ＥＶＥ）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＯＯＣＨ３（ＥＶＥ－カルバメート）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＳＯ２Ｆ（ＰＳＥＰＶＥ）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＮ（８ＣＮＶＥ）、Ｎ３（ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２）３（ＥＶＥ－トリアジン）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＮ（ＥＶＥ－ＣＮ）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＯＨ（ＥＶＥ－ＯＨ）、ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＰＯ２（ＯＨ）２（ＥＶＥ－Ｐ）ＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦＣＦ３ＯＣＦ２ＣＦ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（ＥＶＥ－ＣＯＯＨ）、及び２，２－ビストリフルオロメチル－４，５－ジフルオロ－１，３－ジオキソール（ＰＤＤ）のうちの１つ以上を含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内層は、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）製のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＳＦ６０（ＴＦＥ／ＰＭＶＥ／ＰＥＶＥ，ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＳＦ６１（ＴＦＥ／ＰＭＶＥ／ＰＥＶＥ／ＥＶＥ－Ｐ）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＳＦ５０（ＴＦＥ／ＨＦＰ）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ＡＦ１６００（ＰＤＤ／ＴＦＥ）、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２１３０（ＰＤＤ／ＣＴＦＥ）；Ａｓａｈｉ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（東京）製のＣＹＴＯＰ（登録商標）（ＣＹＴＯＰタイプＡ、ＣＹＴＯＰタイプＭ、ＣＹＴＯＰタイプＳ、又はＣＹＴＯＰ ＮＭ）；ＭＹ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）製の（ＭＹ－１３３）；又はＮｕｓｉｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）製の（ＬＳ－２３３）などの１つ以上の市販の非晶質フルオロポリマーを含み得る。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内層（例えば、実質的にフッ素化エチレン－プロピレンを含む）は、０．００１～０．７ｍｍ、例えば、０．００１～０．４ｍｍ、又は０．００１～０．１ｍｍ、又は０．００５～０．７ｍｍ、又は０．００５～０．４ｍｍ、又は０．００５～０．１ｍｍ、又は０．０１～０．７ｍｍ、又は０．０１～０．４ｍｍ、又は０．０１～０．１ｍｍの厚さを有する。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、内層は、少なくとも９５重量％のフッ素化エチレン－プロピレンを含み、０．０１～０．１ｍｍの厚さを有する。
上述したように、ポリマーフィルムの各々（すなわち、積層ポリマーフィルムであり、このようなフィルムが１つだけバッグの中に存在する必要があることを認識している）は、ポリマーを含む外層を含む。様々なポリマーを使用することができ、当業者は、特にガス透過性及びしわに関して、本明細書の開示に基づいて望ましいポリマーを選択するであろう。特定の望ましい実施形態では、外層は、フルオロポリマーを実質的に含まず、例えば、５％を超えるフルオロポリマーを含まず、例えば、１％以下のフルオロポリマーを含まない。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、エラストマーを含む。当業者が理解するように、「エラストマー」又は「ゴム」は、粘弾性特性及び比較的弱い分子間力を有する、炭素、水素、酸素、及び／又はケイ素を含むモノマーから形成されるポリマーを含む。エラストマーは、典型的には、比較的低いヤング率及び比較的高い破壊歪みを有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、実質的にエラストマー、例えば、少なくとも８０重量％、又は少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％のエラストマーを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、天然ゴム（ＮＲ）、合成ポリイソプレンゴム（ＩＲ）、ポリブタジエンゴム（ＢＲ）、クロロプレンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリルゴム（ＮＢＲ）、及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）などの、硫黄加硫によって硬化される１つ以上の不飽和ゴムを含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）などの熱可塑性シリコーンを含む熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、エラストマーＰＥＴ、及びエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）などの、硫黄加硫によって硬化不可能な１つ以上の不飽和ランナーを含む。特定のこのような実施形態では、１つ以上の不飽和ゴムは、外層の少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９９重量％）の合計量で存在する。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、１つ以上の熱可塑性ポリウレタン又は熱硬化性ポリウレタンを含む。特定のこのような実施形態では、外層は、ポリエステル及びポリエーテルグレードのポリオールの両方を含む、メチレンジイソシアネート（ＭＤＩ）又はトルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）に基づく熱可塑性ポリウレタンなどの１つ以上の熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）を含む。例えば、様々な実施形態では、外層は、Ｂａｙｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅの商標である「ＴＥＸＩＮ」、Ｌｕｂｒｉｚｏｌの商標である「ＥＳＴＡＮＥ」、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．の商標である「ＰＥＬＬＥＴＨＡＮＥ」、及びＢＡＳＦ，Ｉｎｃ．の商標である「ＥＬＡＳＴＯＬＬＡＮ」を含む市販の「プレポリマー」に基づく１つ以上の熱可塑性ポリウレタンを含む。特定のこのような実施形態では、１つ以上の熱可塑性ポリウレタン又は熱硬化性ポリウレタンは、外層の少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９９重量％）の合計量で存在する。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）１４０シリコーンＴＰＥ、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）２００シリコーンＴＰＥエラストマー（９０％ポリジメチルシロキサン及びイソシアネート）、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）、６０シリコーンＴＰＥ、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）８０シリコーンＴＰＥ、又はＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）１４５ＴＰＥなどの１つ以上の熱可塑性シリコーンを含み、これらの全ては、９０％ポリジメチルシロキサン及びイソシアネートを含む。特定のこのような実施形態では、１つ以上の熱可塑性シリコーンは、外層の少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９９重量％）の合計量で存在する。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、外層は、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）（すなわち、メチルペンテンモノマー単位の熱可塑性ポリマー）を含む。例えば、特定のこのような実施形態では、外層は、少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）のポリメチルペンテンを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、シリコーンゴムを含む。例えば、特定のこのような実施形態では、外層は、少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）のシリコーンゴムを含む。
特定のこのような実施形態では、外層は、例えば、ジメチルシロキサン、ジエチルシロキサン、ジプロピルシロキサン、メチルエチルシロキサン、及びメチルプロピルシロキサンのうちの１つ以上から形成されるポリアルキルシロキサンを含むシリコーンポリマーマトリックスを含むシリコーンゴムを含む。特定の望ましい実施形態では、シリコーンゴムは、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリジアルキルシロキサンを含む。特定のこのような実施形態では、シリコーンポリマーは、比較的非極性であり、ハロゲン化物官能基（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）及びフェニル官能基を実質的に含まない。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、両末端がビニルジメチルシロキシ基で末端封鎖されたポリジメチルシロキサン、両末端がビニルジメチルシロキシ基で末端封鎖されたジメチルシロキサン－ビニルメチルシロキサンコポリマー、及び両末端がビニルジメチルシロキシ基で末端封鎖されたジメチルシロキサン－メチルフェニルシロキサンコポリマーから選択される１つ以上のポリオルガノシロキサンを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、シリコーンゴムは、白金触媒による液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）又は高粘稠度ガムゴム（ＨＣＲ）を含む。様々な実施形態では、シリコーンゴムは、過酸化物触媒によるシリコーンゴム（ＬＳＲ）又は高粘稠度ガムゴム（ＨＣＲ）、例えば、Ｓａｉｎｔ－Ｇｏｂａｉｎによって製造される過酸化物系シリコーンであるＳＩＬＭＥＤＩＣ（登録商標）などを含む。ＨＣＲシリコーンゴムの一例は、ＧＥ Ｐｌａｓｔｉｃｓから入手可能なＧＥ ９４５０６ ＨＣＲである。また、ＬＳＲシリコーンゴムの例としては、Ｗａｃｋｅｒ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ（Ａｄｒｉａｎ，ＭＩ）によるＷａｃｋｅｒ ３００３、及びＲｈｏｄｉａ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ（Ｖｅｎｔｕｒａ，ＣＡ）によるＲｈｏｄｉａ ４３６０が挙げられる。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層（例えば、実質的にポリメチルペンテン又はシリコーンゴムを含む）は、０．０１～５ｍｍ、例えば、０．０１～１ｍｍ、又は０．０１～０．５ｍｍ、又は０．０５～５ｍｍ、又は０．０５～１ｍｍ、又は０．０５～０．５ｍｍ、又は０．１～５ｍｍ、又は０．１～１ｍｍ、又は０．１～０．５ｍｍの厚さを有する。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、外層は、少なくとも９５重量％のポリメチルペンテンを含み、０．１～０．５ｍｍの厚さを有する。本明細書に別様に記載されるような他の望ましい実施形態では、外層は、少なくとも９５重量％のシリコーンゴムを含み、０．１～０．５ｍｍの厚さを有する。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、内層は０．００１～０．７ｍｍの厚さを有し、外層は０．０１～５ｍｍの厚さを有する。例えば、様々な実施形態では、内層は０．０１～０．４ｍｍの厚さを有し、外層は０．０５～１ｍｍの厚さを有する。別の例では、様々な実施形態では、内層は０．０１～０．１ｍｍの厚さを有し、外層は０．１～０．５ｍｍの厚さを有する。特定のこのような実施形態では、内層は、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）フッ素化エチレン－プロピレンを含む。特定のこのような実施形態では、外層は、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含む。
上述したように、ポリマーフィルムの内層及び外層は互いに接着される。様々な実施形態では、接着された層は、コーティングプロセスによって形成される。特定のこのような実施形態では、接着された内層及び外層は、キャスト可能なフルオロポリマー組成物をポリマー層（例えば、エラストマー層）上に分散させた産物である。当然ながら、他のそのような実施形態では、接着された層は、キャスト可能なポリマー組成物（例えば、キャスト可能なエラストマー組成物）をフルオロポリマー層上に分散させた産物である。当業者が理解するように、「キャスト可能な」ポリマー（例えば、フルオロポリマー又は非フルオロポリマー）を液体キャリア媒体中に分散、溶解、懸濁、乳化、又は他の方法で分配して、支持材料上に堆積させてポリマー層を形成することができるポリマー組成物を提供することができる。当然ながら、「キャスト可能な」ポリマーは、液体状態で溶融又は他の方法で処理され得、次いで冷却又は他の方法で硬化されて（例えば、ＵＶ、ＩＲ、開始剤、又は電子ビームによって）、固体ポリマー層を形成することができるポリマーも含むことができる。好適なキャリア液体（例えば、ＤＭＡＣ、ＮＭＰ、グリコールエーテル、水）及び本明細書に記載のポリマーをキャストするための方法は、当該技術分野において既知である。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、接着された層は、化学結合を伴うコーティングプロセスによって形成される。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含み、それに接着された内側フルオロポリマー層は、シリコーンゴムに結合することができる反応性化合物を含有するフルオロポリマー組成物をキャストした産物である。特定のこのような実施形態では、反応性化合物は、例えば、シロキサン結合を有する化合物、アルコキシシリル基を有するシランカップリング剤、クロロシリル基又はシラザンを有する官能性シラン、アミノシラン、及びシリル化剤などの炭化水素ケイ素含有化合物から選択される。これらの中でも、シロキサン結合を有する化合物、及びアルコキシシリル基を有するシランカップリング剤が好ましい。様々な実施形態では、反応性化合物は、シロキサン結合（例えば、末端修飾ジメチルシロキサン、縮合型又は付加型液体シリコーン、ケイ酸塩、及びアクリルシリコーンポリマー）を有する。
例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、外層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含み、それに接着された内側フルオロポリマー層は、アミノシラン末端修飾を有するフルオロポリマー（例えば、ＣＹＴＯＰタイプＭ）又はカルボキシル基末端修飾を有するフルオロポリマー（例えば、ＣＹＴＯＰタイプＡ）を含み、任意選択でカップリング剤を含む組成物をキャストした産物である。このような実施形態では、化学結合による接着性は、縮合、アルキル化、アミド化、シリル化、エーテル化（例えば、直接又はカップリング剤を介して）のうちの１つ以上によって生じ得る。例えば、特定のこのような実施形態では、内側フルオロポリマー層は、ヒドロキシル基、アミノ基、又は硫黄基と反応するイソシアネート化合物を含む組成物をキャストした産物である。他の実施形態では、フルオロポリマー層は、水素結合によって外層に接着される。
本明細書に別様に記載されるような他の実施形態では、内層及び外層は、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒結合、レーザ溶着、表面処理、押出、共押出、及び積層のうちの１つ以上によって結合される。例えば、特定の望ましい実施形態では、内層（例えば、実質的にフッ素化エチレンプロピレンを含む）及び外層（例えば、実質的にシリコーンゴムを含む）は、Ｃ処理（Ｓａｉｎｔ－Ｇｏｂａｉｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国特許第６，７２６，９７９号）、コロナ放電、プラズマ処理、及びエッチングから選択される１つ以上の表面処理によって結合される。他の実施形態では、内層及び外層は、単独で又は本明細書に記載の処理方法と併せて使用することができる添加剤又はプライマーを伴う化学処理によって結合される。
例えば、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、内層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）フッ素化エチレン－プロピレン（例えば、Ｃ処理されたフッ素化エチレン－プロピレン）を含み、それに接着された外層は、フッ素化エチレン－プロピレンを液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）シリコーンで（例えば、押出によって）プライミング及びコーティングした産物である。他の実施形態では、内層及び外層は、（例えば、ＬＩＧＨＴＳＷＩＴＣＨ（登録商標）完成品（Ｓａｉｎｔ－Ｇｏｂａｉｎ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ））のものと同様に）一緒に予備積層される。
本発明者らは、本明細書に記載のバッグの内層が、望ましくは低い全有機体炭素（ＴＯＣ）を有し得ることに注目する。当業者は、「全有機体炭素」が有機化合物中に結合した炭素の量であり、とりわけ医薬品製造機器の非特異的指標として使用されることが多いことを理解するであろう。全有機体炭素は、精製及び分配システムを使用する単位操作の性能を監視するために、バイオテクノロジー産業におけるプロセス制御属性として利用される。
全有機体炭素は、バッグの内部表面積又は別の物品の表面積からの抽出によって測定される（結果は、ｍｇ／ｃｍ２の単位で提供され、表面積１平方センチメートル当たりの総抽出可能有機体炭素である）。材料は、７０℃で２４時間、所与の量の精製水と接触させることによって抽出される。
フッ素化エチレンプロピレンバッグの（すなわち、ＦＥＰフィルムを使用する）全有機体炭素値の一例は、＜０．０１ｍｇ／ｃｍ２である。シリコーンチューブでは、抽出率は、１４．６ｃｍ２／ｍＬであってもよいし（例えば、Ｂｉｏｓｉｌ）、１５．９ｃｍ２／ｍＬであってもよく（例えば、ＳＲ１３９）、シリコーンＢｉｏｓｉｌチューブの全有機体炭素値の一例は、０．０２１ｍｇ／ｃｍ２であり、シリコーンＳＲ１３９チューブの全有機体炭素値の一例は、０．００８ｍｇ／ｃｍ２である。少なくとも特定のシリコーンチューブでは、抽出物の体積及び濃度によって値が機械の最大検出値を超えるので、サンプルが希釈され得る。希釈及び異なる抽出率により、重量／面積値を提供するために、これらのサンプルとバッグサンプルとの比較が必要となる。
本明細書で定量化されるように、全有機体炭素は、ＵＶ促進化学酸化の高温湿式酸化反応を利用する機器を使用して、米国薬局方（ＵＳＰ）６４３に従って測定される（Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｕｌｔｒａ－Ｐｕｒｅ Ｗａｔｅｒ，Ｏｈｍｉ，Ｔａｄａｈｉｒｏ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年，４９７～５１７頁）。精製水を、１ｍＬの水に対して３ｃｍ２の物品表面積の比で、７０℃で２４時間ポリマーと接触させて置く。水をポリマーとの接触から除去し、ＴＯＣ分析器で試験する。好適な機器は、ＴＥＫＭＡＲ ＤＯＨＲＭＡＮＮ Ｍｏｄｅｌ Ｐｈｏｅｎｉｘ ８０００ＴＯＣ分析器である。
したがって、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグを構成するポリマーフィルムのうちの１つ以上（例えば、各々）は、ガス透過性であり、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満、例えば、又は０．５ｍｇ／ｃｍ２未満、又は０．１ｍｇ／ｃｍ２未満、又は０．０１ｍｇ／ｃｍ２未満、又は０．００１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有する内層を備える。例えば、特定のこのような実施形態では、ポリマーフィルムの各々は、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．１ｍｇ／ｃｍ２、例えば、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０７５ｍｇ／ｃｍ２、又は０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０５ｍｇ／ｃｍ２、又は０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０１ｍｇ／ｃｍ２の水中全有機体炭素を有する内層を備える。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、外層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含み、内層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）フッ素化エチレンプロピレンを含み、内層は、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０５ｍｇ／ｃｍ２、例えば、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０１ｍｇ／ｃｍ２の水中全有機体炭素を有する。
上述したように、バッグは酸素透過性である。本発明者らは、本明細書に記載の酸素透過性ポリマーフィルムが、細胞培養に必要なガス交換（例えば、酸素の補充）を容易にすることができ、バッグへの又はバッグからの１つ以上の追加のガス供給の必要性を低減又は更に排除することに注目する。したがって、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグを構成するポリマーフィルムのうちの少なくとも１つ（例えば、各々）は、１日当たり少なくとも１００ｃｃ／ｍ２、例えば、１日当たり少なくとも５００ｃｃ／ｍ２、又は１日当たり少なくとも１，０００ｃｃ／ｍ２、又は１日当たり少なくとも２，０００ｃｃ／ｍ２のガス透過性（例えば、酸素透過性）を有する。本明細書で定量化されるように、酸素透過性は、ＭＯＣＯＮ Ｏｘ－ｔｒａｎ ２／２１Ｈ酸素分析器を用いて、ＡＳＴＭ Ｄ３９８５に従って、２５℃で測定される。フィルム透過性の別の態様では、正規化単位（ｃｃ－ｍｍ／ｍ２－日）を使用して、任意の厚さのフィルムを示すことができる。例えば、５ｍｍフィルムの変換範囲は、２５℃の温度で約１２．７ｃｃ－ｍｍ／ｍ２－日～少なくとも約２７９ｃｃ－ｍｍ／ｍ２－日である。構造体／複合体の透過性は、２つの層から構成されるので、ｃｃ／ｍ２の項で表すことができる。
本発明者らは更に、本明細書に別様に記載されるバッグが、望ましくは二酸化炭素に対して透過性であり得る（例えば、蓄積した二酸化炭素の除去を容易にするために）ことに注目する。したがって、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、バッグを構成するポリマーフィルムのうちの少なくとも１つ（例えば、各々）は、１日当たり少なくとも５，０００ｃｃ／ｍ２、例えば、１日当たり少なくとも１０，０００ｃｃ／ｍ２、又は１日当たり少なくとも１５，０００ｃｃ／ｍ２、又は１日当たり少なくとも２０，０００ｃｃ／ｍ２の二酸化炭素透過性を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグを構成するポリマーフィルムのうちの少なくとも１つ（例えば、各々）は、１日当たり１０，０００～４０，０００ｃｃ／ｍ２、例えば、１日当たり１５，０００～３５，０００ｃｃ／ｍ２、又は１日当たり２０，０００～３０，０００ｃｃ／ｍ２の二酸化炭素透過性を有する。本明細書で定量化されるように、二酸化炭素透過性は、ＭＯＣＯＮ Ｐｅｒｍａｔｒａｎ－Ｃ ４４１ ＣＯ２ＴＲ分析器を用いて、ＡＳＴＭ Ｆ２４７６に従って、２５℃で、１００％ＣＯ２、及び０％相対湿度でフィルムの両側において測定される。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、外層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含み、内層は、実質的に（例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）フッ素化エチレンプロピレンを含み、ポリマーフィルムのうちの少なくとも１つ（例えば、各々）は、１日当たり１０００～２５，０００ｃｃ／ｍ２の範囲内のガス透過性、及び０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有する。特定のこのような実施形態では、ポリマーフィルムの各々は、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．１ｍｇ／ｃｍ２、例えば、０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０７５ｍｇ／ｃｍ２、又は０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０５ｍｇ／ｃｍ２、又は０．００１ｍｇ／ｃｍ２～０．０１ｍｇ／ｃｍ２の水中全有機体炭素を有する内層を備える。
上述したように、バッグは、内部区画に複数のマイクロキャリアを含む。特定の望ましい実施形態では、バッグの内部区画に含まれるマイクロキャリアは、多孔性かつ非分解性（例えば、水性細胞培養培地中で）である。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、ポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースを含む。特定の望ましい実施形態では、マイクロキャリア表面は、正又は負に荷電した官能基（例えば、ポリスチレン、架橋デキストラン、セルロースなどに共有結合している）を含む。例えば、特定のこのような実施形態では、マイクロキャリアは、実質的にポリスチレンであり、酸素含有官能基（例えば、ポリスチレンに共有結合している）を含む正味負に荷電した表面を有する。当業者は、そのような「表面処理された」マイクロキャリアが、細胞付着及び／又は拡散を容易にする比較的親水性の表面を有し得ることを理解するであろう。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、１つ以上の細胞外マトリックス化合物、例えば、コラーゲンＩ、ポリ－Ｌ－リジン、フィブロネクチン、レトロネクチン、ヒアルロン酸、ポリドーパミンを含む。例えば、特定のこのような実施形態では、マイクロキャリアは、実質的にポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースを含むコア粒子の表面に共有結合した１つ以上の細胞外マトリックス化合物（例えば、コラーゲン又はポリドーパミン）を含む。本明細書に記載される他の実施形態では、マイクロキャリアは、少なくとも少なくとも９０重量％、例えば、少なくとも９５重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％、又は少なくとも９９．５重量％の、ポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースのうちの１つ以上を含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、１００～４００μｍ、例えば、１００～３００μｍ、又は１００～２７５μｍ、又は１１０～４００μｍ、又は１１０～３００μｍ、又は１１０～２７５μｍ、又は１２０～４００μｍ、又は１２０～３００μｍ、又は１２０～２７５μｍの平均直径を有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、１～１．２５ｇ／ｍＬ、例えば、１～１．１５ｇ／ｍＬ、又は１～１．１ｇ／ｍＬの平均密度を有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、０．１～１０ｃｍ２／ｍｇ、例えば、０．１～７．５ｃｍ２／ｍｇ、又は０．５～１０ｃｍ２／ｍｇ、又は０．５～７．５ｃｍ２／ｍｇ、又は１～１０ｃｍ２／ｍｇ、又は１～７．５ｃｍ２／ｍｇの平均比表面積を有する。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内部区画に含まれる複数のマイクロキャリアの合計質量（すなわち、グラム）対内部区画の体積（すなわち、リットル）の比は、１～１５ｇ／Ｌ、例えば、１～１２．５ｇ／Ｌ、又は１～１０ｇ／Ｌ、又は２．５～１５ｇ／Ｌ、又は２．５～１２．５ｇ／Ｌ、又は２．５～１０ｇ／Ｌ、又は５～１５ｇ／Ｌ、又は５～１２．５ｇ／Ｌ、又は５～１０ｇ／Ｌである。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアは、０．１～１０ｃｍ２／ｍｇ（例えば、０．５～１０ｃｍ２／ｍｇ）の平均比表面積を有し、内部区画に含まれる複数のマイクロキャリアの合計質量対内部区画の体積の比は、１～１５ｇ／Ｌ（例えば、２．５～１０ｇ／Ｌ）である。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、内部区画に含まれる複数のマイクロキャリアは、バッグの内部区画に隣接する内層の総表面積の少なくとも１００％、例えば、少なくとも５００％、又は少なくとも１，０００％、又は少なくとも５，０００％、又は少なくとも１０，０００％である総表面積を有する。
上述したように、本明細書に記載のバッグは、細胞培養中の不均一なマイクロキャリア分布及び／又は固定された細胞の望ましくない剪断力及び衝突力への曝露を有利に制限することができる。したがって、本開示の別の態様は、細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培養培地を本明細書に記載のバッグに追加するステップを含む、方法である。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、細胞は、血液細胞又は免疫細胞を含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、細胞は、幹細胞、多能性間質細胞、肝細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、上皮細胞、ニューロンである。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、細胞は、分化した幹細胞、例えば、軟骨細胞様、骨芽細胞様、又は脂肪細胞様の分化した幹細胞などである。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、細胞は、内皮前駆細胞、間葉系間質細胞、又は例えば、単球などの緩く接着した細胞である。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、細胞の、複数のマイクロキャリアの総表面積に対する比が１，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２、例えば、１，０００～９，０００細胞／ｃｍ２、又は１，０００～７，５００細胞／ｃｍ２、又は２，５００～１０，０００細胞／ｃｍ２、又は２，５００～９，０００細胞／ｃｍ２、又は２，５００～７，５００細胞／ｃｍ２、又は３，５００～１０，０００細胞／ｃｍ２、又は３，５００～９，０００細胞／ｃｍ２、又は３，５００～７，５００細胞／ｃｍ２となるように、いくつかの足場依存性細胞がバッグに添加される。
バッグは所望のインキュベーション温度に維持することができ、撹拌することができる。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、バッグを揺動させるステップを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、（例えば、固定された細胞をトリプシンに曝露することによって）培養された細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、次いで、（例えば、バッグの内部区画内にマイクロキャリアを保持するように構成されたフィルタを通して）培養された細胞をバッグから取り出すステップと、を更に含む。
上述したように、本明細書に記載のバッグは、有利には、１つ以上の灌流成分を含むことができる。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグは、分割されていない内部区画と、内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、ポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備える。このような実施形態では、第１の液体透過性チューブは、チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える。本発明者らは、望ましくは、第２のチューブから内部容積を通って第１のチューブの外に培地を流すことによって、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、フィード培地をバッグの内部区画に通して灌流することができることに注目する。第１のチューブの第１のフィルタ層は、マイクロキャリアが内部区画の内部容積から逃げるのを防止することができる。したがって、足場依存性細胞は、フィード培地供給制限及び／又は廃棄物除去制限なしに、内部区画において増殖及び濃縮され得る。存在する場合、第３のポートは、培地サンプリング並びに内部区画への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入のために使用され得る。本発明者らは更に、有利には、細胞培養プロセスに続いて、培養された細胞をマイクロキャリアから分離し、第１のフィルタ層を通して（例えば、マイクロキャリアを内部区画に保持する）バッグから取り出すことができることに注目する。
しかし、当業者は、第１及び第２のポートのうちの１つ以上に対してフィルタを様々な方法で、すなわち、例えば、灌流中にマイクロキャリアがバッグから出るのを防止するために、フィルタを通して内部区画（internal compartment）を出る培地を濾過するのに好適な方法で配列することができる。
特に、このような実施形態では、内部区画は分割されていなくてもよい（例えば、第１及び第２のチューブが第１のサブ区画内にあり、第３のポートが、膜又は他の多孔質構造によって第１のサブ区画から分割された第２のサブ区画に接続されるように、内部区画を分割する膜又は他の多孔質構造がない）。本発明者らは、これが、インキュベーション細胞と灌流培地との間の良好な流体移動を有利に可能にし得ることに注目する。
そのようなバッグの実施形態が、図１の概略上面図（上）及び断面図（下）に示されている。図１のバッグ１００は、長軸１３２を有する分割されていない内部区画１３０の周りに縁部を形成するように、それらの縁部で共に結合された第１のポリマーフィルム１１０及び第２のポリマーフィルム１２０を含む。バッグ１００は、第１のポート１４０及び第２のポート１５０を更に含み、両方とも内部区画１３０と流体連通する。図１の特定の実施形態では、第１のポート１４０は、第１の液体透過性チューブ１７０に動作可能に結合され、第２のポート１５０は、第２の液体透過性チューブ１８０に動作可能に結合される。図１の実施形態では、バッグ１００は、内部区画１３０と流体連通する第３のポート１６０を更に含む。しかしながら、当業者は、第３のポートが、本明細書で企図される全ての実施形態において存在するという必要がないことを理解するであろう。マイクロキャリア１３５は、内部区画１３０内に配置することができる。
図２は、本明細書に記載されるバッグ、例えば、図１のバッグの構成に使用するのに好適なポリマーフィルムの部分断面図である。ここで、ポリマーフィルム１１０は、本明細書に別様に記載されるフルオロポリマーを含む（例えば、フルオロポリマーである）内側層１１１と、本明細書に別様に記載されるポリマー（例えば、非フッ素化ポリマー）を含む（例えば、ポリマーである）外層１１２と、を有する。
本明細書に記載のバッグは、様々な容積で提供することができる。特に限定されないが、内部区画の容積は、例えば、５ｍＬ～３５００ｍＬ、例えば、１０ｍＬ～５００ｍＬ、又は１０ｍＬ～１００ｍＬ、又は１００ｍＬ～３０００ｍＬ、又は５００ｍＬ～２５００ｍＬ、又は５００ｍＬ～２０００ｍＬの範囲内であり得る。しかし、当業者が理解するように、異なる容積のバッグも企図される。
本明細書に記載のバッグは、望ましくは、第１のポートと第２のポートとの間を流れることによって、内部容積のかなりの部分を通る培地の灌流を可能にするように構成される。
例えば、上述した図１のもののような、第１のチューブ及び第２のチューブを含むバッグの様々な望ましい実施形態では、第１のチューブは、バッグの第１の側縁部に隣接して配置され、第２のチューブは、バッグの第２の反対側の側縁部に隣接して配置される。様々な実施形態では、各々がバッグの側縁部から２ｃｍ以内にある。例えば、図１の実施形態では、第１のチューブ１７０は、第１の側縁部１３４に隣接して配置され、第２のチューブ１８０は、第１の側縁部１３４からバッグの反対側にある第２の側縁部１３６に隣接して配置される。チューブは、例えば、互いに実質的に平行であってもよく、例えば、互いに２０度以内又は更に１０度以内であってもよい。特定の望ましい実施形態では、第１のチューブ及び第２のチューブは、バッグの長軸の方向に沿って延びる。例えば、図１の実施形態では、第１のチューブ１７０及び第２のチューブ１８０は、バッグの長軸１３２の方向に沿って延びる。当然ながら、他の実施形態では、チューブは任意の好適な方法で配列することができる。例えば、様々な実施形態では、第１のチューブ及び第２のチューブは、湾曲され、丸みを帯びたバッグの側縁部に沿って延びる。
当然ながら、他の実施形態では、チューブは含まれない。様々な実施形態では、フィルタは、第１のポート及び第２のポートのうちの１つ以上に配置されることができ、それを通してバッグから出る培地を濾過するように構成される。フィルタは、細胞を通過させるが、マイクロキャリアがバッグの外側に通過することを防止するように構成され得る。
第１、第２、及び（存在する場合）第３のポートは、バッグに沿って様々な位置に設置することができる。例えば、様々な実施形態では、第１及び第２のポートは、バッグの縁部、例えば、バッグ内へのチューブの延伸の方向に直交して延びる縁部に形成される。これは、図１のバッグに示されるように同じ縁部にあってもよく、又は両縁部にあってもよい。図１に示されるようなチューブを含む実施形態では、これは、第１及び第２のポートの相対位置が、共通方向に沿って（例えば、バッグの長軸に沿って）第１の液体透過性チューブ及び第２の液体透過性チューブの延伸を促進することを可能にする。第３のポートは、例えば、第１及び第２のポートの一方又は両方と同じ縁部に沿って形成することができる。図１の実施形態では、ポート１４０、１５０、及び１６０は、共通縁部に沿っている。しかし、第３のポートは、代替として、第１及び第２のポートが形成される縁部に直交する縁部に沿って、又は代替として、バッグの別の表面に沿って、例えば、細胞の重力支援除去を可能にする底面に沿って存在することができる。ポートの位置は、第１及び第２のポート（並びにそれに結合された第１及び第２のチューブ）の相対位置がバッグのかなりの容積を通した灌流を容易にする限り、特に限定されない。当業者は、本開示に基づいて、第１のポート及び第２のポート、並びに任意の構造（第１のチューブ及び第２のチューブなど）を配列して、例えば、バッグ内の灌流の流れにおけるデッドスポットを最小限に抑え、かつ／又は灌流の流れが細胞成長を妨害しないことを確実にする。存在する場合、第３のポートは、例えば、培地サンプリング並びにバッグの内部容積への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入を容易にするように位置付けられ得る。
本明細書に記載されるようなバッグを形成するために、１つ以上のポリマーフィルムの縁部は、高周波（ＲＦ）溶着、熱インパルス溶着、超音波溶着、ホットバー溶着、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒溶着、レーザ溶着、コロナ放電、放射、表面処理、極熱、ベルト、若しくは溶融積層、エッチング、プラズマ処理、押出、湿潤、接着剤、又はこれらの組み合わせなどの任意の望ましい方法によって（例えば、同じポリマーフィルムの他の縁部に、又は２つ以上のポリマーフィルムの場合は互いに）結合され得る。特定の望ましい実施形態では、１つ以上のフィルムは、熱溶着、レーザ溶着、又はホットバー溶着によって結合される。
存在する場合、第１のチューブ及び第２のチューブは、カラー封止プロセスによって（例えば、高周波溶着、超音波溶着、熱インパルス溶着、ホットバー溶着、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒溶着、レーザ溶着、コロナ放電、放射、極熱若しくは溶融積層、エッチング、プラズマ処理、湿潤、接着剤、又はこれらの組み合わせによって）、バッグの１つ以上の縁部に形成されたそれぞれの第１及び第２のポートに取り付けられ得る。これは、バッグの形成時に行うことができる。第１のチューブは、その外側フィルタ層が、細胞が内部区画からチューブを通って第１のポートから外に送られることを防止することができるように、（例えば、カラー封止によって）封止することができる。したがって、第１及び／又は第２のチューブは、バッグの外側からバッグの内側に延びることができる（その多孔性部分は、望ましくは、実質的にバッグ内にのみ延びる）。当然ながら、他の実施形態では、第１及び／又は第２のチューブは、バッグで終端し、他のチューブを通して流体システムに接続することができる。そのような他のチューブは、第１及び第２の流体透過性チューブについて本明細書に記載されるものと同じ材料から作製され得る。
上述のように、様々な実施形態では、第１のチューブ（例えば、図１のチューブ１７０）は、チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える。本明細書に詳細に記載されるように、第１の内側支持構造は、様々な形態、例えば、穿孔されたか、若しくはそうでなければ多孔性のチューブ、フレーム、又は螺旋状に巻かれたフィラメントの形態をとり得る。支持構造は、本明細書の図に示されるように断面が円形であってもよく、又は他の断面形状、例えば多角形を有してもよい。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、支持構造及び外側フィルタ層の材料は、チューブを通る液体の流れが最小圧力で開始又は維持されることができるように、親水性、自己湿潤性、及び／又は十分に多孔性である。
そのような流体透過性チューブの実施形態が、図３の切り取り図に示されている。図３のチューブ３００は、螺旋状に巻かれたフィラメント３７２と、フィラメントを取り囲む外側フィルタ層３７４と、を含む。外側フィルタ層３７４は、少なくともポート（例えば、図１のポート１４０）において螺旋状に巻かれたフィラメント３７２に取り付けられるが、フィラメントに沿った１つ以上の追加の点において螺旋状に巻かれたフィラメント３７２に取り付けられ得る。外側フィルタ層は、螺旋状に巻かれたフィラメントを比較的緩く取り囲むことができ（例えば、フィラメント３７２上の緩いバッグとして）、又は螺旋状に巻かれたフィラメントに対してより緊密に配置することができる（例えば、フィラメント３７２上の密着スリーブとして）。
したがって、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の内側支持構造は、螺旋状に巻かれたフィラメントを備える。フィラメントは、比較的剛性であっても比較的可撓性であってもよく、当然ながら、フィラメントがチューブの中央ルーメンを画定し、第１の外側フィルタ層を支持することができる限り、比較的きつく巻かれていても比較的緩く巻かれていてもよい。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、フィラメントは、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有するポリマーを含む（例えば、ポリマーである）。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、フィラメントは、（例えば、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有する）フルオロポリマー、ポリメチルペンテン、又はこれらの組み合わせを含む（例えば、これらから形成される）。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、螺旋状に巻かれたフィラメントの間隔（すなわち、中央ルーメンの軸に沿った）は、複数のマイクロキャリアの平均サイズとほぼ等しいか、又は更にそれよりも大きい。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、螺旋状に巻かれたフィラメントの間隔は、少なくとも５００μｍ、又は５００μｍ～１０ｍｍ、若しくは５００μｍ～７．５ｍｍ、若しくは５００μｍ～５ｍｍの範囲内である。本発明者らは、１００μｍより大きい間隔を有するチューブが、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、望ましい流量での培養培地灌流を有利に促進することができると判定した。
本明細書に別様に記載されるような他の実施形態では、支持構造は、例えば、フィラメント形状材料から形成されるが、螺旋とは異なって配列される、フレームとして提供することができる。フィラメント及びフィラメントの間隔は、螺旋状に巻かれたフィラメントについて上述した通りであってもよい。
本明細書で別様に提供されるような他の実施形態では、支持構造は、多孔質チューブの形態であり得る。１つのこのような実施形態（例えば、図１のチューブ１７０として使用するための）が、図４に切り取られて示されている。図４のチューブ４７０は、多孔質チューブ４７２と、多孔質チューブを取り囲む外側フィルタ層４７４と、を含む。外側フィルタ層は、少なくともポート（例えば、図１のポート１４０）において多孔質チューブに取り付けられるが、チューブに沿った１つ以上の追加の点において多孔質チューブに取り付けられ得る。外側フィルタ層は、多孔質チューブを比較的緩く取り囲むことができ（例えば、多孔質チューブ４７２上のバッグとして）、又は多孔質チューブに対してより緊密に配置することができる（例えば、多孔質チューブ４７２上のスリーブとして）。
したがって、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の内側支持構造は、第１の多孔質チューブを備える。チューブは、当然ながら、チューブが第１の外側フィルタ層を支持することができる限り、比較的可撓性であっても比較的剛性であってもよい。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、多孔質チューブは、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有するポリマーを含む（例えば、ポリマーから形成される）。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブは、（例えば、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有する）エラストマー、フルオロポリマー、ポリメチルペンテン、又はこれらの組み合わせを含む（例えば、これらから形成される）。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、多孔質チューブは、（例えば、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有する）シリコーン又はポリ塩化ビニルを含む（例えば、これらから形成される）。例えば、特定のこのような実施形態では、多孔質チューブは、シリコーンエラストマーを含む。別の例では、特定のこのような実施形態では、多孔質チューブは、フッ素化エチレンプロピレンを含む。しかし、他の好適な材料と同様に、様々なフッ素化及び非フッ素化ポリマーを使用することができる。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブは、１００μｍ～５，０００μｍの範囲内の平均孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブの平均孔径は、１００～２５００μｍ、又は１００～１０００μｍ、又は２５０～５０００μｍ、又は２５０～２５００μｍ、又は２５０～１０００μｍ、又は５００～５０００μｍ、又は５００～２５００μｍ、又は５００～１０００μｍである。本明細書で使用される場合、平均孔径は、細孔が好都合な光学的測定には小さすぎる場合に、キャピラリーフローポロメトリーによって測定される。当業者は、１０μｍ～５，０００μｍの範囲内の孔径が、ほとんどのマイクロキャリアのサイズとほぼ同等であるか、又はそれより大きくなり得ることを認識するであろう。しかしながら、本発明者らは、多孔質チューブが、特に外側フィルタ層と共に使用される場合に、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、望ましい流量での培養培地灌流を有利に促進することができると判定した。
多孔質チューブは、広い範囲内の多孔率を有することができる。当業者は、機械的安定性及び流量の所望の組み合わせを提供する多孔率を選択するであろう。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブは、１０％～９０％の範囲内の多孔率を有する。当業者は、物品中の細孔の容積の、材料の総容積に対する尺度である多孔率は、いくつかの既知のポロシメトリー法によって測定することができることを理解するであろう。本明細書で使用される場合、水蒸発は、細孔が好都合な光学的測定には小さすぎる場合に、チューブの多孔率を測定するために使用される。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブの多孔率は、２０％～９０％、又は３０％～９０％、又は４０％～９０％、又は５０％～９０％、又は１０％～８０％、又は１０％～７０％、又は１０％～６０％、又は１０％～５０％、又は２０％～８０％、又は３０％～７０％、又は４０％～６０％の範囲内である。
多孔質チューブの多孔性は、当該分野で認識されている多くの方法、例えば、成形、熱穿孔、レーザ穿孔、電子ビーム穿孔、放電加工、機械穿孔、スタンピング、又は切断のいずれかによって提供することができる。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第１の多孔質チューブの多孔性の大部分は、第２の液体透過性チューブの反対側の表面（例えば、半円筒形表面）上に局在化される。有利には、本発明者らは、第２の液体透過性チューブから離れたチューブの多孔性の配向が、第２の液体透過性チューブから第１の液体透過性チューブへの培養培地灌流によってもたらされる培養された細胞の妨害及び／又はマイクロキャリアの減少を更に最小限にすることができると判定した。したがって、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の多孔質チューブの多孔率の少なくとも６５％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％は、第２の液体透過性チューブの反対側の表面（例えば、半円筒形表面）上に局在化される。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第１の多孔質チューブの多孔性は、液体透過性チューブの中央ルーメンの軸に沿って比較的均一に分布され、すなわち、バッグの長軸に沿った均一灌流を促進する。
上述したように、第１のチューブは、第１の内側支持構造の周りに配置された第１の外側フィルタ層を含み得る。第１の外側フィルタ層は、灌流中にマイクロキャリアがバッグから逃げるのを防止するのに役立つように選択された平均孔径を有する多孔質材料から形成される。様々な実施形態では、平均孔径は、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均サイズよりも小さくなるように選択される。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の外側フィルタ層は、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満の平均孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の外側フィルタ層の平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。当業者は、２００μｍ以下の孔径が、ほとんどのマイクロキャリアとほぼ同等であるか、又はそれよりも小さくなり得ることを認識するであろう。驚くべきことに、本発明者らは、外側フィルタ層（例えば、培養された細胞に対して小さな機能的孔径を有する）と内側支持構造（例えば、培養された細胞に対して大きな機能的孔径又は間隔を有する）との組み合わせが、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、望ましい流量での培養培地の灌流を促進することができると判定した。しかし、フィルタ孔径がマイクロキャリアサイズよりもいくらか大きい場合であっても、フィルタは、灌流中の内部容積からのマイクロキャリアの著しい損失を防止するのに有効であり得る。
特定の望ましい実施形態では、第１の外側フィルタ層は、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均直径の約１００％未満、例えば、約７５％未満、又は約５０％未満、又は約４０％未満、又は約３０％未満、又は約２５％未満の平均孔径及び／又はＤ９９孔径を有する。
当業者は、フィルタ層の「機能的」孔径が、層内の孔の平均サイズ及び最大サイズの両方に応じて異なることを理解するであろう。したがって、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、フィルタ層のＤ９９孔径（すなわち、９９パーセンタイルのサイズである細孔のサイズ）は、フィルタ層の平均孔径と最大１００％、例えば、最大５０％、最大３０％、又は最大１０％異なる。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、フィルタ層のＤ９９孔径は、５００μｍ未満、例えば、２５０μｍ未満、又は２００μｍ未満、又は１５０μｍ未満である。
しかしながら、当業者が理解するように、第１の外側フィルタ層の小さい平均孔径は、バッグを通る流れを減速させることがある。したがって、当業者は、所望のマイクロキャリアのための濾過を提供するのに十分小さいが、バッグを通る所望の流量を提供するのに十分大きい孔径を選択することができる。例えば、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、バッグに含まれるマイクロキャリアは、１００～４００μｍの平均直径を有し、第１の外側フィルタ層の平均孔径は、１０～２００μｍである（例えば、マイクロキャリアの平均直径より小さい）。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第１の外側フィルタ層は、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有するポリマーを含む（例えば、ポリマーから形成される）。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の外側フィルタ層は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の外側フィルタ層は、ステンレス鋼を含む。特定のこのような実施形態では、第１の外側フィルタ層は、ポリマー被覆ステンレス鋼（例えば、ポリテトラフルオロエチレン被覆ステンレス鋼）を含む。
しかしながら、本明細書に別様に記載されるようなバッグの他の実施形態では、第１のチューブは、支持構造から分離されたフィルタ層を含むものではないが、代わりに、第１の外側フィルタ層について本明細書に記載される平均孔径を有するチューブである。これは、例えば、多孔質フィルム材料をチューブに形成することによって（例えば、溶着によって）、又は所望の孔径を有する剛性管状材料を提供することによって、作製することができる。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１のチューブは、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満の平均孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１のチューブの平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。特定の望ましい実施形態では、第１のチューブは、例えば、第１の外側フィルタ層に関して上述したように、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均直径の約１００％未満、例えば、約７５％未満、又は約５０％未満、又は約４０％未満、又は約３０％未満、又は約２５％未満の平均孔径及び／又はＤ９９孔径を有する。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第１のチューブのＤ９９孔径（すなわち、９９パーセンタイルのサイズである細孔のサイズ）は、チューブの平均孔径と最大５０％、例えば、最大３０％、又は最大１０％異なる。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第１のチューブのＤ９９孔径は、５０μｍ未満、例えば、２０μｍ未満である。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１のチューブは、１０μｍ未満のＤ９９孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１のチューブのＤ９９孔径は、５００μｍ未満、例えば、２５０μｍ未満、又は２００μｍ未満、又は１５０μｍ未満である。特定の望ましい実施形態では、第１のチューブは剛性であり、すなわち、その中を流れる流体の圧力なしにその断面形状を維持するのに十分に剛性である。
第２の液体透過性チューブ（例えば、図１のチューブ１８０）は、概して、培地をバッグの内部区画に投入するために使用されるため、多くの実施形態では、フィルタ層を有する必要はない。したがって、様々な実施形態では、第２の液体透過性チューブは、外側フィルタ層を有していない、第１の液体透過性チューブの多孔質チューブ支持構造について上述したようなものであり得る。第２の液体透過性チューブは、様々な他の管状構造をとることができる。
しかしながら、本明細書に別様に記載されるような他の実施形態では、第２の液体透過性チューブは、チューブの中央ルーメンを画定する第２の内側支持構造と、第２の内側支持構造を取り囲む第２の外側フィルタ層と、を備える。そして、他の実施形態では、第２の液体透過性チューブは、２００μｍ以下の平均孔径を有するチューブである。このような実施形態では、第２の液体透過性チューブは、第１の液体透過性チューブについて本明細書の任意の実施形態において別様に記載されるようなものであり得る。有利には、このようなバッグは、第２のチューブから、内部容積を通って、第１のチューブの外への、上述したような培地の流れを可能にし、その逆も同様である。本発明者らは、このような実施形態において灌流の方向を逆にすることによって、細胞を第１の外側フィルタ層から除去することができるが、内部区画内に保持することができると判定した。当然ながら、このような「双方向」バッグはまた、ユーザによるより便利なセットアップ及び操作を容易にすることができる。特定の望ましい実施形態では、第２の液体透過性チューブの内側支持構造及び外側フィルタ層は、第１の液体透過性チューブの任意の実施形態に関して本明細書に記載される通りである。図３及び図４に示す構造は、様々な実施形態では、第２の液体透過性チューブとして使用することができる。
例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第２の内側支持構造は、螺旋状に巻かれたフィラメント（例えば、上述した螺旋状に巻かれたフィラメント）を備える。特定のこのような実施形態では、第１の液体透過性チューブの第１の内側支持構造はまた、螺旋状に巻かれたフィラメントを備える。同様に、本明細書に別様に記載されるような特定の他の実施形態では、第２の内側支持構造は、フレーム構造を備える。特定のこのような実施形態では、第１の液体透過性チューブの第１の内側支持構造はまた、フレーム構造を備える。
別の例では、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第２の内側支持構造は、多孔質チューブ（例えば、上述したような多孔質チューブ）を備える。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第１の内側支持構造は第１の多孔質チューブを備え、第２の内側支持構造は第２の多孔質チューブを備える。特定のこのような実施形態では、第２の多孔質チューブ（例えば、及び第１の多孔質チューブ）は、１００～２５００μｍ、又は１００～１０００μｍ、又は２５０～５０００μｍ、又は２５０～２５００μｍ、又は２５０～１０００μｍ、又は５００～５０００μｍ、又は５００～２５００μｍ、又は５００～１０００μｍの範囲内の機能的孔径を有する。特定のこのような実施形態では、第２の多孔質チューブ（例えば、及び第１の多孔質チューブ）は、１０％～９０％、又は２０％～８０％、又は３０％～７０％の範囲内の多孔率を有する。特定のこのような実施形態では、第２の多孔質チューブの多孔率の少なくとも６０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも９０％が、第１の液体透過性チューブの反対側の表面（例えば、半円筒形表面）上に局在化される（例えば、第１の多孔質チューブの多孔率の少なくとも６０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも９０％が、第２の液体透過性チューブの反対側の表面（例えば、半円筒形表面）上に局在化される）。様々な実施形態では、第２の多孔質チューブ（例えば、及び第１の多孔質チューブ）は、シリコーンエラストマーを含む。様々な実施形態では、第２の外側フィルタ層（例えば、及び第１の外側フィルタ層）は、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満の平均孔径を有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第２の外側フィルタ層の平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。様々な実施形態では、第２の外側フィルタ層（例えば、及び第１の外側フィルタ層）は、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む。
そして、他の実施形態では、第２の液体透過性チューブは、第２の支持構造及び第２の外側フィルタ層を含まないチューブであるが、代わりに、第２の外側フィルタ層について本明細書に記載される孔径を有するチューブの形態である。これは、例えば、多孔質フィルム材料をチューブに形成することによって（例えば、溶着によって）、又は所望の孔径を有する剛性管状材料を提供することによって、作製することができる。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第２のチューブは、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満の平均孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、第２のチューブの平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。特定の望ましい実施形態では、第２のチューブは、例えば、第１の外側フィルタ層に関して上述したように、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均直径の約１００％未満、例えば、約７５％未満、又は約５０％未満、又は約４０％未満、又は約３０％未満、又は約２５％未満の平均孔径及び／又はＤ９９孔径を有する。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、第２のチューブのＤ９９孔径（すなわち、９９パーセンタイルのサイズである細孔のサイズ）は、第２のチューブの平均孔径と最大５０％、例えば、最大３０％、又は最大１０％異なる。特定の望ましい実施形態では、第２のチューブは剛性であり、すなわち、その中を流れる流体の圧力なしにその断面形状を維持するのに十分に剛性である。
第２の液体透過性チューブが第２のフィルタ層によって覆われているか、又は上述したように小さな孔径を有する場合、バッグの内部容積への細胞の導入及び／又はバッグの内部容積からの細胞の除去を単純化するために、第３のポートが存在することが望ましい場合がある。
上述のように、本発明者らは、第１及び／又は第２のポートにおける濾過が、本明細書で提供される管状構造以外によって提供され得ることを企図する。例えば、フィルタは第１のポートに動作可能に結合され得、及び／又はフィルタは第２のポートに動作可能に結合され得る。他の例では、フィルタは、ポートを細胞培養システムの他の部分に接続するように作用するコネクタに差し込まれ得る。これらのフィルタは、概して、上述したものと同じ特性を有することができる。例えば、様々な実施形態では、平均孔径は、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均サイズよりも小さくなるように選択される。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、フィルタは、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満の平均孔径を有する。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、フィルタの平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。当業者は、２００μｍ以下の孔径がほとんどのマイクロキャリアとほぼ同等又はそれより小さくなり得るが、フィルタ孔径がマイクロキャリアサイズよりもいくらか大きい場合であっても、フィルタは、灌流中の内部容積からのマイクロキャリアの著しい損失を防止するのに有効であり得る事を認識するであろう。特定の望ましい実施形態では、フィルタは、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均直径の約１００％未満、例えば、約７５％未満、又は約５０％未満、又は約４０％未満、又は約３０％未満、又は約２５％未満の平均孔径及び／又はＤ９９孔径を有する。当業者が理解するように、フィルタの「機能的」孔径は、層内の孔の平均サイズ及び最大サイズの両方に応じて異なる。したがって、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、フィルタのＤ９９孔径（すなわち、９９パーセンタイルのサイズである細孔のサイズ）は、フィルタの平均孔径と最大１００％、例えば、最大５０％、最大３０％、又は最大１０％異なる。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、フィルタのＤ９９孔径は、５００μｍ未満、例えば、２５０μｍ未満、又は２００μｍ未満、又は１５０μｍ未満である。しかしながら、当業者が理解するように、フィルタの小さい平均孔径は、バッグを通る流れを減速させることがある。したがって、当業者は、所望のマイクロキャリアのための濾過を提供するのに十分小さいが、バッグを通る所望の流量を提供するのに十分大きい孔径を選択することができる。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な望ましい実施形態では、バッグに含まれるマイクロキャリアは、１００～４００μｍの平均直径を有し、フィルタの平均孔径は、５０～２００μｍである（例えば、マイクロキャリアの平均直径より小さい）。
上述のように、本発明者らは、本明細書に記載のバッグが、マイクロキャリア細胞培養を通して培地を灌流するために有用であると判定した。したがって、本開示の別の態様は、細胞を培養する方法であって、本明細書に別様に記載されるようなバッグ（例えば、図１のバッグ１００）を提供するステップであって、バッグが内部区画（例えば、内部区画１３０）内に培地及び細胞（例えば、本明細書に別様に記載される）を含む、ステップと、第２のポート（例えば、ポート１５０）を通して（及び第２の液体透過性チューブ（例えば、チューブ１８０）を通して）培地を添加することによって内部区画を通して培地を流すステップと、第１のポート（例えば、ポート１４０）から（存在する場合、第１の液体透過性チューブ（例えば、チューブ１７０）を介して）培地を除去するステップと、を含む、方法である。様々なこのような実施形態では、内部区画内に培地及び細胞を含むバッグは、バッグの外面に形成されバッグの内部区画と流体連通する第３のポート（例えば、ポート１６０）を通して、培地及び細胞をバッグに添加することによって提供され得る。しかしながら、他の実施形態では、特に第３のポートが存在しない場合、第１又は第２のポートを使用して、培地及び細胞をバッグに入れることができる。例えば、０．５～２０ｍＬ／分の範囲内の様々な流量を使用することができる。流量は、望ましくは、マイクロキャリアが培養培地中に懸濁されたままであることを可能にするのに十分に低い。当然ながら、通常の動作の過程にわたって、流量は変化し得、又は更に不連続であり得る（例えば、偶発的に、又は細胞活性に基づいて）。したがって、別の例では、流量は、１日当たり０．２～２バッグ容積置換の範囲であり得る。バッグは、灌流中に所望のインキュベーション温度に維持することができ、揺動又は他の方法で撹拌することができる。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、（例えば、マイクロキャリア接着細胞の数を所望の第１のレベルに増加させるのに十分な）インキュベーション期間後に、追加の複数のマイクロキャリアをバッグに添加するステップ（例えば、培養された細胞に利用可能な接着基質の総面積を増加させるために）を含む。様々な実施形態では、追加の複数のマイクロキャリア（例えば、本明細書に別様に記載されるようなマイクロキャリアを含む）は、バッグの外面にありバッグの内部区画と流体連通する第３のポート（例えば、ポート１６０）を通る。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、（例えば、マイクロキャリア接着細胞の数が所望の最終レベルまで増加した後に）マイクロキャリアから培養された細胞を分離するステップと、次いで、バッグの内部区画から培養された細胞を取り出すステップと、を更に含む。当業者が理解するように、接着細胞をマイクロキャリアから分離する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアから培養された細胞を分離するステップは、トリプシンをフィード培地（例えば、第２のポートを通して流される）に添加するステップを含む。
本発明者らは、有利には、培養された細胞が、第１のポート（例えば、ポート１４０）を通して（存在する場合、第１の液体透過性チューブ（例えば、チューブ１７０）を介して）バッグの内部区画から取り出され得るが、マイクロキャリアは、例えば、第１のチューブ、第１の多孔質チューブ、又はいくらかの他のフィルタの周りに配置された第１の外側フィルタ層である、第１のポートに動作可能に結合されたフィルタによって内部区画内に保持されることに注目する。
しかしながら、本発明者らは、第１のポート又は第２のポートに対して動作可能に結合されたフィルタが、本開示のシステム及び方法において要件とされないことに注目する。いくつかの実施形態では、流れは、マイクロキャリアのかなりの部分をバッグから押し出すことを回避するように制御され得る。しかしながら、他の実施形態では、多孔質膜を使用して、マイクロキャリアが配置される内部区画の容積から第１及び第２のポートを連通する内部区画の容積を分離することができる。膜の孔径がマイクロキャリアのサイズよりもいくらか大きい場合であっても、膜は、第１のポートと第２のポートとの間の流れがマイクロキャリアを妨害して運び去ることを可能にすることなく、区画間の培地の交換を可能にすることができる。
したがって、別の例では、本明細書に記載されるバッグは、灌流膜を含むことができる。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグは、内部区画の第１の部分を内部区画の第２の部分から分離する第１の多孔質膜であって、第２の部分は複数のマイクロキャリアを含有する、第１の多孔質膜と、バッグの外面に形成された第３のポートと、を備える。このような実施形態では、第１のポート及び第２のポートは各々、内部区画の第１の部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の第２の部分と流体連通する。本発明者らは、望ましくは、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は内部区画の第２の部分に含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、フィード培地をバッグの内部区画の第１の部分に通して灌流することができることに注目する。本発明者らは、望ましくは、第１のポートと第２のポートとの間の内部容積を通って培地を流すことによって、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、フィード培地をバッグの内部区画に通して灌流することができることに注目する。内部区画を分割する多孔質膜は、マイクロキャリアが内部区画の第２の部分から逃げるのを防止することができる。したがって、足場依存性細胞は、フィード培地供給制限及び／又は廃棄物除去制限なしに、第２の部分において増殖及び濃縮され得る。第３のポートは、培地サンプリング並びに内部区画の第２の部分への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入のために使用され得る。本発明者らは更に、有利には、細胞培養プロセスに続いて、培養された細胞をマイクロキャリアから分離し、多孔質膜を通して（すなわち、マイクロキャリアを内部区画に保持する）バッグから取り出すことができることに注目する。別の実施形態では、第３のポートは、第１及び第２のポートに関して上述したように、それに動作可能に結合されたフィルタを有することができ、これにより、バッグからマイクロキャリアを除去することなく細胞を収集することができる。
そのようなバッグの実施形態が、図５の概略上面図（上）及び断面図（下）に示されている。図５のバッグ５００は、多孔質膜５３０によって第１の部分５４０及び第２の部分５５０に分離されている内部区画の周りに縁部を形成するように、それらの縁部で共に結合された第１のポリマーフィルム５１０及び第２のポリマーフィルム５２０を含む。バッグ５００は、各々内部区画の第１の部分５４０と流体連通する第１のポート５６０及び第２のポート５７０と、内部区画の第２の部分５５０と流体連通する第３のポート５８０と、を更に含む。
バッグは、望ましくは、第１のポートと第２のポートとの間を流れることによって、内部容積のかなりの部分を通る培地の灌流を可能にするように構成される。当業者は、本開示に基づいて、第１のポート及び第２のポートを配列して、例えば、バッグ内の灌流の流れにおけるデッドスポットを最小限に抑え、かつ／又は灌流の流れが細胞成長を妨害しないことを確実にする。第３のポートは、例えば、培地サンプリング並びにバッグの第２の部分への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入を容易にするように位置付けられ得る。
別の例では（図示せず）、バッグは、第１の部分内に延び第１の部分と流体連通する第１の液体透過性チューブ（例えば、本明細書に別様に記載されるような）であって、第１のポートに動作可能に結合された第１の液体透過性チューブと、第１の部分内に延び第１の部分と流体連通する第２の液体透過性チューブ（例えば、本明細書に別様に記載されるような）であって、第２のポートに動作可能に結合された第２の液体透過性チューブと、を備える。特定のこのような実施形態では、チューブは、例えば、互いに実質的に平行であり、バッグの反対側の縁部に隣接して配置され得る（例えば、多孔質膜上の流動培地の分布を増加させる）。
図５の実施形態では、内部区画は、第１のポリマーフィルム５１０及び多孔質膜５２０によって境界付けられた第１の部分５４０と、第２のポリマーフィルム５２０及び多孔質膜５３０によって境界付けられた第２の部分５５０とに分割される。当然ながら、内部区画は、そのように均等に分割される必要はない。例えば、図６の実施形態では、バッグ６００は、内部区画の周りに縁部を形成するように、それらの縁部で共に結合された第１のポリマーフィルム６１０及び第２のポリマーフィルム６２０を含み、多孔質膜６３０は、第２のポリマーフィルム６２０に結合された縁部を有し、内部区画を第１の部分６４０及び第２の部分６５０に分離する。別の例では、図７の実施形態では、バッグは、内部区画の周りに縁部を形成するように、それらの縁部で共に結合された第１のポリマーフィルム７１０及び第２のポリマーフィルム７２０を含み、多孔質膜７３０は、折り畳まれ、それらの縁部で結合されて、内部区画を第１の部分７４０及び第２の部分７５０に分離する。このような実施形態では、当業者は、本明細書に記載される第１のポート、第２のポート、及び第３のポートを位置付けて、例えば、バッグ内の灌流の流れにおけるデッドスポットを最小限に抑え、灌流の流れが細胞成長を妨害しないことを確実にし、バッグの第２の部分への細胞及び／若しくはマイクロキャリアの導入を容易にし、並びに／又はバッグ内の流体サンプリング若しくは監視の所望の位置を提供することができる。
更に別の例では、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、バッグは、内部区画の第１の部分を内部区画の中央部分から分離する第１の多孔質膜と、内部区画の第２の部分を内部区画の中央部分から分離する第２の多孔質膜であって、中央部分はマイクロキャリアを含有する、第２の多孔質膜と、バッグの外面に形成された第３のポートと、を備える。このような実施形態では、第１のポートは、内部区画の第１の部分と流体連通し、第２のポートは、内部区画の第２の部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の中央部分と流体連通する。本発明者らは、望ましくは、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は内部区画の中央部分に含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、フィード培地をバッグの内部区画の中央部分に通して灌流することができることに注目する。本発明者らは、望ましくは、第２のチューブから内部容積を通って第１のチューブの外へ培地を流すことによって、固定された細胞を感知できるほど妨害することなく、かつ／又は含まれるマイクロキャリアの数を減少させることなく、フィード培地をバッグの内部区画に通して灌流することができることに注目する。内部区画を分割する多孔質膜は、マイクロキャリアが内部区画の中央部分から逃げるのを防止することができる。したがって、足場依存性細胞は、フィード培地供給制限及び／又は廃棄物除去制限なしに、中央部分において増殖及び濃縮され得る。第３のポートは、培地サンプリング並びに内部区画の中央部分への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入のために使用され得る。本発明者らは更に、有利には、細胞培養プロセスに続いて、培養された細胞をマイクロキャリアから分離し、多孔質膜を通して（すなわち、マイクロキャリアを中央区画に保持する）バッグから取り出すことができることに注目する。
そのようなバッグの実施形態が、図８の概略上面図に示されている。図８のバッグ８００は、第１の多孔質膜８２０によって第１の側方部分８４０及び中央部分８５０に分離されており、第２の多孔質膜８３０によって第２の側方部分８６０及び中央部分８５０に分離されている内部区画の周りに縁部を形成するように、それらの縁部で共に結合された第１のポリマーフィルム８１０及び第２のポリマーフィルム（図示せず）を含む。バッグ８００は、内部区画の第１の側方部分８４０と流体連通する第１のポート８７０と、第２の側方部分８６０と流体連通する第２のポート８８０と、内部区画の中央部分８５０と流体連通する第３のポート８９０と、を更に含む。
バッグは、望ましくは、第２のポートから第１のポートに流れることによって、内部容積のかなりの部分を通る培地の灌流を可能にするように構成される。当業者は、本開示に基づいて、第１のポート及び第２のポートを配列して、例えば、バッグ内の灌流の流れにおけるデッドスポットを最小限に抑え、かつ／又は灌流の流れが細胞成長を妨害しないことを確実にする。第３のポートは、例えば、培地サンプリング並びにバッグの中央部分への細胞及び／又はマイクロキャリアの導入のために位置付けられ得る。
内部区画を分割する１つ以上の膜を含むバッグを形成するために、１つ以上のポリマーフィルム及び１つ以上の多孔質膜の縁部は、高周波溶着、熱インパルス溶着、超音波溶着、ホットバー溶着、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒溶着、レーザ溶着、コロナ放電、放射、表面処理、極熱、ベルト、若しくは溶融積層、エッチング、プラズマ処理、押出、湿潤、接着剤、又はこれらの組み合わせなどの任意の望ましい方法によって結合され得る。特定の望ましい実施形態では、ポリマーフィルムは、熱溶着、レーザ溶着、又はホットバー溶着によって共に結合される。
本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜は、０．１ｍｇ／ｃｍ２未満の水中全有機体炭素を有するポリマーを含む（例えば、ポリマーから形成される）。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、実質的にフルオロポリマー、例えば、少なくとも８０重量％、又は少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％、又は少なくとも９７．５重量％、又は少なくとも９８重量％、又は少なくとも９９重量％のフルオロポリマー（例えば、１つ以上のポリマーフィルムの内層に関して上述したように）を含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、及び官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーから選択される１つ以上のフルオロポリマーを含む。特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、少なくとも８０重量％（例えば、少なくとも９０重量％、又は少なくとも９５重量％）のフッ素化エチレン－プロピレンを含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は、ステンレス鋼を含む。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は、フルオロポリマー被覆基材を含む。例えば、特定のこのような実施形態では、１つ以上の多孔質膜は、フルオロポリマー被覆ステンレス鋼（例えば、ポリテトラフルオロエチレン被覆ステンレス鋼）を含む。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜（例えば、実質的にフルオロポリマーを含む）は各々個別に、０．００１～０．７ｍｍ、例えば、０．００１～０．４ｍｍ、又は０．００１～０．１ｍｍ、又は０．００５～０．７ｍｍ、又は０．００５～０．４ｍｍ、又は０．００５～０．１ｍｍ、又は０．０１～０．７ｍｍ、又は０．０１～０．４ｍｍ、又は０．０１～０．１ｍｍの厚さを有する。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、少なくとも９５重量％のフッ素化エチレン－プロピレンを含み、０．０１～０．１ｍｍの厚さを有する。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々、灌流中にマイクロキャリアが第２の部分又は中央部分から逃げるのを防止するのに役立つように選択された平均孔径を有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜の平均孔径は、２００μｍ未満、例えば、１５０μｍ未満である。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜の平均孔径は、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍである。
特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜は、バッグに含まれるマイクロキャリアの平均直径の約１００％未満、例えば、約７５％未満、又は約５０％未満、又は約４０％未満、又は約３０％未満、又は約２５％未満の平均孔径及び／又はＤ９９孔径を有する。
１つ以上の多孔質膜は、広い範囲内の多孔率を有することができる。当業者は、機械的安定性及び流量の所望の組み合わせを提供する多孔率を選択するであろう。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、１つ以上の多孔質膜は各々個別に、１０％～９０％の範囲内の多孔率を有する。本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、多孔質チューブの多孔率は、２０％～９０％、又は３０％～９０％、又は４０％～９０％、又は５０％～９０％、又は１０％～８０％、又は１０％～７０％、又は１０％～６０％、又は１０％～５０％、又は２０％～８０％、又は３０％～７０％、又は４０％～６０％の範囲内である。
多孔質膜の多孔性は、当該分野で認識されている多くの方法、例えば、成形、熱穿孔、レーザ穿孔、電子ビーム穿孔、放電加工、機械穿孔、スタンピング、又は切断のいずれかによって提供することができる。
当業者が理解するように、多孔質膜の「機能的」孔径は、膜内の孔の平均サイズ及び最大サイズの両方に応じて異なる。したがって、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜のＤ９９孔径（すなわち、９９パーセンタイルのサイズである細孔のサイズ）は、１つ以上の多孔質膜の平均孔径と最大１００％、例えば、最大５０％、最大３０％、又は最大１０％異なる。本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、１つ以上の多孔質膜のＤ９９孔径は、５００μｍ未満、例えば、２５０μｍ未満、又は２００μｍ未満、又は１５０μｍ未満である。
しかしながら、当業者が理解するように、１つ以上の多孔質膜の小さい平均孔径は、バッグを通る流れを減速させ、及び／又は培地が灌流される内部区画の部分とマイクロキャリアが配置される内部区画の部分との間の交換を減速させ得る。したがって、当業者は、所望のマイクロキャリアのための濾過を提供するのに十分小さいが、バッグを通る所望の流量を提供するのに十分大きい孔径を選択することができる。例えば、本明細書に別様に記載されるような特定の望ましい実施形態では、バッグに含まれるマイクロキャリアは、１００～４００μｍの平均直径を有し、１つ以上の多孔質膜の平均孔径は、５０～２００μｍである（例えば、マイクロキャリアの平均直径より小さい）。しかし、他の実施形態（例えば、図５～図７の実施形態に類似した実施形態）では、１つ以上の多孔質膜の平均孔径は、マイクロキャリアの平均直径よりもいくらか大きくてもよい。そのような場合であっても、それにかかわらず、膜はかなりの割合のマイクロキャリアが逃げるのを防止することができる。
上述のように、本発明者らは、本明細書に記載のバッグが、細胞培養を通して培地を灌流するために有用であると判定した。したがって、本開示の別の態様は、細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培地をマイクロキャリアとともに、本明細書に別様に記載されるようなバッグ（例えば、図５のバッグ５００又は図８のバッグ８００）の内部区画に提供するステップと、第１のポートと第２のポートとの間の内部区画を通して培地を流すステップと、を含む、方法である。フィルタが第１のポートに動作可能に結合される場合、流れは、例えば、第２のポートから第１のポートへの流れであり得る。１つ以上の膜が内部区画を様々な区画に分割する場合、マイクロキャリアをバッグに入れるために第３のポートを使用することができる。細胞及び培地は、同様に第３のポートを通して添加され得る。
例えば、０．５～２０ｍＬ／分の範囲内の様々な流量を使用することができる。流量は、望ましくは、マイクロキャリアが培養培地中に懸濁されたままであることを可能にするのに十分に低い。当然ながら、通常の動作の過程にわたって、流量は変化し得、又は更に不連続であり得る（例えば、偶発的に、又は細胞活性に基づいて）。したがって、別の例では、流量は、１日当たり０．２～２バッグ容積置換の範囲であり得る。バッグは、灌流中に所望のインキュベーション温度に維持することができ、揺動又は他の方法で撹拌することができる。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、（例えば、マイクロキャリア接着細胞の数を所望の第１のレベルに増加させるのに十分な）インキュベーション期間後に、追加の複数のマイクロキャリアをバッグに添加するステップ（例えば、培養された細胞に利用可能な接着基質の総面積を増加させるために）を含む。様々な実施形態では、追加の複数のマイクロキャリア（例えば、本明細書に別様に記載されるようなマイクロキャリアを含む）は、第３のポートを通り、又はフィルタが第１のポートに動作可能に結合される実施形態では、第２のポートを通る。
本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、本方法は、（例えば、マイクロキャリア接着細胞の数が所望の最終レベルまで増加した後に）マイクロキャリアから培養された細胞を分離するステップと、次いで、バッグの内部区画から培養された細胞を取り出すステップと、を更に含む。当業者が理解するように、接着細胞をマイクロキャリアから分離する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に別様に記載されるような様々な実施形態では、マイクロキャリアから培養された細胞を分離するステップは、トリプシンをフィード培地（例えば、第２のポートを通して流される）に添加するステップを含む。
本発明者らは、有利には、培養された細胞は、かなりの量のマイクロキャリアがバッグから出ることを防止するためにフィルタ又は多孔質膜を使用して、バッグの内部区画から取り出され得ることに注目する。すなわち、マイクロキャリアは、多孔質膜又はフィルタによって内部区画内に保持される。
実施例において、酸素及び二酸化炭素透過性バッグＡは、内側フッ素化エチレン－プロピレン層及び外側シリコーンゴム層を含むポリマーフィルムから形成された。バッグＡ及び比較の市販のフルオロポリマーバッグＣを、同様の標準条件下、オートクレーブ中で滅菌した（１２１℃で３０分間、続いて６０分間の乾燥時間）。図９に示されるように、バッグＣは、顕著に収縮し（フィルム押出「機械方向」、すなわち図示されるような垂直方向に２～５％、フィルム押出「横断方向」、すなわち図示されるような水平方向に１～３％）、バッグの内面に目に見えるしわを生じさせる。対照的に、バッグＡは、図１０に示すように、望ましく滑らかなままであった。
ポリスチレンマイクロキャリア、培地、及び接着細胞を滅菌バッグに添加し、次いでこれを揺動デバイス上でインキュベートした。最初のインキュベーション期間後、マイクロキャリア分布は、バッグＣよりもバッグＡの容積全体にわたってより均一に分布していた（バッグの内面のしわの間にマイクロキャリアの顕著な「プーリング」を示した）。そして、バッグＡからの（すなわち、マイクロキャリアからの分離後の）培養された細胞の総収率（培養容積当たり）は、バッグＣのものよりも顕著に高かった。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、バッグＡ中のマイクロキャリア（したがって、接着細胞）は、バッグＣ中のものよりも顕著に小さい剪断力及び衝突力にさらされ得、マイクロキャリアは、バッグＣの表面のしわと衝突し得、バッグＡの均一な分布におけるものよりも顕著に高い速度で他の「プールされた」マイクロキャリアと衝突し得ることに注目する。
本開示の追加の態様は、以下の非限定的な付番実施形態によって提供され、これらは、技術的にも論理的にも矛盾しない任意の数及び任意の組み合わせで組み合わせることができる。
実施形態１． 酸素透過性バッグであって、
バッグの内部区画の境界を画定する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、
バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、
内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、
内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグ。
実施形態２． 酸素透過性バッグが、
バッグの内部区画を形成するように結合された縁部を有する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、
内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグである、実施形態１に記載のバッグ。
実施形態３． 内層が、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態４． 内層がフッ素化エチレン－プロピレンを含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態５． 内層が０．００１～０．７ｍｍ（例えば、０．０１～０．１ｍｍ）の厚さを有する、実施形態１～４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態６． 外層がエラストマーを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態７． 外層が、天然ポリイソプレンゴム（ＮＲ）、合成ポリイソプレンゴム（ＩＲ）、ポリブタジエンゴム（ＢＲ）、クロロプレンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリルゴム（ＮＢＲ）及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、エチレン－酢酸ビニル（ＥＶＡ）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、並びにエラストマーＰＥＴのうちの１つ以上を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態８． 外層がポリメチルペンテンポリマー（ＰＭＰ）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態９． 外層が、シリコーンゴム（例えば、高粘稠度ゴム（ＨＣＲ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ）、液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）、室温加硫ゴム（ＲＴＶ）、熱可塑性シリコーンゴム（ＴＰＥ）、白金硬化シリコーンゴム、及び過酸化物硬化シリコーンゴムから選択される）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１０． 外層が０．０１～５ｍｍ（例えば、０．０５～１ｍｍ）の厚さを有する、実施形態１～９のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１１． 内層が、０．００１～０．７ｍｍ（例えば、０．０１～０．１ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）フッ素化エチレン－プロピレンを含み、
外層が、０．０１～５ｍｍ（例えば、０．１～０．５ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態１２． 内層及び外層が、（例えば、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒結合、レーザ溶着、表面処理、押出、共押出、コーティング、及び積層のうちの１つ以上によって）結合される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１３． マイクロキャリアが、１００～４００μｍ（例えば、１１０～３００μｍ、又は１２０～２７５μｍ）の平均直径を有する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１４． マイクロキャリアが、１～１．２５ｇ／ｍＬ（例えば、１～１．１５ｇ／ｍＬ、又は１～１．１ｇ／ｍＬ）の平均密度を有する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１５． マイクロキャリアが、０．１～１０ｃｍ２／ｍｇ（例えば、０．５～７．５ｃｍ２／ｍｇ、又は１～７．５ｃｍ２／ｍｇ）の平均比表面積を有する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１６． マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１７． マイクロキャリアが、１つ以上の細胞外マトリックス化合物（例えば、コラーゲンＩ、ポリ－Ｌ－リジン、フィブロネクチン、レトロネクチン、ヒアルロン酸、及びポリドーパミンから選択される）を含み、細胞外マトリックス化合物がマイクロキャリアの表面の少なくとも一部分を構成する、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１８． 内部区画に含まれる複数のマイクロキャリアが、バッグの内部区画の総表面積の少なくとも１００％（例えば、少なくとも５００％、又は少なくとも１０００％）である総表面積を有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１９． 分割されていない内部区画と、
内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、第１のポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
第１の液体透過性チューブは、チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２０． バッグの外面に形成され、バッグの内部区画と流体連通する第３のポートを備える、実施形態１９に記載のバッグ。
実施形態２１． 第１の内側支持構造が、第１の多孔質チューブを備える、実施形態１９又は実施形態２０に記載のバッグ。
実施形態２２． 第１の多孔質チューブが、１００～５，０００μｍの平均孔径、及び１０～９０％の多孔率を有する、実施形態２１に記載のバッグ。
実施形態２３． 第１の内側支持構造が、螺旋状に巻かれたフィラメントを備える、実施形態１９又は実施形態２０に記載のバッグ。
実施形態２４． 第１の外側フィルタ層が、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２５． 第１の外側フィルタ層が、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２６． 第２の液体透過性チューブが、チューブの中央ルーメンを画定する第２の内側支持構造と、第２の内側支持構造を取り囲む第２の外側フィルタ層と、を備える、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２７． 第２の内側支持構造が、螺旋状に巻かれたフィラメント又は第２の多孔質チューブを備える、実施形態２６に記載のバッグ。
実施形態２８． 第２の外側フィルタ層が、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態２６又は実施形態２７に記載のバッグ。
実施形態２９． 第２の外側フィルタ層が、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３０． 分割されていない内部区画と、
バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、ポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
第１の液体透過性チューブは、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３１． 第１の液体透過性チューブが、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態３０に記載のバッグ。
実施形態３２． 内部区画の第１の部分を内部区画の第２の部分から分離する多孔質膜であって、第２の部分は複数のマイクロキャリアを含有する、多孔質膜と、
バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
第１のポート及び第２のポートは各々、内部区画の第１の部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の第２の部分と流体連通する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３３． 多孔質膜がフルオロポリマーを含む、実施形態３２に記載のバッグ。
実施形態３４． 多孔質膜が、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態３２に記載のバッグ。
実施形態３５． 多孔質膜が、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍの平均孔径を有する、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３６． 多孔質膜が、１０～９０％（例えば、２０～７０％、又は３０～５０％）の多孔率を有する、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３７． 内部区画の第１の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第１の多孔質膜と、
内部区画の第２の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第２の多孔質膜であって、中央部分は複数のマイクロキャリアを含有する、第２の多孔質膜と、
バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
第１のポートは、内部区画の第１の側方部分と流体連通し、第２のポートは、内部区画の第２の側方部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の中央部分と流体連通する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３８． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、フルオロポリマーを含む、実施形態３７に記載のバッグ。
実施形態３９． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態３７に記載のバッグ。
実施形態４０． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態４１． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、１０～９０％（例えば、２０～７０％、又は３０～５０％）の多孔率を有する、実施形態３７～４０のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態４２． 細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培地をマイクロキャリアとともに、実施形態１～４１のいずれかに記載のバッグの内部区画に提供するステップと、第１のポートと第２のポートとの間の内部区画を通して培地を流すステップと、を含む、方法。
実施形態４３． バッグを（例えば、揺動させることによって）撹拌するステップを含む、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４． インキュベーション期間後、追加の複数のマイクロキャリアを（例えば、バッグの外面に形成された第３のポートを通して）バッグの内部区画に添加するステップを更に含む、実施形態４２又は４３に記載の方法。
実施形態４５． 培養された細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、
培養された細胞をバッグから取り出すステップと、を更に含む、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６． バッグが、実施形態１９～３１のいずれか１つに記載のバッグであり、第２のポートを通して及び第２の液体透過性チューブを通して培地を添加し、第１の液体透過性チューブを通して及び第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態４７． バッグを提供するステップが、バッグの外面に形成された第３のポートを通して、複数のマイクロキャリア及び培地を添加するステップを含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８． 培養された細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、
培養された細胞を、バッグの内部区画から、第１の液体透過性チューブを通して及び第１のポートを通して取り出すステップと、を更に含む、実施形態４６又は実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９． バッグが、実施形態３２～３６のいずれか１つに記載のバッグであり、培地及び足場依存性細胞が内部区画の第２の部分に提供され、第２のポートを通して培地を添加し、第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態５０． バッグが、内部区画の中央部分に培地及び足場依存性細胞を含む、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載のバッグであり、第２のポートを通して培地を添加し、第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態５１． 複数のマイクロキャリアが、第３のポートを通して内部区画に提供される、実施形態４９又は実施形態５０に記載の方法。
実施形態１． 酸素透過性バッグであって、
バッグの内部区画の境界を画定する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、
バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、
内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、
内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグ。
実施形態２． 酸素透過性バッグが、
バッグの内部区画を形成するように結合された縁部を有する１つ以上のポリマーフィルムであって、１つ以上のポリマーフィルムの各々は、バッグの内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第１のポートと、
バッグの外面に形成され、内部区画と流体連通する第２のポートと、
内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグである、実施形態１に記載のバッグ。
実施形態３． 内層が、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態４． 内層がフッ素化エチレン－プロピレンを含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態５． 内層が０．００１～０．７ｍｍ（例えば、０．０１～０．１ｍｍ）の厚さを有する、実施形態１～４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態６． 外層がエラストマーを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態７． 外層が、天然ポリイソプレンゴム（ＮＲ）、合成ポリイソプレンゴム（ＩＲ）、ポリブタジエンゴム（ＢＲ）、クロロプレンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリルゴム（ＮＢＲ）及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、エチレン－酢酸ビニル（ＥＶＡ）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、並びにエラストマーＰＥＴのうちの１つ以上を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態８． 外層がポリメチルペンテンポリマー（ＰＭＰ）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態９． 外層が、シリコーンゴム（例えば、高粘稠度ゴム（ＨＣＲ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ）、液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）、室温加硫ゴム（ＲＴＶ）、熱可塑性シリコーンゴム（ＴＰＥ）、白金硬化シリコーンゴム、及び過酸化物硬化シリコーンゴムから選択される）を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１０． 外層が０．０１～５ｍｍ（例えば、０．０５～１ｍｍ）の厚さを有する、実施形態１～９のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１１． 内層が、０．００１～０．７ｍｍ（例えば、０．０１～０．１ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）フッ素化エチレン－プロピレンを含み、
外層が、０．０１～５ｍｍ（例えば、０．１～０．５ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含む、実施形態１又は２に記載のバッグ。
実施形態１２． 内層及び外層が、（例えば、化学結合、接着結合、熱溶融結合、溶媒結合、レーザ溶着、表面処理、押出、共押出、コーティング、及び積層のうちの１つ以上によって）結合される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１３． マイクロキャリアが、１００～４００μｍ（例えば、１１０～３００μｍ、又は１２０～２７５μｍ）の平均直径を有する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１４． マイクロキャリアが、１～１．２５ｇ／ｍＬ（例えば、１～１．１５ｇ／ｍＬ、又は１～１．１ｇ／ｍＬ）の平均密度を有する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１５． マイクロキャリアが、０．１～１０ｃｍ２／ｍｇ（例えば、０．５～７．５ｃｍ２／ｍｇ、又は１～７．５ｃｍ２／ｍｇ）の平均比表面積を有する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１６． マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１７． マイクロキャリアが、１つ以上の細胞外マトリックス化合物（例えば、コラーゲンＩ、ポリ－Ｌ－リジン、フィブロネクチン、レトロネクチン、ヒアルロン酸、及びポリドーパミンから選択される）を含み、細胞外マトリックス化合物がマイクロキャリアの表面の少なくとも一部分を構成する、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１８． 内部区画に含まれる複数のマイクロキャリアが、バッグの内部区画の総表面積の少なくとも１００％（例えば、少なくとも５００％、又は少なくとも１０００％）である総表面積を有する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態１９． 分割されていない内部区画と、
内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、第１のポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
内部区画内に延び、内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
第１の液体透過性チューブは、チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２０． バッグの外面に形成され、バッグの内部区画と流体連通する第３のポートを備える、実施形態１９に記載のバッグ。
実施形態２１． 第１の内側支持構造が、第１の多孔質チューブを備える、実施形態１９又は実施形態２０に記載のバッグ。
実施形態２２． 第１の多孔質チューブが、１００～５，０００μｍの平均孔径、及び１０～９０％の多孔率を有する、実施形態２１に記載のバッグ。
実施形態２３． 第１の内側支持構造が、螺旋状に巻かれたフィラメントを備える、実施形態１９又は実施形態２０に記載のバッグ。
実施形態２４． 第１の外側フィルタ層が、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２５． 第１の外側フィルタ層が、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２６． 第２の液体透過性チューブが、チューブの中央ルーメンを画定する第２の内側支持構造と、第２の内側支持構造を取り囲む第２の外側フィルタ層と、を備える、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態２７． 第２の内側支持構造が、螺旋状に巻かれたフィラメント又は第２の多孔質チューブを備える、実施形態２６に記載のバッグ。
実施形態２８． 第２の外側フィルタ層が、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態２６又は実施形態２７に記載のバッグ。
実施形態２９． 第２の外側フィルタ層が、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３０． 分割されていない内部区画と、
バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、ポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
バッグの内部区画内に延び、バッグの内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
第１の液体透過性チューブは、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３１． 第１の液体透過性チューブが、ステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル、ナイロン、及びフッ素化エチレン－プロピレンのうちの１つ以上を含む、実施形態３０に記載のバッグ。
実施形態３２． 内部区画の第１の部分を内部区画の第２の部分から分離する多孔質膜であって、第２の部分は複数のマイクロキャリアを含有する、多孔質膜と、
バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
第１のポート及び第２のポートは各々、内部区画の第１の部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の第２の部分と流体連通する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３３． 多孔質膜がフルオロポリマーを含む、実施形態３２に記載のバッグ。
実施形態３４． 多孔質膜が、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態３２に記載のバッグ。
実施形態３５． 多孔質膜が、１０～２００μｍ、例えば、２０～２００μｍ、又は３０～２００μｍ、又は７５～２００μｍ、又は１０～１５０μｍ、又は２０～１５０μｍ、又は３０～１５０μｍ、又は５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍの平均孔径を有する、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３６． 多孔質膜が、１０～９０％（例えば、２０～７０％、又は３０～５０％）の多孔率を有する、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３７． 内部区画の第１の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第１の多孔質膜と、
内部区画の第２の側方部分を内部区画の中央部分から分離する第２の多孔質膜であって、中央部分は複数のマイクロキャリアを含有する、第２の多孔質膜と、
バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
第１のポートは、内部区画の第１の側方部分と流体連通し、第２のポートは、内部区画の第２の側方部分と流体連通し、第３のポートは、内部区画の中央部分と流体連通する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態３８． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、フルオロポリマーを含む、実施形態３７に記載のバッグ。
実施形態３９． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、フッ素化エチレン－プロピレン（ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、テトラフルオロエチレン－ペルフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／エチレンコポリマー（ＨＴＥ）、クロロトリフルオロエチレン／フッ化ビニリデンコポリマー、クロロトリフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー、エチレン／クロロトリフルオロエチレンコポリマー（ＥＣＴＦＥ）、エチレン／トリフルオロエチレンコポリマー、エチレン／テトラフルオロエチレンコポリマー（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン／プロピレンコポリマー（ＴＦＥ／Ｐ）、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレンコポリマー（ＦＥＰ／ＨＦＰ）、ヘキサフルオロプロピレン／テトラフルオロエチレン／ビニリデンコポリマー（ＴＨＶ）、又は官能化ポリマー末端基を有するペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ホモシクロポリマーのうちの１つ以上を含む、実施形態３７に記載のバッグ。
実施形態４０． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態４１． 第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜が各々個別に、１０～９０％（例えば、２０～７０％、又は３０～５０％）の多孔率を有する、実施形態３７～４０のいずれか１つに記載のバッグ。
実施形態４２． 細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培地をマイクロキャリアとともに、実施形態１～４１のいずれかに記載のバッグの内部区画に提供するステップと、第１のポートと第２のポートとの間の内部区画を通して培地を流すステップと、を含む、方法。
実施形態４３． バッグを（例えば、揺動させることによって）撹拌するステップを含む、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４． インキュベーション期間後、追加の複数のマイクロキャリアを（例えば、バッグの外面に形成された第３のポートを通して）バッグの内部区画に添加するステップを更に含む、実施形態４２又は４３に記載の方法。
実施形態４５． 培養された細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、
培養された細胞をバッグから取り出すステップと、を更に含む、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６． バッグが、実施形態１９～３１のいずれか１つに記載のバッグであり、第２のポートを通して及び第２の液体透過性チューブを通して培地を添加し、第１の液体透過性チューブを通して及び第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態４７． バッグを提供するステップが、バッグの外面に形成された第３のポートを通して、複数のマイクロキャリア及び培地を添加するステップを含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８． 培養された細胞をマイクロキャリアから分離するステップと、
培養された細胞を、バッグの内部区画から、第１の液体透過性チューブを通して及び第１のポートを通して取り出すステップと、を更に含む、実施形態４６又は実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９． バッグが、実施形態３２～３６のいずれか１つに記載のバッグであり、培地及び足場依存性細胞が内部区画の第２の部分に提供され、第２のポートを通して培地を添加し、第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態５０． バッグが、内部区画の中央部分に培地及び足場依存性細胞を含む、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載のバッグであり、第２のポートを通して培地を添加し、第１のポートを通して培地を除去することによって、内部区画を通して培地を流す、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の細胞を培養する方法。
実施形態５１． 複数のマイクロキャリアが、第３のポートを通して内部区画に提供される、実施形態４９又は実施形態５０に記載の方法。
Claims (15)
- 酸素透過性バッグであって、
前記バッグの内部区画の境界を画定する１つ以上のポリマーフィルムであって、前記１つ以上のポリマーフィルムの各々は、
前記バッグの前記内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、
前記内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
前記バッグの外面に形成され、前記内部区画と流体連通する第１のポートと、
前記バッグの外面に形成され、前記内部区画と流体連通する第２のポートと、
前記内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグ。 - 前記酸素透過性バッグが、
前記バッグの内部区画を形成するように結合された縁部を有する１つ以上のポリマーフィルムであって、前記１つ以上のポリマーフィルムの各々は、前記バッグの前記内部区画に隣接する内層であって、フルオロポリマーを含む、内層と、前記内層に接着された、ポリマーを含む外層と、を含む、１つ以上のポリマーフィルムと、
前記バッグの外面に形成され、前記内部区画と流体連通する第１のポートと、
前記バッグの外面に形成され、前記内部区画と流体連通する第２のポートと、
前記内部区画に含まれる、複数のマイクロキャリアと、を備える、酸素透過性バッグである、請求項１に記載のバッグ。 - 前記内層がフッ素化エチレン－プロピレンを含む、請求項１に記載のバッグ。
- 前記外層がエラストマーを含む、請求項１に記載のバッグ。
- 前記外層が、シリコーンゴム（例えば、高粘稠度ゴム（ＨＣＲ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ）、液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）、室温加硫ゴム（ＲＴＶ）、熱可塑性シリコーンゴム（ＴＰＥ）、白金硬化シリコーンゴム、及び過酸化物硬化シリコーンゴムから選択される）を含む、請求項１に記載のバッグ。
- 前記内層が、０．００１～０．７ｍｍ（例えば、０．０１～０．１ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）フッ素化エチレン－プロピレンを含み、
前記外層が、０．０１～５ｍｍ（例えば、０．１～０．５ｍｍ）の厚さを有し、実質的に（例えば、少なくとも９５重量％）シリコーンゴムを含む、請求項１に記載のバッグ。 - 前記マイクロキャリアが、１００～４００μｍ（例えば、１１０～３００μｍ、又は１２０～２７５μｍ）の平均直径を有する、請求項１に記載のバッグ。
- 前記マイクロキャリアが、ポリスチレン、架橋デキストラン、又はセルロースを含む、請求項１に記載のバッグ。
- 前記内部区画に含まれる前記複数のマイクロキャリアが、前記バッグの前記内部区画の総表面積の少なくとも１００％（例えば、少なくとも５００％、又は少なくとも１０００％）である総表面積を有する、請求項１に記載のバッグ。
- 分割されていない内部区画と、
前記内部区画内に延び、前記内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、前記第１のポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
前記内部区画内に延び、前記内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、前記第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
前記第１の液体透過性チューブは、前記チューブの中央ルーメンを画定する第１の内側支持構造と、前記第１の内側支持構造を取り囲む第１の外側フィルタ層と、を備える、請求項１に記載のバッグ。 - 分割されていない内部区画と、
前記バッグの前記内部区画内に延び、前記バッグの前記内部区画と流体連通する第１の液体透過性チューブであって、前記ポートに動作可能に結合された、第１の液体透過性チューブと、
前記バッグの前記内部区画内に延び、前記バッグの前記内部区画と流体連通する第２の液体透過性チューブであって、前記第２のポートに動作可能に結合された、第２の液体透過性チューブと、を備え、
前記第１の液体透過性チューブは、５０～２００μｍ（例えば、５０～１５０μｍ、又は７５～１５０μｍ）の平均孔径を有する、請求項１に記載のバッグ。 - 前記内部区画の第１の部分を前記内部区画の第２の部分から分離する多孔質膜であって、前記第２の部分は前記複数のマイクロキャリアを含有する、多孔質膜と、
前記バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
前記第１のポート及び第２のポートは各々、前記内部区画の前記第１の部分と流体連通し、前記第３のポートは、前記内部区画の前記第２の部分と流体連通する、請求項１に記載のバッグ。 - 前記内部区画の第１の側方部分を前記内部区画の中央部分から分離する第１の多孔質膜と、
前記内部区画の第２の側方部分を前記内部区画の前記中央部分から分離する第２の多孔質膜であって、前記中央部分は前記複数のマイクロキャリアを含有する、第２の多孔質膜と、
前記バッグの外面に形成された第３のポートと、を備え、
前記第１のポートは、前記内部区画の前記第１の側方部分と流体連通し、前記第２のポートは、前記内部区画の前記第２の側方部分と流体連通し、前記第３のポートは、前記内部区画の前記中央部分と流体連通する、請求項１に記載のバッグ。 - 細胞を培養する方法であって、足場依存性細胞及び培地を前記マイクロキャリアとともに、請求項１～１３のいずれかに記載のバッグの前記内部区画に提供するステップと、前記第１のポートと前記第２のポートとの間の前記内部区画を通して培地を流すステップと、を含む、方法。
- 培養された細胞を前記マイクロキャリアから分離するステップと、
前記培養された細胞を前記バッグから取り出すステップと、を更に含む、請求項１４に記載の方法。
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