JP4107410B2

JP4107410B2 - 単球捕捉フィルター

Info

Publication number: JP4107410B2
Application number: JP2002080497A
Authority: JP
Inventors: 美雪清水; 正鮫島
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: JP2003274923A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、末梢血などから単球を選択的に分離できる単球捕捉フィルターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞機能の研究や、細胞の分離、培養技術の進歩によって、種々の疾患に対して細胞を移植する治療法が試みられている。このような治療では、血液や組織液など種々の細胞が混在した細胞懸濁液から目的細胞を分離し、培養等の操作の後、患者へ細胞を移植することが行われている。
【０００３】
樹状細胞は、強力な抗原提示細胞としての機能が最近明らかになり、細胞治療の一つとして研究が進められている。この治療は、樹状細胞に患者の癌細胞あるいは癌特異的抗原を提示する方法、樹状細胞に抗原遺伝子を導入する方法、樹状細胞を腫瘍細胞と細胞融合させる方法などの処理を行い、処理された樹状細胞を患者に戻すことで、患者の持つ免疫機能を強化させる一種の免疫療法であり、癌ワクチンとしての利用が期待されている。
【０００４】
この治療のために必要な樹状細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血に含まれるＣＤ３４陽性細胞から培養によって分化誘導させる方法、末梢血や臍帯血に含まれる未熟な樹状細胞を採取する方法、末梢血単核球分画から培養によって分化誘導させる方法などによって得られ、特に末梢血単球を利用する方法が臨床応用に広く用いられている。
【０００５】
末梢血単球を利用する方法では、最初にアフェレーシスや比重遠心法によって末梢血中の単球を分離し、さらに比重遠心法や非付着性細胞の除去を行うことによって単球を分離している。このようにして得られた単球は、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインや血清を添加した培養液中で培養される。
【０００６】
このような操作は、一般的な培養用の理化学用具を用いて行われているため、分離操作中に何回も分離用遠沈管に移し替える作業が必要であるので、操作が非常に煩雑である。また、遠心操作を繰り返すので、細胞へのダメージが大きく、細胞のロスの危険性が高いだけでなく、また、処理に時間を要する。さらに、分離操作と培養操作は、開放操作で行われるために細菌汚染の危険性が高い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡単な操作で、末梢血などから単球を効率良く分離することができる単球捕捉フィルターを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（４）の本発明により達成される。
【０００９】
（１）単球を含有する被処理液から単球を選択的に捕捉する単球捕捉フィルターであって、前記単球捕捉フィルターは、平均孔径が６〜８μｍであり、かつ肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比が１００〜２００であることを特徴とする単球捕捉フィルター。
【００１０】
（２）前記肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比が１２０〜１５０である上記（１）に記載の単球捕捉フィルター。
（３）前記単球を含有する被処理液は、末梢血である上記（１）または（２）に記載の単球捕捉フィルター。
（４）前記単球捕捉フィルターは、連通孔を有するスポンジ状多孔質体からなる上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の単球捕捉フィルター。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを詳細に説明する。
【００１８】
最初に、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターについて説明する。図１は、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いる単球分離器具の平面図であり、図２は、図１の断面図である。
【００１９】
図１および図２に示すように、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルター１１は、単球を含有する被処理液（例えば、末梢血、臍帯血など）から単球を選択的に捕捉できる濾材であり、ハウジング１２内を流入室１５と流出室１６とに区分するように設けられている。ハウジング１２は、ガス透過性がある材質からなり、流入口１３および流出口１４を有するものである。本実施例において、単球分離器具１は、ハウジング１２と単球捕捉フィルター１１とを備えるものであり、流入口１３からハウジング１２内に入った被処理液が流入室１５を通って、必ず単球捕捉フィルター１１を通過して、流出室１６に流れ、流出口１４から出るように構成されている。
【００２０】
ここで、本発明における被処理液とは、末梢血、臍帯血または骨髄液、これらを比重遠心分離することにより得られた単球浮遊液、バフィーコートなどの単球を含有する生体由来の液状物である。
ハウジング１２は、２枚のシートからなり、単球捕捉フィルター１１によって捕捉された単球を培養するのにあったて支障のない程度のガス透過性を有する熱可塑性樹脂からなる。具体的には、軟質ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。
【００２１】
また、流入口１３および流出口１４は、チューブ形状であり、ハウジング１２を構成する２枚のシートの間に、単球捕捉フィルター１１と共に挟んだ状態で高周波融着や熱シールすることによって、ハウジング１２に固定されるため、ハウジング１２とのシール性に優れる材料からなる。具体的には、ハウジング１２と同一の材料か、融点が近い材料である。
【００２２】
単球捕捉フィルター１１は、肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比（肉厚／平均孔径）が１００〜２００の範囲になるものであり、１２０〜１５０の範囲であることがより好適である。肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比は、この範囲より小さくなると単球の捕捉率の低下を招く。また、この範囲より大きくなると、単球以外の細胞の捕捉率が高くなり、余分な細胞成分が多くなる。
【００２３】
単球捕捉フィルター１１の平均孔径は、直径５５ｍｍの円盤状に打抜いたフィルターをパームポロメーターで測定したときの値である。また、単球捕捉フィルター１１は、総肉厚と平均孔径との比が上記の範囲に入るものであれば、単層（１枚）でも複数層（複数枚を重ねたもの）からなるものでもよい。
単球捕捉フィルター１１は、単球以外の細胞は吸着しない材料で、細胞培養用担体として使用可能なものであればよい。また、液を通過させる観点から、親水性、保水性を有するものが好ましい。このような材料としては、天然樹脂、合成樹脂、天然繊維、合成繊維などが挙げられる。具体的には、ポリウレタン、ポリビニルアルコールなどの合成樹脂からなる連通孔を有するスポンジ状多孔質体や、ポリエステル、ナイロン、ポリオレフィンなどの合成樹脂からなる織布または不織布からなる繊維塊である。
【００２４】
次に、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置について説明する。図３は、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置を説明するための平面図である。また、図４は、本発明の他の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置を説明するための平面図である。
【００２５】
図３に示すように、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置１００は、単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球を培養するためのフィルターを備えるバッグシステムであり、上述した単球分離器具１と、単球分離器具１の流入口１３に連通する被処理液の流入ライン２１と、流入ライン２１に連通する培養液の添加ライン２２と、単球分離器具１の流出口１４に連通する排出ライン３１とを備える。
【００２６】
流入ライン２１は、末端に単球を含有する被処理液（例えば、末梢血、臍帯血などの未処理液）を収容するための処理液バッグ２を備えている。この処理液バッグ２には、被処理液をバッグ内に収容する採液ライン２３が設けられていることが好ましい。
【００２７】
被処理液が末梢血である場合には、処理液バッグ２として公知の採血バッグを用いることができ、この場合には、採液ライン２３は末端に採血針（図示せず）を有する採血チューブを用いられる。また、被処理液が臍帯血や骨髄液である場合には、処理液バッグ２として凍結保存に適した材料からなる容器を用いることができる。
【００２８】
添加ライン２２は、添加ポート２２２と、この添加ポート２２２の先端に設けられたコネクタ２２１を備えている。このコネクタ２２１は、洗浄液が入ったシリンジや容器（図示せず）を接続するために設けられている。
【００２９】
排出ライン３１は、末端に廃液バッグ３４を有し、単球分離器具１を通過した被処理液を回収するための回収ライン３２と、使用済みの培養液を排出するための廃液ライン３３とに分岐している。図３に示す実施例では、廃液ライン３３の末端に廃液バッグ３４が設けられている。
【００３０】
図４に示すように、本発明の他の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置１１０においては、廃液ライン３３が、廃液ポート３３２と、この廃液ポート３３２の先端に設けられたコネクタ３３１とから構成されている。このコネクタ３３１には、廃液を収容するためのシリンジ、バッグ、容器など（図示せず）を接続することができる。このように、単球分離培養装置１１０は、図３に示す単球分離培養装置１００と廃液ライン３３の構成が異なる。なお、この他の構成については、図３に示す単球分離培養装置１００と同様であるため説明を省略する。
【００３１】
処理液バッグ２、回収バッグ３および廃液バッグ３４は、軟質ポリ塩化ビニルのような熱可塑性樹脂材料からなる２枚のシートを高周波融着や熱シールにより融着して作製された公知の血液バッグを用いられる。
【００３２】
図示した処理液バッグ２、回収バッグ３および廃液バッグ３４は、それぞれ２つの排出口２５，３５，３４５を有するものであるが、これに限らず、排出口がなくても、排出口が１つまたは３つ以上あってもよい。これらの排出口は、バッグ内の液体をサンプリングしたり、バッグ内の液体を別のバッグなどに分離するために設けられている。
【００３３】
図３および図４における流入ライン２１、排出ライン３１および回収ライン３２と、図３における廃液ライン３３は、軟質ポリ塩化ビニルのような熱可塑性樹脂材料からなる可撓性のチューブで構成されている。これらの各ラインには、必要に応じて、ローラークレンメ、ワンタッチクレンメなどの開閉手段を取り付けることができる。
【００３４】
次に、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置の使用方法、すなわち、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた樹状細胞回収方法について説明する。
【００３５】
本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた樹状細胞回収方法は、上述した単球分離器具を用いて、単球を含有する被処理液から単球を選択的に分離するとともに、分離された単球から得られる樹状細胞を回収する方法であり、以下の（１）〜（４）の工程を含むものである。
【００３６】
（１）単球を含有する被処理液（例えば、末梢血）を単球分離器具１の流入口１３から導入して、単球捕捉フィルター１１により単球を捕捉し、その他の被処理液（実質的に単球を除く細胞成分を含む末梢血）を単球分離器具１の流出口１４から排出する工程
【００３７】
（２）培養液（培地およびサイトカインを含有する溶液）を単球分離器具１の流入口１３から導入して、分離された単球から樹状細胞を分化誘導する工程、
【００３８】
（３）抗原溶液（抗原分子およびサイトカインを含有する溶液）を単球分離器具１の流入口１３から導入して、樹状細胞に抗原を提示する工程
【００３９】
（４）単球分離器具１の流入口１３から抗原を提示された樹状細胞を回収する工程
【００４０】
以下、図３に示す単球分離培養装置１００を用いて、単球を含有する被処理液として末梢血（全血）を用いる場合を例にして、上記各工程を具体的に説明する。
【００４１】
上記（１）の工程は、全血から単球を分離するための工程である。この工程では、予め処理液バッグ２に収容され、抗凝固剤と混合された全血を、流入ライン２１を通して流入口１３から単球分離器具１内に導入し、単球捕捉フィルター１１に通して実質的に単球のみを選択的に捕捉させることにより分離し、残りの血液成分（赤血球、血小板、リンパ球および顆粒球）を単球分離器具１の流出口１４から排出させることにより、全血から実質的に単球だけが単球分離器具１内に分離され、残りの血液成分は排出ライン３１および回収ライン３２を介して回収バッグ３内に回収される。なお、このような操作に先立って、プライミング操作を行うことが好ましい。
【００４２】
この工程においては、残りの血液成分を確実に排出させるために、単球捕捉フィルター１１に単球を捕捉させた状態で洗浄液を通して単球捕捉フィルター１１を洗浄することが好ましい。具体的には、予め洗浄液が充填されたシリンジ（図示せず）を添加ライン２２のコネクタ２２１に接続し、洗浄液を添加ポート２２２から流入口１３を介して単球分離器具１内に流入し、単球捕捉フィルター１１に通過させて、流出口１４から排出ライン３１および回収ライン３２を介して回収バッグ３内に排出することにより、単球分離器具１の流出室１６などに残留していた残りの血液成分が確実に洗い流される。洗浄液としては、ＦＣＳ、ヒト血漿、ヒトアルブミン等を加えた生理食塩水や、デキストラン４０、ＰＢＳなどを用いることができる。
【００４３】
このような（１）の工程が終了後に、末梢血（全血）が入っていた処理液バッグ２および残りの血液成分が回収された回収バッグ３は、不要となるので、処理液バッグ２は流入ライン２１の所定位置でチューブシーラーを用いてシールして取り外し、回収バッグ３は回収ライン３２の所定位置でチューブシーラーを用いてシールして取り外す。
【００４４】
上記（２）の工程は、単球から樹状細胞を分化誘導するための工程である。この工程では、単球分離器具１の流入口１３を開放状態、流出口１４を閉塞状態とし、予め培地およびサイトカインを含有する培養液を入れたシリンジを添加ライン２２のコネクタ２２１に接続して、添加ポート２２２から流入ライン２１を介して、流入口１３から単球分離器具１内の単球捕捉フィルター１１に捕捉されている単球に培養液を添加することにより、単球から樹状細胞が分化誘導される。この工程で用いる培養液は、培地およびサイトカインを含有するものである。
【００４５】
この工程では、単球分離器具１の流入口１３および流出口１４を閉塞状態とし、一定時間経過後に、流出口１４を開放状態にして、単球分離器具１内の培養液を排出し、流出口１４を閉塞し、流入口１３を再び開放状態として、新しい培地およびサイトカインを含有する培養液を単球分離器具１内に導入し、流入口１３を閉塞し、一定時間経過後に、この操作（培養液の交換）を複数回繰り返し行うことにより、短時間で効率良く、単球から樹状細胞を分化誘導することができる。
【００４６】
この操作にあたって、単球分離器具１内の培養液の排出は、培養液を排出ライン３１から廃液ライン３３を介して廃液バッグ３４に送り込むことにより行われる。なお、図４に示す単球分離培養装置１１０を用いる場合には、廃液ライン３３のコネクタ３３１に、廃液を回収するためのバッグなどを接続して行われる。
【００４７】
この工程で用いる培地としては、１〜１０％ＦＣＳ、ヒト血漿が加えられたＲＰＭＩ１６４０またはＸ−Ｖｉｖｏ１０、ＡＩＭ−Ｖなどが挙げられる。サイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などを用いることができる。
このような（２）の工程は、単球から樹状細胞が分化誘導されるまで行われる。具体的には、３〜２０日程度、好ましくは５〜１０日程度行う。このような一連の操作は、３７℃，５％ＣＯ_２雰囲気下で行うことが好ましい。
【００４８】
上記（３）の工程は、樹状細胞に抗原を提示するための工程である。この工程では、抗原溶液を単球分離器具１の流入口１３から導入して、樹状細胞に抗原が提示される。抗原分子の導入は、予め抗原分子を充填したシリンジ（図示せず）を添加ライン２２のコネクタ２２１に接続し、抗原溶液を添加ポート２２２から流入口１３を介して単球分離器具１内に導入し、樹状細胞に添加することにより行われる。この工程で用いる抗原溶液は、抗原分子を含有するものであり、抗原分子の他にサイトカインを含有していても良い。抗原分子としては、癌細胞溶解産物、酸抽出ペプチド、癌特異的合成ペプチドなどを用いることができる。また、サイトカインとしては、ＴＮＦ−αなどを用いることができる。
【００４９】
このような（３）の工程は、数時間〜数日、好ましくは4時間〜２日行う。この間に、培養液の交換、培地の交換またはサイトカインの交換や、抗原分子の添加を必要に応じて行うことにより、確実に樹状細胞に抗原を提示することができる。
【００５０】
上記（４）の工程は、抗原を提示された樹状細胞を回収するための工程である。この工程では、単球分離器具１の流入口１３から抗原を提示された樹状細胞が回収される。抗原提示後の樹状細胞の回収は、単球分離器具１内の培養液を排出した後に、置換液を導入して、培養液を流出口から排出し、次いで、回収液を導入する操作により行う。
【００５１】
具体的には、最初に、単球分離器具１内の培養液を単球分離器具１の流出口１４から排出ライン３１および廃液ライン３３を介して廃液バッグ３４内に排出し、その後に、予め置換液を充填したシリンジ（図示せず）を添加ライン２２のコネクタ２２１に接続し、置換液を添加ポート２２２から単球分離器具１の流入口１３を介して単球分離器具１内に導入し、抗原提示後の樹状細胞を置換液に浮遊させ、次いで、置換液が入っていたシリンジで樹状細胞浮遊液を吸引することにより、シリンジ内に抗原提示後の樹状細胞を回収する。
【００５２】
なお、図４に示す単球分離培養装置１１０を用いる場合には、廃液を回収するためのバッグ（図示せず）を廃液ライン３３のコネクタ３３１に接続して、このバッグ内に培養液を排出する。また、樹状細胞の回収は、置換液を単球分離器具１内に流入した後に、予め回収液を充填したシリンジなど（図示せず）を廃液ライン３３のコネクタ３３１に接続し、回収液を廃液ポート３３２から排出ライン３１を介して流出口１４から単球分離器具１内に流入し、単球捕捉フィルター１に通して（逆流させる）、置換液が入っていたシリンジに排出することにより行うことができる。
【００５３】
この工程で用いる回収液としては、ＦＣＳ、ヒト血漿、ヒトアルブミンなどを加えた生理食塩水や、デキストラン４０、ＰＢＳなどを好適に用いることができる。また、置換液としても、回収液と同様のものを用いることができる。
【００５４】
【実施例】
表１に示すような、平均孔径、肉厚および肉厚と平均孔径の比（肉厚／平均孔径）を有する実施例１〜１０および比較例１〜９の単球捕捉フィルターを作製し、単球および残りの血液成分（リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板）の捕捉率を算出した。
【００５５】
ポリウレタン製のスポンジ状多孔質体を直径２６ｍｍの円形に切り抜いて、単球捕捉フィルターを作製した。このフィルターを外周面からの液漏れがないように平膜固定用の容器にセットした。そして、この容器の流入口には軟質ポリ塩化ビニル製チューブを接続し、流出口には２１Ｇ注射針（２１Ｇ）を接続し、この注射針の先端に、ろ過した血液を回収できるように血液回収容器をセットした。なお、流出口から血液回収容器までの落差は１５ｃｍとした。
【００５６】
最初に、流入口から０．５％アルブミン加生理食塩水を平膜固定用容器に流してプライミングし、次いで、予め各血球成分数（リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板）をカウントしたＣＰＤ加新鮮全血（末梢血）１０ｍＬを３ｍＬ／ｍｉｎの流速でろ過し、フィルターに単球を捕捉させた。そして、３０ｍＬの０．５％アルブミン加生理食塩水を流してフィルターを洗浄した。このような操作の終了後に、ろ液中の各血球成分の数をカウントし、捕捉率を算出した。この結果を表１に示す。なお、ろ過前後の各血球成分数は、自動血球計算機（Ｓｙｓｍｅｘ
ＳＥ−９０００）で測定した。
【００５７】
【表１】

【００５８】
表１に示す結果より、実施例１〜９の単球捕捉フィルターは、単球の捕捉率が高く、残りの血液成分（リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板）の捕捉率は低く、単球が選択的に捕捉されている。特に、実施例２および実施例３の単球捕捉フィルターは、リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板の捕捉率が低い。
これに対して、比較例１〜９のフィルターは、単球の捕捉率が高いと、残りの血液成分（リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板）の捕捉率も高く、単球の捕捉率が低いと、残りの血液成分（リンパ球、顆粒球、赤血球および血小板）の捕捉率も低く、単球が選択的に捕捉されていない。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の単球捕捉フィルターは、簡単な操作で、末梢血などから単球を効率良く分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いる単球分離器具の平面図である。
【図２】図２は、図１の断面図である。
【図３】図３は、本発明の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置を説明するための平面図である。
【図４】図４は、本発明の他の実施例に係る単球捕捉フィルターを用いた単球分離培養装置を説明するための平面図である。
【符号の説明】
１単球分離器具
１１単球捕捉フィルター
１２ハウジング
１３流入口
１４流出口
１５流入室
１６流出室
１００単球分離培養装置
１１０単球分離培養装置
２処理液バッグ
２１流入ライン
２２添加ライン
２２１コネクタ
２２２添加ポート
２３採液ライン
２５排出口
３回収バッグ
３１排出ライン
３２回収ライン
３３廃液ライン
３３１コネクタ
３３２廃液ポート
３４廃液バッグ
３４５排出口
３５排出口

Claims

単球を含有する被処理液から単球を選択的に捕捉する単球捕捉フィルターであって、
前記単球捕捉フィルターは、平均孔径が６〜８μｍであり、かつ肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比が１００〜２００であることを特徴とする単球捕捉フィルター。
前記肉厚（ｍｍ）と平均孔径（ｍｍ）との比が１２０〜１５０である請求項１に記載の単球捕捉フィルター。
前記単球を含有する被処理液は、末梢血である請求項１または２に記載の単球捕捉フィルター。
前記単球捕捉フィルターは、連通孔を有するスポンジ状多孔質体からなる請求項１ないし３のいずれかに記載の単球捕捉フィルター。