JP6020513B2 - 細胞培養バッグおよび細胞培養バッグの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養バッグに係り、特に、測定対象物に反応するセンサチップを内蔵した細胞培養バッグおよび細胞培養バッグの製造方法に関する。

医薬製造等における細胞培養工程においては、培養液中の溶存酸素濃度、ｐＨ、栄養成分濃度、培養液温度等を細胞の育成に最適な条件に維持するために、これらの値を測定することが重要である。

細胞培養を行なう培養容器としては、フラスコが一般的であったが、近年ではシングルユースの細胞培養バッグが広く用いられるようになっている。細胞培養バッグは、滅菌された状態で市販されており、取り扱いが容易、ガス透過性が高い、効率の良い高密度培養が可能等の特性を有している。

細胞培養バッグ内の培養液を対象とした測定について、溶存酸素濃度を例に図１２を参照して説明する。溶存酸素濃度センサとしては、電極式、試薬利用方式、光学式等いくつかの方式が実用化されているが、ここでは、光学式の溶存酸素センサを用いるものとする。

光学的に溶存酸素濃度を測定する場合には、酸素に反応する物質を含有した酸素検出用のセンサチップを培養液中に配置しておく。そして、励起光をセンサチップに照射し、センサチップから発せられる燐光を観測する。溶存酸素濃度が高いほど、燐光の位相が励起光の位相より遅れ、また燐光の強度が減少するため、照射する励起光を、正弦波等で変調し、観測される燐光の位相遅れあるいは強度を測定することで、培養液中の溶存酸素濃度を得ることができる。

本図において、細胞培養バッグ３１０には、培地である培養液３２０が収容されている。また、細胞培養バッグ３１０には培養液３２０中の酸素濃度分布等を均一にするために撹拌翼３３０が用いられており、モータにより所定の回転速度で回転している。

細胞培養バッグ３１０の内側には、酸素検出用のセンサチップ３４０を貼付しておく。光学式溶存酸素センサ３５０は、信号処理部３５１と光学系３５２とを備えており、光学系３５２は、正弦波等で変調した励起光をセンサチップ３４０に照射する励起光学系と、センサチップ３４０が発する燐光を受光し電気信号に変換する受光光学系とを含んでいる。信号処理部３５１は、受光光学系から取得した電気信号に対して所定の信号処理を行ない、酸素濃度に対応した電気信号に変換する。

図１３は、センサチップ３４０の貼付箇所付近の細胞培養バッグ３１０とセンサチップ３４０の構成例を示している。本図に示すように、細胞培養バッグ３１０は、積層構造となっており、例えば、内側からＥＶＡ（エチレンビニルアセテート）層３１１、ＥＶＯＨ（エチルビニルアルコール）層３１２、ＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）層３１３から構成されている。

センサチップ３４０は、酸素感応膜３４２の一方の面上に、反射膜３４３と遮光膜３４４とが配置されており、酸素感応膜３４２の他方の面に形成された接着剤層３４１により細胞培養バッグ３１０に貼付されている。

酸素感応膜３４２は、例えば、酸素消光性を有する光励起物質であり、金属ポルフィリン錯体等を用いることができる。反射膜３４３は、励起光を反射して酸素感応膜３４２に戻すことにより、励起光を有効利用する目的で用いられている。遮光膜３４４は、不要な外来光が光学系３５２に入射しないようにするために用いられている。

特開２００９−２２２４２９号公報 特開２０１０−１３６６２８号公報 特許第２６２８４０６号公報 特許第３１０９７４０号公報 米国特許第２０１２１７１７６０号明細書

細胞を培養する場合、細胞に直接触れる器具等は無菌状態でなければならない。一般に、ユーザは、滅菌済の細胞培養バッグ３１０の内側に、別途購入したセンサチップ３４０を貼り付けて使用するため、貼り付け後の細胞培養バッグ３１０に対してユーザ自身がγ線等を用いて滅菌処理を行なう必要がある。このため、ユーザは過剰な負荷が強いられるのみならず、スキル不足や不手際等で滅菌処理が十分でない状況も生じかねない。

センサチップ３４０は、細胞培養バッグ３１０内部で露出し、培養液に接液した状態で使用されるため、滅菌処理が不十分の場合や、センサチップ３４０に含まれている物質が培養液中に溶出すると、細胞の培養に悪影響を与えるおそれがある。

そこで、本発明は、検出対象の物質に反応するセンサチップが培養液に接しない細胞培養バッグおよび細胞培養バッグの製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明の細胞培養バッグは、培養液を収容する細胞培養バッグであって、外部膜と、前記外部膜の培養液側に配置された、検出対象物に反応する層を含んだセンサチップと、前記センサチップの培養液側を、当該センサチップと、前記外部膜の培養液側における当該センサチップの周囲と、の双方に亘って密着して覆って前記検出対象物を透過させる透過膜と、を有する。
ここで、前記透過膜は、前記外部膜の内側全面を覆っていてもよい。
あるいは、前記透過膜は、前記外部膜の内側の前記センサチップを含んだ部分的な領域を覆っていてもよい。
また、前記センサチップは、複数個配置されており、前記複数個のセンサチップは、複数のサイズに区別され、中心部分に最も大きなサイズのセンサチップが配置されているものであってもよい。
上記課題を解決するため、本発明の細胞培養バッグの製造方法は、培養液を収容する細胞培養バッグの製造方法であって、外部膜となるロール素材に、検出対象物に反応する層を含んだセンサチップを貼付、あるいは前記検査対象物に反応する材料を噴霧してセンサチップとするステップ、前記検出対象物を透過させる透過膜となるロール素材を、前記外部膜となるロール素材に前記センサチップを覆うように重ねるステップ、両ロール素材を熱圧着するステップ、を含むことを特徴とする細胞培養バッグの製造方法。

本発明によれば、検出対象の物質に反応するセンサチップが培養液に接しない細胞培養バッグおよび細胞培養バッグの製造方法が提供される。

本実施形態に係る細胞培養バッグの使用形態を説明する図である。 センサチップ付近の細胞培養バッグの構成例を示している。 細胞培養バッグ用のシートの作成方法の一例を示す図である。 細胞培養バッグ用のシートの作成方法の別例を示す図である。 細胞培養バッグ用のシートの作成方法の別例を示す図である。 細胞培養バッグ用のシートの作成方法の別例を示す図である。 複数個のセンサチップを取り付けた細胞培養バックの例を示す図である。 複数個のセンサチップを取り付けた細胞培養バックの他の例を示す図である。 センサチップを噴霧器で形成する場合を説明する図である。 センサチップパターンの例を示す図である。 センサチップパターンの別例を示す図である。 細胞培養バッグ内の培養液を対象とした従来の溶存酸素濃度測定について説明する図である。 センサチップの貼付箇所付近の細胞培養バッグとセンサチップの従来の構成例を示す図である。

本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図１は、本実施形態に係る細胞培養バッグ１１０の使用形態を説明する図である。従来と同じ部位については同じ符号を付している。

細胞培養バッグ１１０には、培地である培養液３２０が収容されている。また、細胞培養バッグ１１０には培養液３２０中の酸素濃度分布等を均一にするために撹拌翼３３０が用いられており、モータにより所定の回転速度で回転している。細胞培養バッグ１１０内に、培養液３２０を曝気するスパージャを設置してもよい。

本実施形態の細胞培養バッグ１１０は、多層構造となっており、最内側の層には酸素透過膜１１２が形成されている。そして、酸素透過膜１１２の外側に酸素検出用のセンサチップ１２０が配置されている。このため、センサチップ１２０は、酸素透過膜１１２を介して培養液３２０と接することになる。細胞培養バッグ１１０の最外側は、従来の細胞培養バッグ３１０と同様の構成の外部膜１１１とすることができる。

すなわち、本実施形態の細胞培養バッグ１１０は、外部膜１１１上に配置したセンサチップ１２０を酸素透過膜１１２で覆った構造となっている。培養液３２０中の酸素は、酸素透過膜１１２を通過してセンサチップ１２０に到達する。

光学式溶存酸素センサ３５０は、信号処理部３５１と光学系３５２とを備えており、光学系３５２は、正弦波等で変調した励起光をセンサチップ１２０に照射する励起光学系と、センサチップ１２０が発する燐光を受光し電気信号に変換する受光光学系とを含んでいる。信号処理部３５１は、受光光学系から取得した電気信号に対して所定の信号処理を行ない、酸素濃度に対応した電気信号に変換する。

図２は、センサチップ１２０付近の細胞培養バッグ１１０の構成例を示している。上述のように、細胞培養バッグ１１０は、外部膜１１１上に配置したセンサチップ１２０を酸素透過膜１１２で覆った多層構造となっている。外部膜１１１は、従来の細胞培養バッグ３１０と同様の積層膜とすることができる。例えば、内側からＥＶＡ（エチレンビニルアセテート）層、ＥＶＯＨ（エチルビニルアルコール）層、ＬＤＰＥ（低密度ポリエチレン）層とすることができるが、他の構成であってもよい。

センサチップ１２０は、従来と同様に酸素感応膜１２２の一方の面上に、反射膜１２３と遮光膜１２４とが配置されており、酸素感応膜１２２の他方の面に形成された接着剤層１２１により細胞培養バッグ１１０の外部膜１１１に貼付されている。

酸素感応膜１２２は、例えば、酸素消光性を有する光励起物質であり、金属ポルフィリン錯体等を用いることができる。反射膜１２３は、励起光を反射して酸素感応膜１２２に戻すことにより、励起光を有効利用する目的で用いられる。遮光膜１２４は、不要な外来光が光学系３５２に入射しないようにするために用いられる。

酸素透過膜１１２は、酸素透過率が高く、外部膜１１１との接着性が良好で、溶出部の少ない膜を用いるものとする。このような膜としては、低密度ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン等が挙げられるが、他の材料であってもよい。

本実施形態の細胞培養バッグ１１０は、細胞培養バッグ１１０とセンサチップ１２０とが一体形成されており、センサチップ１２０が露出してないため、ユーザは滅菌済の状態でセンサチップ１２０付き細胞培養バッグ１１０を購入することができ、別途滅菌処理を行なう必要はない。また、センサチップ１２０は、酸素透過膜１１２を介して培養液３２０と接するため、センサチップ１２０の含有物質の培養液３２０への溶出を防ぐことができる。

図３は、細胞培養バッグ１１０用のシートの製造方法の一例を示す図である。本図の例では、外部膜１１１のロール素材２１１にセンサチップ１２０を貼付し、酸素透過膜１１２のロール素材２１２を重ねて、熱圧着用ロール２１４で熱圧着することで細胞培養バッグ１１０のシート２１３が製造される。

このシート２１３を所定の形状に切断し、接着等することにより細胞培養バッグ１１０を製造することができる。ただし、他の製造方法を採用してもよい。

例えば、図４（ａ）〜（ｄ）に示すように、センサチップ１２０を、外部膜１１１に熱圧着により埋め込み、その上に酸素透過膜１１２を重ねてシート２１３を製造してもよい。この場合、接着剤層１２１は不要である。本製造方法では、センサチップ１２０の取り付け箇所で外部膜１１１とセンサチップ１２０とで段差が生じないため、外部膜１１１と酸素透過膜１１２との密着性を高めることができる。

また、図５に示すように、外部膜１１１にセンサチップ１２０を貼り付け、外部膜１１１の全面ではなく、センサチップ１２０を含んだ部分的な領域にセンサチップ１２０を覆うように酸素透過膜１１３を熱圧着、接着剤等で貼り付けて細胞培養バッグ１１０用のシート２１３を製造してもよい。

あるいは、図６に示すように、酸素透過膜１１３に代えて、樹脂１１４によるセンサチップ１２０のコーティング処理を行なって細胞培養バッグ１１０用のシート２１３を製造してもよい。樹脂１２０は、高い酸素透過性を有するフッ素樹脂等を用いることができる。一般に、酸素透過性の高い樹脂１２０によるコーティングは、酸素透過膜１１３よりも薄く形成することができるため、コーティングにより、酸素透過性が高まり、溶存酸素濃度測定の応答速度が向上する。

図７に示すように、細胞培養バッグ１１０は、複数個のセンサチップ１２０を内蔵するようにしてもよい。図３〜図６に例示したような製造方法により、コストを上昇させることなく、容易に複数個のセンサチップ１２０を細胞培養バッグ１１０に内蔵させることができる。複数個のセンサチップ１２０を用いることで、細胞培養バッグ１１０内の溶存酸素分布を測定することができるようになる。各センサチップ１２０の検出対象物質を変えるようにしてもよい。

複数個のセンサチップ１２０を内蔵した場合、本図に示すように、センサチップ１２０毎に光学式溶存酸素センサ３５０を用意してもよいが、光学式溶存酸素センサ３５０はセンサチップ１２０に比して高価であるため、１台の光学式溶存酸素センサ３５０で各センサチップ１２０の測定を順次行なうようにしてもよい。

この場合、図８に示すように、細胞培養バッグ１１０の外側の各センサチップ１２０の近傍にセンサチップ１２０を識別するためのＩＤ情報を書き込んだバーコード１４０を貼り付けるとともに、光学式溶存酸素センサ３６０にバーコードリーダ部３５３を備えさせるようにしてもよい。

このような光学式溶存酸素センサ３６０を用いて、各センサチップ１２０を順次測定すると、センサチップ１２０からの燐光を測定するのと同時に、バーコード１４０を読み取ることができるようになり、測定値とセンサチップ１２０とを容易に対応付けることができる。バーコード１４０に限られず、ＩＤタグ等を各センサチップ１２０近傍に付して、光学式溶存酸素センサ３６０が読み取るようにしてもよい。

なお、センサチップ１２０を構成する膜のうち、測定対象物である酸素に反応する酸素感応膜１２２は必須であるが、反射膜１２３、遮光膜１２４については状況により省くことができる。反射膜１２３、遮光膜１２４を省くことにより、培養液３２０から酸素感応膜１２２への酸素透過量が増えるため、溶存酸素濃度測定の応答速度が向上する。

例えば、反射膜１２３は、励起光を反射して酸素感応膜１２２に戻すことにより、励起光を有効利用する目的で用いられるが、燐光の受光量が十分得られる場合は省いてもよい。また、遮光膜１２４は、不要な外来光が光学系３５２に入射しないようにするために用いられるが、細胞培養バッグ１１０は、ステンレス製のジャケット内に保持されることが多く、このような場合は、外来光の影響を受けにくいため、遮光膜１２４を省いてもよい。

酸素感応膜１２２のみでセンサチップ１２０を構成する場合には、図９に示すように、酸素感応材料を粉末または液体にして、噴霧器３７０から外部膜１１１に噴霧して酸素感応膜１２２を形成するようにしてもよい。噴霧器３７０は、スプレーやインクジェットプリンタ等を利用することができる。

ところで、センサチップ１２０の大きさや色によっては、また、細胞培養バッグ１１０が不透明の場合等には、細胞培養バッグ１１０の外部からセンサチップ１２０の位置が分かりづらく、光学式溶存酸素センサ３６０を適切な位置に配置することが困難な場合が起こり得る。

そこで、例えば、図１０（ａ）に示すようなパターンで複数個のセンサチップ１２０を細胞培養バッグ１１０内に配置するようにしてもよい。本パターンでは、実際の測定に用いる中央のセンサチップ群のサイズを最も大きくし、左右に隣接するセンサチップ群のサイズを中程度のサイズとし、隅のセンサチップ群のサイズを最小のサイズとしている。このようなパターン形成は、噴霧器３７０を用いることで容易に行なうことができる。

センサチップ１２０が発する燐光の強度はセンサチップ１２０の大きさに応じるため、図１０（ａ）に示すようなパターンでセンサチップ１２０を形成すると、光学式溶存酸素センサ３６０は、その位置により、図１０（ｂ）に示すような強度の信号を計測することになる。

そこで、光学式溶存酸素センサ３６０を信号強度が高くなる方向移動させることで、光学式溶存酸素センサ３６０を適切な位置に配置することができるようになる。また、上記実施例とは別に、複数個のセンサチップが単一のサイズで等間隔に配置されていてもよい。さらに、上記実施例とは別に、複数個のセンサチップが単一のサイズで異なる間隔で規則的に配置されていてもよい。

また、図１１に示すようなパターンとしてもよい。本パターンでは、同心円状に複数個のセンサチップ１２０を並べ、中心のセンサチップほどサイズが大きくなるようにしている。このようなパターンでも光学式溶存酸素センサ３６０を信号強度が高くなる方向移動させることで、光学式溶存酸素センサ３６０を適切な位置に配置することができるようになる。

以上、本発明の細胞培養バッグについて酸素を検出対象物質の例として説明したが、ｐＨ、グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸、アンモニア、二酸化炭素等を検出対象としてもよい。この場合、検出対象に反応するセンサチップを用いるとともに、検出対象物を透過させる膜でセンサチップを覆って細胞培養バッグを製造すればよい。

１１０…細胞培養バッグ、１１１…外部膜、１１２…酸素透過膜、１１３…酸素透過膜、１１４…樹脂、１２０…センサチップ、１２１…接着剤層、１２２…酸素感応膜、１２３…反射膜、１２４…遮光膜、１４０…バーコード、２１１…ロール素材、２１２…ロール素材、２１３…シート、２１４…熱圧着用ロール、３７０…噴霧器

Claims (5)

1. 培養液を収容する細胞培養バッグであって、
   外部膜と、
   前記外部膜の培養液側に配置された、検出対象物に反応する層を含んだセンサチップと、
   前記センサチップの培養液側を、当該センサチップと、前記外部膜の培養液側における当該センサチップの周囲と、の双方に亘って密着して覆って前記検出対象物を透過させる透過膜と、
   を有することを特徴とする細胞培養バッグ。
2. 前記透過膜は、前記外部膜の内側全面を覆っていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養バッグ。
3. 前記透過膜は、前記外部膜の内側の前記センサチップを含んだ部分的な領域を覆っていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養バッグ。
4. 前記センサチップは、複数個配置されており、
   前記複数個のセンサチップは、複数のサイズに区別され、中心部分に最も大きなサイズのセンサチップが配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
5. 培養液を収容する細胞培養バッグの製造方法であって、
   外部膜となるロール素材に、検出対象物に反応する層を含んだセンサチップを貼付、あるいは前記検査対象物に反応する材料を噴霧してセンサチップとするステップ、
   前記検出対象物を透過させる透過膜となるロール素材を、前記外部膜となるロール素材に前記センサチップを覆うように重ねるステップ、
   両ロール素材を熱圧着するステップ、を含むことを特徴とする細胞培養バッグの製造方法。