WO1992015668A1 - Bassin de culture cellulaire - Google Patents

Description

明糸田書

細 胞 培 養 槽

【技術分野】

本発明は、 細胞の高密度培 ¾において、 培養液中に高濃度に酸素を供給するこ とが可能であり、 酸素供給と投^に伴う泡を消泡し、 かつ迚続的に培養液回収が 可能な細胞培! tf!に閱するものである。

【背景技術】

—般に細胞の高密度培養とは、 培養液 1 ML当りに 1 0 〜 1 0 ÷ 個の細胞を培 養することをさす。 細胞、 ことに動物細胞をこのような高密度で培養するために は、 細胞の生育に必要な、 栄 成分の供給と、 増殖によって生産される物 ゃ老 廃物の除去と、 高密度培養時に消 15される酸素の速やかな供給が必要である。 栄 養成分の供給と老廃物の除去は、 新鮮培地の連続供給と培養液の回収により、 容 易に達成され得るが、 高密度細胞の培養に必要な高濃度酸素の供給は非常に困難 であ た。

従来通常は、 培養榕中に酸素若しくは空気を i l接曝気する方法が採用されていた。

しかし、 この方法では気体から溶液への溶解速度が遅いため、 必要とするだけ の酸素が培赉液に充分供給されず、 また、 酸素供給量を增やした場合には、 培養 液の発泡が多くなるという問題があつた。

この問題点の解決策として、 溶解速度を向上させるために拉抨を行なうことが 提案されている。 しかし、 この方法では、 搅抻による発泡と、 投^に作う剪断力 による細胞の障害が問題点とされている。 特に、 動物細胞の培 ¾においては、 剪 断力による細胞の障害が大きい。

このため、 日本国特開昭 6 3— 1 7 7 7 8 0号公報に開示されるように、 曝気 のための特定の領域を設け、 かつ、 可逆回転する羽根車を用いた装置や、 曰本国 特閲昭 6 0 - 2 3 4 5 8 0号公報に開示されるように半透膜を介し、 酸素を供給 する装置や、 日本国特閗昭 6 2 - 5 0 0 3 5 7号公報に開示されたホローファィ バーを用いる装^などが提案されている。 又口本国特開昭 6 3— 1 4 6 8 7号公 報には、 培狡攒外で培養液に酸素を溶解させる装置をそなえた培養 fflや、 曰木 H 特開昭 6 1 - 2 5 7 1 8 1号公報にはホロ一ファイバ一により、 ガス交換と老廃 物の交換を同時に行う培！!方法が閗示されている。 しかし、 以上のものを動物細胞の高密度培養装置としては使用した場合には、 必ずしも満足のゆく結果が得られない。 特に酸素供給量の不足や、 細胞と培養液 の分離などの問題点は依然未解決のままである。

本発明者らは、 細胞の高密度培養に適する装置として、 図 7に示すような日本 国特開平 1一 174376号公報に開示した装置を提案した。 この装 gは、 これ までの装 i :の欠点であった、 酸素の供給と培養液の灌流を効率よく行ないうるも のであった力 酸素溶解用の搅 It-羽根 （13) は、 培養槽 （14) の搅拌羽根 ( 12) の回 シャフト （11) に E接連結する構造となっており、 したがってよ り高密度の細胞培養を行うために、 撹拌羽根の高速回転を行うと培養擠 (14) の全体から発泡が起こるので、 撹^羽根 （13) を高速回転することは出来ない。 従って、 酸素の溶解効率が低下し、 培養液への酸素供給 が十分ではなかった。 また、 この装^の構造上、 培 Ϊ液の搅拌による発泡が問題であった。

以上より、 本発明においては、 培養槽の一部に、 培養液および、 培養細 fl の生 産する蛋白質は透過する力 細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔 離される領域を設け、 この内部で酸素を高濃度に溶解させることができ、 かつ消 泡作用を有しており、 培養液のみを回収できる機能を有する培養搏を提供するこ とを目的とするものである。

【発明の開示】

本発明は、 細胞培養槽 （Λ) の培養領域 （Α' ) の一部に培養液および培養細 胞の生産する蛋白質は透過する力 細胞又は細胞の接着担体は透過しないフィル タ一 （8) によって隔離される領域 （Β) を設け、 この領域 （Β) の底部に酸素 又は空気を供給する導管を設 Sし、 この導管の噴出ノズル直上に高速回転する拉 拌羽根を設け、 又フィルターの高さの 30〜50%は細胞培養擠内の気 ffl部分に 露出していて、 領域 （B) 内の液而 K下に培養液回収用の導管ノズルを有するこ とを特徴とする細胞培養槽である。 なお、 颌域 （B) の上面部は気扪に対し開 放されており、 領域 （B) の液而上に高速回転する消泡羽根を設けても良い。

更に領域 （B) 内の発生した泡によって低下した撹拌領域 （B) 内の液而を上 昇せしめるための培養槽気相部分に開口した無菌空気通気管を設け、 これによつ て前記領域 （B) 内の泡をフィルターを介して培養槽中に押し出させ^泡するよ うにしても良い。 本発明の効果は、 従来の浮遊培養用培養槽において高密度細胞培養時に必要な 高濃度酸素を供給し、 かつ、 従来問題としていた発泡や、 剪断による細胞の破壊 を防止することができる。 また、 酸素を迚続 -給しても良好な消泡効 ¾が^られ るので、 培養液の迚続供給、 回収も可能であり、 長期 の高密度細胞培 ¾が可能 となる。 以下、 本発明の概要をより詳細に説明する。 本発明の装置は浮遊性の細胞若し くはマイクロキャ リアによる細胞培養に適する装置である。 細胞培 ¾槽は、 通常 の浮遊培養に適したものであればどのようなものでも使用できる力 通常は、 低 速撹抨培養槽が好ましい。 この培養槽内に 1個ないし数 細胞もしくは細胞付 着性担体を通過しないフィルターで隔離された領域 （B ) をもうける。 この領域 ( B ) を以下便宜上、 気液混合室 （B ) と呼 フィルタ一は、 浮遊性細胞の場 合、 セラミ ックフィルターなどが適する。 マイクロキャリアの 合は、 5 0〜 1 5 0メ ッシュのステンレスフィルターが適する力 これ以外の材質も使用可能で ある。 フィルタ一は、 ポアサイズ、 メ ッシュサイズの異なるものを多層に重ねた ものでも良いし、 さらに、 培養液の沲流に伴って、 細胞が付笤し、 目詰まりを生 じさせるのを防止するため振 S もしくは回転させることも可能である。

気液混合室 （B ) は、 細胞密度の^加にあわせて、 増加させることで培養液へ の酸素供給をすみやかに、 かつ高濃度に行うことができる。 培费槽の気相部分に、 気液混合室の高さの 3 0〜 5 0 %が露出されていることが培養液の透液がすみや かに行われて、 培養液の消泡上重要であり、 必要に応じて、 この部分のフィル夕 —をより大きなメ ッシュサイズ、 ポアサイズの材 とすることも^泡上効梁があ 。

気液混合室 （B ) には、 底部に酸素もしくは空気を供給する導 3=を配し、 導管 ノズル上に 1 0 0〜5 0 0 r p mの回転数を冇する搅抨羽根を設^し、 高速搅拌 により酸素を培養液に溶解させる。

気体混合室 （B ) 内液而下には、 培養液回収導管を設ける。 又気液混合室の上 面は密閉もしくは開放してもさしっかえがないが、 開放する場合は液面上に消泡 用の羽根を設匿して、 消泡効率を上げることもできる。 ここで密閉する意味は、 泡が外部に飛散しないようにするためである。 【図面の簡単な説明】

図 1は、 本発明の培養装置の縱断面図を示す。

図 2は、 図 1の本発明の培養装置の平面図であり、 同装置の半分のみを示して いる。

図 3は、 図 1の本発明の培養装置フィルタ一 （B) によって隔離される領域 （ B) において領域 （B) の上面が密閉された構造を示す部分断而図である。

図 4は、 図 3の領域 （B) の実施例とは異なり、 領域 （B) の上面が開放さ k かつ、 液面に消泡羽根を冇する装 Sの部分断面図を示す。

図 5は、 図 1の領域 （B) を有する培養掊に圧力を調整する機能を付加させた ものの断面図を示す。

図 6は、 実験例 2の Ε Ρ Ο活性を E I Α法により測定した結果を示すグラフで あり、 縦軸は E P 0活性の相対活性を、 横軸は培養日数を示している。

図 7は、 従来の日本国特開平 1一 1 743 76号に開示された回転フィルター 装置の一部を切り欠いた斜視図である。

【発明を実施するための最良の形態】

以下に本発明の実施 s 実験例を説明する。

図 1は本発明の細胞培養槽を示すものである。 （A) は細胞培養槽本体であり、 培養液中にフィルタ一 （8) で隔離された領域 （B) を 1つないし複数個設ける。 なお、 細胞培養槽 （A) の内、 領域 （B) を除いた培養領域を （Α' ) とする。 細胞培養槽 （Α) および主な撹拌羽根 （1 ) は浮遊細^ もしくはマイクロキ ャリア培養に適した形状を有しており、 撹拌羽根 （1 ) を回転するためのモータ (5) は撹拌羽根 （1) を 5 0 r p m程度の低速回転できる能力を有している。 フィルタ一 （8) により隔離された領域 （B) は、 モータ （4) により高速回 転する気液混合用撹拌羽根 （3) で 3 00 r pm以上の回転数で激しく撹拌され 図 3は図 1に示したフィルター （8) で隔離された領域 （Β' ) の構造の詳細 を示したものである。 下部には、 酸素、 もしくは空気導入用のノズル （6) をも ち、 ノズルより放出された酸素は撹拌羽根 （3) で撹拌さ^ 培養液に溶解する。 酸素又は空気の導入と撹 に伴い発生する泡は、 培養槽の液面 (D) 上に露出し ているフィルターのメッシュを通過し、 培養液上に滲出し消泡される。 フィルタ

― (8) のメ ッシュは、 マイクロキヤリア一を使用した場合は、 50〜 150メ ッシュのものを使用すると目詰まりも生じず、 培地の交換もスムースに行われる。 フィルターの材質としては、 細胞に毒性を与えず、 気体の吸着のないもの、 例え ばポリエステル、 ガラス、 焼結金 セラ ミ ックス、 ステンレスなどがあげら; これらの多層、 若しくは Φ層構造を有するものが適当である力 これに限定され るものではない。

培養液の液面の直下には、 開孔部を有する培養液回収用導管 （7) が設 Sさ 細胞やマイクロキヤリア一を含有しない培養液のみを回収することができる。 図 4は、 図 3とは異なる実施例を示しており、 発生する泡を、 培费液の液面 ( D) の直上に、 撹拌羽根 （3) と同軸上に設けた羽根 （9) により消泡するもの ある o

羽根 （9) は発生する泡の性状に適したものを採用することができる。 上部は、 培養槽の気相中に開口するように開口部 （10) を設けており、 消泡効果と消泡 用の羽根 （9) の回転による圧力変化を均一にする機能を有している。

図 5は図 3とは異なる他の実施例である。 即ち、 図 3に示した （B) 領域の構 造を有する培養槽にさらに、 それぞれ SV 2、 SV 3の排気用バルブ、 通気用バ ルブを設け、 培養榕の圧力を調整する機能を付加させたものである。 （B) 領域 内は上述したように、 気体混合のため高速撹拌さ U 発生する泡はフィルター （ 8) を通過して培養槽中に移動する過程で消泡される。

この消泡効果をさらに増強するためには、 培養槽の （Α' ) 領域と （Β) 領域 の間に圧力差を生じさせれば良い。

このためには、 図 5に示した、 S V 1、 SV2、 S V 3のバルブの開閉により、 圧力を調整する。 S VIは酸素用バルブ、 SV 2は排気用バルブ、 SV3は通気 用のバルブである。 SV 1は、 酸素導入用のノズル （6) への導管中に設けられ たものである。 又、 SV 2は排気管 （20) 中に、 SV 3は、 無菌空気通気管 （ 21) 中に設けられている。

SV 1、 SV2、 SV 3バルブの開閉は同調しており、 3 1開放時は5¥ 2 が開放、 SV 3は閉鎖し、 S V 1閉銷時は S V2は閉鎖、 SV 3は開放される。 このようなバルブ開閉により、 容器内の圧力を可変させるように制御出来る。 さらに、 領域 （B) 内では、 酸素供給と高速撹拌により泡が発生することは上 述の通りである。 この泡は、 領域 （B) 内の液面を培養榕側より押し下げ、 次第 に領域 （B) 内に充満する。 しかしこのバルブ SV 1、 SV2を閉じ、 SV 3を 開け、 無菌空気を培養槽内に導入し、 培養擠内の圧を加圧することにより、 培養 槽内の培養液がフィルタ一を介して領域 （B) 内に流入し、 低下した液而を回復 せしめる。 液面の上昇に伴い、 領域 （B) に発生した泡はフィルター （8) を通 過して培養槽に押し出されて行き、 フィルタ一 （8) を通過することで消泡され 。

また （B) 領域の撹拌羽根 （3) はバルブの開閉に同調しており、 SV 1開放 時に回転し、 SV1閉鎖時に停止する。 S V 1バルブの開閉時間は、 開放 3~5 秒、 閉鎖 8〜13秒とすると消泡効果、 酸素溶解効率が高まる。 また SV3より 無菌空気を供給し、 SV 3開放時は、 培養槽内の圧力を 0. 2〜0. 4 k g/ c 高くなるよう加圧する。

なお、 この場合領域 （Β) 内はある程度密封されている必要があり、 図 4のよ うな開口部 （10) を有するものは、 領域 （Α' ) と領域 （Β) が同一の内圧に なるので適用できない。 以上説明したように本発明の作用は、 フィルター内で隔離された領域 （Β) 内 に導管を介し、 直接酸素又は空気を導入し、 高速撹拌により酸素を培養液に溶解 させている。

このため、 培養液は、 細胞の必要とする充分な酸素を含み、 フィルターから培 養槽へ出てゆく。 またフィルターを気相と広い面積で接するようにしており、 気 液混合室の通液がすみやかに起こり消泡される。

また、 本発明の消泡羽根によっても発生した泡を消すことができる。

本発明の高速撹拌は細胞の存在しない領域内のみに使用さ l 従来の装置で問 題とされた高速撹拌による剪断力で細胞の破壊を引き起こすことはまったくなく なった。 また連続的に細胞の含まれない培養液を、 培養液回収用導管を介して回 収することができる。

更に本発明は、 気相部分に開口した無菌空気通気管から無菌空気を導入し、 培 養槽内を加圧することにより気液混合室内の液面を上昇せしめて気液混合室内の 泡をフィルターを介して培養槽内に押出し消泡することが出来る 以上の本発明の装置を使用して従来法との比較をした荬験例を説明する。

〔実験例 1〕

図 3で述べた培養槽を用いて、 培赉液中への酸素供給速度を求めた。 又比蛟例 として、 本発明の方法 （a ) の他に、 （b ) シリコンチューブによる酸素供給法、 ( c ) 直接曝気による酸素供給法、 （d ) 図 7に示した特開平 1— 1 7 4 3 7 6 号公報に開示された装匮 （以下、 回転フィ ルタ一法という。 ） による供給法の値 を求めた。 その結果を次の表 1に示す。

〔表 1〕

〇 少ない (^ β好)

X 多い （結 ¾不良） なお以上の各方法の条件は以下の通りである。

(a) 本発明の方法 フィルター、 孔怪 150、 100、 60メ ッシュの三 ® フィルター内回転絜 ' · '径 70麗ディスクタービン 3枚 曙気量、 純酸素 1リッ トル 分

(b ) シリコンチューブ法 シリコンチューブ外 ί圣 3 mm

シリコンチューブ長さ 60m

( c ) 直接噁気法 曝気量 1リッ トル Z分

(d) 回転フィルタ一法 フィルタ一回転数 80 r p m

螺気量 1リ ッ トル 分

上記条件で溶存酸素の経時変化を求め、 酸素供給速度 (mm o 1 /h) を計 した。 あわせて、 2%血清を含む培地での泡の発生状態を観察し、 上記 〔表 1〕 に示す結果を得たのである。

以上の結果に示す通り、 本発明装置は特に高い酸素供給速度を示し、 高密度培 養が可能なことを示し o

〔実験例 2〕

図 5に示した培養槽を用いて長期問細胞培養槽を行つ

ヒ 卜エリスロポエチン （EP0) を生産する遺伝子組み換え BHK細胞 （日本 国特開昭 62— 269697号公報参照） を用いて細胞培養と物質生産について検討を行 つた。 上記 EP0生産細胞を 2 X10 · 個 ミ リ リ ッ トノレ、 サイ トデックスー1 (フアルマシア製） 60 gを牛血清 10%を含む01^1£1^培地151中に懸濁さ せ、 一晩ゆるやかに撹拌しながら培養し、 マイクロキャリア一に付 ti-させた。 翌日より、 SV1開放 3秒、 閉鎮 10秒のバルブ開閉条件に設定し、 また気液撹 拌槽の撹拌数 300 r p m、 酸素曝気量 3〜 4リ ッ トル 分、 S V 1閉鎖時の培 養槽内圧 1. 2〜1. 4 k g/cm- の条件により一力月間連続的に細胞培養を 行った。 培養液は図 3に示した培養液回収用導管 （7) より連続的に回収し、 回 収培養液中の E P 0活性を E P 0測定用ェンザィムィムノアッセィ （E I A) 法 により測定した。 測定結果は培養開始日の活性に対する相対活性として図 6に示 した通りであり、 図 6では、 EP0活性の相対活性が長期 f¾失われる なく持続 していることを示している。 このように 30日間 E P 0が連続的に高い濃度で生 産されていることが確認でき o

またこの培養期問中、 従来の浮遊培養法で発生する泡の問題は無く、 本発明装 置が高い消泡効果を有することが確認でき また培養液中への酸素 給速度は

4 O m m o 1 時問であり、 従来の酸素供給方法と比較して高いことが確認でき 以上のように本発明においては、 培養榕の一部に、 培養液および、 培養細胞の 生産する蛋白質は透過する力、 細胞の接着担体は透過しないフィルターによって 隔離される領域を設け、 この内部で酸素を高濃度に溶解させることができ、 かつ 消泡作用も十分に機能するが、 本発明は上記に記載された実施例に限定されるこ とはない。

Claims

請求の範匪

1. 細胞培養擠の一部に培養液及び培養細胞の生産する蛋白赏は透過する力 钿 胞又は細胞の接着担体は透過しないフィルタ一によって隔離される領域を設け、 当該領域の底部に酸素等を供給する導管を設 ^し、 この導管の喷出ノズル疸上に 高速回転する搅拌羽根を設け、 又フィルター高さの 3 0〜5 0 %は細胞培養構内 の気相部分に露出していて、 当該領域内の液而直下に培養液回収用の導 ノズル を有する細胞培養槽。

2. 細胞又は細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔離される領域の 液面上に高速回転する消泡羽根を設けてなる請求の範囲 1記載の細胞培養^

3. 細胞又は細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔離される領域の 上面部に開口部を設けた請求の範囲 2記載の細胞培養

4. 細胞培筏措内で細胞又は細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔 離される領域外に投拌羽根を設けた請求の範囲 1記載の細胞培養措。

5. 細胞培養槽の気相部分に開口した無菌空気通気管を設け、 これによつて細胞 又は細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔離される領域内の発生し た泡によって低下した当該領域内の液面を上昇せしめ、 当該領域内の泡をフィル 夕一を介して細胞培養槽中に押し出させ消泡せしめることが可能な請求の範面 1 記載の細胞培養槽。

6. 無菌空気通気管に開閉バルブを設けた請求の範囲 5記載の細胞培養槽

7. 細胞培養槽の気相部分に開口した排気管を設けた請求の範囲 1記載の細胞培

8. 細胞培養槽の気相部分に開口した排気管と細胞又は細胞の接着担体は透過し ないフィルターによって隔離される領域の底部に酸素等を供給する導管とに開閉 バルブを設けた請求の範囲 7記載の細胞培養槽

9. 細胞培養槽の気相部分に開口した無菌空気通気管及びその開閉バルブを設け、 これによつて細胞又は細胞の接着担体は透過しないフィルターによって隔離され る領域内の発生した泡によつて低下した当該領域内の液面を上昇せしめ、 当該領 域内の泡をフィルターを介して細胞培養槽中に押し出させ消泡せしめることが可 能な請求の範囲 8記載の細胞培養槽。