JP4240525B2 - 細胞の培養・回収方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は細胞の培養・回収方法及び装置に係り、特に付着系細胞を培養して回収する培養・回収方法及び装置に関する。

付着系細胞は、活性が高く、特定の機能を有するものが多いことから、付着系細胞を高密度で培養し、その生理活性や代謝産物を利用したいという要望がある。このため、付着系細胞を高密度で大量に培養する培養装置が開発されている。

特許文献１には、培養容器の内部に多孔材を設けた培養装置が記載されている。この培養装置によれば、多孔材の内部に付着系細胞を高密度で培養することができる。

特許文献２には、培養槽の内部にスパージャー（給気口）が設けられ、このスパージャーから培養液内にガスを送気する培養装置が記載されている。この培養装置によれば、送気したガスによって培養液が攪拌されるので、攪拌液内の細胞とガスの接触効率を向上し、細胞を高密度で培養することができる。
特開２００２−２１８９６７号公報 特開平６−２２７５３号公報

しかしながら、特許文献１及び２は、高密度の付着系細胞を短時間で培養することができないという問題や、培養した付着系細胞を効率よく回収することができないという問題があった。

すなわち、特許文献１は、多孔材の内部に付着した細胞に対してガスや基質を十分に供給することができず、付着系細胞を短時間で培養することができないという問題があった。また、特許文献１は、多孔材の内部に培養された付着系細胞を回収することが困難であるという問題があった。

特許文献２は、培養槽の内部にガスや基質の偏りが発生し、高密度の付着系細胞を安定して培養することができないという問題や、付着系細胞の回収方法についての記載がないという問題があった。

このため、特許文献１及び２は、高密度の付着系細胞を培養するのに長い時間を必要とするとともに、培養した付着系細胞の回収作業に多大な労力を要していた。特に純粋培養系では、コンタミネーションを防止するために無菌操作も必要となり、回収作業に更なる労力を要していた。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、付着系細胞を効率良く培養できるとともに、培養した細胞を効率良く回収できる細胞の培養・回収方法及び装置を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は前記目的を達成するために、細胞の培養・回収方法であって、チューブに液体培地を通液させることによって前記チューブの内面に細胞を付着させて培養し、該培養した細胞を、前記チューブを変形させることによって該チューブから剥離させて回収することを特徴としている。

請求項２に記載の発明は前記目的を達成するために、細胞の培養・回収装置であって、チューブと、該チューブに液体培地を通液させる通液手段と、前記チューブを変形させる装置とを備え、前記チューブに前記液体培地を通液させることによって、前記チューブの内面に細胞が付着して培養され、該培養された細胞は、前記装置により前記チューブを変形させることによって前記チューブの内面から剥離されて、回収されることを特徴としている。

請求項１及び２に記載に記載の発明によれば、チューブに液体培地を通液することによって、チューブの内面に細胞を付着させて培養するので、細胞に対する液体培地の接触効率が高く、高密度の付着系細胞を短時間で培養することができる。

また、請求項１及び２に記載の発明によれば、チューブを変形させることによって、チューブの内面に付着した細胞を簡単に剥離させることができる。よって、培養した付着系細胞を、少ない労力で効率よく回収することができる。なお、チューブの変形は、例えばチューブを揉んだり、扱いたり、ほぐすことによって行われる。請求項２の発明によれば、チューブに付着した細胞を自動的に回収することができる。

請求項３に記載の発明は請求項２の発明において、前記チューブにガスを送入する送入手段を備えたことを特徴としている。請求項３の発明によれば、チューブにガスを送入するので、チューブの内面に付着した細胞にガスを直接接触させることができる。したがって、例えば有酸素ガスをチューブに送入することによって、好気性微生物を効率よく培養することができる。また、無酸素ガスをチューブに送入することによって、嫌気性微生物を効率よく培養することができる。

請求項４の発明は請求項３の発明において、前記チューブは口径が１ｍｍ以上１２ｍｍ以下であることを特徴としている。請求項４の発明によれば、チューブの口径を１２ｍｍ以下としたことによって、チューブ内に送り込んだガスが気泡溜まりを形成したり、液体培地の通液方向に対して逆流したりすることを防止できる。また、チューブの口径を１ｍｍ以上としたことによって、チューブの内面に細胞が付着する環境を形成することができる。なお、チューブの口径は、１ｍｍ以上１２ｍｍ以下が好ましく、２ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましい。

請求項５に記載の発明は請求項２〜４のいずれか１の発明において、前記液体培地が貯留されるとともに、前記チューブの両端部が接続される密閉容器を備え、該密閉容器内の液体培地が前記チューブ内を循環することを特徴としている。

請求項５の発明によれば、液体培地がチューブと密閉容器との間を循環するので、液体培地の消費量を減少させることができ、少ない液体培地の消費量で高密度の付着系細胞を培養することができる。また、密閉容器を用いることによって、密閉容器とチューブとを含む密閉系が形成されるので、目的としない細胞の混入を防止することができる。

請求項６に記載の発明は請求項２〜５のいずれか１の発明において、前記チューブは、ガス透過性チューブであることを特徴としている。請求項６の発明によれば、チューブの表面から内部にガスが供給されるので、チューブの内面に付着した細胞へのガスの供給効率を向上させることができる。

請求項７に記載の発明は請求項２〜６のいずれか１の発明において、チューブを変形させる前記装置は、チューブポンプであることを特徴としている。

本発明に係る細胞の培養・回収方法及び装置によれば、チューブに液体培地を通液させることによって、チューブの内面に細胞を付着させて培養するので、細胞へ液体培養を効率よく供給することができ、高密度の付着系細胞を短時間で培養することができる。また、チューブの内面に付着した細胞は、チューブを変形させることによって剥離するので、培養した付着系細胞を効率良く回収することができる。

以下、添付図面に従って本発明に係る細胞の培養・回収方法及び装置の好ましい実施の形態について詳説する。

図１は、本発明が適用された培養・回収装置１０の構成を模式的に示している。

図１に示すように培養・回収装置１０は主として、チューブ１２、チューブポンプ（通液手段）１４、及び密閉容器１６によって構成されている。

チューブ１２は、その両端部１２Ａ、１２Ｂが密閉容器１６に接続されている。密閉容器１６の内部には、基質及び必須元素を含む液体培地（以下、培地という）が貯留されており、この培地に、チューブ１２の端部１２Ａが浸漬されている。したがって、チューブ１２に配設されたポンプ２０を駆動することによって、密閉容器１６内の培地は、端部１２Ａからチューブ１２内に送り込まれ、端部１２Ｂから密閉容器１６内に返送される。これにより、培地が密閉容器１６とチューブ１２との間で循環される。この密閉容器１６とチューブ１２が成す循環路は密閉系であるので、外部から細胞が侵入することを防止できる。なお、密閉容器１６には、不図示のガス抜き手段が設けられており、密閉容器１６内のガスを引き抜くことができるようになっている。

チューブ１２には、ポンプ２０の下流側に、ガス送入管２２が接続されている。ガス送入管２２の先端は不図示のガス供給源に接続されており、ポンプ２４を駆動することによってガス送入管２２に所定のガス（例えば炭酸ガスや酸素ガス）が供給される。ガス送入管２２には、電磁弁２６が配設されており、この電磁弁２６は、一定の時間間隔でガス送入管２２を開閉するように制御される。したがって、電磁弁２６が開かれた時にのみ、ガスが気泡となってチューブ１２内に送入され、電磁弁２６が閉じられた際には培地が送入される。これにより、チューブ１２にガスと培地が交互に送り込まれる。

チューブ１２は、途中で分岐して三本の小口径チューブ１２Ｘ、１２Ｙ、１２Ｚを形成し、この三本の小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの先端が合流して密閉容器１６に接続される。小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径は、１ｍｍ以上１２ｍｍ以下が好ましく、２ｍｍ以上１０ｍｍ以下がより好ましい。小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径を１２ｍｍ以下、好ましくは１０ｍｍ以下としたことによって、チューブ１２内に送り込んだガスを確実に一方向に通気させることができる。すなわち、チューブ１２内に送り込んだガスが気泡溜まりを形成したり、液体培地の通液方向に対して逆流したりすることを防止できる。また、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径を１ｍｍ以上、好ましくは２ｍｍ以上としたことによって、付着系細胞が成長しやすい環境を形成することができる。すなわち、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径が小さ過ぎると、付着した細胞によって小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚが液詰まりを起こしたり、付着した細胞が成長せずに剥離したりするおそれがあるが、これを防止することができる。

また、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚは、透明（或いは半透明）で、且つ、ガス透過性を有するものを使用することが好ましい。透明な小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを用いることによって、付着した細胞の成長度を視認することができる。また、ガス透過性を有する小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを用いることによって、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの外面から内部にエアを取り入れることができ、付着した細胞にエアを供給することができる。

小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚにはそれぞれ、チューブポンプ１４が配設される。チューブポンプ１４は、図２に示すように、ケーシング４０、駆動ローラ４２、及び従動ローラ４４、４４…によって構成される。ケーシング４０の上端と下端には開口が形成されており、この開口を介して小口径チューブ１２Ｘ（或いは１２Ｙ、１２Ｚ）がケーシング４０の内部を貫通するように取り付けられる。駆動ローラ４２は不図示のモータに接続され、このモータを駆動することによって回転するようになっている。従動ローラ４４、４４…は、駆動ローラ４２に連結されており、駆動ローラ４２を回転させることによって駆動ローラ４２の周りを回転するようになっている。また、従動ローラ４４は、それ自体が回動自在に支持されている。このように構成されたチューブポンプ１４は、駆動ローラ４２を回転させることによって、従動ローラ４４、４４…が小口径チューブ１２Ｘ（或いは１２Ｙ、１２Ｚ）を押しつぶしながら扱き、培地及び気泡を一定流量で流すことができる。なお、チューブポンプ１４は、各小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚにそれぞれ取り付けてもよいが、三本の小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに、共通のチューブポンプ１４を取り付けてもよい。すなわち、図２に示すチューブポンプ１４において、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを図２の奥行き方向に並べて配置し、従動ローラ４４、４４…が三本の小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを同時に扱くように構成してもよい。また、チューブポンプ１４の構成はこれに限定するものではなく、例えば偏心ロータを回転させる構成であってもよい。さらに、チューブポンプ１４の代わりに他のポンプを用いて、培地及び気泡を一定流量で送り込むようにしてもよい。

図１に示すように、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚが合流したチューブ１２には、抜き取り管３０が接続される。抜き取り管３０には弁３２が配設されており、この弁３２を開き、チューブ１２に配設された弁３４を閉じることによって、チューブ１２から抜き取り管３０に流体（付着系細胞を含む培地）が抜き取られる。

次に上記の如く構成された培養・回収装置１０の操作方法及び作用について図３に基づいて説明する。

まず、オートクレーブ（湿熱加圧滅菌処理）によって、培養・回収装置１０を滅菌する。次いで、図３（Ａ）の密閉容器１６内に培地を準備し、この培地に種細胞を添加する。その際、細胞の付着性を向上させるため、アルギル酸ナトリウムを添加するとよい。

次に、ポンプ２０、ポンプ２４及びチューブポンプ１４を駆動するとともに、電磁弁２６を開閉制御し、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚにガスと培地を交互に通過させる。その際、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径が１２ｍｍ以下であるので、ガスは、逆流したり気泡溜まりを形成したりすることなく確実に通気される。このように小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚにガスと培地を送り込むことによって、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの内面には、細胞が付着して培養される。

図１に示す如く、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの内面に付着した細胞には、ガスと培地が交互に接触される。したがって、細胞に対するガス及び培地の接触効率が良く、細胞を短時間で高密度に培養することができる。特に本実施の形態では、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚとしてガス透過性のものを使用したので、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの外面から内部にエアを取り入れることができ、付着系細胞に対する酸素の供給効率を向上させることができる。したがって、付着系細胞をより短時間で高密度に培養することができる。

また、本実施の形態では、一定の口径で形成された小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚにガスと培地を一定流量で送り込むので、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの全域において、均一な培養環境が形成される。したがって、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの全域において高密度の付着系細胞を均一に培養することができる。

さらに、本実施の形態では、オートクレーブによって滅菌した後に種細胞を添加し、密閉容器１６とチューブ１２から成る密閉系で培養するので、目的とする細胞のみを培養することができる。なお、純粋培養系でない場合には、オートクレーブ操作を省略してもよい。

小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの内面に付着した細胞が十分に成長した後、図３（Ｂ）に示すように、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを揉みほぐしたり、扱いたりして変形させる。これにより、付着していた細胞が小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの内面から剥離される。

剥離させた細胞は、弁３２を開いて弁３４を閉じることによって、図３（Ｃ）に示すように、抜き取り管３０から抜き取られ、回収容器３６に回収される。そして、図３（Ｄ）に示すように、必要に応じて遠心濃縮される。これにより、高密度に培養された付着系細胞を回収することができる。このように、本実施の形態によれば、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを変形させることによって付着系細胞を簡単に剥離させることができるので、細胞の回収効率を大幅に向上させることができる。

以上説明したように、本実施の形態の培養・回収装置１０によれば、付着系細胞を高密度で短時間に培養することができるとともに、培養した付着系細胞を容易に回収することができる。

また、本実施の形態の培養・回収装置１０は、大きな培養槽が不要となるので、装置を小型化することができる。さらに、チューブ１２を巻回した状態にして設置することによって、非常に小さなスペースに配置することができる。

なお、上述した実施の形態は、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに通液する培地を密閉容器１６との間で循環させるようにしたが、これに限定するものではなく、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに一方向に培地を通液するように構成されていればよい。したがって、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに通液した培地をそのまま廃棄するようにしてもよい。この場合には、常に高濃度の培地を小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに通液させることができるので、付着系細胞の培養効率をさらに向上させることができる。

また、上述した実施の形態は、チューブ１２にガスを送入したが、これに限定するものではなく、ガスを送入せずに培地のみを通液させる構成としてもよい。その場合には、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの口径を１２ｍｍ以上としてもよい。

また、上述した実施の形態は、三本の小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを設けたが、これに限定するものではなく、四本以上の小口径チューブを設けて、細胞の付着面積を増加させてもよい。また、二本、或いは一本の小口径チューブを設けてもよく、その場合には、チューブの長さを延長して、細胞の付着面積を十分に確保するとよい。

また、上述した実施の形態は、ガス透過性を有する小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを用いるとともに有酸素ガスを送入することによって好気性細胞を培養したが、これに限定するものではない。ガス不透過性のチューブを用いるとともに無酸素ガス（例えば窒素ガスやアルゴンガス）を送入することによって嫌気性細胞を培養することもできる。

さらに、上述した実施の形態は、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの内面に付着した細胞を剥離する剥離作業（すなわち、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを変形させる作業）を作業者が行うようにしたが、自動化してもよい。この自動化装置としては、例えば、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを挟圧して変形させる一対のローラ（不図示）を設けるとともに、この一対のローラを小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに沿って移動させる移動装置（不図示）を設けるとよい。これにより、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚを自動的に変形させることができ、付着系細胞の回収作業を自動化することができる。

なお、図２のチューブポンプ１４を利用して、剥離作業を自動化することもできる。すなわち、チューブポンプ１４を小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの上流側端部に固定して細胞の培養を行い、剥離作業時には、チューブポンプ１４を小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに沿って下流側に相対的に移動させるとよい。これにより、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚをチューブポンプ１４の従動ローラ４４によって変形させることができるので、細胞を自動的に剥離して回収することができる。なお、チューブポンプ１４を小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚに対して相対的に走行させる方法としては、小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの上流側端部を固定してチューブポンプ１４を移動させるか、或いはチューブポンプ１４を固定して小口径チューブ１２Ｘ〜１２Ｚの上流側を引っ張って移動させるとよい。

本実施の形態の培養・回収装置の構成を模式的に示す図 チューブポンプの構成を示す断面図 図１の培養・回収装置の操作方法を示す説明図

符号の説明

１０…培養・回収装置、１２…チューブ、１２Ｘ〜１２Ｚ…小口径チューブ、１４…チューブポンプ、１６…密閉容器、２０…ポンプ、２２…ガス送入管、２４…ポンプ、２６…電磁弁、３０…抜き取り管、３２…弁、３４…弁、３６…回収容器、４０…ケーシング、４２…駆動ローラ、４４…従動ローラ

Claims (7)

1. チューブに液体培地を通液させることによって前記チューブの内面に細胞を付着させて培養し、
   該培養した細胞を、前記チューブを変形させることによって該チューブから剥離させて回収することを特徴とする細胞の培養・回収方法。
2. チューブと、該チューブに液体培地を通液させる通液手段と、前記チューブを変形させる装置とを備え、
   前記チューブに前記液体培地を通液させることによって、前記チューブの内面に細胞が付着して培養され、
   該培養された細胞は、前記装置により前記チューブを変形させることによって前記チューブの内面から剥離されて、回収されることを特徴とする細胞の培養・回収装置。
3. 前記チューブにガスを送入する送入手段を備えたことを特徴とする請求項２に記載の細胞の培養・回収装置。
4. 前記チューブは口径が１ｍｍ以上１２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項３に記載の細胞の培養・回収装置。
5. 前記液体培地が貯留されるとともに、前記チューブの両端部が接続される密閉容器を備え、該密閉容器内の液体培地が前記チューブ内を循環することを特徴とする請求項２〜４のいずれか１に記載の細胞の培養・回収装置。
6. 前記チューブは、ガス透過性チューブであることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１に記載の細胞の培養・回収装置。
7. チューブを変形させる前記装置は、チューブポンプであることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１に記載の細胞の培養・回収装置。

Images