DE10326746A1

DE10326746A1 - Bioreaktor in Form einer Organkopie, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Anzucht, zur Differenzierung, zum Erhalt und/oder zur Nutzung von Zellen

Info

Publication number: DE10326746A1
Application number: DE10326746A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Dr. Dr.med. Bornemann
Original assignee: Gerlach Jorg Drmed
Current assignee: Gerlach Jorg Drmed
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: DE10326746B4; US20050003535A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor in Form einer Organkopie mit einem für die menschlichen Organe typischen Aufbau, ein Verfahren zu dessen Herstellung, sowie die Verwendung des Bioreaktors zur Anzucht, zur Differenzierung, zum Erhalt und zur Vermehrung und Nutzung von Zellen eines Organs oder dessen Stammzellen.

Description

Bioreaktoren für die Züchtung von Zellen, z. B. Zellkulturschalen, Zellkulturflaschen oder Reaktionsgefäße, insbesondere im Bereich der klinischen Therapie mit Zellen, zur Herstellung von biologischen Zellen oder Zellprodukten, als alternative Methode zu Tierversuchen oder zur Nutzung der Leistung der Zellen in der Industrie sind bekannt.

Bei diesem Stand der Technik sind ebenfalls die Anzucht, Kultur und Vermehrung von Zellen üblich. Ein derartiger Bioreaktor ist zum Beispiel in der WO 0075275 (Mac Donald, USA/ EP 1185612 (Mac Donald, USA) beschrieben. Diese Verfahren konnten aber bisher keine zufriedenstellenden Ergebnisse hinsichtlich der Leistungen von primären Zellen und Stammzellen, im Vergleich zum natürlichen Organverband liefern. Insbesondere ist es nicht möglich, die verschiedenen Zellen isoliert aus einem Organ "in vitro" unter organtypischen Bedingungen wieder naturgetreu zu reorganisieren.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Bioreaktor anzugeben, der hinsichtlich seiner Struktur und seiner Leistungen möglichst nahe an die natürlichen Organe heranreicht. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Bioreaktors anzugeben und dessen Verwendung.

Die Aufgabe wird im Bezug auf den Bioreaktor durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruches 1 und in Bezug auf das Verfahren zur Herstellung durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruches 12 erreicht. Die Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. In den Ansprüchen 27 bis 47 sind weiterhin besondere Verwendungen des Bioreaktors angegeben.

Kern der erfindungsgemäßen Lehre nach Patentanspruch 1 ist es somit, dass die Strukturen des natürlichen Organs in Form einer Kopie nachgebildet sind, so dass möglichst die identischen Versorgungs- und Entsorgungsbedingungen vorherrschen, wie sie auch in den natürlichen Organen vorliegen. Erfindungsgemäß wird dies nun dadurch erreicht, dass ein Bioreaktor in Form einer Organkopie bereitgestellt wird. Die Hohlstrukturen des erfindungsgemäßen Bioreaktors erlauben somit die Versorgung einer größeren Zellmasse in hoher Dichte, wobei der Flüssigkeitsaustausch zu/von den Zellen mittels Blutplasma oder Nährmedien dezentralisiert und unter Vermeidung größerer Stoffgradienten erfolgt. Zu den Hohlstrukturen gehören die zuführenden Gefäße (Arterien), die abführenden Gefäße (Venen), sowie weitere organtypische Gefäße, wie qz. B. bei der Leber die Leberportalvenen oder Lebergallenwegskanäle und die Heeringschen Kanäle mit den Leberstammzellen.

Wesentlich beim Bioreaktor nach der Erfindung ist, daß dessen immunologisch inaktiver offenporiger poröser Körper Poren aufweist, die miteinander kommunizieren können. Die Poren weisen dabei eine Größe auf die größer als die Größe der Zellen des jeweiligen Organs entspricht. Der Porendurchmesser liegt deshalb bevorzugt bei 50–1000 μm. Die Poren sind dabei über Porenwandöffnungen untereinander verbunden. Diese Öffnungen, die bevorzugt kanalförmig ausgebildet sind, sind bevorzugt 100–300 μm groß. Durch diese Ausgestaltung wird somit sichergestellt, dass die Poren über die Porenwandöffnungen untereinander und mit den Hohlstrukturen der Organkopie in Verbindung stehen. Die vorstehend beschriebene Struktur des porösen Körpers kann auch als offenporige Schaum-/Schwammstruktur bezeichnet werden.

Wichtig für den erfindungsgemäßen Bioreaktor ist somit, dass dieser aus einer immunologisch inaktiven, perfundierbaren Schaum- bzw. Schwammstruktur gebildet ist wobei innerhalb der Hohlräume die Zellen einge bracht sind und die Poren der Schaumstruktur miteinander kommunizieren. Über die Poren ist damit eine Mediumperfusion, ein Einspülen der Zellen, die Migration von Zellen sowie der Stoffaustausch möglich. Dadurch wird, wie vorstehend beschrieben, ein Bioreaktor realisiert der hinsichtlich seiner Stoffaustauschstrukturen und damit der Leistungen und Eigenschaften gegenüber den bekannten Bioreaktoren des Standes der Technik deutlich verbessert ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor wird somit eine Vorrichtung beschrieben, die die organtypische Reorganisierung von biologischen Zellen erlaubt. Für die Erfindung charakteristisch ist, dass die spezifischen Hohlstrukturen zur Versorgung der Zellen im Körper so dargestellt sind wie die natürliche Situation im Organ es vorgibt.

Als Materialien die zu Schaum-/Schwammstrukturen im Sinne der vorliegenden Erfindung führen, eignen sich alle bisher im Stand der Technik bekannten Materialien die offenporige Strukturen bilden. Geeignet hierfür sind z. B. Keramiken. Beispielhaft sei hier Hydroxylapatit genannt. Hydroxylapatit ist bereits im Stand der Technik aus der Medizin bestens bekannt und untersucht, so dass er sich hier für diesen Anwendungsfall besonders eignet. Hydroxylapatit liegt in Form eines Pulvers vor und kann gegebenenfalls als Suspension unter Zusatz von Porenbildner und anderen Additiven zur gewünschten Schaum-/Schwammstruktur aufgeschäumt und anschließend gesintert werden. Diese Zusätzen wie beispielsweise Eiweiß als organischer Schaumbildner werden anschließend wieder bei hohen Temperaturen des Sinterungsprozesse ausgebrannt. Bevorzugt werden dabei Schaumbildner eingesetzt, die während der Temperaturerhöhung zu Gasausdehnung und damit zu einem aufbrechen der Zwischenwände der Schaumblasen führen.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor ist bevorzugt in einem keim- und flüssigkeitsdichten Behältnis angeordnet. Geeignet hierfür sind Folien oder entsprechend dimensionierte Gehäuse. In diesem Falle sind selbstverständlich Anschlüsse vorgesehen, die mit mindestens einer Hohlstruktur des Organabgusses in Verbindung stehen, um die entsprechenden Ver- und Entsorgungen im Bioreaktor zu gewährleisten. In Bezug auf die Ausgestaltung der Anschlüsse können selbstverständlich mehrere Zu- und/oder Abgänge des Organs am Behältnis zu einem einzigen Zu- und/oder Abgang zusammengefasst werden. Weiterhin kann das Gehäuse noch verschiedene weitere Zugänge aufweisen, um Druck-, pH- und Temperaturmessungen oder das Einführen von optischen Sonden zur Mikroskopie oder zur Messung mittels Fluoreszenzlichtverfahren im Innenbereich des Moduls zu erlauben; ebenso kann das Gehäuse das sterile Öffnen erlauben, um einzelne Anteile der zellbesiedelten porösen Körperstruktur im Inneren für medizinische Implantationszwecke zu entnehmen. Derartige Lösungen für Bioreaktoren sind bereits auch aus der in der Beschreibungseinleitung genannten WO 0075275 (Mac Donald, USA)/ EP 1185612 (Mac Donald, USA) bekannt.

Das Gehäuse weist in einer weiteren Ausgestaltung noch verschiedene weitere Zugänge auf. Ein erster Zugang dient dabei dazu, um die Mikroorganismen in das Modul einzufüllen. Weitere Zugänge dienen beispielsweise zur Druck-, pH- und Temperaturmessung oder zum Einführen von optischen Sonden zur Mikroskopie oder zur Messung mittels Fluoreszenzlichtverfahren im Innenbereich des Moduls.

Eine weitere Variante des Gehäuses erlaubt das sterile öffnen des Gehäuses, um einzelne Anteile der zellbesiedelten porösen Körperstruktur im inneren, z.B. einzelne der vorgenannten Scheiben, für medizinische Implantationszwecke zu entnehmen.

Vorteilhaft beim erfindungsgemäßen Bioreaktor ist weiterhin, dass das Behältnis und die Anschlüsse auch aus einem resorbierbaren bzw. biologisch abbaubaren Material gefertigt werden können, so dass es auch möglich ist den Bioreaktor als Implantat zu verwenden.

Bevorzugt ist der Bioreaktor eine Kopie der Leber, des Knochenmarks, der Lymphknoten, des Thymus, Milz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Inselorgans, Schleimhaut, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Nebenniere, Knochen, Hoden, Gebärmutter, Placenta, Eierstock, Blutgefäße, Herz, Lunge, Muskel, Herzmuskel, Darm, Blase oder weiterer Säugetierorgane.

Die Erfinder konnten zeigen, dass ein Bioreaktor nach der Erfindung in Form einer Organkopie ausgezeichnete Strukturen besitzt. Die Zellen die in den Bioreaktor nach der Erfindung z. B. eingespült werden, werden in den offenen Poren immobilisiert um sich "naturgetreu" zu reorganisieren. Die Zellen gemäß dem Bioreaktor können in höherer Dichte gut versorgt werden und können unter Verwendung von Ko-Kulturen parenchymatöser Zellen mit organtypischen Nichtparenchym-Zellen auch zu Gewebsstrukturen reorganisiert werden.

In ersten Versuchen konnten die Erfinder zeigen, dass die vorstehend beschriebene Organkopietechnologie bei der Leber zu ausgezeichneter Ergebnissen führt. Ein Bioreaktor in Form einer Organkopie einer Leber stellt somit eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Selbstverständlich ist aber die Erfindung nicht auf einen Organabguß dieses Organs beschränkt, sondern ist grundsätzlich auf alle Organe, wie z.B. das Knochenmark, übertragbar.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Organkopie. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Organstrukturabgussverfahren bezeichnet werden.

Das Verfahren zur Herstellung des Körpers basiert auf den Schritten a) bis e) nach Patentanspruch 12. Die Schritte a) und c) bringen Substanz ein, die Schritte b) und d) entfernen Substanz. Über Negativ/Positiv-Ausgüsse wird die biologische Substanz mit den Zellen des Organs vollständig aufgelöst, wobei die versorgenden Hohlstrukturen in ihrer Form kopiert werden. Anstelle biologischer Wände der Hohlstrukturen treten immunologisch inaktive offenporige Schaumstrukturen, in welchen sich Zellen reorganisieren können, wobei die immunologischen Charakteristika des Originalorgans völlig verschwinden. Auch die ursprünglichen Stoffwechselcharakteristika des ursprünglichen Organs (z. B. Schweineleberstoffwechsel) verschwinden und können durch die nachfolgend eingebrachten Zellen ersetzt werden (z. B. bei humanen Leberzellen der Humanleberstoffwechsel).

In einem ersten Schritt a erfolgt die Auffüllung der Hohlstrukturen eines Organs, um welche herum die Zellen angeordnet sind. Dies erfolgt bevorzugt über alle ver- und entsorgenden Strukturen separat. Mit Schritt a entsteht ein dreidimensionaler Negativabguss der Gefäßstrukturen, welcher eine Organarchitektur aller stoffver- bzw. -entsorgenden Strukturen nachbildet. Wesentlich ist, dass der Negativabguss aus einem Material besteht, welches die anschließende Auflösung bzw. Verdauung des biologischen Organmaterials übersteht, und welches danach mechanisch stabil genug ist, um einen erneuten Positivabguss mit einer offenporigen schaumartigen Struktur zu ermöglichen. Zusätzlich muss das Negativmaterial so beschaffen sein, dass es nach Auffüllen der Zwischenräume mit dem offenporigen schaumartigen Material wiederum selbst vollständig aufgelöst bzw. verdampft werden kann, ohne die offenporige Schaummaterialstruktur zu zerstören. Geeignete Materialien hierfür sind flüssige Kunststoffe, die problemlos in die Hohlstrukturen eingebracht werden können und die dann nach Ausfüllung der kompletten Hohlstruktur ausgehärtet werden. Solche Polymere sind z.B. in der Anatomie bekannt. Das Material für die Negativkopie wird demnach so ausgewählt, dass es nach der vollständigen Ausfüllung der Hohlstruktur in den Hohlstrukturen polymerisiert. Grundsätzlich sind hierfür Materialien geeignet deren Zersetzungstemperatur max. 600 °C beträgt. Es können hierbei sowohl flüssige Kunststoffe in Form eines Einkomponenten-Kunststoffes oder auch Zweikomponenten-Kunststoffe verwendet werden.

In einem Schritt b) werden die Zellen und die Bindegewebsstrukturen des biologischen Organs verdaut bzw. aufgelöst. Zum Verdauen können Enzyme, wie beispielsweise Kollagenase/Trypsin verwendet werden. Gleichermaßen eignet sich die Gewebeauflösung mit Säurebädern oder Laugenbädern bzw. Säure-/Laugewechselbädern, wenn die Substanz des Negativausgusses für eine solche Behandlung geeignet ist.

In einem Schritt c) wird ein erneuter Positivabguss aus offenporigem schwamm/schaumartigen Material angefertigt, der um die Bereiche der ursprünglichen Gefäßstrukturen herum an die Stelle des Bindegewebes bzw. der Zellen des ursprünglichen Organs tritt. Charakteristisch für das offenporige schwammartige Material ist, dass die schwammartigen Hohlräume Zellen aufnehmen können, dass die Hohlräume miteinander kommunizieren und eine freie Passage von 1. Zellen (beim Einschwemmen und der Zellmigration) erlauben und 2. Stoffwechseledukten und Produkten mit Kulturmedien am frei zirkulieren können.

Als eine Substanz für den Positivabguss ist Hydroxylapatit bevorzugt. Hydroxylapatit gehört zur Gruppe der Calciumphosphate, worunter keramische Werkstoffe mit unterschiedlichen Anteilen von Calcium und Phosphor verstanden werden. Hydroxylapatit ist eine Verbindung, die sowohl natürlich vorkommt, wie auch synthetisch hergestellt werden kann. Der medizinische Einsatz von Hydroxylapatit als Knochenersatzwerkstoff ist Stand der Technik. Die Motivation für den klinischen Einsatz von Hydroxylapatit ist es, einen Werkstoff mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung wie die mineralische Phase des Knochens anzuwenden. Hydroxylapatit kommt als natürliche Komponente im mineralischen Anteil des Knochens mit 60–70 % vor. Hydroxylapatitpulver wird dem Stand der Technik entsprechend beispielsweise über Fällungsmethoden aus einer wässrigen Lösung, beispielsweise durch Zugabe von Amoniumphosphat in einer Calciumnitratlösung bei alkalischem pH hergestellt. Zur Verbindung der Pulverteilchen kann bei Temperaturen um 1000–1600°C eine Sinterung erfolgen, wobei Wintermantel (Wintermantel E, Suk-woo Ha: Biokompatible Werkstoffe und Bauweisen: Implantate für Medizin und Umwelt. Berlin/Springer 1998:256-257. ISBN 3-540-64656-6) beschreibt, dass für die Herstellung von porösen Fest körpern aus Hydroxylapatit, beispielsweise offenporige schaumartige Strukturen, das Hydroxylapatitpulver mit organischen Zusätzen vermischt wird, die anschließend wieder bei hohen Temperaturen ausgebrannt werden. Bevorzugt werden dabei Schaumbildner eingesetzt, die während der Temperaturerhöhung zu Gasausdehnung und damit zu einem aufbrechen der Zwischenwände der Schaumblasen führen.

In einem Schritt d) wird die Substanz der Negativkopien entfernt, so dass wieder Hohlstrukturen entstehen, die an die Stelle der Gefäße des biologischen Organs treten. In dem Schritt der Substanzauflösung bzw. Verdampfung muss die Negativausgussform des Organs rückstandslos aufgelöst werden, ohne die Positivformstrukturen zu verändern.

Der gemäß den Verfahrensschritten a) bis d) hergestellte Bioreaktor wird dann in ein keimdichtes und flüssigkeitsdichtes Behältnis eingebracht. Als Behältnisse eignen sich hierfür an und für sich aus dem Stand der Technik bekannte Folien und/oder entsprechende Behälter. Das Behältnis weist dabei Anschlüsse auf, die mit mindestens einer Hohlstruktur der Organkopie in Verbindung stehen, damit von außen eine Zu- und Abfuhr der Medien bzw. ein Einschwemmen der Zellen erfolgen kann.

Für die jeweils nachfolgende Auflösung des Organgewebes (Auflösungschritt b)) und die Auflösung des Negativformmaterials (Auflösungsschritt d)) sind gegensätzliche Materialeigenschaften der offenporigen Schaumstruktur des Positivabgusses und des Negativabgussmaterials entscheidend. Nach Ausformung der Positivform zwischen dem Negativmaterial muss das Negativmaterial rückstandslos entfernbar sein, ohne die Struktur des Positivmaterials zu verändern bzw. zu beeinträchtigen.

Beispiele für verschiedene technische Lösungen dieser Problematik sind am Beispiel der Verwendung offenporiger Keramikschaummaterialien als Positivmaterial genannt: Da Hydroxylapatit hitzebeständig ist, kann als Negativformmaterial ein Polymer verwendet werden, welches bei Temperaturen von bevorzugt über 600°C rückstandslos verbrennt/verdampft. Da Hydroxylapatit in wässriger Lösung unlöslich ist, kann als Positivformmaterial auch eine kristallisierende Substanz eingesetzt werden, welche sich beim Eintauchen des Hydroxylapatits in wässrige Lösung auflöst. Vergleichbare Ergebnisse können auch mit künstlichen oder natürlichen Wachsen erreicht werden, die in flüssiger Form oberhalb der Schmelztemperatur eingespritzt werden um in den Gefäßstrukturen des Organs abzukühlen/auszuhärten und die dann den Auflösungsprozess des biologischen Materials überstehen.

Vergleichbare Prozesse können mit Materialien unterschiedlicher gegensätzlicher Eigenschaften, beispielsweise bei unterschiedlichen Eigenschaften unter pH-Veränderungen, unterschiedlichen Eigenschaften bei Lösungsmittelzugabe usw. erreicht werden.

Die weiteren Schritte dienen der Herstellung eines perfundierbaren Körpers im Sinne eines geschlossenen Kultursystems. So können keimdichte Behältnisse wie Außengehäuse und Anschlüsse zur Zuführung/Abführung von Kulturmedien, Blut, Plasma oder Zellprodukten und ähnliche Vorrichtungen angebracht werden, die Stand der Technik in der Zellkulturtechnologie sind. Weitere Zugänge, beispielsweise zur Druck-, pH- und Temperaturmessung oder zum Einführen von optischen Sonden zur Mikroskopie oder zur Messung mittels Fluoreszenzlichtverfahren im Innenbereich des Bioreaktors, kön nen angebracht werden.

Für eine spezielle Ausgestaltung der Erfindung wesentlich ist die Option, diese Anschlüsse wie auch die Gehäusematerialien und das offenporige schaumartige Bioreaktormaterial aus resorbierbarem/biologisch abbaubarem Material herzustellen. Auf diese Weise ist eine klinische Implantierbarkeit der gesamten Strukturen möglich, die zu einem dauerhaften biologischen Organersatz mit Zellkulturen am Patienten führen kann. Letzteres ist möglich, wenn immunologisch kompatible Zellen kultiviert werden (autologe Zellen, Stammzellen oder transgene Zellen beispielsweise . Vorteilhaft für die Implantation solcher Strukturen ist, dass durch die Erfindung jegliche biologische Komponenten des ursprünglichen Abgussorgans verloren gehen. Damit wird die Verwendung von Abgussorganen tierischen Ursprungs in Schritt a) möglich.

Die weiteren Schritte dienen der Vorbereitung der Kultur von Zellen in den offenporigen schaumartigen Strukturen des Körpers. Hierzu kann eine Reinigung, z. B. mit wässrigen Medien, erfolgen. Üblicherweise sollte eine Sterilisation erfolgen. Auch eine Beschichtung mit Biomatrix, z. B. Collagen, entspricht dem Stand der Technik. Unter Verwendung Biomatrix produzierender Zellen in Ko-Kultur im Körper ist jedoch eine Beschichtung mit Fremdbiomatrix vermeidbar.

Aufgrund der hohen Zelldichte ist eine ausreichende Sauerstoffversorgung im Körper wünschenswert. Dies kann durch hohe Zirkulationsraten oxygenierten Mediums erfolgen, aber auch durch Sauerstoffträger, die mit dem Medium zirkuliert werden (z. B. künstliches Hämoglobin oder Erythrozyten).

Die weiteren Schritte entsprechen dem Stand der Technik der Anwendung von Kultursystemen. Die Zellen werden über die Hohlstrukturen eingespült, welche im früheren Organ den Gefäßen entsprechen. Dies erfolgt zweckmäßigerweise mit allen organtypischen Zellen für eine Ko-Kultur aller Zellen des Organs. Das Einspülen der Zellen erfolgt zweckmäßigerweise mit Kulturmedium.

Nachdem die Parenchym- und Nichtparenchymzellen des Organs eingeschwemmt wurden, kann eine organtypische Kultur im Körper erfolgen.

In einigen Körperorganen werden Zellen produziert, die anschließend über den Blutweg ausgespült werden. So zum Beispiel die Stammzellen des Knochenmarks. Analog kann ein Ausspülen produzierbare Zellen, beispielsweise von Immunzellen oder von Blutzellen und/oder Stammzellen, aus dem Bioreaktor zur Zellgewinnung erfolgen.

Eine Gewinnung von Zellen kann durch Ausspülen mit Kulturmedien, ggf. nach enzymatischer Biomatrixverdauung beispielsweise mit Collagenase/Trypsin erfolgen.

Wird in einer speziellen Ausfertigung die Implantation in den Körper eines Patienten und der chirurgische Anschlüsse der Versorgungshohlstrukturen an die Blutgefäße des Patienten gewünscht, kann vor Implantation in einem weiteren Schritt das Einschwemmen von Gefäßendothelzellen (z. B. des Patienten) in die Hohlstrukturen erfolgen. Hierdurch wird die Blutverträglichkeit nach Implantation verbessert und die Thrombusbildung reduziert. Werden hier körpereigene Endothelzellen des Empfängerpatienten verwendet, können immunologische Reaktionen reduziert werden.

Mit der beschriebenen Methodik konnten bereits adulte Stammzellen der Leber, humane bi-potentielle Progenitorzellen, erfolgreich zu Leberstrukturen kultiviert werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Bioreaktors.

Grundsätzlich ist der erfindungsgemäße Bioreaktor zum Erhalt, zur Vermehrung und/oder zur Nutzung von einzelnen Zellen und verschiedene Zellarten (Ko-Kulturen) eines Organs oder auch von Zelllinien oder immortalisierten Zellen geeignet. Die Nutzung des Bioreaktors kann dabei in der industriellen Produktion von diagnostischen/therapeutischen Substanzen durch Zellen liegen oder aber auch in der Produktion von Zellen für die industrielle Nutzung wie auch für die therapeutische Transplantation. Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann auch zur Nutzung der Zellleistungen für einen Patienten im Sinne eines exra-korporalen hybriden Organs für die Organunterstützung eingesetzt werden. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Bioreaktor zur Bildung von implantierbaren Organtransplantaten dienen. Der Bioreaktor ist auch als Laborsystem zum Ersatz oder zur Ergänzung von Tierversuchen in der Forschung und Pharmakologie geeignet. Eine weitere Nutzungsmöglichkeit liegt in der Schaffung eines Zellsystems für die Virusvermehrung, z.B. von HIV-Viren, Hepatitis B/C-Viren. Der Bioreaktor kann auch zur Vaccinherstellung dienen. Die Vorrichtung erlaubt insbesondere die Reorganisation und den Erhalt von Stammzellen und dessen Wachstum und Differenzierung zu Organgewebe. Weitere bevorzugte Verwendungen sind in den Ansprüchen 41 bis 47 angegeben.

Die Erfindung wird nachfolgend durch die 1 bis 4 näher beschrieben.
1 zeigt die negative Kopie der Gefäßstruktur einer Leber. Zur Herstellung der in 1 gezeigten Struktur wurden alle Gefäßstrukturen eines Organes, hier die Leber, mit Schläuchen kannüliert und ein Zwei-Komponenten Kunststoff flüssig eingespritzt. Der flüssig eingespritzte Kunststoff polymerisiert dann in den Gefäßstrukturen des Organs und härtet dann aus. Zur Erzeugung der in 1 dargestellten negativen Kopie der Gefäßstruktur des Organs wurde das biologische Material durch eine Säurebehandlung entfernt. 1 verdeutlicht, dass mit einem derartigen Vorgehen nicht nur die Arterien und Venen, sondern auch die feingliedrigsten Hohlstrukturen des natürlichen Organs nachgebildet werden können.
2a-c zeigt nun noch einmal schematisch den Ablauf des Verfahrens zur Herstellung der Organkopie. 3a zeigt nun anhand eines Beispiels den Zustand beim Herstellungsverfahren nach der Entfernung des biologischen Materials. 3a zeigt somit schematisch den bereits in 1 beschriebenen Vorgang. Die in 3a dargestellte leiterförmige Ausbildung (12) symbolisiert somit die Gefäßstrukturen des Organs.
2b zeigt nun den Zustand des Herstellungsverfahrens der Organkopie, die resultiert wenn die Umhüllung der Negativkopie mit dem offenporigen Material durchgeführt worden ist. Die Gefäßstrukturen (12) sind von schaumartigen Material (11) umgeben.
3c zeigt nun wiederum schematisch letztlich den Endzustand, d.h. den Zustand nach entfernen der Nega tivkopie, so dass sich die entsprechenden Hohlgänge (13) in dem porösen Material (11) ausbilden.
3 zeigt somit nun den Endzustand eines erfindungsgemäßen Bioreaktors ausschnittsweise in schematischer Darstellung. 3 zeigt nun den Zustand der resultiert, wenn Zellen (14) in die offenporige Schaumstruktur (11) eingespült werden. In der Figur dargestellt ist eine spontane Reorganisation in den offenen Poren des Keramikschaums (11), die unter Perfusion mit Kulturmedien durch die kopierten Gefäßstrukturen ausgebildet wird.
4 zeigt die Dimensionen der offenporigen Struktur mit einem Versorgungsgang (8), der sich durch die Kopie eines Blutgefässes ergibt, den offenen Poren (9) des schaumartigen Materiales zwischen den Gefäßkopie-Versorgungsgängen, sowie den Porenwanddurchbrüchen (10) welche die miteinander kommunizierenden Hohlräume der offenporigen Strukturen ausmachen. Im Beispielsfall der 4 beträgt der Porendurchmesser (9) 250 Mikrometer, der der Durchmesser der offenen Poren 100 Mikrometer und der Versorgungsgang (8) der Dimension einer natürlichen Blutkapillare. Weitere Porendurchmesser (9) liegen zwischen 50–1000 μm und die der Porenwandöffnungen (10) zwischen 50–300 μm.
5 zeigt das Ausführungsbeispiel nach 4, jedoch nach Zellbesiedelung mit den Zellen (14).

Claims

Bioreaktor in Form einer perfundierbaren Organkopie die aus einem immunologisch inaktiven porösem Körper, dessen offene Poren miteinander kommunizieren und organspezifischen Hohlstrukturen besteht.
Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die offenen Poren einen Durchmesser von 40 – 1000 μm aufweisen.
Bioreaktor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren miteinander durch 10–300 μm große Porenwandöffnungen verbunden sind.
Bioreaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Organkopie in einem flüssigkeits- und keimdichten Behältnis angeordnet und dass das Außengehäuse mit Anschlüssen versehen ist, die mit mindestens einer Hohlstruktur der Organkopie in Verbindung stehen.
Bioreaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis und die Anschlüsse aus einem biologisch abbaubaren Material bestehen.
Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einem biologisch abbaubaren Material be steht.
Bioreaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des porösen Körper aus einem gesinterten Keramikpulver bestehen.
Bioreaktor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der offenporige poröse Körper aus Hydroxylapatitsuspensionen mit Additiva zur Schaumbildung gebildet wurde.
Bioreaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Kopie der Leber, Knochenmark, Lymphknoten, Thymus, Milz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Inselorgan, Schleimhaut, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Nebenniere, Knochen, Hoden, Gebärmutter, Placenta, Eierstöcke, Blutgefäße, Herz, Lunge, Muskel, Darmwand, Blase, Herzmuskel und/oder weitere Säugetierorgane ist.
Bioreaktor nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in den offenen Poren, Zelllinien, immortale Zellen, primäre Zellen und/oder Ko-Kulturen immobilisiert sind.
Bioreaktor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in hoher Dichte und/oder Gewebsstrukturen reorganisiert sind.
Verfahren zur Herstellung eines Bioreaktors in Form einer Organkopie mit folgenden Schritten: a) Herstellung einer Negativkopie der Hohlstrukturen des Organs, b) Entfernung des biologischen Materials, c) Umhüllen der Negativkopie mit einem Material, dass die Bildung eines offenporigen Körpers ermöglicht, d) Entfernen der Negativkopie, e) Einbringen in keim- und flüssigkeitsdichtes Behältnis.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Negativkopie (Verfahrensschritt a)) ein flüssiger Kunststoff in die Hohlstrukturen eingebracht und durch dessen Aushärtung eine feste Negativkopie gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zwei-Komponenten-Polymer verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff so ausgewählt ist, dass er eine Zersetzungstemperatur von max. 600°C besitzt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung des biologischen Materials (Verfahrensschritt b)) biologisch mittels Enzymen z.B. mit Collagenase/Trypsin erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Entfernung des biologischen Material (Verfahrensschritt. b)) eine chemische Behandlung z.B. Säure- und/oder Laugenbehandlung durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein offenporiger Körper (Verfahrensschritt c)) hergestellt wird, dessen Poren miteinander kommunizieren können.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der offenporige Körper eine Temperaturbeständigkeit von über 600°C aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der offenporige Körper mittels einer ein Keramikpulver wie z.B. Hydroxylapatit und schaumbildenden Additiva enthaltenden Suspension hergestellt wird und das beim Sintern die Wände der Poren teilweise aufgebrochen sind.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung der Negativkopie (Verfahrensschritt d)) durch Temperung erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein offenporiger Körper hergestellt wird, der aus einem Material besteht, dass nach Implantation durch Resorption in ein Organ aus biologischen Zellen im Körper umgewandelt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein offenporiger Körper hergestellt wird, der aus einem Material besteht welches sich bei einer in vitro Perfusion biologisch abbaut und so ein Organ ex vivo bildet.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete Organ transplantiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich das Behältnis und die Anschlüsse aus einem abbaubaren/resorbierbaren Material gebildet werden, so dass nach Transplantationen ein Organ im Körper entsteht.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Negativkopie des Organs tierische und/oder humane Organe verwendet werden.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zur Anzucht, zum Erhalt, zur Differenzierung, zur Vermehrung und/oder zur Nutzung einzelner Zellarten und/oder verschiedener Zellarten (Ko-Kulturen) eines Organs.
Verwendung nach Anspruch 27, für Stammzellen.
Verwendung nach Anspruch 27, für humane Zellen.
Verwendung nach Anspruch 27, für adulte Stammzellen.
Verwendung nach Anspruch 27, zur Produktion von Zellen.
Verwendung nach Anspruch 27, zur Produktion von Progenitorzellen für die Zelltransplantation.
Verwendung nach Anspruch 27, zur Produktion gentechnologisch-modifizierter Zellen, immortaler Zellen, Zelllinien und/oder transgener Zellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der An sprüche 1 bis 12, zur Produktion von Substanzen durch Zellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zur Differenzierung von organtypischen Zellen aus Stammzellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, zur Bildung von organtypischen Strukturen aus adulten Stammzellen, Knochenmarkzellen oder embryonalen Stammzellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, als extra-korporales hybrides Organ zur Organunterstützung.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, als implantierbares Organtransplantat.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, als Laborsystem zum Ersatz und/oder Ergänzung von Tierversuchen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12, als in vitro Viruskultur und Virusvermehrungssystem.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Erzeugung von Stoffen wie zellulären Stoffwechselprodukten, bekannten oder unbekannten Mediatoren, Hormonen, Differenzierungsfaktoren, Signalmolekülen, Wachstumsfaktoren, Sensibilisierungsfaktoren, Cytokinen, Proteinen, Antikörpern, Impfstoffen und/oder zur Erzeugung von organspezifischen Biomatrixsubstanzen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Ausbildung einer hybriden Drüse.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Erzeugung von biologischen Zellen wie Stammzellen oder differenzierten Zellen eines bestimmten Organs, Blutzellen, Immunsystemzellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als hybrides Immunsystem zur Herstellung von immunkompetenten Zellen und Vaccinen, Progenitorzellen für Organe und Blutbestandteile.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als hybrides Blutzellsystem (Knochenmark) zur Herstellung von Blutbestandteilen, insbesondere Blutplättchen und Erythrozyten.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als hybrides Stammzellensystem zur Herstellung von Progenitorzellen für Organe, insbesondere für die Transplantation von Reparaturzellen.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der zellbasierten Therapie, in der regenerativen Medizin, in der Zellbiologie und/oder in der Vaccinentwicklung bzw. zur Vaccinherstellung.