CN110327495A - 组织工程耳廓形态复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组织工程耳廓形态复合支架及制备方法，该方法包括：将软骨组织制成软骨脱细胞基质粉末，配制含软骨脱细胞基质的明胶或胶原混悬液，经CT、MRI或激光扫描、计算机辅助设计构建人耳形态的三维数字模型；3D打印PCL基材制备三维人耳形态耳廓网格框架，制备出对应耳廓形态的实体阳模和实体阴模；将三维人耳形态耳廓网格框架固定于实体阳模和实体阴模正中间，灌注配制好的软骨脱细胞基质的明胶或胶原混悬液，灌注后行冷冻处理，冷冻后剥离实体阳模和实体阴模，获得三维冷冻支架，三维冷冻支架经冷冻干燥后，浸入化学交联剂中交联，交联后去离子水反复冲洗、浸泡去除残余的化学交联剂，再经真空冷冻干燥获得最终的三维耳廓形态支架。

Description

组织工程耳廓形态复合支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物医学组织工程，尤其涉及一种具有三维结构的组织工程耳廓形态支架及其制备方法。
背景技术
因先天性小耳畸形、外伤及肿瘤等各种原因造成的耳廓缺损或缺失临床常见。耳廓是人体面部的主要特征之一，其缺损或缺失会严重影响患者的美观和心理健康。人体的耳廓主要由皮肤和软骨两种组织组成，由于皮肤组织很容易通过局部皮肤扩张和/或植皮获得，因此，耳廓缺损进行耳再造的关键难点在于如何获得形态和功能均良好的耳再造支架。目前临床耳再造方法主要基于自体肋软骨雕刻或高密度聚乙烯(HDPE)人造耳支架，缺点是创伤大或缺乏生物学功能，不同程度的存在造型不一、继发缺损等问题，无法满足实际临床需求，现迫切需要研制一种创伤小且具有正常生理功能的耳再造支架。
组织工程与再生医学技术为研制该支架提供了可能。目前软骨组织工程技术利用自体软骨细胞或成体干细胞作为种子细胞，接种在具有三维多孔结构的可降解支架上，最终经体外预构建形成软骨组织以修复缺损。当前在支架材料方面最常选用的是聚羟基乙酸(PGA)，因其具有良好的生物相容性和可降解性。目前已应用聚羟基乙酸/聚乳酸(polyglycolic acid/polylactic acid,PGA/PLA)支架复合大动物软骨细胞，在体外成功构建出了具有精确人耳形态的软骨，但经体内长时间观察发现，由于此支架为高分子合成材料，其构建软骨内残留的少量未降解支架易引发无菌性炎症反应，导致体内软骨再生不稳定。
因此本领域迫切需要寻找一种⑴生物相容性好、免疫原性低、体内炎症反应轻；⑵孔径孔隙率及三维形态精确可控；⑶力学强度好，体内长期维持三维形态；⑷降解速率适中，与软骨再生速率相匹配；⑸能模拟软骨微环境，促进体内外软骨再生的生物材料，研制出一种对病人创伤小且具有正常生理功能的耳再造支架，并应用该支架体外构建精确人耳形态软骨，最终实现临床转化突破,满足耳再造临床需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于软骨脱细胞基质的具有三维结构的组织工程耳廓形态支架及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将软骨组织切成小块，液氮中预冷，用低温冷冻研磨仪和组织破碎机粉碎成细颗粒状，制备成软骨粉末，并经脱细胞处理和真空冷冻干燥制成软骨脱细胞基质粉末；
(2)用一定质量的明胶或胶原溶于去离子水中配成1-5％(w/v)浓度的明胶或胶原溶液，1-5％(w/v)浓度的明胶或胶原溶液中混入一定质量的软骨脱细胞基质粉末，4度低温预冷搅拌混匀，配成软骨脱细胞基质含量占1-10％(w/v)的明胶或胶原混悬液；
(3)应用CT、MRI或激光扫描、经计算机辅助设计构建人耳形态的三维数字模型；
(4)基于三维数字模型经3D打印PCL基材制备毫米级三维人耳形态耳廓网格框架；以及基于三维数字模型制备出对应耳廓形态的实体阳模和实体阴模；
(5)将三维人耳形态耳廓网格框架固定于实体阳模和实体阴模正中间，灌注配制好的软骨脱细胞基质的明胶或胶原混悬液，灌注后行冷冻处理，温度为-20-0度，时间为6-12小时；冷冻后剥离实体阳模和实体阴模，获得三维冷冻支架；
(6)三维冷冻支架经冷冻干燥后，浸入化学交联剂中交联，交联完成去离子水反复冲洗、浸泡去除残余的化学交联剂，再经真空冷冻干燥获得最终的三维耳形态支架。
进一步，所述软骨组织包括耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨、半月板的弹性软骨、透明软骨及纤维软骨组织。
进一步，所述软骨组织切成小块在液氮中预冷时间为0.5～5min。
进一步，所述脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理。
进一步，所述明胶或胶原混悬液中加入软骨诱导生长因子、血管抑制因子或药物。
进一步，所述交联试剂为：1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，或者戊二醛、或者京尼平。
一种组织工程耳廓形态复合支架，包括由组织工程耳廓形态复合支架的制备方法制得的三维耳形态支架。
本发明的有益效果：
本发明提出了一种软骨脱细胞基质粉末的制备方法，提供了一种基于软骨脱细胞基质的具有三维结构的组织工程耳廓形态支架及其制备方法，其有益效果包括：
(1)软骨组织致密，将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞处理，可以彻底脱细胞，消除免疫原性。
(2)软骨脱细胞基质作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，更重要的是，其含有的软骨基质成分可以提供软骨再生微环境，促进软骨细胞基质分泌和软骨形成，减轻体内炎症反应。
(3)单纯软骨脱细胞基质成型困难，复合一定比例的明胶或胶原作为辅剂，有效提升了交联性能，可制成具备一定形状的三维支架。
(4)支架的孔径和孔隙率与材料复合比例及冻干参数密切相关，支架降解速率与交联参数有关，可系统地调控材料复合比例、浓度、冻干和交联参数来精准的控制孔径孔隙率及降解速率。
(5)整合3D打印人耳形态模具、浇注成型、冷冻干燥等系列技术制备成精确人耳形态多孔支架，既解决了天然材料不能3D打印精确控制形态的难题，又更大限度的保持了其生物学活性和软骨基质微环境，同时更适合在浇注成型和冷冻干燥过程中添加各类生物活性因子，为进一步提升复合支架对软骨再生的调控功能提供了可能。
(6)应用的高强度、慢降解内核理念，将3D打印的精确人耳形态聚己内酯(polycaprolactone,PCL)网格支架作为内核，固定于人耳形态浇注模具中，显著提升了三维支架的力学性能以维持其精确形状。
(7)得益于多孔仿生结构，利于营养的渗透和代谢物质的排除，可联合细胞实现体外和体内的组织再生。
附图说明
图1为不同比例软骨脱细胞基质/明胶支架SEM图片；
图2为基于软骨脱细胞基质的具有三维结构的组织工程耳廓形态支架图；
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作一步说明。
实施例1：
一种组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其步骤如下：
(1)将新鲜牛关节软骨组织，剔除表面多余组织和筋膜，获得透明软骨片。将样品浸入液氮中5min，经冷冻研磨仪制成软骨粉末，随后进行脱细胞处理：①0.5％胰蛋白酶/PBS溶液(w/v)37℃恒温震荡24h，每4h更换新的胰蛋白酶溶液；②核酸酶溶液(50U/ml脱氧核糖核酸酶、1U/ml核糖核酸酶A，溶于10mM Tris-HCL中，PH＝7.5)37℃搅拌4h；③10mMTris-HCL(含10U/ml抑肽酶)37℃震荡20h；④1％Triton X-100/PBS溶液(v/v)37℃震荡24h；⑤PBS溶液洗涤6个循环，每次2h。最后经冷冻干燥制成脱细胞基质粉末。
(2)取一定质量的明胶颗粒，37℃去离子水中恒温震荡1h溶解，配制成浓度为1％(w/v)的明胶溶液。取一定质量的软骨脱细胞基质粉末，去离子水配制成浓度为1％(w/v)的悬浊液，取明胶溶液和软骨脱细胞基质悬浊液按体积比(9:1；7:3；5:5；3:7；1:9)震荡混匀，4度低温预冷搅拌6小时充分混匀，配成一定浓度的软骨脱细胞基质/明胶混悬液。
(3)激光扫描获得的耳廓三维数据，经计算机辅助设计构建人耳形态的三维数字模型。基于三维数字模型，利用PCL打印墨水经3D打印机(MAM-ⅡFreeForm FabricationSystem)制备三维支架，通过调节不同层宽，不同沉积角度(-45°/45°、-60°/60°或0°/60°/120°)及不同直径的不锈钢针头(19G、20G或21G)，设置合适的挤料速度、打印速度和层高等打印参数，制备不同孔径大小和形状等内部结构的三维打印耳廓形态网格支架(见图2)，并制备对应耳廓形态的实体阳模和实体阴模，实体阳模和实体阴模中预留多个内核支架固定点。
(4)将三维打印的PCL耳廓网格框架固定于实体阳模和实体阴模正中间，灌注配制好的一定浓度的将软骨脱细胞基质/明胶混悬液，-10度低温冷冻8小时后剥离阳模和阴模，获得三维冷冻支架，三维冷冻支架经冷冻干燥48小时后，将支架放入含有0.5％EDC的95％酒精溶液中充分交联12小时。去离子水反复浸泡冲洗三维支架6小时，去除三维支架中的化学交联剂，再经真空冷冻干燥24小时，得到可用于软骨组织再生的的三维耳廓形态支架，不同比例软骨脱细胞基质/明胶支架SEM图,如图1所示。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，但本发明的保护范围并不局限于此，对于本领域的熟悉技术人员来说，本发明可以有各种的更改和变化，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)将软骨组织切成小块，液氮中预冷，用低温冷冻研磨仪和组织破碎机粉碎成细颗粒状，制备成软骨粉末，并经脱细胞处理和真空冷冻干燥制成软骨脱细胞基质粉末；
(2)用一定质量的明胶或胶原溶于去离子水中配成1-5％(w/v)浓度的明胶或胶原溶液，1-5％(w/v)浓度的明胶或胶原溶液中混入一定质量的软骨脱细胞基质粉末，4度低温预冷搅拌混匀，配成软骨脱细胞基质含量占1-10％(w/v)的明胶或胶原混悬液；
(3)应用CT、MRI或激光扫描、经计算机辅助设计构建人耳形态的三维数字模型；
(4)基于三维数字模型经3D打印PCL基材制备毫米级三维人耳形态耳廓网格框架；以及基于三维数字模型制备出对应耳廓形态的实体阳模和实体阴模；
(5)将三维人耳形态耳廓网格框架固定于实体阳模和实体阴模正中间，灌注配制好的软骨脱细胞基质的明胶或胶原混悬液，灌注后行冷冻处理，温度为-20-0度，时间为6-12小时；冷冻后剥离实体阳模和实体阴模，获得三维冷冻支架；
(6)三维冷冻支架经冷冻干燥后，浸入化学交联剂中交联，交联完成去离子水反复冲洗、浸泡去除残余的化学交联剂，再经真空冷冻干燥获得最终的三维耳形态支架。
2.根据权利要求1所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于：所述软骨组织包括耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨、半月板的弹性软骨、透明软骨及纤维软骨组织。
3.根据权利要求1所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于：所述软骨组织切成小块在液氮中预冷时间为0.5～5min。
4.根据权利要求1所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于：所述脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理。
5.根据权利要求1所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于：所述明胶或胶原混悬液中加入软骨诱导生长因子、血管抑制因子或药物。
6.根据权利要求1所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法，其特征在于：所述交联试剂为：1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，或者戊二醛、或者京尼平。
7.一种组织工程耳廓形态复合支架，其特征在于：包括由权利要求1-6任一所述的组织工程耳廓形态复合支架的制备方法制得的三维耳形态支架。
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