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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Druck-Drehbett-Bioreaktor, mit denen adhärent wachsende Stammzellen oder primäre Zellen aus humanen und tierischen Quellen in einem Drehbett-Bioreaktor dynamisch im Perfusionsmodus mit gleichzeitiger Druckbeaufschlagung expandiert werden können.
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Die
DE 101 04 008 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen auf einer modellierbaren Trägerstruktur, wobei die Zellen zur Bildung einer Zellschicht in einem Zellkulturraum zwischen der Trägerstruktur oder einer auf der Trägerstruktur aufgebrachten Folie und einer zweiten Folie eingebracht werden. Sauerstoff und Nährmedium werden in den Zellkulturraum eingeleitet. Die Trägerstruktur mit dem Zellkulturraum sind mit noch einer weiteren Folie umgeben, die dann in ein als Bioreaktor dienendes Druckgehäuse verbracht wird, der mit Druckanschlüssen versehen ist und über pneumatisches bzw. hydraulische Mittel mit wechselnden und homogenen Druckbelastungen beaufschlagt wird.
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In der
DE 101 30 512 wird eine Vorrichtung zur Druckperfusion für das Züchten und Behandeln von Zellen beschrieben, die eine die Zellen enthaltende Bioreaktoreinheit und ein mit dieser Bioreaktoreinheit in Verbindung stehendes Pumpmodul aufweist, das ein in einem Kreislauf strömendes Fluid diskontinuierlich und mit physiologischer, homogener einwirkender Druck- und Volumenamplitude durch den Bioreaktor fördert. Die Bioreaktoreinheit besitzt ein Sperrventil zur Erzeugung des Druckanstieges. Das Pumpmodul besteht aus einem in einem Zylinder angeordneten beweglichen Kolben in Form eines ersten Magneten und einem zweiten am Ende des Zylinders liegenden Magneten, der den ersten Magneten im Zylinder entlang der Zylinderachse hin und her bewegt. Weiterhin kann der bewegliche Kolben die Form einer Platte aufweisen, die mittels Druckluft im Zylinder bewegt wird.
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Die
DE 102 01 259 beschreibt eine Vorrichtung zum Züchten oder Kultivieren von Zellen in einem dosenartigen Behälter, der einen Boden und wenigsten einen eine Zulauf- und eine Rücklaufanschlussbohrung für Nährmedien tragenden Deckel aufweist und dem kontinuierlich oder diskontinuierlich Nährmedien zugeführt, sowie die sich bildenden Zellkulturen mit Druck auch mit wechselndem Druck beaufschlagt werden. Im Innern dieses Behälters ist eine Zellkulturraum oder eine Zellstruktur, auf der Zellen gezüchtet werden, angeordnet. Der separate Zellkulturraum oder die Zellstruktur wird über eine Druckbeaufschlagungsvorrichtung in Form einer Zylinder-/Kolbeneinheit mit Druck beaufschlagt. Der Druckaufbau erfolgt durch eine absperrbares Rückschlagventil im Eingangsbereich der Zylinder-/Kolbeneinheit. Durch den Kolben dieser Zylinder-/Kolbeneinheit wird das über die Zulaufbohrung eingebrachte Nährmedium unter Druck gesetzt, der sich in das Innere des Behälters fortsetzt. Eine Regelung des Druckes erfolgt über das Rückschlagventil oder über die Rücklaufanschlussbohrung. Ein Druckaufbau im Innern des Behälters kann auch über in den beiden Deckel angeordneten gesonderte Bohrungen über ein Gas, z. B. Luft erfolgen. Auch kann die innere Druckbeaufschlagung der Zellen über eine Einrichtung erfolgen, die im Behälter oder im Deckel angeordnet ist. Die Einrichtung weist eine bewegliche Folie, Platte oder Membran auf, hinter der sich eine hydraulische Flüssigkeit oder eine Gas befindet, wobei die hydraulische Flüssigkeit oder das gasförmige Medium über eine Druckeinrichtung mit wechselnden Druck beaufschlagt und so eine wechselnder Druck auf die Zellen ausgeübt wird. Anstelle der elastischen Platte kann auch ein Ballon verwendet werden, wobei alle Wände des Behälter auf der Innenseite von einem derartigen Beutel oder Ballon umschlossen werden und das Implantat oder die Zellkulturen sich im Innern diesen Beutels oder Ballon befinden.
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In der
DE 103 49 484 wird ein Bioreaktor zur Kultivierung und Stimulierung von dreidimensionalen, vitalen und mechanisch widerstandsfähigen Zelltransplantaten beschrieben, wobei der Bioreaktor aus einem Grundkörper besteht, der druckdicht und steril mit einem Reaktorverschluss verbunden ist und mindestens einen Reaktorraum bildet, in dem eine Ablagefläche für ein Transplantat sowie ein Mini-Aktuator implementiert sind. Außerdem ist der Bioreaktor mit wenigstens zwei Schlauchkupplungsanschlüssen für die Medienzu- und Medienabfuhr bzw. zur Begasung versehen. Innerhalb der oberen Kammer des Bioreaktors ist der als magnetischer Stempel ausgebildete Mini-Aktuator angeordnet, der als Druckapplikator kontaktlos durch einen Kontrollmagneten oder eine elektromagnetische Spule gesteuert wird und so als ein Stempel wirkend Druck auf das im sich Reaktorraum befindliche Transplantat ausübt.
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Ein Aufbringen mechanischer Kompression oder hydrostatischen Druckes über Stößel auf auf einem Trägermaterial aufzentrifugierte Zellen wird in der
DE 198 08 55 beschrieben. Dazu werden die autologen Zellen im ersten Schritt vereinzelt, in Kulturflaschen ausgesät und vermehrt und anschließend auf ein Trägermaterial (z. B. Hydroxyapatit) zu Zellpellets zentrifugiert. Diese Zellpellets werden dann in eine Kulturkammer, bestehend einer mit einem rechteckigen Kanal versehenen Grundplatte, aus mehreren als Einschraubsätze ausgebildete Einsätzen mit diesen Zellpellets, die in Bohrungen in diesem rechteckigen Kanal eingeschraubt werden und einer Abdeckung gegeben, wobei über Schlauchanschlüsse und Verteilerschlitze Medium durch den Kanal gepumpt und über Bohrungen in die Einschraubsätze geführt wird. Die Kammer ist von oben mit einer elastischen Membran versehen und über mechanische Stößel, die von Druckfedern gehalten werden, wird auf die Membran bzw. auf die Kulturen ein Druck ausgeübt.
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Auch in der
DE 199 62 456 wird die mechanische Stimulierung von Zellen, Implantaten oder dreidimensionalen Gewebekulturen in einer Kammer durch Druckbelastung mittels eines Stößels bei gleichzeitiger Durchströmung mit Nährflüssigkeit beschrieben.
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In der
US 2006/0234372 wird die mechanische Stimulierung der Zellen mittels Scherstress in einer Zellkultivierungsvorrichtung durch die Überlagerung eines im wesentlichen gleichmäßigen Stromes der Nährflüssigkeit mit einem oszillierendem Strom der Nährflüssigkeit erzielt, wobei die Druckerhöhung über die Erhöhung der Fliesgeschwindigkeit des oszillierenden Stromes erreicht wird. Dabei entstehen Drücke von 0,8 bis 3 Pa. Erreicht wird dies durch zwei im Fließweg angeordnete Pumpen, die mit der Flusskammer kommunizieren, wobei eine für die Aufrechterhaltung des im wesentlich gleichmäßigen Fließens und eine für die Erzeugung des oszilierenden Flusses der Flüssigkeit sorgt. Der gleichmäßige Strom der Flüssigkeit beträgt 0,01 bis 3 mL/min, während die oszilierende Fließrate auf 40 mL/min über eine intermitierende Zeit kleiner als 30 min eingestellt ist.
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Eine mechanische Stimulation der Zellen zur starken Vermehrung dieser ohne Anwendung von Wachstumsfaktoren durch Aussetzung der Zellen einer mechanischen Vibration mit einer Amplitude von < 100 μm, vorzugsweise 20 μm und einer Frequenz von < 100 Hz, vorzugsweise 1 bis 10 Hz wird in der
US 2005/0153437 beschrieben.
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Die
US 2005/0048643 beschreibt eine Zell/Gewebe-Kulturvorrichtung, wobei die Kulturkammer aus einem flexiblen Material besteht, die in einem mit wassergefüllten Behälter eingetaucht ist. In der Kulturkammer ist eine Matrix für die Besiedelung mit Zellen oder Gewebe angeordnet und sie besitzt ein Zu- und Ablauf für die Kulturflüssigkeit, über die auch während der Druckbeaufschlagung Kulturflüssigkeit zu- und abgeführt werden kann. Der Druck auf die aus flexiblen Material bestehenden Kulturkammer und damit auf die in der Matrix adhärierten Zellen oder Gewebe wird über eine Pumpen/Düsensystem über das Wasser im Behälter erreicht. Durch eine spezielles Regelsystem in diesem Pumpen/Düsensystem kann sowohl hydrostatischer Druck als auch ein Scherstress auf die Zellen oder Gewebe ausüben.
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Die
WO 03/054137 beschreibt eine Apparatur für die Kultivierung von Zellen/Geweben mit physikalischer Stimulierung, wobei dieser Apparat mit einer Kulturkammer versehen ist, in der die Kultur angesiedelt ist und mit Kulturmedium versorgt wird und in der eine bewegliche Druckplatte zur physikalischen Stimulierung der Zell- oder Gewebekulturen angeordnet ist. Die Druckplatte wird durch einen nicht mit der Druckplatte verbundenen Elektromagneten in Bewegung versetzt.
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In der
WO 2207/039726 wird ein biologische oder chemischer Reaktor zur Züchtung und Vermehrung von Säugerzellen, in dem die Zellen einem hydrodynamischen Druck oder Scherkräften zur mechanischen Stimulierung ausgesetzt werden. Der Reaktor besteht aus einem äußeren und einem inneren Kessel, wobei die Zellen auf Reaktionsträgern angeordnet sind, die in Bohrungen in einem der Wände der Kessel lagern. Im ringförmigen Zwischenraum der beiden Kessel ist befindet sich eine Flüssigkeit, die durch die relative Rotation der beiden Kessel zueinander in eine Drehbewegung versetzt wird, so an den Träger (am Gerüst) und durch die Träger strömt und dabei den hydrostatischen Druck oder die Scherkräfte entstehen lässt.
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In der
EP 1 077 072 wird ein in-vitro-Verfahren zur Herstellung einer homologen Herzklappen- oder Gefäßprothese beschrieben, wobei die vorgebildeten herzklappen- bzw. gefäß-analoge Struktur in ein pulsatiles System eingebracht wird, in dem sie steigenden Flussraten und/oder Drücken ausgesetzt werden kann. Es wurde festgestellt, dass durch eine langsame Adaption der Flussraten und Drücke die Bildung einer strömungsbeständigen herzklappen- bzw. gefäß-analogen Struktur erreicht werden kann. Dazu besitzt der Bioreaktor eine Flusskammer, in der im Fall der Herstellung einer Herzklappe ein Klappenventil angeordnet ist und/oder ein verzweigtes Schlauchsystem, in dem tubuläre Träger bzw. Matrices befestigt werden können. Der Antrieb zum Pumpen des Fluids durch die Flusskammer sollte dabei außerhalb der Flusskammer angeordnet sein. Diese wird bei dem verwendeten Bioreaktor durch einer der Flusskammer benachbarten Luftkammer (Antriebskammer) erzielt, die durch eine hoch elastische Membran von der Flusskammer getrennt ist. Durch pulsierendes Ändern des Luftdruckes in der Luftkammer kann ein Fördern des Fluids durch die Flusskammer erzeugt werden. Zur Erzeugung der pulsierenden Drücke können auch andere Medien verwendet werden, wie Flüssigkeiten und andere Gase. Durch entsprechende Pumpen, wie Respiratorpumpen können einstellbare Druckimpulse erzeugt werden, durch die der Druck der Flusskammer periodisch erhöht werden kann. Mit dieser Pumpe kann eine Pumpvolumen von 50 bis 5000 ml/min und eine Pumpfrequenz von 5 bis 20 Pulsen/min eingestellt werden, wobei der Systemdruck zwischen 20 und 240 mm Hg liegt.
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In der
EP 1 380 640 wird eine Zell-/Gewebekultivierungsvorrichtung beschrieben, bei der die zu kultivierenden Zellen und Gewebe beim Kultivierungsvorgang einer physikalische Stimulation unterworfen werden. In der Kultivierungseinrichtung ist eine Kammer angeordnet, in der das zu kultivierende Material eingelagert wird und die mit Zu- und Abführungen für das Kulturmedium versehen ist. Außerdem ist in dieser Kammer eine magnetische Scheibe angeordnet, die über einen außerhalb der Zellkulturkammer liegenden Magnetantrieb in Rotation versetzt wird. Die durch die Rotation der magnetischen Scheibe entstehenden Scherkräfte bewirken die physikalische Stimulation bei der Kultivierung von Zellen und Gewebe.
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In der Literatur wird ein Gasdruckreaktor beschrieben, wobei der Gasdruckreaktor aus einer Belastungskammer besteht, die die gleichzeitige Kultivierung von sechs Korpel-Konstrukten ermöglicht. Die Gasversorgung wird über das Prozessleitsystem gesteuert. Zum Druckaufbau schließt das Auslassventil, während die Gaszufuhr hoch geregelt wird. Die Höhe des erreichten Druckes (0,3 MPa) wird dabei über den Gasvolumenstrom und den Gasvordruck geregelt. Zur Entlastung öffnet das Auslassventil und die Massendurchflussregler werden herunter geregelt. (Wiegandt, Dissertation 2009 TUHH). Hier wird auch ein Kolbendruckreaktor dargestellt, wobei für die Konstruktion dieses Reaktors das Prinzip der Druckaufbringung über die Gasphase verwendet wurde, so dass sich im Reaktor sowohl eine Gas- als auch Flüssigkeitsphase befinden. Um die großen Gasvolumenströme wie im Gasdruckreaktor zu vermeiden und die Beaufschlagung mit Druck flexibler zu gestalten, wurde der Druckaufbau über einen Kolben realisiert. Zum Druckaufbau werden die Magnetventile der Begasung geschlossen und das Ventil des pneumatischen Motors geöffnet, so das der Kolben nach oben gedrückt wird. Über die resultierende Volumenverkleinerung in der Belastungskammer wird ein Druck aufgebaut, der vom Vordruck des Druckzylinders abhängt. Die Geschwindigkeit des Druckaufbaus wird über das vor dem Druckzylinder geschaltete Drosselventil eingestellt (Wiegandt, Dissertation 2009 TUHH).
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Weiterhin ist die Kultivierung von Fibrochondrozyten in einer Bioreaktoreinheit, bestehend aus einem druckpulsierenden Bioreaktor DPR 50 (druckpulsierender Bioreaktor bis 50 bar), einem Computer und einer Presslufteinheit, die aus einer Pressluftflasche und einem Druckminderer besteht, bekannt (Akevold, Dissertation 2009 TU München). Durch eine 2 mm dicke Silikonmembran wird der Hauptraum des Reaktors von einem Gasraum getrennt. Im Hauptraum werden Zellen kultiviert. Im Gasraum kann durch eine Wechselspiel der Ventile für die Gaszu- und -abfuhr in Kombination mit einem Schluss der Medienventile Druck auf und wieder abgebaut werden, der mittelbar über die Silikonmembran auf den Hauptraum einwirkt. Eine kontinuierliche Zuführung von Medien ist mit diesem Reaktor nicht möglich, da hier nur während der Druckpausen Medien mit einer Fließrate von 1 mL/min zugeführt werden.
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Bei den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen werden die Zellen (z. B. Chondrozyten, Fibrochondrozyten) nach dem Adhärieren auf die Träger oder Matrices und nach der Züchtung bzw. Vermehrung unter statischen Bedingungen mit Druck beaufschlagt, wobei bei einigen Lösungen während der Druckbeaufschlagung Nährmedium oder auch Gas zu- und abgeführt werden kann. Aber allen dieser Lösungen ist eigen, dass die expandierenden Zellen nicht gleichzeitig dynamisch mit Medien und Gasen versorgt und mit Druck beaufschlagt werden können. Es können so keine Bedingungen geschaffen werden, die den in vivo-Bedingungen entsprechen und die biomechanischen Eigenschaften der in vivo wachsenden Zellen können nicht erreicht werden. Bei Reaktoren, die mechanische Stimulierung über hohe Scherkräfte realisieren, z. B. bei Reaktoren mit Kulturkammern in wassergefülltem Druckkessel, befinden sich die Kulturen in Petrischalen, kleinen Reaktionsgefäßen oder Beuteln, die mit Medium gefüllt und in einigen Fällen mit einer semipermeablen Membran verschlossen werden. Dieses System führt bei längerer Kultivierungsdauer zu Nachteilen, weil kein festgesetzter bzw. geregelter Gasaustausch stattfindet und die Konzentration der gelösten Gase und damit der pH-Wert über den Kultivierungszeitraum nicht konstant bleiben. Bei Reaktoren, in denen sich ausschließlich Medium und keine Gasphase befindet, erfolgt die Begasung außerhalb des Reaktors und die benötigten Gase werden über Perfusion zu den Zellen geleitet. Zum Aufbringen des Druckes wird die Mediumperfusion gestoppt und der Druck über die Flüssigkeit im Reaktor, z. B. mithilfe eines beweglichen Kolbens, aufgebaut. Dies Prinzip eignet sich zwar für längerere Kultivierungsphasen, dies aber nur unter statischen Bedigungen. Für Kultivierungen mit Zugabe von Wachstumfaktoren ist es ungeeignet, weil manche Wachstumsfaktoren nur wenige Stunden stabil sind und jeweils erneut zugesetzt werden müssen. Dies führt bei großen Medienmengen im Perfusionssystem zu erheblichen zusätzlichen Kosten. Des weiteren wird der Effekt des Druckes durch eine fluiddynamische Belastung überlagert.
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Weiterhin ist aus dem Stand der Technik ein drucklos betriebener Drehbett-Bioreaktor, bei dem primäre Zellen oder Stammzellen humanen und tierischen Ursprungs dynamisch und kontinuierlich im Perfusionsmodus wachsen können, bekannt, bei dem das Drehbett horizontal im Reaktor angeordnet ist, durch einen Magnetantrieb berührungslos in Rotation versetzt wird und so den Zellträger abwechselnd durch das Medium und die Overlay-Atmosphäre bewegt. Das Drehbett besteht aus einer Vielzahl von, auf einer axial im Bioreaktor angeordneten, rotierenden Welle befestigten Zellträgern aus makroporigen keramischen „Sponceram”-Scheiben, die aus Oxidkeramiken bestehen. (
Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, Nr.: 12, S 1803–1807). Für diesen Bioreaktortyp sind auch Drehbetten mit Zellträgern aus anderen Materialien und in anderer Anordnung beschrieben (z. B. Polymerstoffe, dichtgebrannte glatte Keramik, parallel zur Achse angeodnete Zellträger) oder auch Drehbetten, die als verschieden geformten Implantat-Formteilen angeordnet sind. Auf den verschiedenen Zellträgern in Drehbett-Bioreaktoren adhärieren Zellen schnell, vermehren sich dreidimensional unter Ausbildung zelleigener extrazellulärer Matrix (ECM) und bilden gewebeartige, dicke Schichten aus. Einerseits sind dynamische Kultivierungsbedingungen notwendig, um eine dreidimensionale, gewebeartige Expansion von Zellen unter Bildung zelleigener ECM überhaupt zu erreichen. Andererseits können Bioreaktoren mit im Reaktorraum bewegten Teilen Säugetierzellen beschädigen und die Zellen außerdem hohen Flüssigkeitsscherkräften aussetzen (
EP 0 423 227 ). Hohe Scherkräfte führen zu mechanischen Zellschädigungen und damit zu schlechten Wachstumsraten. Zellen höherer Eukaroyten (humane und tierische Zellen) sind in vitro durch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber mechanischen und hydraulischen Scherkräften sowie durch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber physikalischen und chemischen Umwelteinflüssen ausgezeichnet (
DE 27 229 21 ). Die Drehbett-Bioreaktoren vermeiden durch geregelte Bettrotation, durchströmte bzw. überströmte Zellträger, entsprechende Zellträger-Geometrien und perfundierte Mediummengen pro Zeit solche nachteiligen Einflüsse. Alle üblichen Stammzellen und primären Zellen lassen sich schnell und in großen Mengen darin expandieren und bilden dabei auf Zellträgern und Implantat-Formteilen gewebeartig dicke dreidimensionale Schichten aus Zellen und ECM. Allerdings bleiben die Schichten aus Zellen und ECM gallertartig weich. Zellbesiedelte Implantate sind funktionell in vielen Fällen nur dann brauchbar, wenn das extrazelluläre Gerüst, in das die gewebe-typischen Zellen eingebettet sind (Knorpel, Knochen, Blutgefäße, Herzklappen usw.), feste bis harte Konsistenz (im Show-Härtebereich) aufweist.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und einen dynamischen Druck-Drehbett-Bioreaktor zur dynamischen Expansion von auf geeigneten Zellträgern adhärierten Stammzellen oder primären Zellen humanen und tierischen Ursprungs zu entwickeln, wobei diese dynamische Expansion unter Bedingungen erfolgt, die den in-vivo-Bedingungen annähernd gleich kommen und die zu biomechanischen Eigenschaften solcher in extrazelluläre Matrix eingebetteten Zellen führen, die sie für die Verwendung als geformte und mechanisch feste Implantate geeignet macht, insbesondere als Knorpel-, Knochen-, Luftröhren-, Blutgefäß-, Herzklappen-Implantate.
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Überraschender Weise wurde gefunden, dass Stammzellen oder primäre Zellen humanen und tierischen Ursprungs sich auch dann weiter vermehren und gewebeartige dreidimensionale Schichten auf Zellträgern generieren, wenn der dynamische Kultivierungsprozess unter gleichzeitiger Druckbeaufschlagung stattfindet. Das gilt selbst dann, wenn die Drucke höher als 20 bar sind. Mit zunehmender Dauer und Intensität der Druckbeaufschlagung wird die Zell-ECM-Schicht kompakter und mechanisch fester. Bei Drucken zwischen 2 und 10 bar verändern sich nach 10 bis 15 Tagen dynamischer Kultivierung z. B. mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnurgewebe oder Fettgewebe so, dass die gallertartige Zell-ECM-Schicht sich in ein bindegewebeartiges, noch weiches, aber zusammenhängend von den Zellträgern abzulösendes Formteil umwandelt. Bei Drucken bis 20 bar entstehen in solchen Zeiträumen Konstrukte, die eine noch erheblich härtere Struktur aufweisen. Davon unabhängig differenzieren expandierende Stammzellen unter Druckbeaufschlagung und dem zusätzlichen Einfluss von den bekannten Mediumzusätzen zu spezifischen Gewebetypen (z. B. Knorpel, Knochenkallus). Dazu wird in einem Reaktorgehäuse (1) ein als Zellträger oder Implantatunterlage (5, 5a, 5b) ausgebildetes, über einen Magnetantrieb angetriebenes rotierendes Drehbett (6), auf denen die Stammzellen oder primären Zellen humanen oder tierischen Ursprungs angesiedelt werden, angeordnet und die auf den Zellträgern oder Implantatunterlagen (5, 5a, 5b) adhärierten Zellen werden mittels alternierender rotierender Bewegung durch das sich im Reaktorgehäuse (1) befindliche Kulturmedium und durch die sich im Kopfraum des Reaktorgehäuse befindliche Overlay-Atmosphäre dynamisch kultiviert und gleichzeitig einer konstanten und/oder wechselnden Druckbelastung unterworfen, wobei die Drehzahl des Drehbettes konstant auf einen Wert zwischen 0,1 bis 20 rpm, vorzugsweise 0,5 bis 2 rpm eingestellt und die Medien und die Overlay-Atmosphäre kontinuierlich zu- und abgeführt werden.
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Ein weiteres Merkmal der Erfindung stellt ein Druck-Drehbett-Bioreaktor dar, der aus einem aus Borosilikatglas gefertigten, druckdichten Reaktorgehäuse (1) mit an den Seiten lösbar angeordneten, das Reaktorgehäuse (1) dicht verschließenden und aus Edelstahl gefertigten, druckfesten Deckeln (2, 3) besteht. In den beiden Deckeln (2, 3) sind nicht dargestellte Lager für die Aufnahme einer Welle oder Aufnahmevorrichtung, (4) eingearbeitet, wobei auf der Welle oder Aufnahmevorrichtung (4) das aus Zellträger oder Implantatunterlagen (5) bestehende Drehbett (6) befestigt ist, wobei das Drehbett (6) aus einem Paket von übereinander, mit definierten Abstand zueinander parallel zur Welle (4) des Drehbettes (6) angeordnete Zellträgern (5) von rechteckigen Scheiben unterschiedlicher, jeweils dem Durchmesser des Reaktorgehäuses (1) angepasster Breite oder aus Zellträgern (5a) als Paket von runden Scheiben mit definierten Zwischenräumen und mit an das Reaktorgehäuse (1) angepasstem Durchmesser, die senkrecht zur Welle oder Aufnahmevorrichtung (4) auf der Welle oder Aufnahmevorrichtung (4) angeordnet sind oder auch aus anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Zellträgern oder Implantatunterlagen (5b), die als rotierende Drehbetten geeignet sind, besteht. Die Welle oder Aufnahmevorrichtung (4) wird über den darauf angeordneten Permanentmagneten (7) und über einen nicht dargestellten Magnetantrieb außerhalb des Reaktorgehäuses (1) in Rotation versetzt. Die Deckel (2, 3) sind mit Ports für die Zuführung (8) und Abführung (9) von Kultur- oder Nährmedien und Ports für Zuführung (10) und Abführung (11) von Overlay-Atmosphäre versehen. In den Zu- und Abführungen für die Kultur- und/oder Nähmedien und in den Zu- und Abführungen für die Overlay-Atmosphäre sind regelbare Druckbegrenzungsventile (12, 13, 14, 15), vorzugsweise solche mit Proportionaltechnik angeordnet, über die die Druckbeaufschlagung mittels geeigneter Druckpumpen entweder über die Kultur- und Nährmedien oder über die Overlay-Atmosphäre und somit auf die adhärierten und in der Expansionsphase befindlichen Stammzellen oder primären Zellen humanen oder tierischen Ursprungs erfolgt. Zum Aufbau des Druckes über die Overlay-Atmosphäre werden die Druckbegrenzungsventile (14, 15) auf den gewünschten Wert eingestellt und die Overlay-Atmosphäre wird über eine entsprechende Druckpumpe in der Zuführung (10) sowie über die Abführung (11) so lang zu- und abgeführt, bis der entsprechende Druck im Kopfraum des Reaktorgehäuses (1) erreicht ist. Zum Aufbau des Druckes über die Kultur- oder Nährmedien werden die Druckbegrenzungsventile (12, 13) auf den gewünschten Wert eingestellt und Kultur- oder Nährmedien werden über ein Pumpsystem (17) und die Abführung (9) so lange zu- und abgeführt bis der entsprechende Druck im Reaktorgehäuse (1) erreicht ist.
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Die dynamische Kultivierung von Stammzellen oder primären Zellen humanen oder tierischen Ursprungs auf Zellträger oder Implantatunterlagen unter Druckbeaufschlagung bis 5 MPa bedingt, dass der Bioreaktor alle Merkmale eines Druckgefäßes erfüllen muss. Für die Herstellung größerer Gewebekonstrukte, wie sie beim Tissue Engineering gebraucht werden, müssen Bioreaktoren außerdem Gefäßvolumina von 100 bis 500 ml besitzen. Gleichzeitig muss gewährleistet sein, dass die Zellträger in Medium rotieren, mit frischem Medium perfundiert und mit Overlay-Atmosphäre versorgt werden.
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Ausführungsbeispiele
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Die Erfindung soll nun an Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden, wobei die
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1 eine schematische Darstellung des Druck-Drehbett-Bioreaktors mit senkrecht zur Welle des Drehbettes angeordneten runden Scheiben als Zellkulturträger mit
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Bezugszeichenliste
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- 1
- druckdichtes Reaktorgefäß
- 2, 3
- lösbare Deckel
- 4
- Welle für das Drehbett
- 5a
- Zellträgerscheiben oder Aufnahmevorrichtung (rund)
- 6
- Drehbett
- 7
- Permanentmagnet
- 8
- Zuführung des Kultur- oder Nährmediums
- 9
- Abführung des Kultur- oder Nährmediums
- 10
- Zuführung der Overlay-Atmosphäre
- 11
- Abführung der Overlay-Atmosphäre
- 12
- Druckbegrenzungsventil in der Zuführung des Kultur- oder Nährmediums
- 13
- Druckbegrenzungsventil in der Abführung des Kultur- oder Nährmediums
- 14
- Druckbegrenzungsventil in der Zuführung der Overlay-Atmosphäre
- 15
- Druckbegrenzungsventil in der Abführung der Overlay-Atmosphäre
- 16
- Druckflasche für die Overlay-Atmosphäre mit Druckminderer
- 17
- regelbare Pumpeinrichtung für die Kutur- und Närhmedien
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die 2 eine schematische Darstellung des Druck-Drehbett-Bioreaktors mit parallel zur Welle des Drehbettes angeordneten rechteckigen Scheiben als Zellkulturträger, wobei die Bezugszeichen die gleichen wie in der 1 sind nur mit
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Bezugszeichenliste
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- 5
- rechteckige Zellträgerscheiben
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- Seitliche Aufnahmen für die rechteckigen Zellkulturträgerscheiben
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und die 3 eine schematische Darstellung gemäß Ausführungsbeispiel 2 des Druck-Drehbett-Bioreaktors mit auf der Welle des Drehbettes angeordneten Spacers mit röhrenförmiger Folie als Zellträger darstellen, wobei die Bezugszeichen die gleichen wie in der 1 sind, nur mit
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Bezugszeichenliste
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- 5b
- Drehbett in Form eines Spacers
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- Zellträger in Form einer röhrenförmigen Folie
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Ausführungsbeispiel 1: Vermehrung humaner Stammzellen aus Knochenmark im Druck-Drehbett-Bioreaktor zu knorpelartigem Gewebe
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Mesenchymale Stammzellen aus humanem Knochenmark werden wie aus der Literatur bekannt isoliert und zunächst auf Zellträgern (5) aus glatten Polymerscheiben (z. B. aus Polystyrol) im Druck-Drehbett-Bioreaktor adhäriert. Dazu werden die Stammzellen in einem für die Vermehrung geeigneten Medium (z. B. DMEM oder Alpha MEM mit Zusatz von Humanserum) suspendiert. Die Zellsuspension wird in ein Reaktorgefäß (1) überführt, dessen Drehbett (6) aus parallel zur Drehachse angeordneten Zellträgern (5) besteht. Die horizontal ausgerichteten Zellträger-Scheiben werden so lange unbewegt stehen gelassen, bis die suspendierten Zellen vollständig adhäriert sind (in der Regel 3 bis 8 h). Dann wird das Drehbett (6) in langsame Rotation versetzt, der Overlayraum des Reaktors wird mit einem von den vorgewählten Werten für pH und pO2 gesteuerten Gemisch aus N2 und O2 überströmt, das Medium wird umgepumpt. Ein Teil des Mediumvolumens wird mehrere Tage lang jeweils durch kontinuierlich zugeführtes frisches Medium ersetzt. Die Menge an zugeführtem Frischmedium wird so gesteuert, dass die Glukosekonzentration im Reaktor etwa 40% der Glukosekonzentration im Frischmedium beträgt. Unter diesen Bedingungen bleibt die Differenzierung der Zellen unverändert. Auf den Zellträgern (5) entsteht eine wachsende Schicht aus Zellen, die in selbst-generierte extra-zelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind. Wenn die Schicht Millimeter-dick hochgewachsen ist, wird das Medium gewechselt. Die weitere Kultivierung wird in einem der bekannten Medien fortgeführt, das eine Differenzierung der Zellen zu Chondrozyten fördert. Zusätzlich wird der Reaktor ab diesem Zeitpunkt phasenweise mit Druck beaufschlagt, ansonsten werden die Betriebs-Parametern und Merkmalen des Kultivierungslaufs nicht verändert. Die phasenweise Beaufschlagung mit Druck erfolgt so, dass der Reaktorraum alternierend jeweils 1 h lang unter Druck gesetzt wird und anschließend 1 h lang druckfrei bleibt. Am ersten Tag wird ein Druck von 3 bar eingebracht, in den folgenden Tagen wird der Druck jeweils um 3 bar gesteigert. Ab dem 5 Tag wird der Kultivierungslauf mit alternierend 15/0 bar über 8 bis 13 Tage weitergeführt. Die anfangs gallertartige Schicht aus Zellen und ECM wird während dieser Zeit zunehmend fester, sie ähnelt am Ende der Kultivierung humanem Knorpel. Die knorpelartige, zusammenhängende Schicht lässt sich vom Zellträger abheben und enthält vitale Zellen.
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Ausführungsbeispiel 2: Herstellung eines elastischen Gewebeschlauches aus perivasculären mesenchymalen Nabelschnur-Stammzellen im Druck-Drehbett-Bioreaktor gemäß Fig. 3
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Perivasculäre mesenchymale Stammzellen werden aus einer präparierten Nabelschnur-Arterie nach einem der bekannten Protokolle gewonnen und in einem üblichen, für die Expansion dieser Zellen geeigneten Medium suspendiert. Die Suspension wird dann in das Reaktorgefäß (1) des Druck-Bioreaktors verbracht. Das Drehbett (6) des Druck-Bioreaktors besteht aus einer den Reaktorraum füllenden Welle (5b) aus Polymermaterial (einem sog. Spacer), die das Reaktorvolumen bis auf einen verbleibenden Spalt von wenigen mm zur Reaktorinnenwand ausfüllt. Der Spacer (5b) ist von einem Zellträger (19) umschlossen, der aus einer röhrenförmigen Folie aus saugfähigem Kollagen (z. B. Collagen Cell Carrier, PAA) oder auch aus einem saugfähigen Vlies aus PG/PL-Mischpolymerisat besteht. Die Menge an Suspensionsflüssigkeit ist so bemessen, dass der Zellträger (19) darin eintaucht und das Medium mit Zellen nahezu vollständig vom Zellträger (19) aufgesaugt wird. Das Drehbett (6) mit Zellträger (19) und darin aufgesaugten Stammzellen wird so lange in langsamer Rotation gehalten, bis die Zellen im und auf dem Trägermaterial adhäriert sind, was normalerweise nach 5 bis 10 h der Fall ist. Die Expansionsphase des Druck-Bioreaktorlaufs wird dadurch gestartet, dass soviel Medium in den Reaktorraum gegeben wird, bis 90 bis 95% des Reaktorvolumens mit Medium gefüllt sind. Das Drehbett (6) wird sodann in langsame Rotation versetzt, das Medium wird mit geringer Flussrate umgepumpt, ein Teil des Mediumvolumens wird über die Dauer der Kultivierung ständig durch kontinuierlich zugeführtes frisches Medium ersetzt. Der Overlayraum des Reaktors wird mit einem Gemisch aus N2 und O2 überströmt, dessen Zusammensetzung von den vorgewählten Werten für pH und pO2 gesteuert wird. Diese Bedingungen werden über die gesamte Dauer der Kultivierung beibehalten. Von Beginn der Expansionsphase an wird das über den Overlayraum strömende Gasgemisch zusätzlich auch mit Druck beaufschlagt. In den ersten beiden Tagen beträgt der Druck 1 bar, danach wird er 2 Tage lang auf 2 bar erhöht und so fortlaufend, bis am 8. Tag 4 bar erreicht sind. Dieser Druck wird über die weitere Kultivierungsdauer aufrecht erhalten, die 12 bis 16 Tage betragen kann. Während dieser Zeit wächst eine Schicht aus Zellen und ECM auf den (bio-abbaubaren) Zellträgern aus Kollagen oder PG/PL-Mischpolymerisat, die sich fest damit verbindet.
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dieser Zeit wächst eine Schicht aus Zellen und ECM auf den (bio-abbaubaren) Zellträgern aus Kollagen oder PG/PL-Mischpolymerisat, die sich fest damit verbindet. Die Schicht aus Zellen, ECM und Zellträgermaterial kann nach Beenden der Expansionsphase vom Spacer abgezogen werden. Das schlauchförmige Gebilde ist elastisch, gleichmäßig dick und dicht. Es enthält vitale Zellen, die homogen in dem Gewebeschlauch verteilt sind.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 10104008 [0002, 0030]
- DE 10130512 [0003, 0030]
- DE 10201259 [0004, 0030]
- DE 10349484 [0005, 0030]
- DE 1980855 [0006]
- DE 19962456 [0007, 0030]
- US 2006/0234372 [0008, 0030]
- US 2005/0153437 [0009]
- US 2005/0048643 [0010, 0030]
- WO 03/054137 [0011, 0030]
- WO 2207/039726 [0012]
- EP 1077072 [0013, 0030]
- EP 1380640 [0014, 0030]
- EP 0423227 [0018, 0030]
- DE 2722921 [0018, 0030]
- WO 2007/039726 [0030]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Wiegandt, Dissertation 2009 TUHH [0015]
- Wiegandt, Dissertation 2009 TUHH [0015]
- Chemie Ingenieur Technik 2008, 80, Nr.: 12, S 1803–1807 [0018]
- Dissertation Wiegandt 2009 TUHH (veröffentl. http.doku.b.tu-harburg.de) [0030]
- Dissertation Akevold 2009 TU München (veröffentl. deposit.d-nb.de) [0030]
