DE19725602A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Züchten von Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von tierischen Zellen und insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von fixierungsabhängigen Monoschicht-Zellen

Aufgrund der steigenden Nachfrage nach von Tierzellen abgeleiteten Produkten in der pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie, ist die Entwicklung von Tierzellkulturverfahren zu einer unabdingbaren Aufgabe auf dem biomedizi­ nischen Sektor geworden. Für die meisten Tierzellkulturen, wie die Säugerzell­ kulturen, sind Träger zum Fixieren bzw. Verankern bzw. Anhaften der Zellen nötig, da die Zellen nicht in Suspension in einem Nährmedium wachsen können. Viele Zellkultursysteme sind zum Züchten von fixierungsabhängigen Tierzellen entwickelt worden. Beispiele dieser Systeme schließen Gewebekulturkolben, Rollröhrchen, Zellherstellungseinrichtungen, Mikroträger in gerührten Behältern, Hohlfasern und keramische Systeme ein (Wei-Shou Hu et al; "Animal Cell Biore­ actors-Recent Advances and challenges to Scale-Up" The Canadian Journal of Chemial Engineering, "Specialized Techniques" Band 69, April, 1991, Seiten 409-420; "Specialized Techniques", Culture of Animal Cells, Kapitel 23, Seiten 371-377).

Eine der grundlegenden Erfordernisse hinsichtlich der Tierzellkulturverfahren ist die ausreichende Zuführung von Gas, wie Sauerstoff, und von Nährstoffen. Eine unzureichende Zuführung von Gas oder Nährstoffen verzögert das Wachstum der Zellen. Ein weiteres Erfordernis ist die Kontrolle des Anteils an metabolischen Produkten, welche das Zellwachstum inhibieren können, wenn sie in den Kultur­ medien in hoher Konzentration angereichert werden.

Das Rollröhrchen ist ein Badtyp-System, welches keine das Medium zirkulierende Vorrichtung aufweist. Das System schließt Röhrchen zum Aufnehmen eines Nähr- bzw. Kulturmediums und zum Rotieren auf einem Träger ein. Üblicher­ weise wird ein Zellkulturmedium in ein rotierendes Röhrchen in einer Menge von 1/10-1/5 des Innenvolumens des Röhrchens gebracht bzw. plaziert und die Zellen wachsen an den inneren Oberflächen des Röhrchens. Es kann eine erhöh­ te Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Medium erhalten werden, weil ein dünner Film des Mediums, welcher den Gasaustausch zwischen der gasförmigen und der flüssigen Phase erleichtert, auf den nicht-eingetauchten inneren Ober­ flächen des Röhrchen während der Rotation des Röhrchens gebildet wird. Daher kann ausreichend Gas oder Sauerstoff den Zellen zugeführt werden, auch wenn die Zelldichte hoch ist. Dieses System liefert ebenfalls einen vergrößerten Ober­ flächenbereich zum Anhaften der Zellen und ein mäßiges Schütteln bzw. Rühren. Eine Transfusionsvorrichtung oder eine Mischvorrichtung wie eine Pipette oder eine peristaltische Pumpe kann zum Zufügen von frischem Medium verwendet werden.

Das System liefert jedoch keine Kontrolle bezüglich des pH-Wertes und des gelösten Sauerstoffs. Weiterhin erfordert die Beseitigung von toxischen metabo­ lischen Abfallprodukten und die Verarmung an Nährstoffen aufgrund der Abwe­ senheit einer das Medium zirkulierenden Vorrichtung einen konstanten Wechsel der Medien, was demzufolge arbeitsintensiv ist. Bezüglich einer großtechnischen Herstellung, bei der eine große Anzahl an Rollröhrchen benötigt wird, ist es umständlich, das System zu betreiben, und schwierig, ein Produkt einheitlicher Qualität zu erhalten. Daher ist die Anwendung solcher Rollröhrchen beschränkt.

Zellkultursysteme mit das Kulturmedium zirkulierenden Systemen sind bezüglich der Auffrischung bzw. des Nachfüllens bzw. des Ersetzens des Kulturmediums und der Beseitigung von Metaboliten vorteilhaft. In solchen Systemen werden die Zellen in ihren Kulturmedien konstant eingetaucht, und die Rate der Kulturmedien wird derart kontrolliert, daß den Zellen ausreichend Nährstoffen und gelöster Sauerstoff zugeführt wird.

Mikroträgersysteme sind vom Zirkulationstyp und können hinsichtlich einer großtechnischen Herstellung einfach erweitert werden. Neben ihren hohen Kosten ist auch die Bedienung dieser Systeme aufgrund der leichten Abtrennbar­ keit der Zellen von Mikrosubstraten, insbesondere, wenn hohe Scherkräfte auftreten, (unpraktisch.

Andere Kultursysteme vom Zirkulationstyp sind Pfropfströmungs- bzw. Kolben­ strömungsbioreaktoren wie Hohlfasern und keramische Systeme. Bezüglich der Hohlfasersysteme läuft ein Medium mit einer hohen Strömungsrate durch das Lumen der Fasern und nur ein geringer Teil dringt durch die Fasermembran. Diese Hohlfasersysteme stellen im allgemeinen eine hohe Kulturdichte oder Wirksamkeit bereit. Da die Zuführung von Nährstoffen mit geringem Molekular­ gewicht und die Beseitigung von Metaboliten im allgemeinen durch Molekulardif­ fusion aufgrund des Konzentrationsgradienten quer über die Membran erreicht wird, können jedoch der gelöste Sauerstoff und die Nährstoffe nicht ausreichend bzw. mangelhaft sein, wenn die Länge oder Dicke der Hohlfasern erhöht wird. Daher ist die Herstellung von Zellen im großen Maßstab mit den Hohlfaser­ systemen noch schwierig.

In keramischen Systemen werden die Zellen in die Kanäle eines porösen Kera­ mikzylinders inokuliert und ein Medium wird durch die Kanäle zur Bereitstellung von Nährstoffen und zur Beseitigung der Metaboliten geleitet. Die Menge an gelöstem Sauerstoff wird unter Verwendung einer das Medium zirkulierenden Pumpe erhöht. Um jedoch gelösten Sauerstoff ausreichend zuzuführen, ist es im allgemeinen notwendig, die Zirkulationsrate des Mediums zu erhöhen. Ein An­ stieg in der Zirkulationsrate kann aber zu einem Abziehen bzw. Abreißen der Zellen von ihren Fixierungsoberflächen führen, was sich nachteilig auf die Her­ stellungseffizienz auswirkt.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein System zum Züchten von Tierzellen bereitzustellen, welches ein das Medium zirkulierendes System, welches die Beseitigung von Metaboliten und die Auffrischung oder das Ersetzen des Kulturmediums erleichtert und welches die Belüftung der Zell­ fixierungsoberfläche während des Zellwachstums ermöglicht, wodurch das Problem des Sauerstoffmangels für Zellen von hoher Dichte beseitigt werden kann, einschließt.

Vorzugsweise soll ein das Medium zirkulierendes System bereitgestellt werden, welches keine hohen Scherkräfte entwickelt, während dem Medium gelöster Sauerstoff für das Wachstum der Zellen ausreichend zugeführt wird.

Vorzugsweise soll weiter ein System zum Züchten von Tierzellen bereitgestellt werden, welches kontrolliert werden kann und welches leicht zur großtech­ nischen Herstellung ausgelegt werden kann.

Diese Aufgabe wird gemäß einem ersten Aspekt durch die Bereitstellung einer Vorrichtung gelöst, welche eine Zellkulturkammer, mit einer Einlaßeinrichtung, einer Auslaßeinrichtung und aufrecht stehenden Substrat- bzw. Trägerplatten mit Anker- bzw. Fixierungsoberflächen zum Anhaften bzw. Fixieren von Zellen und Einrichtungen zum Zirkulieren bzw. Zirkulieren lassen eines Kulturmediums in der Zellkulturkammer durch die Einlaß- und Auslaßeinrichtungen umfaßt. Die Zirkula­ tionseinrichtung wirkt in einem abwechselnden bzw. alternierenden Erhöhen und Erniedrigen des Niveaus des Kulturmediums relativ zu den Oberflächen der Substratplatten zwischen einem Hochniveau oberhalb der Substratplatten und einem Niederniveau unterhalb der Substratplatten, ohne die Substratplatten und/oder die Kulturkammer zu bewegen. Die Zirkulationseinrichtung kontrolliert ebenfalls das Einströmen des Kulturmediums durch die Einlaßeinrichtung in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Niederniveau und kontrolliert das Ausströmen des Mediums durch die Auslaßeinrichtung in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Hochniveau. Mit dieser Zirkulationseinrichtung können Zellen, welche an die Substratplatten angebracht bzw. fixiert sind, abwechselnd in das Medium eingetaucht und einer gasförmigen Umgebung, die oberhalb des Niveaus des Mediums vorliegt, ausgesetzt werden, ohne die Substratplatten und die Kulturkammer zu bewegen. Vorzugsweise ist die Kultur­ kammer eine stationäre Kammer und die Substratplatten sind fest an die Kultur­ kammer in vertikalen Positionen angebracht bzw. angeordnet.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Züchten von fixierungsabhängigen Zellen bereitgestellt, welches

• (a) Bereitstellen einer Zellkulturkammer mit einem Einlaß, einem Auslaß und aufrecht stehenden Substratplatten zum Anhaften von Zellen;
• (b) Zuführen eines Kulturmediums in die Zellkulturkammer und Anhaften der Zellen an die Substratplatten;
• (c) Zirkulieren des Kulturmediums durch die Einlaß- und Auslaßeinrichtungen und abwechselndes Erhöhen und Erniedrigen des Niveaus des Kulturmedi­ ums während des Zellwachstums, ohne die Substratplatten und/oder die Kulturkammer zwischen einem Hochniveau oberhalb der Substratplatten und einem Niederniveau unterhalb der Substratplatten derartig zu bewe­ gen, daß die Zellen abwechselnd in das Kulturmedium eingetaucht oder einer gasförmigen Umgebung, die oberhalb des Niveaus des Kulturmedi­ ums vorliegt, ausgesetzt werden;
• (d) Kontrollieren des Ausströmens des Kulturmediums durch die Auslaßein­ richtung in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Hochni­ veau; und
• (e) Kontrollieren des Einströmens des Kulturmediums durch die Einlaßein­ richtung in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Niederni­ veau, umfaßt.

Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgen­ den, detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen mit Bezug auf die angefügten Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, welche eine bevorzugte Ausführungs­ form einer Vorrichtung zum Züchten von anker- bzw. fixierungsabhängigen Zellen zeigt.

Fig. 2 ist eine Darstellung eines Teils der bevorzugten Ausführungsform, welche die Kulturkammer detaillierter zeigt.

Fig. 3 zeigt einen Flachplattensubstrataufbau, welcher in der bevorzugten Ausführungsform verwendet wird.

Wie in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt ist, umfaßt die Züchtungsvorrichtung einen Behälter 1, welcher eine Kulturkammer 11 zum Aufnehmen eines Kultur­ mediums, obere und untere Einlaßöffnungen 12 und 13 zum Beschicken des Kulturmediums, eine Auslaßöffnung 14 zum Austragen bzw. Abfließen des Kulturmediums und eine Überlauföffnung 15, welche das Ablaufen des Überlaufs erlaubt, aufweist. Ein erstes Sammelbehältnis 2 wird bei einem Niveau an­ gebracht, welches niedriger ist als die Kulturkammer 11, und ein zweites Sam­ melbehältnis 3 wird an einem Niveau angebracht, welches höher ist als die Kulturkammer 11.

Eine Substrat- bzw. Trägereinrichtung 7, welche eine Vielzahl von Substrat­ platten 71 einschließt, ist in der Kulturkammer 11 zur Bereitstellung von Fixie­ rungsoberflächen zum Zellwachstum angebracht. Die Substratplatten 71 sind flache Platten, welche sich vertikal erstrecken und horizontal mit Zwischenräu­ men angeordnet sind. Obwohl nur flache Platten als Zellfixierungssubstrate bzw. -träger in dieser Ausführungsform gezeigt sind, ist die in der vorliegende Erfin­ dung verwendete Substrateinrichtung nicht darauf beschränkt. Andere Substrate bzw. Träger, wie netz- bzw. gitterartige Platten oder Einbettungsmaterialien, welche herkömmlicherweise zum Anhaften bzw. Fixieren von Zellen verwendet werden können, können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Ein Zirkulationssystem zum Zirkulieren des Kulturmediums umfaßt eine Einlaß­ bzw. Zuführleitung 41, eine Auslaß- bzw. Ablaufleitung 42, eine Überlaufleitung 43 und eine Rückführungsleitung 44. Die Zuführleitung 41 ist mit den Einlaßöff­ nungen 12 und 13 und dem zweiten Vorrats- bzw. Sammelbehältnis 3 verbun­ den, und die Auslaßleitung 42 ist mit der Auslaßöffnung 14 und dem ersten Vorrats- bzw. Sammelbehältnis 2 verbunden. Die Überlaufleitung 43 erstreckt sich zwischen der Überlauföffnung 15 und dem ersten Vorratsbehältnis 2. Die Rückführungsleitung 44 verbindet miteinander das erste und zweite Vorrats­ behältnis 2 und 3 und hat eine Pumpe 45 eingebaut, welche das Kulturmedium von dem ersten Vorratsbehältnis 2 zu dem zweiten Vorratsbehältnis 3 trans­ portiert.

Ventile V1, V2, V3 und V31 sind zur Kontrolle der Strömung des Kulturmediums in der Überlaufleitung 43, der Auslaßleitung 42 und der Einlaßleitung 41 an­ geordnet. Mittels des Ventils V31, welches ein Dreiwegeventil ist, kann das Kulturmedium in die Kulturkammer 11 durch die obere oder untere Einlaßöff­ nungen 12 und 13 gemäß den Erfordernissen zum Betrieb der Züchtungsvor­ richtung zugeführt werden. Luftfilter F1 und F2 werden für die Kulturkammer 11 bereitgestellt und Luftfilter F3 und F4 werden für die Behältnisse 2 bzw. 3 bereitgestellt. Eine Luftpumpe 5 ist mit dem Luftfilter F1 verbunden, um Frisch­ luft in die Kulturkammer 11 zu fördern, sofern erwünscht. Ein Füllstandsmeßge­ rät 80 ist mit dem ersten Vorratsbehältnis 2 verbunden, um den Oberflächen­ spiegel bzw. das Oberflächenniveau des Mediums im ersten Vorratsbehältnis 2 zu ermitteln. Wenn der Pegel bzw. Spiegel des Mediums ein vorbestimmtes Niveau erreicht, wird die Pumpe 45 in Betrieb gesetzt, um das Medium zum zweiten Vorratsbehältnis 3 zu transportieren.

Ein Siphonrohr 6 weist einen Arm auf, welcher mit dem ersten Vorratsbehältnis verbunden ist, und einen weiteren Arm, der mit der Auslaßleitung 42 verbunden ist. Die Höhe des Siphonrohrs 6 ist derart ausgelegt, daß das Siphonrohr 6 das Medium von der Zellkulturkammer in das erste Vorratsbehältnis einzusaugen beginnt, wenn der Oberflächenspiegel des Kulturmediums ein Niveau erreicht, das höher ist als die Höhe der Substrat- bzw. Trägerplatten 71, welches fast so hoch ist wie die Überlauföffnung 15.

Die Züchtungsvorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann weiter Einrichtungen zum gleichförmigen Verteilen des Kulturmediums entweder an der Ober- oder Unterseite der Kulturkammer oder an beiden umfassen. Die Einrichtung zum gleichförmigen Verteilen 8 kann am oberen Ende der Kulturkam­ mer 11 zum gleichförmigen Verteilen des Kulturmediums auf den flachen Sub­ stratplatten 71 angeordnet sein. Die Einrichtung 8 umfaßt Verteilerrohre 81, welche mit der Einlaßöffnung 13 verbunden sind und welche eine Vielzahl an Auslaßöffnungen aufweisen, welche an der Oberseite der Kulturkammer 11 verteilt sind, sowie eine perforierte Platte bzw. Boden bzw. Gefäßeinsatz 82 zum Aufnehmen des Kulturmediums von den Verteilerrohren 81 und zum Verteilen desselben auf die Substratplatten 71. Andererseits können Sprühvorrichtungen (nicht gezeigt) anstelle der perforierten Platte 82 zum Sprühen des Kulturmedi­ ums verwendet werden.

Der Betrieb der Vorrichtung beginnt ausgehend vom Stadium des Anhaftens bzw. des Fixierens bzw. des Aufbringens der Zellen. In diesem Stadium wird ein Kulturmedium in die Kulturkammer 11 vom zweiten Vorratsbehältnis 3 durch Schwerkraft oder einen Gradientendruck bei einer geeigneten konstanten Rate, kontrolliert durch das Ventil V3, zugeführt. Die Düse V1 an der Überlauföffnung 15 wird gleichzeitig geöffnet, um den Oberflächenspiegel des Kulturmediums bei einer Höhe h4 oder einem Oberflächenspiegel zu halten, so daß alle Substrat­ platten 71 vollständig im Kulturmedium eintauchen. Das Kulturmedium strömt von der Überlauföffnung 15 durch die Leitung 43 aufgrund der Schwerkraft oder einem Gradientendruck in das erste Vorratsbehältnis 2. Die Pumpe 45 wird mittels des Füllstandmeßgeräts 80, welches das Niveau des Mediums im ersten Vorratsbehältnis 2 mißt, zum Inbetriebsetzen des Transports des Kulturmediums zum zweiten Vorratsbehältnis 3 kontrolliert. Wenn das Niveau des Mediums im ersten Vorratsbehältnis 2 unterhalb seiner unteren Grenze ist, arbeitet die Pumpe 45 nicht. Das Kulturmedium wird über einen Schleifenweg, welcher durch die Kulturkammer 11 und das erste und zweite Vorratsbehältnis 2 und 3 läuft, zirkuliert. Die Dauer der Zirkulation kann 30 Minuten betragen oder kann kürzer oder länger sein, abhängig von der Dauer, die benötigt wird, um die Zellen auf dem Substrat anzuheften.

Nachdem die Zellen an die Oberflächen der Substratplatten 71 angebracht sind, wird das Ventil V1 geschlossen und das Ventil V2 wird geöffnet, während sich das Ventil V3 noch in seiner offenen Stellung befindet. Da der Oberflächen­ spiegel des Kulturmediums in diesem Stadium bei einem vollen Pegelstand oder höher als die Höhe des Siphonrohrs 6 ist, wird das Kulturmedium durch die Auslaßöffnung 14 aufgrund eines Einsaugens, das in dem Siphonrohr 6 bewirkt wird, zu dem ersten Vorratsbehältnis 2 abgezogen. Wenn der Oberflächenspiegel erniedrigt wird, werden die Fixierungsoberflächen der Substratplatten 71 expo­ niert und nur ein dünner Film des Mediums wird auf jeder Substratplatte 71 belassen. Der Betrieb wird derart wiederholt, daß die Substratplatten 71 in Abständen vom Kulturmedium exponiert sind. Der Betrieb wird gestoppt, wenn die Zellen die Oberflächen der Substratplatten 71 bedecken. Die Dauer eines zyklischen Betriebs ist vorzugsweise 30 Sekunden. Basierend auf den konstanten volumetrischen Strömungsraten f1 und f2 in den Leitungen 41 und 43 kann die Zeitdauer des Zyklus vom Beginn der Pegelabsenkung bis zum Ende des Pegel­ anstiegs, wie im folgenden beschrieben, bestimmt werden.

In Fig. 2 bedeuten h1 bzw. h2 die Höhe des Bodens der Substratplatten 71 vom Boden der Kulturkammer 11 und die Höhe des oberen Endes der Substrat­ platten 71 vom Boden der Kulturkammer 11. h3 ist die Höhe des Siphonrohrs 6 vom Boden der Kulturkammer 11, und h4 ist die Höhe der Überlauföffnung vom Boden der Kulturkammer 11. Die Höhe des Oberflächenspiegels des Mediums ist h_l. In Fig. 3 ist w die Breite der Kulturkammer und l ist die Länge davon. Wenn das Kulturmedium in die Kulturkammer zum Erhöhen des Oberflächenspiegels des Mediums zugeführt wird, arbeitet das Siphonrohr 6 nicht und die Flußrate f2 des Mediums (nach Volumen), welche in der Leitung 43 konstant gehalten wird, ist Null. In diesem Stadium wird,

wenn 0 < h_l < h1 oder h2 < h_l < h3,

die Anstiegsrate des Oberflächenspiegels durch die folgende Gleichung be­ schrieben:

u1 = f1/wl (1)

Wenn h1 < h_l < h2 ist,
wird die Anstiegsrate des Oberflächenspiegels durch die folgende Gleichung beschrieben:

u1 = f1/w(l-Nd) (2)

(wobei N die Anzahl der Substratplatten und d die Dicke jeder Platte ist).

Bezüglich diesem Stadium, in welchem der Oberflächenspiegel des Niveaus aufgrund des Betriebs des Siphonrohrs 6 sich absenkt, wird angenommen, daß die Flußraten f1 und f2 des Mediums in den Leitungen 41 und 43 konstant sind. Unter diesen Umständen,

wenn 0 < h_l < h1 oder h2 < h_l < h3 ist,

wird die Absenkrate des Oberflächenspiegels durch die folgende Gleichung beschrieben:

Wenn h1 < h_l < h2 ist,
wird die Absenkrate des Oberflächenspiegels durch die folgende Gleichung beschrieben:

Die Zeit, die zum Erhöhen des Oberflächenspiegels des Mediums von 0 zu h3 benötigt wird, wird daher durch die folgende Gleichung beschrieben:

t₁ = w[(h1 + h2 + h3)l + (h2 - h1) (l-Nd)j/f1 (5)

und die Zeit, die benötigt wird, um den Oberflächenspiegel des Mediums von h3 zu 0 zu erniedrigen, wird durch die Gleichung gegeben:

t₂ = w[(h1 + h3 - h2)l + (h2 - h1) (l - Nd)]/(f2 - f1) (6)

Als Ergebnis ist die Gesamtzeit des Zyklus vom Beginn der Pegelabsenkung bis zum Ende des Pegelanstiegs:

t_p = t₁ + t₂ (7)

Obwohl die bevorzugten Ausführungsformen, wie beschrieben, stationäre Substratplatten, welche in Abständen von der Oberfläche des Kulturmediums durch Erhöhen und Erniedrigen des Oberflächenspiegels des Mediums exponiert werden, umfassen, können Vorrichtungen zum Aufwärts- und Abwärtsbewegen der Substratplatten verwendet werden, so daß die Substratplatten exponiert und eingetaucht werden.

Claims (11)

1. Vorrichtung zum Züchten von Zellen, umfassend eine Zellkulturkammer (11) mit Einlaß- und Auslaßeinrichtungen (12, 14), einer Substratein­ richtung (7), die innen in der Zellkulturkammer (11) angeordnet ist, und Einrichtungen (2, 3, V3, V2, 6, 80, 44, 45) zum Zirkulieren eines Kultur­ mediums durch die Zellkulturkammer und die Einlaß- und Auslaßeinrich­ tungen, wobei die Zirkulationseinrichtung mit der Einlaß- und der Auslaß­ einrichtung verbunden ist, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zirkulationseinrichtung alternierend ein Erhöhen und Erniedri­ gen des Kulturmediumniveaus relativ zur Oberfläche der Substratein­ richtung zwischen einem Hochniveau, um die an der Substrateinrichtung fixierten Zellen in das Kulturmedium einzutauchen, und einem Niederni­ veau, um die an der Substrateinrichtung fixierten Zellen einer gasförmigen Umgebung auszusetzen, ohne Bewegen der Substrateinrichtung relativ zur Zellkulturkammer bewirkt, wobei die Zirkulationseinrichtung befähigt ist, das Einströmen des Kulturmediums durch die Einlaßeinrichtung in Abhän­ gigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Niederniveau und das Aus­ strömen durch die Auslaßeinrichtung in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Hochniveau zu kontrollieren.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Zirkulationseinrichtung weiter ein erstes Vorratsbehältnis (2) umfaßt, welches mit der Auslaßeinrichtung (14) verbunden ist, und das an einem Niveau angeordnet ist, welches niedriger als der Boden der Zellkulturkammer (11) ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zirkulationseinrichtung weiter ein zweites Vorratsbehältnis (3) umfaßt, welches stromaufwärts der Kulturkammer (11) an einem Niveau angeordnet ist, welches höher als das obere Ende der Zellkulturkammer (11) ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zirkulationsein­ richtung weiter eine Pumpeinrichtung (45) zwischen dem ersten und zweiten Vorratsbehältnis (2, 3) umfaßt.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zirkulationsein­ richtung eine mit der Auslaßeinrichtung (14) und dem ersten Vorrats­ behältnis (2) verbundene Siphon-Vorrichtung umfaßt, wobei die Siphon- Vorrichtung eine Saugkraft erzeugt, wenn der Oberflächenspiegel des Kulturmediums das Hochniveau erreicht.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zirkulationsein­ richtung weiter ein mit der Auslaßvorrichtung (14) verbundenes erstes Kontrollventil (V2) zur Kontrolle des Ausströmens des Kulturmediums und ein mit der Einlaßeinrichtung (12) verbundenes zweites Kontrollventil (V3) zur Kontrolle des Einströmens des Kulturmediums in die Zellkulturkammer umfaßt.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zirkulationsein­ richtung weiter eine mit der Zellkulturkammer verbundene Überlaufleitung (43) an einem Niveau oberhalb des oberen Endes der Substrateinrichtung und ein mit der Überlaufleitung (43) verbundenes Überlaufventil (V1) umfaßt.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zirkulationsein­ richtung weiter eine Einrichtung (80) zum Ermitteln des Oberflächen­ spiegels des Kulturmediums in dem ersten Vorratsbehältnis (2) und zum Auslösen des Betriebs der Pumpeinrichtung (45) umfaßt.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Einlaßeinrich­ tung einen ersten Einlaß (13), welcher benachbart zum oberen Ende der Zellkulturkammer angeordnet ist, und einen zweiten Einlaß (12), der benachbart zum Boden der Zellkulturkammer angeordnet ist, umfaßt.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, welche weiter eine Ein­ richtung (5) zum Zuführen von Gas in die Zellkulturkammer vom oberen Ende der Zellkulturkammer umfaßt.

11. Verfahren zum Züchten von Zellen, umfassend

• (a) Bereitstellen einer Zellkulturkammer (11) mit einem Einlaß (12), einem Auslaß (14), einer Substrateinrichtung (7) zum Anhaften von Zellen,
• (b) Einbringen eines Kulturmediums in die Zellkulturkammer (11) und Anhaftenlassen von Zellen an die Substrateinrichtung (7),
• (c) Zirkulieren lassen des Kulturmediums durch die Einlaß- und Auslaß­ einrichtungen (12, 13) und alternierend Erhöhen und Erniedrigen des Kulturmediumniveaus während des Zellwachstums ohne Bewe­ gen der Substrateinrichtung relativ zu der Kulturkammer zwischen einem Hochniveau, um die an der Substrateinrichtung fixierten Zellen in das Kulturmedium einzutauchen, und einem Niederniveau, um die an der Substrateinrichtung fixierten Zellen einer gasförmigen Umgebung, welche oberhalb des Niveaus des Kulturmediums vor­ liegt, auszusetzen,
• (d) Kontrollieren des Ausströmens des Kulturmediums durch die Aus­ laßeinrichtung (14) in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmedi­ ums am Hochniveau, und
• (e) Kontrollieren des Einströmens des Kulturmediums durch die Einlaß­ einrichtung (12) in Abhängigkeit vom Erreichen des Kulturmediums am Niederniveau.