JP7179548B2 - バイオリアクタ、細胞培養システム及び細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するためのバイオリアクタ、細胞培養システム及び細胞培養方法に関する。

例えば、特許文献１には、ハウジング内に収容された複数の中空糸膜の内面に細胞を播種させた状態で複数の中空糸膜の外面側に培地を供給することにより、細胞を培養するバイオリアクタが開示されている。ハウジングの一端部には入口側キャップが連結され、ハウジングの他端部には出口側キャップが連結されている。

入口側キャップの中央部には、中空糸膜に播種するための細胞をハウジング内に導入する１つの入口ポートが設けられている。出口側キャップの中央部には、培養された細胞をハウジング内から導出させるための１つの出口ポートが設けられている。

特表２０１６－５３７００１号公報

上述した従来技術では、入口側キャップの中央部に１つの入口ポートを設けているため、複数の中空糸膜の全体に細胞を均等に播種することが容易ではない。そのため、細胞を効率的に培養することができないおそれがある。

本発明は、このような課題を考慮してなされたものであり、簡易な構成により効率的に細胞を培養することができるバイオリアクタ、細胞培養システム及び細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明の第一の態様は、細胞を培養するためのバイオリアクタであって、細胞が播種される細胞播種面を有する被播種部材と、前記被播種部材を収容するハウジングと、前記ハウジングに設けられ、細胞含有液、細胞を前記細胞播種面から剥離するための剥離液及び培地の少なくとも１つの流体を前記ハウジング内に導入する導入部と、前記ハウジングに設けられ、前記流体を前記ハウジング内から導出させる導出部と、を備え、前記導入部は、複数の入口流路と、前記複数の入口流路のそれぞれを開閉するための複数の入口バルブと、を有する、バイオリアクタである。

本発明の第二の態様は、上述したバイオリアクタと、前記導出部から導出された前記流体を前記導入部に循環させる循環流路と、前記流体を前記循環流路に導く流体導入部と、を備える、細胞培養システムである。

本発明の第三の態様は、バイオリアクタを用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記バイオリアクタは、細胞が播種される細胞播種面を有する被播種部材と、前記被播種部材を収容するハウジングと、前記ハウジングに設けられ、細胞含有液を前記ハウジング内に導入する導入部と、前記ハウジングに設けられ、細胞含有液を前記ハウジング内から導出する導出部と、を備え、前記導入部は、複数の入口流路と、前記複数の入口流路のそれぞれを開閉するための複数の入口バルブと、を有し、前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に細胞含有液を導入して細胞を前記被播種部材に播種する播種工程を行う、細胞培養方法である。

本発明によれば、複数の入口流路から選択的にハウジング内に流体（細胞含有液、剥離液及び培地）を導入することができるため、ハウジング内の流体の流速分布のバラツキを抑えることができる。これにより、細胞播種面の全体に略同じ流速の流体（細胞含有液、培地）を供給することができるため、簡易な構成により効率的に細胞を培養することができる。また、細胞播種面から細胞を剥離するときはハウジング内の流体の流速分布を集約させて、細胞剥離する力を強めて、細胞の回収効率を向上させることができる。

本発明の一実施形態に係る細胞培養システムの模式的構成図である。 バイオリアクタの一部の斜視図である。 図２のＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿った断面図である。 図３のＩＶ－ＩＶ線に沿った断面図である。 図３のＶ－Ｖ線に沿った断面図である。 被播種部材の斜視図である。 本発明の細胞培養方法を説明するフローチャートである。 細胞培養方法のプライミング工程の説明図である。 細胞培養方法の播種工程の説明図である。 細胞培養方法の接着工程の説明図である。 細胞培養方法の培養工程の説明図である。 細胞培養方法の剥離液添加工程の説明図である。 細胞培養方法の剥離工程の説明図である。 細胞培養方法の回収工程の説明図である。

以下、本発明に係るバイオリアクタ、細胞培養システム及び細胞培養方法について好適な実施形態を挙げ、添付の図面を参照しながら説明する。

本発明の一実施形態に係る細胞培養システム１０は、生体組織から分離した細胞を培養して増殖するものである。本実施形態において、細胞培養システム１０に用いられる細胞は、接着細胞である。ただし、細胞は、接着細胞に限定されず、浮遊細胞であってもよいし、接着細胞と浮遊細胞とを組み合わせたものであってもよい。また、細胞としては、例えば、幹細胞（間葉細胞、造血細胞等）、繊維芽細胞、角化細胞、前駆細胞、その他の完全分化細胞又はそれらを組み合わせたものが用いられる。

図１に示すように、細胞培養システム１０は、システム本体１２と、システム本体１２に所定の流体を導入する流体導入部１４と、システム本体１２から流体を排出する排出部１６と、培養された細胞を回収する回収部１８と、制御部１９とを備える。

システム本体１２に導入される所定の流体は、細胞含有液、培地及び剥離液である。細胞含有液は、システム本体１２の後述する被播種部材６０の細胞播種面５８に細胞を播種させるための細胞懸濁液である。細胞含有液としては、例えば、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）等が用いられる。

培地は、被播種部材６０に播種された細胞に育成環境を提供する流体（培養液）である。培地としては、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等が用いられる。剥離液は、細胞を被播種部材６０から剥離するための液体である。剥離液としては、例えば、細胞の蛋白質を分解するトリプシン溶液及びトリプシンＥＤＴＡ溶液等が挙げられる。

システム本体１２は、細胞を培養するためのバイオリアクタ２０、循環流路２２、酸素供給部２４、複数のバルブ２６、循環ポンプ２８及び圧力センサ３０を有する。バイオリアクタ２０の詳細な構成については後述する。

循環流路２２には、流体導入部１４から所定の流体（細胞含有液、培地及び剥離液）が導入される。循環流路２２は、バイオリアクタ２０の導出部６４ｂから導出された流体をバイオリアクタ２０の導入部６４ａに循環させる。循環流路２２は、第１流路２２ａ、第２流路２２ｂ、第３流路２２ｃ、第４流路２２ｄ及びバイパス流路２２ｅを有する。

第１流路２２ａは、酸素供給部２４に連結されている。第２流路２２ｂは、酸素供給部２４とバイオリアクタ２０の導入部６４ａとを互いに連結する。第３流路２２ｃは、バイオリアクタ２０の導出部６４ｂに連結されている。第４流路２２ｄは、第３流路２２ｃと第１流路２２ａとを互いに連結する。バイパス流路２２ｅは、第１流路２２ａと第２流路２２ｂとを互いに連結する。

酸素供給部２４は、ガス交換部３２、培地入口部３４ａ、培地出口部３４ｂ、ガス入口部３６ａ及びガス出口部３６ｂを有する。ガス交換部３２は、培地に酸素を供給することにより培地の酸素濃度を高める。培地入口部３４ａには第１流路２２ａが連結され、培地出口部３４ｂには第２流路２２ｂが連結されている。ガス入口部３６ａには、所定のガス（酸素を含むガス）が導入される。ガス出口部３６ｂには、培地との間でガス交換された後の使用済みのガスが流通する。

複数のバルブ２６は、流路を開放及び閉塞する開閉弁である。複数のバルブ２６は、第１流路２２ａのうちバイパス流路２２ｅとの連結部よりも第４流路２２ｄ側に設けられたバルブ２６ａと、第１流路２２ａのうちバイパス流路２２ｅとの連結部よりも酸素供給部２４側に設けられたバルブ２６ｂと、バイパス流路２２ｅに設けられたバルブ２６ｃとを含む。

循環ポンプ２８は、第４流路２２ｄに設けられている。循環ポンプ２８は、第１方向と第２方向（第１方向とは反対方向）とに流体をポンピング可能に構成されている。つまり、循環ポンプ２８は、第１流路２２ａ、酸素供給部２４（バイパス流路２２ｅ）、第２流路２２ｂ、バイオリアクタ２０、第３流路２２ｃ及び第４流路２２ｄの順番（第１方向）に流体を流通させる。また、循環ポンプ２８は、第１流路２２ａ、第４流路２２ｄ、第３流路２２ｃ、バイオリアクタ２０、第２流路２２ｂ、バイパス流路２２ｅの順番（第２方向）に流体を流通させることができる。

圧力センサ３０は、第４流路２２ｄに設けられ、循環流路２２内の流体の圧力を検出する。循環ポンプ２８及び圧力センサ３０は、第４流路２２ｄに設けられた例に限定されず、循環流路２２の任意の位置に設けることができる。

流体導入部１４は、第１導入流路３８ａ、第２導入流路３８ｂ、第３導入流路３８ｃ、複数の導入バルブ４０及び導入ポンプ４２を有する。第１導入流路３８ａは、細胞含有液を収容可能な第１収容部４４ａ（細胞含有液収容バッグ）と第１流路２２ａとを互いに連結する。第２導入流路３８ｂは、剥離液を収容可能な第２収容部４４ｂ（剥離液収容バッグ）と第１導入流路３８ａとを互いに連結する。第３導入流路３８ｃは、培地を収容する第３収容部４４ｃ（培地収容バッグ）と第２導入流路３８ｂとを互いに連結する。

複数の導入バルブ４０は、流路を開放及び閉塞する開閉弁である。複数の導入バルブ４０は、第１導入流路３８ａのうち第２導入流路３８ｂとの連結部よりも第１収容部４４ａ側に設けられた導入バルブ４０ａと、第２導入流路３８ｂのうち第３導入流路３８ｃとの連結部よりも第２収容部４４ｂ側に設けられた導入バルブ４０ｂと、第３導入流路３８ｃに設けられた導入バルブ４０ｃとを含む。

導入ポンプ４２は、第１導入流路３８ａにおける第２導入流路３８ｂとの連結部よりも循環流路２２側に設けられている。導入ポンプ４２は、第１～第３収容部４４ａ～４４ｃから循環流路２２に流体（細胞含有液、剥離液及び培地）を導く。

第２導入流路３８ｂは、第１導入流路３８ａに連結された例に限定されず、循環流路２２に直接連結されていてもよい。第３導入流路３８ｃは、第２導入流路３８ｂに連結された例に限定されず、循環流路２２に直接連結されていてもよい。

排出部１６は、排出流路４６及び排出バルブ４８を有する。排出流路４６は、第３流路２２ｃと廃棄収容部５０（廃棄バッグ）とを互いに連結する。排出バルブ４８は、排出流路４６に設けられ、排出流路４６を開放及び閉塞する開閉弁である。

回収部１８は、回収流路５２及び回収バルブ５４を有する。回収流路５２は、培養された細胞を収容可能な回収収容部５６（回収バッグ）と第３流路２２ｃとを互いに連結する。回収バルブ５４は、回収流路５２を開放及び閉塞する開閉弁である。

図１～図６において、バイオリアクタ２０は、細胞が播種される細胞播種面５８を有する被播種部材６０（図３～図６参照）と、被播種部材６０を収容するハウジング６２と、ハウジング６２に設けられた導入部６４ａ及び導出部６４ｂとを含む。

図３～図６に示すように、被播種部材６０は、いわゆるシャーレ積層型として構成されており、矢印Ｚ方向に互いに積層された複数の板状部材６８を有する。板状部材６８は、細胞が播種可能な材料（例えば、硬質樹脂材料）によって一体的に成形されている。板状部材６８は、矩形状に形成されており、一方向（矢印Ｘ方向）に延在している。

板状部材６８の表面６８ａ（矢印Ｚ２方向の面）には、複数の突起７０が複数の板状部材６８の積層方向に沿って（矢印Ｚ２方向に向かって）突出している。各突起７０は、例えば、板状部材６８の全長に亘って（図４の導入部６４ａから導出部６４ｂに向かう方向）に沿って直線状に延在している。

複数の突起７０は、複数の板状部材６８の積層方向と突起７０の延在方向とに交差する方向（矢印Ｙ方向）に互いに離間した状態で並んでいる。換言すれば、複数の突起７０は、板状部材６８の短手方向に等間隔に設けられている。複数の突起７０の突出端面７０ａは、突起７０の突出方向（矢印Ｚ２方向）に隣接する板状部材６８の裏面６８ｂに接触している。つまり、複数の突起７０は、複数の板状部材６８を支持する。

板状部材６８の表面６８ａのうち互いに隣接する突起７０の間には、平面状の細胞播種面５８が形成されている。細胞播種面５８は、板状部材６８の全長に亘って板状部材６８の直線状に延在している。互いに対向する板状部材６８において、細胞播種面５８と板状部材６８の裏面６８ｂとの間には、流体（細胞含有液、培地及び剥離液）が流通して細胞播種面５８を形成する複数の流路７２が形成されている。換言すれば、各板状部材６８には、流体（細胞含有液、剥離液及び培地）が流通する複数の流路７２が形成されている。つまり、流路７２は、互いに隣接する突起７０と細胞播種面５８とによって形成されている。流路７２は、導入部６４ａ側（矢印Ｘ１方向）に向けて開口する第１開口部７２ａと、導出部６４ｂ側（矢印Ｘ２方向）に向けて開口する第２開口部７２ｂとを有する（図３及び図４参照）。

突起７０の数、形状、位置は、任意に設定可能である。例えば、突起７０は、直線状に延在したものに限定されず、湾曲していてもよいし、点状に形成されていてもよい。

図２～図５に示すように、ハウジング６２は、被播種部材６０を覆うように四角筒状に構成されている。ハウジング６２の全長（矢印Ｘ方向の寸法）は、被播種部材６０の全長（矢印Ｘ方向の寸法）よりも長い。ハウジング６２は、例えば、硬質樹脂によって成形されている。ハウジング６２は、ハウジング６２の外側から内部の被播種部材６０を視認可能なように、透明に形成されていてもよい。

ハウジング６２は、被播種部材６０を矢印Ｚ方向から覆う２つの壁部７４ａ、７４ｂと、被播種部材６０を矢印Ｙ方向から覆う２つの壁部７４ｃ、７４ｄとを含む。図５において、壁部７４ａは、最も矢印Ｚ１方向に位置する板状部材６８の裏面６８ｂに接触している。壁部７４ｂは、最も矢印Ｚ２方向に位置する板状部材６８の各突起７０の突出端面７０ａに接触している。各壁部７４ｃ、７４ｄは、各板状部材６８の側面に接触している。

図１～図４に示すように、導入部６４ａは、第２流路２２ｂの流体をハウジング６２内に導入する。導入部６４ａは、入口側端壁部７６ａ、１つの導入流路７８ａ、複数の入口側連結流路８０ａ及び複数の入口バルブ８２ａを有する。なお、図２では、導入流路７８ａ、複数の入口側連結流路８０ａ及び複数の入口バルブ８２ａの図示を省略している。

入口側端壁部７６ａは、ハウジング６２の矢印Ｘ１方向の開口部６２ａを閉塞するようにハウジング６２の一端部に設けられている。入口側端壁部７６ａと被播種部材６０との間には、入口側空間８４ａが形成されている（図３及び図４参照）。入口側端壁部７６ａには、矢印Ｙ方向に配列した複数個の入口ポート８６ａからなる入口ポート列８８ａが矢印Ｚ方向に複数設けられている（図２参照）。

各入口ポート８６ａは、入口側端壁部７６ａをその厚さ方向（矢印Ｘ方向）に貫通する円形状の貫通孔である。図４において、複数の入口ポート８６ａは、被播種部材６０の複数の流路７２に対応するように配置されている。つまり、複数の入口ポート８６ａは、被播種部材６０の流路７２に対して矢印Ｘ１方向に位置する。ただし、複数の入口ポート８６ａの大きさ、形状、位置及び数は、任意に設定可能である。

導入流路７８ａは、第２流路２２ｂに連結している（図１参照）。図３及び図４において、複数の入口側連結流路８０ａは、第２流路２２ｂから複数の入口ポート８６ａに分岐している。すなわち、複数の入口側連結流路８０ａは、第２流路２２ｂの流体を複数の入口ポート８６ａのそれぞれに導く。複数の入口側連結流路８０ａのそれぞれは、複数の入口ポート８６ａのそれぞれに連結することにより複数の入口流路７９ａを構成する。複数の入口バルブ８２ａは、複数の入口側連結流路８０ａのそれぞれに設けられている。つまり、導入部６４ａは、複数の入口流路７９ａと、複数の入口流路７９ａのそれぞれを開閉するための複数の入口バルブ８２ａとを有する。複数の入口バルブ８２ａは、入口側端壁部７６ａに個別に設けられている。

図１～図４に示すように、導出部６４ｂは、流体をハウジング６２内から導出させる。導出部６４ｂは、出口側端壁部７６ｂ、１つの導出流路７８ｂ、複数の出口側連結流路８０ｂ及び複数の出口バルブ８２ｂを有する。出口側端壁部７６ｂは、ハウジング６２の矢印Ｘ２方向の開口部６２ｂを閉塞するようにハウジング６２の他端部に設けられている。出口側端壁部７６ｂと被播種部材６０との間には、出口側空間８４ｂが形成されている（図３及び図４参照）。出口側端壁部７６ｂには、矢印Ｙ方向に配列した出口ポート８６ｂからなる出口ポート列８８ｂが矢印Ｚ方向に複数設けられている（図２参照）。

各出口ポート８６ｂは、出口側端壁部７６ｂをその厚さ方向（矢印Ｘ方向）に貫通する円形状の貫通孔である。図４において、複数の出口ポート８６ｂは、被播種部材６０の複数の流路７２に対応するように配置されている。つまり、複数の出口ポート８６ｂは、被播種部材６０の流路７２に対して矢印Ｘ２方向に位置する。すなわち、複数の出口ポート８６ｂは、入口ポート８６ａと同数設けられている。換言すれば、複数の出口ポート８６ｂの位置は、矢印Ｘ方向からの平面視で複数の入口ポート８６ａと重なる位置に設けられている。ただし、複数の出口ポート８６ｂの大きさ、形状、位置及び数は、任意に設定可能である。

図３及び図４に示すように、複数の出口側連結流路８０ｂは、複数の出口ポート８６ｂから導出流路７８ｂに延出する。すなわち、複数の出口側連結流路８０ｂは、複数の出口ポート８６ｂから導出された流体を導出流路７８ｂに導く。複数の出口側連結流路８０ｂのそれぞれは、複数の出口ポート８６ｂのそれぞれに連結することにより複数の出口流路７９ｂを構成する。導出流路７８ｂは、第３流路２２ｃに連結している（図１参照）。複数の出口バルブ８２ｂは、複数の出口側連結流路８０ｂのそれぞれに設けられている。つまり、導出部６４ｂは、複数の出口流路７９ｂと、複数の出口流路７９ｂのそれぞれを開閉するための複数の出口バルブ８２ｂとを有する。複数の出口バルブ８２ｂは、出口側端壁部７６ｂに個別に設けられている。

図１において、制御部１９は、マイクロコンピュータを含む計算機であり、ＣＰＵ（中央処理装置）、メモリであるＲＯＭ、ＲＡＭ、等を有しており、ＣＰＵがＲＯＭに記憶されているプログラムを読み出し実行することで各種機能実現部（機能実現手段）として機能する。なお、各種機能実現部は、ハードウエアとしての機能実現器により構成することもできる。

制御部１９は、酸素供給部２４の駆動を制御する。また、制御部１９は、ポンプ制御部９０とバルブ制御部９２とを備える。ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２及び循環ポンプ２８の駆動を制御する。バルブ制御部９２は、複数のバルブ２６、複数の導入バルブ４０、排出バルブ４８及び回収バルブ５４を開閉制御する。また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御し、複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。

次に、上記のように構成された本実施形態に係る細胞培養システム１０を用いた細胞培養方法について説明する。

図７のステップＳ１の準備工程において、各収容部（第１収容部４４ａ、第２収容部４４ｂ、第３収容部４４ｃ、廃棄収容部５０及び回収収容部５６）を所定の流路に接続する。なお、第１収容部４４ａには、細胞含有液が収容され、第２収容部４４ｂには剥離液が収容され、第３収容部４４ｃには培地が収容されている。また、準備工程の状態で、複数のバルブ２６、複数の導入バルブ４０、排出バルブ４８、回収バルブ５４、複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂは閉状態になっている。

続いて、ステップＳ２のプライミング工程において、細胞培養システム１０のプライミング処理を行う。具体的には、図８に示すように、バルブ制御部９２は、複数のバルブ２６ａ、２６ｂ、２６ｃ、導入バルブ４０ｃ、排出バルブ４８、複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂを開状態にする。また、ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２を連続的又は間欠的に駆動させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（培地）が流通するように連続的又は間欠的に循環ポンプ２８を駆動させる。なお、制御部１９は、酸素供給部２４を駆動しない。

そうすると、第３収容部４４ｃから第３導入流路３８ｃ、第２導入流路３８ｂ及び第１導入流路３８ａを介して第１流路２２ａに培地が導入される。第１流路２２ａに導入された培地は、酸素供給部２４を介して第２流路２２ｂに導かれるとともにバイパス流路２２ｅを介して第２流路２２ｂに導かれる。

そして、第２流路２２ｂに導かれた培地は、複数の入口側連結流路８０ａ及び複数の入口ポート８６ａを通りハウジング６２内に導入され、ハウジング６２内が培地で満たされる。ハウジング６２内の培地は、複数の出口ポート８６ｂ及び複数の出口側連結流路８０ｂを通り第３流路２２ｃに導出される。第３流路２２ｃに導出された培地は、第４流路２２ｄを通り第１流路２２ａに戻される。つまり、培地は、循環ポンプ２８の作用下に循環流路２２を第１方向に循環する。なお、循環流路２２に供給された培地の過剰分は、排出流路４６に排出されて廃棄収容部５０に収容される。

次いで、図７のステップＳ３の播種工程において、被播種部材６０の細胞播種面５８に細胞を播種させる。具体的には、図９に示すように、バルブ制御部９２は、バルブ２６ｂ及び導入バルブ４０ｃを閉状態にするとともに導入バルブ４０ａを開状態にする。なお、バルブ２６ａ、２６ｃ、排出バルブ４８は、開状態に維持される。

また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御するとともに複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。換言すれば、バルブ制御部９２は、所定のプログラムに基づいて複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。ここで、所定のプログラムとは、複数の入口流路７９ａと複数の出口流路７９ｂとを開放させる順番及び開放時間が規定されたプログラムであって、被播種部材６０の複数の流路７２に略均等に流体（細胞含有液）が供給されるように設定されている。

具体的には、バルブ制御部９２は、例えば、対応する入口流路７９ａ及び出口流路７９ｂ（矢印Ｘ方向からの平面視で重なる位置にある入口ポート８６ａ及び出口ポート８６ｂ）が同時に開放するように複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂを開閉制御する。この場合、ハウジング６２内に流体を円滑に流通させることができる。

なお、所定のプログラムは、制御部１９の図示しない記憶部に予め記憶されていてもよいし、制御部１９が取得可能なように図示しないサーバ等に記憶されていてもよい。ただし、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂの開閉動作をランダムに制御してもよい。ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２を連続的又は間欠的に駆動させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（細胞含有液）が流通するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させる。

この場合、培地の第１流路２２ａへの導入が停止され、第１収容部４４ａから第１導入流路３８ａを介して第１流路２２ａに細胞含有液が導入される。第１流路２２ａに導かれた細胞含有液は、バイパス流路２２ｅを介して第２流路２２ｂに導かれる。

第２流路２２ｂの細胞含有液は、複数の入口流路７９ａのうち開放されている入口流路７９ａに選択的に導入され、ハウジング６２内の入口側空間８４ａに導かれる。入口側空間８４ａに導かれた細胞含有液は、被播種部材６０の複数の流路７２を介して出口側空間８４ｂまで流れる。この際、細胞含有液は、細胞播種面５８に接触する。そのため、細胞含有液中の細胞が細胞播種面５８に接着（播種）する。

出口側空間８４ｂまで流れた細胞含有液は、複数の出口流路７９ｂのうち開放されている出口流路７９ｂに選択的に導出され、出口側連結流路８０ｂを介して第３流路２２ｃに導かれる。第３流路２２ｃに導出された細胞含有液は、第４流路２２ｄを介して第１流路２２ａに戻される。つまり、細胞含有液は、循環流路２２を第１方向に循環する。

これにより、細胞播種面５８に播種されなかった細胞を再び細胞播種面５８に導くことができる。なお、第３流路２２ｃに導出された細胞含有液の一部は、プライミング時に循環流路２２及びハウジング６２内を満たしていた培地とともに排出流路４６を流れて廃棄収容部５０に収容される。これにより、第１収容部４４ａの細胞含有液を循環流路２２に円滑に導入することができる。播種工程は、被播種部材６０の細胞播種面５８の全体に均等に細胞が播種されるまで所定時間行われる。

続いて、図７のステップＳ４の接着工程において、細胞播種面５８に細胞を接着させる。具体的には、図１０に示すように、バルブ制御部９２は、導入バルブ４０ａ及び排出バルブ４８を閉状態にする。また、ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２及び循環ポンプ２８の駆動を停止させる。これにより、循環流路２２の流体の流れが完全に止まり、細胞が細胞播種面５８に接着される。

なお、接着工程において、ポンプ制御部９０は、循環ポンプ２８の駆動を一定時間停止させた後（ハウジング６２内の細胞が細胞播種面５８に接着された後）、循環流路２２内に残っている細胞を細胞播種面５８へと送るために循環ポンプ２８を駆動し、再度、循環ポンプ２８の駆動を一定時間停止させてもよい。この場合、循環流路２２内の細胞についても細胞播種面５８に接着させることができる。接着工程において、循環ポンプ２８の駆動を停止させている時間は、４～１０分程度が好ましい。

その後、図７のステップＳ５の培養工程において、細胞播種面５８に播種（接着）された細胞を培養する。具体的には、図１１に示すように、バルブ制御部９２は、バルブ２６ｃ及び導入バルブ４０ａを閉状態にするとともにバルブ２６ｂ、排出バルブ４８及び導入バルブ４０ｃを開状態にする。なお、バルブ２６ａは、開状態に維持される。

また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御するとともに複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂの制御は、播種工程のときと同じである。ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２を連続的又は間欠的に駆動させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（細胞含有液）が流通するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させる。さらに、制御部１９は、酸素供給部２４を駆動させて酸素を含む所定のガスをガス交換部３２に流通させる。

この場合、細胞含有液の第１流路２２ａへの導入が停止され、第３収容部４４ｃから第３導入流路３８ｃ、第２導入流路３８ｂ及び第１導入流路３８ａを介して第１流路２２ａに培地が導入される。第１流路２２ａに導入された培地は、酸素供給部２４で酸素が供給された状態で第２流路２２ｂに導かれる。

第２流路２２ｂの培地は、複数の入口流路７９ａのうち開放されている入口流路７９ａに選択的に導入され、ハウジング６２内の入口側空間８４ａに導入かれる。入口側空間８４ａに導かれた培地は、被播種部材６０の複数の流路７２を介して出口側空間８４ｂまで流れる。この際、培地は、細胞播種面５８に播種されている細胞に接触する。換言すれば、細胞播種面５８に播種されている細胞に酸素（栄養）が供給される。そのため、被播種部材６０に播種されている細胞に良好な育成環境が提供される。

出口側空間８４ｂまで流れた播種は、複数の出口流路７９ｂのうち開放されている出口流路７９ｂに選択的に導出され、出口側連結流路８０ｂを介して第３流路２２ｃに導かれる。第３流路２２ｃに導出された播種は、第４流路２２ｄを介して第１流路２２ａに戻される。つまり、培地は、循環流路２２を第１方向に循環する。

これにより、使用済み（細胞に酸素を供給した後）の培地は、酸素供給部２４で再び酸素が取り込まれた状態でハウジング６２内に導入されるため、充分な酸素を含有した培地を被播種部材６０に播種された細胞に供給することができる。なお、第３流路２２ｃに導出された培地の一部は、排出流路４６を流れて廃棄収容部５０に収容される。培養工程は、細胞播種面５８に播種されている細胞が充分に培養されるまで所定時間行われる。

そして、図７のステップＳ６の剥離液添加工程において、剥離液を添加して細胞播種面５８に均一に分散させる。具体的には、図１２に示すように、バルブ制御部９２は、バルブ２６ｂ及び導入バルブ４０ｃを閉状態にするとともにバルブ２６ｃ及び導入バルブ４０ｂを開状態にする。なお、バルブ２６ａ、排出バルブ４８は、開状態に維持される。

また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御するとともに複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂの制御は、播種工程のときと同じである。ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２を連続的又は間欠的に駆動させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（細胞含有液）が流通するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させる。さらに、制御部１９は、酸素供給部２４の駆動を停止させる。

この場合、第３収容部４４ｃから第１流路２２ａへの培地の流入が停止され、第２収容部４４ｂから第２導入流路３８ｂ、第１導入流路３８ａを介して第１流路２２ａに剥離液が導入される。第１流路２２ａに導入された剥離液は、バイパス流路２２ｅを介して第２流路２２ｂに導かれる。

第２流路２２ｂの剥離液は、複数の入口流路７９ａのうち開放されている入口流路７９ａに選択的に導入され、ハウジング６２内の入口側空間８４ａに導かれる。入口側空間８４ａに導かれた剥離液は、被播種部材６０の複数の流路７２を介して出口側空間８４ｂまで流れる。

出口側空間８４ｂまで流れた剥離液は、複数の出口流路７９ｂのうち開放されている出口流路７９ｂに選択的に導出され、出口側連結流路８０ｂを介して第３流路２２ｃに導かれる。第３流路２２ｃに導出された剥離液は、第４流路２２ｄを介して第１流路２２ａに戻され、再利用される。これにより、循環流路２２内及びハウジング６２内に剥離液が添加される。

その後、図７のステップＳ７の剥離工程において、培養された細胞を細胞播種面５８から剥離させる。具体的には、図１３に示すように、バルブ制御部９２は、導入バルブ４０ｂ及び排出バルブ４８を閉状態にする。なお、バルブ２６ａ、２６ｃは、開状態に維持される。

また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御するとともに複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。バルブ制御部９２は、剥離液の流速分布が集約するように複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂを開閉制御する。つまり、剥離工程のバルブ制御は、流速分布を均一にするための播種工程のバルブ制御とは異なる。

ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２の駆動を停止させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（剥離液）が循環するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させる。この際、流体は、例えば、図示しないヒータ等によって所定温度（酵素反応が行われる温度、例えば、３７℃）に維持される。

この場合、剥離液が細胞の蛋白質を分解するため、細胞が細胞播種面５８から化学的に剥離される。また、入口流路７９ａを通る際に圧力が高められた剥離液が細胞播種面５８と細胞との接着部分に直接的に当たるため、細胞が細胞播種面５８から物理的に剥離される。

剥離工程において、ポンプ制御部９０は、剥離液が第１方向と第２方向の両方向に交互に流通するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させてもよい。この場合、細胞を被播種部材６０から効果的に剥離させることができる。

続いて、図７のステップＳ８の回収工程において、剥離された細胞を回収する。具体的には、図１４に示すように、バルブ制御部９２は、導入バルブ４０ｃ及び回収バルブ５４を開状態にする。なお、バルブ２６ａ、２６ｃは、開状態に維持される。

また、バルブ制御部９２は、複数の入口バルブ８２ａを選択的に開閉制御するとともに複数の出口バルブ８２ｂを選択的に開閉制御する。複数の入口バルブ８２ａ及び複数の出口バルブ８２ｂの制御は、播種工程のときと同じである。ポンプ制御部９０は、導入ポンプ４２を連続的又は間欠的に駆動させるとともに循環流路２２を第１方向に流体（細胞含有液）が流通するように循環ポンプ２８を連続的又は間欠的に駆動させる。

この場合、第２収容部４４ｂから第１流路２２ａへの剥離液の流入が停止され、第３収容部４４ｃから第３導入流路３８ｃ、第２導入流路３８ｂ及び第１導入流路３８ａを介して第１流路２２ａに導入される。第１流路２２ａに導入された培地は、バイパス流路２２ｅを介して第２流路２２ｂに導かれる。

第２流路２２ｂの培地は、複数の入口流路７９ａのうち開放されている入口流路７９ａに選択的に導入され、ハウジング６２内の入口側空間８４ａに導かれる。入口側空間８４ａに導かれた培地は、被播種部材６０の複数の流路７２を介して出口側空間８４ｂまで流れる。この際、培地は、被播種部材６０の複数の流路７２に存在する細胞を出口側空間８４ｂに流す。

出口側空間８４ｂまで流れた培地（細胞を含んだ培地、細胞懸濁液）は、複数の出口流路７９ｂのうち開放されている出口流路７９ｂに選択的に導出され、出口側連結流路８０ｂを介して第３流路２２ｃに導かれる。第３流路２２ｃに導出された細胞を含む培地は、回収流路５２を流れて回収収容部５６に収容される。培地の一部は、第４流路２２ｄを介して第１流路２２ａに戻され、ハウジング６２内の細胞の回収に再利用される。ハウジング６２内及び循環流路２２の細胞の回収が完了すると、一連の動作フローが終了する。

このバイオリアクタ２０、細胞培養システム１０及び細胞培養方法は、以下の効果を奏する。

本実施形態によれば、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に流体（細胞含有液、剥離液及び培地）を導入することができるため、ハウジング６２内の流体の流速分布のバラツキを抑えることができる。これにより、細胞播種面５８の全体に略同じ流速の流体を供給することができるため、簡易な構成により効率的に細胞を培養することができる。

導出部６４ｂは、複数の出口流路７９ｂと、複数の出口流路７９ｂのそれぞれを開閉するための複数の出口バルブ８２ｂと、を有している。

このような構成によれば、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に導入された流体を複数の出口流路７９ｂから選択的にハウジング６２の外側に導出することができる。これにより、ハウジング６２内に流体を円滑に流すことができるため、細胞播種面５８の全体に一層効率的に供給することができる。

被播種部材６０には、流体が流通して細胞播種面５８を形成する複数の流路７２が形成されている。複数の流路７２のそれぞれは、導入部６４ａ側に向けて開口する第１開口部７２ａと、導出部６４ｂ側に向けて開口する第２開口部７２ｂと、を有する。

このような構成によれば、複数の入口流路７９ａからハウジング６２内に導入された流体を複数の流路７２に円滑に流通させることができる。これにより、簡易な構成により一層効率的に細胞を培養することができる。

被播種部材６０は、互いに積層された複数の板状部材６８を有している。複数の板状部材６８のそれぞれには、複数の流路７２の少なくとも１つが形成されている。

このような構成によれば、被播種部材６０の構成を簡素化することができる。

複数の板状部材６８のそれぞれの表面６８ａには、導入部６４ａから導出部６４ｂに向かう方向に沿って延在する複数の突起７０が複数の板状部材６８の積層方向に沿って突出している。複数の突起７０は、複数の板状部材６８を支持した状態で複数の流路７２を形成する。

このような構成によれば、簡易な構成により各板状部材６８に流路７２を形成することができる。

複数の突起７０は、複数の板状部材６８の積層方向と複数の突起７０の延在方向とに直交する方向に細胞播種面５８を挟むように並んでいる。

このような構成によれば、突起７０が細胞播種面５８を挟むように並んでいるため、複数の入口流路７９ａからハウジング６２内に導入された流体を細胞播種面５８に効率的に導くことができる。

細胞培養システム１０は、上述したバイオリアクタ２０と、導出部６４ｂから導出された流体を導入部６４ａに循環させる循環流路２２と、流体を循環流路２２に導入する流体導入部１４とを備える。

このような構成によれば、上述したバイオリアクタ２０と同様の効果を有する細胞培養システム１０を得ることができる。

細胞培養システム１０は、循環流路２２に設けられて循環流路２２を流通する培地に酸素を供給するための酸素供給部２４を備える。

このような構成によれば、酸素を含有した培地を被播種部材６０に播種された細胞に効率的に供給することができる。

バイオリアクタ２０を用いて細胞を培養する細胞培養方法では、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に細胞含有液を導入して細胞を被播種部材６０に播種する播種工程を行う。

このような方法によれば、被播種部材６０の細胞播種面５８の全体に効率的に細胞を均等に播種することができる。

細胞培養方法では、播種工程の後で、複数の入口流路７９ａからハウジング６２内への細胞含有液の導入を停止させた状態で細胞を被播種部材６０に接着させる接着工程を行う。

このような方法によれば、細胞を被播種部材６０に確実に接着させることができる。

細胞培養方法では、接着工程の後で、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に培地を導入して被播種部材６０に播種された細胞を培養する培養工程を行う。

このような方法によれば、細胞播種面５８に播種された細胞の全体に培地を効率的に供給することができる。

細胞培養方法では、培養工程の後で、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に剥離液を導入する剥離液添加工程を行う。

このような方法によれば、細胞播種面５８に播種された細胞の全体に剥離液を効率的に供給することができる。

細胞培養方法では、剥離液添加工程の後で、複数の出口流路７９ｂから導出された剥離液を複数の入口流路７９ａに循環させながら複数の入口流路７９から選択的にハウジング６２内に剥離液を導入して培養された細胞を被播種部材６０から剥離する剥離工程を行う。

このような方法によれば、細胞播種面５８から細胞を効率的に剥離させることができる。

細胞培養方法では、剥離工程の後で、複数の入口流路７９ａから選択的にハウジング６２内に培地を導入することにより、被播種部材６０から剥離された細胞を導出部６４ｂから導出させて回収する回収工程を行う。

このような構成によれば、細胞を効率的に回収することができる。

本発明は、上述した構成に限定されない。入口バルブ８２ａ及び出口バルブ８２ｂは、手動で開閉動作できるように構成されていてもよい。被播種部材６０は、導入部６４ａから導出部６４ｂに向かって延在した複数の中空糸膜を有していてもよい。

各入口バルブ８２ａと各入口ポート８６ａとは、流路（入口側連結流路８０ａ）によって互いに連結されていてもよい。複数の入口バルブ８２ａは、入口側端壁部７６ａに個別に設けられる構成に限定されず、１つのバルブユニットを構成してもよい。各出口バルブ８２ｂと各出口ポート８６ｂとは、流路（出口側連結流路８０ｂ）によって互いに連結されていてもよい。複数の出口バルブ８２ｂは、出口側端壁部７６ｂに個別に設けられる構成に限定されず、１つのバルブユニットを構成してもよい。

本発明に係るバイオリアクタ、細胞培養システム及び細胞培養方法は、上述の実施形態に限らず、本発明の要旨を逸脱することなく、種々の構成を採り得ることはもちろんである。

１０…細胞培養システム １４…流体導入部
２０…バイオリアクタ ２２…循環流路
２４…酸素供給部 ５８…細胞播種面
６０…被播種部材 ６２…ハウジング
６４ａ…導入部 ６４ｂ…導出部
６８…板状部材 ７０…突起
７２…流路 ７２ａ…第１開口部
７２ｂ…第２開口部 ７８ａ…導入流路
７８ｂ…導出流路 ７９ａ…入口流路
７９ｂ…出口流路 ８０ａ…入口側連結流路
８０ｂ…出口側連結流路 ８２ａ…入口バルブ
８２ｂ…出口バルブ ８６ａ…入口ポート
８６ｂ…出口ポート

Claims (14)

1. 細胞を培養するためのバイオリアクタであって、
   細胞が播種される細胞播種面を有する被播種部材と、
   前記被播種部材を収容するハウジングと、
   前記ハウジングに設けられ、細胞含有液、細胞を前記細胞播種面から剥離するための剥離液及び培地の少なくとも１つの流体を前記ハウジング内に導入する導入部と、
   前記ハウジングに設けられ、前記流体を前記ハウジング内から導出させる導出部と、を備え、
   前記被播種部材には、前記流体が流通して前記細胞播種面を形成する流路が形成され、
   前記流路は、前記流体を導入する第１開口部を有し、
   前記導入部は、
   前記第１開口部に向かい合う入口側端壁部と、
   前記入口側端壁部を貫通する複数の入口流路と、
   前記複数の入口流路のそれぞれを開閉するために、前記複数の入口流路のそれぞれに対応して設けられる複数の入口バルブと、を有する、バイオリアクタ。
2. 請求項１記載のバイオリアクタであって、
   前記導出部は、
   複数の出口流路と、
   前記複数の出口流路のそれぞれを開閉するための複数の出口バルブと、を有する、バイオリアクタ。
3. 請求項２記載のバイオリアクタであって、
   前記被播種部材には、前記流路が複数形成され、
   複数の前記流路のそれぞれは、前記導出部側に向けて開口する第２開口部をさらに有する、バイオリアクタ。
4. 請求項３記載のバイオリアクタであって、
   前記被播種部材は、互いに積層された複数の板状部材を有し、
   前記複数の板状部材のそれぞれには、複数の前記流路の少なくとも１つが形成されている、バイオリアクタ。
5. 請求項４記載のバイオリアクタであって、
   前記複数の板状部材のそれぞれの表面には、前記導入部から前記導出部に向かう方向に沿って延在する複数の突起が前記複数の板状部材の積層方向に沿って突出し、
   前記複数の突起は、前記複数の板状部材を支持した状態で複数の前記流路を形成する、バイオリアクタ。
6. 請求項５記載のバイオリアクタであって、
   前記複数の突起は、前記複数の板状部材の積層方向と前記複数の突起の延在方向とに直交する方向に前記細胞播種面を挟むように並んでいる、
   バイオリアクタ。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のバイオリアクタと、
   前記導出部から導出された前記流体を前記導入部に循環させる循環流路と、
   前記流体を前記循環流路に導く流体導入部と、を備える、細胞培養システム。
8. 請求項７記載の細胞培養システムであって、
   前記循環流路に設けられて前記循環流路を流通する培地に酸素を供給するための酸素供給部を備える、細胞培養システム。
9. バイオリアクタを用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
   前記バイオリアクタは、
   細胞が播種される細胞播種面を有する被播種部材と、
   前記被播種部材を収容するハウジングと、
   前記ハウジングに設けられ、細胞含有液を前記ハウジング内に導入する導入部と、
   前記ハウジングに設けられ、細胞含有液を前記ハウジング内から導出する導出部と、を備え、
   前記被播種部材には、細胞含有液が流通して前記細胞播種面を形成する流路が形成され、
   前記流路は、細胞含有液を導入する第１開口部を有し、
   前記導入部は、
   前記第１開口部に向かい合う入口側端壁部と、
   前記入口側端壁部を貫通する複数の入口流路と、
   前記複数の入口流路のそれぞれを開閉するために、前記複数の入口流路のそれぞれに対応して設けられる複数の入口バルブと、を有し、
   前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に細胞含有液を導入して細胞を前記被播種部材に播種する播種工程を行う、細胞培養方法。
10. 請求項９記載の細胞培養方法であって、
    前記播種工程の後で、前記複数の入口流路から前記ハウジング内への細胞含有液の導入を停止させた状態で細胞を前記被播種部材に接着させる接着工程を行う、細胞培養方法。
11. 請求項１０記載の細胞培養方法であって、
    前記接着工程の後で、前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に培地を導入して前記被播種部材に播種された細胞を培養する培養工程を行う、細胞培養方法。
12. 請求項１１記載の細胞培養方法であって、
    前記培養工程の後で、前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に剥離液を導入する剥離液添加工程を行う、細胞培養方法。
13. 請求項１２記載の細胞培養方法であって、
    前記導出部は、複数の出口流路を有し、
    前記剥離液添加工程の後で、前記複数の出口流路から導出された剥離液を前記複数の入口流路に循環させながら前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に剥離液を導入して培養された細胞を前記被播種部材から剥離する剥離工程を行う、細胞培養方法。
14. 請求項１３記載の細胞培養方法であって、
    前記剥離工程の後で、前記複数の入口流路から選択的に前記ハウジング内に培地を導入することにより、前記被播種部材から剥離された細胞を前記導出部から導出させて回収する回収工程を行う、細胞培養方法。

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