JPWO2014199754A1 - ラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 - Google Patents
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Abstract
細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、細胞培養器具。
Description
本発明は、細胞培養器具に関するものであり、詳細にはインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具に関するものである。
ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞などのヒト多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。ヒト多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、これら幹細胞を安全かつ安定的に培養、増幅する培養技術の開発が必要である。特に、フィーダー細胞を使用せず、かつ異種動物由来の成分を含まない（ゼノフリー）条件下での安定した培養法の開発は、喫緊の課題となっている。
本発明者らは、初期胚の多能性幹細胞がラミニンα５β１γ１（ラミニン５１１）を主要成分とする基底膜を足場としていることに着目し、ヒトラミニン５１１の組換え蛋白質が、ヒトＥＳ細胞のフィーダーフリー培養基質として有用であることを世界に先駆けて報告した（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、ラミニン５１１はα６β１インテグリンに対して非常に高い親和性を持つこと、および、ラミニン５１１のＥ８フラグメント（ラミニン５１１Ｅ８）は、全長のラミニン５１１と同等のα６β１インテグリン結合活性を有することを報告した（非特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、従来困難であった多能性幹細胞の単一分散による継代培養がラミニン５１１Ｅ８上で可能であることを見出し、ヒトラミニン５１１Ｅ８がヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養基質として極めて有効であることを報告した（特許文献１、非特許文献３参照）。
ヒトラミニン５１１Ｅ８を基質として細胞を培養するには、培養器の表面にヒトラミニン５１１Ｅ８を予めコーティングしておく必要がある。ヒト多能性幹細胞を培養する場合は、０．２５〜２．０μｇ／ｃｍ２になるようにヒトラミニン５１１Ｅ８溶液を培養器に加え、４℃で一夜または室温〜３７℃で１〜３時間インキュベートすることによりコーティングを行う。しかし、培養器の表面にコーティングされたラミニンやその活性フラグメントは乾燥により失活し易く（非特許文献４参照）、実際、本発明者らは、培養器表面にコーティングしたヒトラミニン５１１Ｅ８が、乾燥後徐々に活性を失うことを確認している。ヒトラミニン５１１Ｅ８をヒト多能性幹細胞の培養基質として再生医療等で広く利用するためには、培養器表面にコーティングしたヒトラミニン５１１Ｅ８の活性を乾燥状態で長期間安定に維持するための技術開発が求められている。
Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
Taniguchi Y, Ido H, Sanzen N, Hayashi M, Sato-Nishiuchi R, Futaki S, Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009.
Miyazaki T, Futaki S, Suemori H, Taniguchi Y, Yamada M, Kawasaki M, Hayashi M, Kumagai H, Nakatsuji N, Sekiguchi K, Kawase E. Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun. 3,1236. Doi:10.1038/ncomms2231, 2012.
Doi T, Thyboll J, Kortesmaa J, Jansson K, Iivanainen A, Parvardeh M, Timpl R, Hedin U, Swedenborg j, Tryggvason K. Recombinant human laminin-10 (α5β1γ1). J Biol Chem, 277, 12741-12748, 2002.
本発明は、ヒト幹細胞のフィーダーフリー培養基質として利用可能なラミニンフラグメントの活性を乾燥状態で長期間安定に維持するための技術を見出し、ヒト幹細胞のフィーダーフリー培養基質として利用可能なラミニンフラグメントがその活性を維持したまま乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、以下の（１）、（２）または（３）であることを特徴とする細胞培養器具。
（１）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（２）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（３）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
［２］前記（１）において、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が０．７μｇ／ｃｍ２以上の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［３］前記（２）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その３倍以上の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［４］前記（３）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その２０倍以上の濃度のラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質がコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［５］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［６］インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがラミニンα２β１γ１のフラグメントであることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［７］ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［８］細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングした後、乾燥させることにより製造されることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養器具。
［９］細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具の製造方法であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、（Ａ）コーティングされる蛋白質を含むコーティング溶液を調製する工程、（Ｂ）細胞培養器具の細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングする工程、および（Ｃ）コーティングされた蛋白質を乾燥する工程を含むことを特徴とする製造方法。
［１０］哺乳動物細胞の培養方法であって、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養器具を用いることを特徴とする培養方法。
［１１］哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞もしくは体性幹細胞またはこれらの細胞から分化した細胞である前記［１０］に記載の培養方法。
［１２］ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、コラーゲンおよびラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントからなる群より選択される１種以上を有効成分とし、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤。
［１］細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、以下の（１）、（２）または（３）であることを特徴とする細胞培養器具。
（１）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（２）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（３）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
［２］前記（１）において、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が０．７μｇ／ｃｍ２以上の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［３］前記（２）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その３倍以上の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［４］前記（３）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その２０倍以上の濃度のラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質がコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［５］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［６］インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがラミニンα２β１γ１のフラグメントであることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［７］ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記［１］に記載の細胞培養器具。
［８］細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングした後、乾燥させることにより製造されることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養器具。
［９］細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具の製造方法であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、（Ａ）コーティングされる蛋白質を含むコーティング溶液を調製する工程、（Ｂ）細胞培養器具の細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングする工程、および（Ｃ）コーティングされた蛋白質を乾燥する工程を含むことを特徴とする製造方法。
［１０］哺乳動物細胞の培養方法であって、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養器具を用いることを特徴とする培養方法。
［１１］哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞もしくは体性幹細胞またはこれらの細胞から分化した細胞である前記［１０］に記載の培養方法。
［１２］ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、コラーゲンおよびラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントからなる群より選択される１種以上を有効成分とし、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤。
［１３］コーティングされる蛋白質が、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみであり、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が０．７μｇ／ｃｍ２以上の濃度でコーティングされることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１４］コーティングされる蛋白質が、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントであり、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その３倍以上の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがコーティングされることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１５］コーティングされる蛋白質が、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質であり、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その２０倍以上の濃度のラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質がコーティングされることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１６］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１７］インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがラミニンα２β１γ１のフラグメントであることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１８］ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１９］インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであることを特徴とする前記［１２］に記載の活性低下抑制剤。
［２０］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［１２］または［１９］に記載の活性低下抑制剤。
［１４］コーティングされる蛋白質が、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントであり、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その３倍以上の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがコーティングされることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１５］コーティングされる蛋白質が、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質であり、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その２０倍以上の濃度のラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質がコーティングされることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１６］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１７］インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがラミニンα２β１γ１のフラグメントであることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１８］ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする前記［９］に記載の製造方法。
［１９］インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであることを特徴とする前記［１２］に記載の活性低下抑制剤。
［２０］ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする前記［１２］または［１９］に記載の活性低下抑制剤。
以下、ラミニンα５β１γ１を「ラミニン５１１」、ラミニンα５β２γ１を「ラミニン５２１」、ラミニンα２β１γ１を「ラミニン２１１」と記す。他のラミニンも同様に略記する。ラミニンＥ８フラグメントを「ラミニンＥ８」と記し、Ｅ８フラグメントを単に「Ｅ８」と記す。
本発明によれば、ヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養基質として利用可能なインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具およびその製造方法ならびに当該細胞培養器具を用いる哺乳動物細胞の培養方法を提供することができる。また、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントの乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤を提供することができる。本発明の細胞培養器具は、製造後長期の保存が可能であり、長期保存後においても幹細胞をフィーダーフリー環境下で良好に培養することができる。
〔細胞培養器具〕
本発明は、細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具を提供する。細胞培養器具は動物細胞の培養に使用できるものであれば特に限定されないが、哺乳動物細胞の培養に使用できるものが好ましく、哺乳動物の幹細胞の培養に使用できるものがより好ましく、ヒトの幹細胞の培養に使用できるものがさらに好ましく、ヒト多能性幹細胞の培養に使用できるものが特に好ましい。具体的には、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。
本発明は、細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具を提供する。細胞培養器具は動物細胞の培養に使用できるものであれば特に限定されないが、哺乳動物細胞の培養に使用できるものが好ましく、哺乳動物の幹細胞の培養に使用できるものがより好ましく、ヒトの幹細胞の培養に使用できるものがさらに好ましく、ヒト多能性幹細胞の培養に使用できるものが特に好ましい。具体的には、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。
ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子である。α鎖はα１〜α５の５種類、β鎖はβ１〜β３の３種類、γ鎖はγ１〜γ３の３種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも１２種類以上のアイソフォームが存在する。本発明に用いられるラミニンは、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンであればよいが、中でもラミニン５１１およびラミニン５２１から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
本発明に用いられるラミニンは、インテグリンα６β１結合活性を有するフラグメントまたはその改変体であることが好ましい。ラミニンフラグメントは、インテグリンα６β１結合活性を失活しない限り、α鎖、β鎖およびγ鎖の少なくとも１つ以上が全長より短いフラグメントからなるラミニンフラグメントであればよい。好ましくはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントである。ラミニンフラグメントがヘテロ３量体を形成していることは、ラミニンフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。ラミニンフラグメントがインテグリンα６β１結合活性を有していることは、固相結合アッセイ等により確認することができる。
ヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントの中でも、インテグリン結合活性の強さ、組換えタンパク質としての発現効率等の観点からラミニンＥ８が好ましい。ラミニンＥ８は、マウスラミニンα１β１γ１（以下「マウスラミニン１１１」と記す）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal
survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８に相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してＥ８を分離、同定した報告はない。したがって、本発明に用いられるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１のＥ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
本発明に用いられるインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントは、ヘテロ３量体を形成しているラミニン５１１のフラグメントおよび／またはヘテロ３量体を形成しているラミニン５２１のフラグメントであることが好ましく、ラミニン５１１Ｅ８および／またはラミニン５２１Ｅ８であることが好ましい。
survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８に相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してＥ８を分離、同定した報告はない。したがって、本発明に用いられるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１のＥ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
本発明に用いられるインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントは、ヘテロ３量体を形成しているラミニン５１１のフラグメントおよび／またはヘテロ３量体を形成しているラミニン５２１のフラグメントであることが好ましく、ラミニン５１１Ｅ８および／またはラミニン５２１Ｅ８であることが好ましい。
ラミニンの由来は特に限定されず、各種生物由来のラミニンを用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のラミニンである。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のラミニンを用いることが特に好ましい。ヒトの再生医療材料を得るためにヒト幹細胞を培養する場合には、培養系から異種生物由来の成分を排除するゼノフリー条件を満たす培養環境が求められることから、ヒト由来のラミニンを用いることが好ましい。
ラミニンは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持したまま、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンフラグメントの製造方法は特に限定されず、例えば、全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。なお、全長ラミニンは、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などにより製造することができる。
組換え全長ラミニン、組換えラミニンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いることにより製造することができる。組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントの製造方法としては、例えば、α鎖、β鎖およびγ鎖の各全長タンパク質または部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。組換えラミニン（全長）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada,Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954,
2004.）の方法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。組換えラミニンＥ８の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
2004.）の方法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。組換えラミニンＥ８の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）の方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
主要な哺乳動物のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１に、ヒトを含む主な哺乳動物について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。これら以外の各種生物由来のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
ラミニンＥ８は、α鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４および５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」と記す）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」と記す）およびγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」と記す）が３量体を形成したフラグメントであり、３量体の分子量は約１５０〜約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０〜約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０〜約２５０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８のＣ末端部から３番目のグルタミン酸残基はラミニンＥ８の細胞接着活性に必須である（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）。
本発明に用いられるラミニンフラグメントの改変体としては、例えば、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントに細胞接着分子または増殖因子結合分子が結合している改変ラミニンが挙げられる（国際公開公報第２０１２／１３７９７０号参照）。細胞接着分子としては、例えば、インテグリンと結合する細胞接着分子（フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、オステオポンティン、ＭＡＥＧ、テネイシン、ＳＶＥＰ１、ＴＧＦ−β１ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＧＦ−β３ ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅなど）、膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ネフロネクチン、ラミニンなど）、ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子、ジストログリカンと結合する細胞接着分子（ラミニンなど）、細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎなど）が好ましい。
増殖因子結合分子としては、例えば、パールカン、アグリン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、シンデカン１〜４、グリピカン１〜６などのヘパラン硫酸プロテオグリカン、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１〜４などが好ましい。
増殖因子結合分子としては、例えば、パールカン、アグリン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、シンデカン１〜４、グリピカン１〜６などのヘパラン硫酸プロテオグリカン、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ−β ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１〜４などが好ましい。
ラミニンフラグメントの改変体は、公知の遺伝子組換え技術を用いることにより組み換えタンパク質として製造することができる。公知の細胞接着分子および増殖因子結合分子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
本発明の細胞培養器具は、以下の（１）、（２）、（３）のいずれかであればよい。
（１）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（２）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（３）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
すなわち、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体（以下、「α６β１活性フラグメント等」と記す）が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具は、上記（１）、（２）または（３）の形態で提供されることにより、製造後長期の保存が可能となり、長期保存後においてもインテグリンα６β１依存的な細胞接着と、それに続く細胞増殖を低下させることなく、ヒト幹細胞をフィーダーフリー環境下で良好に培養できる。
（１）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（２）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（３）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
すなわち、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体（以下、「α６β１活性フラグメント等」と記す）が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具は、上記（１）、（２）または（３）の形態で提供されることにより、製造後長期の保存が可能となり、長期保存後においてもインテグリンα６β１依存的な細胞接着と、それに続く細胞増殖を低下させることなく、ヒト幹細胞をフィーダーフリー環境下で良好に培養できる。
上記（１）の細胞培養器具において、インテグリンα６β１結合活性を有するα６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等をコーティング後乾燥させた場合のインテグリンα６β１結合活性が、同じ濃度のα６β１活性フラグメント等が乾燥していない状態でコーティングされている場合のインテグリンα６β１結合活性に対して、６０％以上となる濃度が好ましく、７０％以上となる濃度がより好ましく、８０％以上となる濃度がさらに好ましく、９０％以上となる濃度がさらに好ましく、９５％以上となる濃度が特に好ましい。インテグリンα６β１結合活性の比較は、例えば後述する実施例２に記載の方法で行うことができる。具体的には、適当な濃度に調製したα６β１活性フラグメント等の溶液を９６ウェルマイクロプレートに添加して４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで洗浄した後室温で１時間乾燥したプレートと、ＰＢＳで洗浄した後乾燥していないプレートに、それぞれインテグリンα６β１を添加して３時間反応させた後の結合量を測定することにより行うことができる。
上記（１）の細胞培養器具において、ラミニンＥ８が０．７μｇ／ｃｍ２以上の濃度でコーティングされていれば、通常実施例２に記載の方法で活性を測定したときに、ラミニンＥ８が乾燥していない状態でコーティングされている場合の６０％以上の活性となる。α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は、０．７μｇ／ｃｍ２以上であればよく、好ましくは１．０μｇ／ｃｍ２以上、より好ましくは１．２μｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは１．４μｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは１．５μｇ／ｃｍ２以上である。上限は特に限定されないが、製造コストおよび効果の点で高濃度を用いる利益はなく、好ましくは５．０μｇ／ｃｍ２以下である。
上記（２）の細胞培養器具において、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等をコーティングし、室温で１時間乾燥させた後、密封して４℃で８週間保存したときに、インテグリンα６β１結合活性またはヒトｉＰＳ細胞の増殖活性が低下する濃度であることが好ましい。活性の低下の程度は、α６β１活性フラグメント等が乾燥していない状態でコーティングされている場合と比較して７０％以下が好ましく、６０％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましい。α６β１活性フラグメント等と同時にコーティングするインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメント（以下、「他のラミニンフラグメント」と記す）のコーティング濃度は、ラミニンフラグメントと同時にコーティングすることにより、α６β１活性フラグメント等が乾燥していない状態でコーティングされている場合のインテグリンα６β１結合活性またはヒトｉＰＳ細胞の増殖活性に対して、６０％以上の活性が維持できる濃度が好ましく、７０％以上の活性が維持できる濃度がより好ましく、８０％以上の活性が維持できる濃度がさらに好ましく、９０％以上の活性が維持できる濃度がさらに好ましく、９５％以上の活性が維持できる濃度が特に好ましい。
上記（２）の細胞培養器具において、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は上記の条件を満たす濃度であればよく、特に限定されない。α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は１．５μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、より好ましくは１．３μｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．０μｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは０．７μｇ／ｃｍ２以下である。下限は、０．２μｇ／ｃｍ２以上が好ましい。すなわち、０．２〜１．５μｇ／ｃｍ２が好ましく、０．２〜１．３μｇ／ｃｍ２がより好ましく、０．２〜１．０μｇ／ｃｍ２がさらに好ましく、０．２〜０．７μｇ／ｃｍ２がさらに好ましい。
他のラミニンフラグメントは、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントであれば特に限定されないが、好ましくはヘテロ３量体を形成しているラミニンフラグメントであり、より好ましくはラミニンＥ８である。なかでも、ラミニン２１１のフラグメントが好ましく、ヘテロ３量体を形成しているラミニン２１１フラグメントがより好ましく、ラミニン２１１Ｅ８がさらに好ましい。他のラミニンフラグメントは一種のみを用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。他のラミニンフラグメントのコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度の３倍以上であればよく、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上である。上限は特に限定されず、例えば３００倍以下とすることができる。ラミニンフラグメントまたはその改変体のコーティング濃度が低いほど、他のラミニンフラグメントのコーティング濃度を高くすることが好ましい。
上記（３）の細胞培養器具において、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等をコーティングし、室温で１時間乾燥させた後、密封して４℃で８週間保存した時に、インテグリンα６β１結合活性またはヒトｉＰＳ細胞の増殖活性が低下する濃度であることが好ましい。活性の低下の程度は、α６β１活性フラグメント等が乾燥していない状態でコーティングされている場合と比較して７０％以下が好ましく、６０％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましい。ラミニンフラグメントと同時にコーティングするラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質（以下、「他の蛋白質」と記す）のコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等と同時にコーティングすることにより、ラミニンフラグメントが乾燥していない状態でコーティングされている場合のインテグリンα６β１結合活性またはヒトｉＰＳ細胞の増殖活性に対して、６０％以上の活性が維持できる濃度が好ましく、７０％以上の活性が維持できる濃度がより好ましく、８０％以上の活性が維持できる濃度がさらに好ましく、９０％以上の活性が維持できる濃度がさらに好ましく、９５％以上の活性が維持できる濃度が特に好ましい。
上記（３）の細胞培養器具において、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は上記の条件を満たす濃度であればよく、特に限定されない。α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度は１．５μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、より好ましくは１．３μｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．０μｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは０．７μｇ／ｃｍ２以下である。下限は、０．２μｇ／ｃｍ２以上が好ましい。すなわち、０．２〜１．５μｇ／ｃｍ２が好ましく、０．２〜１．３μｇ／ｃｍ２がより好ましく、０．２〜１．０μｇ／ｃｍ２がさらに好ましく、０．２〜０．７μｇ／ｃｍ２がさらに好ましい。
他の蛋白質は特に限定されず、どのような蛋白質でもインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントの乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制することができる。好ましくは水溶性蛋白質である。また、他の蛋白質の分子量は特に限定されないが、分子量が１００００以上であることが好ましい。他の蛋白質の分子量は１５０００以上であることがより好ましく、２００００以上であることがさらに好ましく、３００００以上であることがさらに好ましく、４００００以上であることがさらに好ましく、６００００以上であることがさらに好ましい。
他の蛋白質として、具体的には、例えば、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、セリシン、コラーゲンなどが挙げられる。好ましくはゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはコラーゲンであり、より好ましくはゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたはトランスフェリンであり、さらに好ましくはゼラチンまたはヒト血清アルブミンである。他の蛋白質は一種のみを用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。他の蛋白質のコーティング濃度は、α６β１活性フラグメント等のコーティング濃度の２０倍以上であればよく、好ましくは１００倍以上、より好ましくは５００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上である。上限は特に限定されず、例えば５０００倍以下とすることができる。
ゼラチンを用いる場合、細胞培養用途に使用される公知のゼラチンを好適に用いることができる。本発明の細胞培養器具を再生医療用の細胞培養に用いる場合は、医療用途の安全性が確認されているゼラチンを用いることが好ましい。医療用途の安全性が確認されているゼラチンとして、ニッピハイグレードゼラチン（ニッピ）、メディゼラチン（ニッピ）などが挙げられる。
〔活性低下抑制剤〕
上記他のラミニンフラグメントおよび他の蛋白質は、いずれもα６β１活性フラグメント等の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤の有効成分として有用である。したがって、本発明は、α６β１活性フラグメント等の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤を提供する。α６β１活性フラグメント等としては、ラミニン５１１またはラミニン５２１のインテグリンα６β１結合活性を有するフラグメントが好ましく、ラミニン５１１Ｅ８またはラミニン５２１Ｅ８がさらに好ましい。本発明の活性低下抑制剤の有効成分は、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、コラーゲンおよびラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。本発明の活性低下抑制剤は、本発明の培養器具を用いて細胞を培養する際に、培養細胞のインテグリンα６β１依存的な細胞接着と、それに続く細胞増殖の低下を抑制することができる。
上記他のラミニンフラグメントおよび他の蛋白質は、いずれもα６β１活性フラグメント等の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤の有効成分として有用である。したがって、本発明は、α６β１活性フラグメント等の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤を提供する。α６β１活性フラグメント等としては、ラミニン５１１またはラミニン５２１のインテグリンα６β１結合活性を有するフラグメントが好ましく、ラミニン５１１Ｅ８またはラミニン５２１Ｅ８がさらに好ましい。本発明の活性低下抑制剤の有効成分は、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、コラーゲンおよびラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。本発明の活性低下抑制剤は、本発明の培養器具を用いて細胞を培養する際に、培養細胞のインテグリンα６β１依存的な細胞接着と、それに続く細胞増殖の低下を抑制することができる。
〔細胞培養器具の製造方法〕
本発明の細胞培養器具は、以下の製造方法により製造することができる。
（Ａ）コーティング溶液を調製する工程
コーティング溶液は、コーティングされる蛋白質を含む溶液である。コーティング溶液は、一種の蛋白質を含むものでもよく、二種以上の蛋白質を含むものでもよい。複数の蛋白質をコーティングする場合、作業の効率化と簡便性の点で、コーティングするすべての蛋白質を含むコーティング溶液を調製することが好ましい。コーティング溶液に含まれる蛋白質の濃度は、培養器具の細胞と接触する表面におけるコーティング濃度を考慮して、目的のコーティング濃度になるように適宜設定すればよい。コーティング溶液に用いることができる溶媒は、蛋白質の活性を低下させない溶媒であれば特に限定されないが、水性溶媒が好ましい。一般に蛋白質の溶媒として用いられる中性の緩衝液を好適に用いることができる。具体的には、リン酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid］］などでｐＨを中性付近に合わせた生理食塩液などが挙げられる。コーティング溶液は、ろ過滅菌等の滅菌処理を行うことが好ましい。
本発明の細胞培養器具は、以下の製造方法により製造することができる。
（Ａ）コーティング溶液を調製する工程
コーティング溶液は、コーティングされる蛋白質を含む溶液である。コーティング溶液は、一種の蛋白質を含むものでもよく、二種以上の蛋白質を含むものでもよい。複数の蛋白質をコーティングする場合、作業の効率化と簡便性の点で、コーティングするすべての蛋白質を含むコーティング溶液を調製することが好ましい。コーティング溶液に含まれる蛋白質の濃度は、培養器具の細胞と接触する表面におけるコーティング濃度を考慮して、目的のコーティング濃度になるように適宜設定すればよい。コーティング溶液に用いることができる溶媒は、蛋白質の活性を低下させない溶媒であれば特に限定されないが、水性溶媒が好ましい。一般に蛋白質の溶媒として用いられる中性の緩衝液を好適に用いることができる。具体的には、リン酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid］］などでｐＨを中性付近に合わせた生理食塩液などが挙げられる。コーティング溶液は、ろ過滅菌等の滅菌処理を行うことが好ましい。
上記（１）の細胞培養器具を製造する場合、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントを含むコーティング溶液を調製すればよい。
上記（２）の細胞培養器具を製造する場合、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントを含むコーティング溶液と、他のラミニンフラグメントを含むコーティング溶液を別々に調製してもよく、両者を含むコーティング溶液を調製してもよい。コーティングされる全蛋白質が含まれるコーティング溶液を調製することが好ましい。
上記（３）の細胞培養器具を製造する場合、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントを含むコーティング溶液と、他の蛋白質を含むコーティング溶液を別々に調製してもよく、両者を含むコーティング溶液を調製してもよい。コーティングされる全蛋白質が含まれるコーティング溶液を調製することが好ましい。
上記（２）の細胞培養器具を製造する場合、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントを含むコーティング溶液と、他のラミニンフラグメントを含むコーティング溶液を別々に調製してもよく、両者を含むコーティング溶液を調製してもよい。コーティングされる全蛋白質が含まれるコーティング溶液を調製することが好ましい。
上記（３）の細胞培養器具を製造する場合、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントを含むコーティング溶液と、他の蛋白質を含むコーティング溶液を別々に調製してもよく、両者を含むコーティング溶液を調製してもよい。コーティングされる全蛋白質が含まれるコーティング溶液を調製することが好ましい。
（Ｂ）細胞培養器具の細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングする工程
細胞培養器具のコーティングしようとする表面に、コーティング溶液を接触させ、一定時間静置または緩やかに振盪することにより、コーティング溶液に含まれる蛋白質をコーティングすることができる。細胞培養容器の底面をコーティングする場合は、コーティング溶液を容器内に添加すればよい。シート状または膜状の細胞培養器具の表面をコーティングする場合は、コーティングする領域にコーティング溶液を重層すればよい。複数のコーティング溶液を用いる場合は、複数のコーティング溶液を順次添加または重層することにより、所望の全蛋白質をコーティングすることができる。ここで、「所望の全蛋白質をコーティングする」とは、コーティングされる蛋白質が２種以上である場合に、１種目の蛋白質のコーティング終了後に２種目の蛋白質をコーティングするのではなく、２種以上の全蛋白質を同時にコーティングすることを意味する。コーティング条件は特に限定されないが、４℃で約２〜１８時間、または室温〜３７℃で約０．５〜６時間行えばよい。所定時間経過後、添加または重層したコーティング溶液を除去する。コーティング溶液除去後、コーティングされた表面を洗浄することが好ましい。洗浄液は特に限定されないが、ＰＢＳ等の緩衝生理食塩液を用いることが好ましい。本工程は、クリーンルーム内、クリーンベンチ内などの無菌環境下で行うことが好ましい。
細胞培養器具のコーティングしようとする表面に、コーティング溶液を接触させ、一定時間静置または緩やかに振盪することにより、コーティング溶液に含まれる蛋白質をコーティングすることができる。細胞培養容器の底面をコーティングする場合は、コーティング溶液を容器内に添加すればよい。シート状または膜状の細胞培養器具の表面をコーティングする場合は、コーティングする領域にコーティング溶液を重層すればよい。複数のコーティング溶液を用いる場合は、複数のコーティング溶液を順次添加または重層することにより、所望の全蛋白質をコーティングすることができる。ここで、「所望の全蛋白質をコーティングする」とは、コーティングされる蛋白質が２種以上である場合に、１種目の蛋白質のコーティング終了後に２種目の蛋白質をコーティングするのではなく、２種以上の全蛋白質を同時にコーティングすることを意味する。コーティング条件は特に限定されないが、４℃で約２〜１８時間、または室温〜３７℃で約０．５〜６時間行えばよい。所定時間経過後、添加または重層したコーティング溶液を除去する。コーティング溶液除去後、コーティングされた表面を洗浄することが好ましい。洗浄液は特に限定されないが、ＰＢＳ等の緩衝生理食塩液を用いることが好ましい。本工程は、クリーンルーム内、クリーンベンチ内などの無菌環境下で行うことが好ましい。
（Ｃ）コーティングされた蛋白質を乾燥する工程
乾燥方法は特に限定されず、自然乾燥、減圧乾燥等の周知の方法を用いることができる。乾燥温度は、コーティングされた蛋白質が変性または失活しない温度であればよく、室温で好適に行うことができる。通常約２℃〜約４０℃の範囲であればよく、好ましくは約４℃〜約３７℃、より好ましくは約１０℃〜約３０℃、さらに好ましくは約１５℃〜約２５℃である。乾燥時間は特に限定されず、目視により液体の残存がなく、コーティングの表面が乾燥していることを確認できた時点で乾燥を終了することができる。細胞培養器具の形状、コーティング溶液の組成、乾燥方法、乾燥温度等の条件に応じて、予め最適な乾燥時間を設定することが好ましい。本工程は、クリーンルーム内、クリーンベンチ内などの無菌環境下で行うことが好ましい。
乾燥方法は特に限定されず、自然乾燥、減圧乾燥等の周知の方法を用いることができる。乾燥温度は、コーティングされた蛋白質が変性または失活しない温度であればよく、室温で好適に行うことができる。通常約２℃〜約４０℃の範囲であればよく、好ましくは約４℃〜約３７℃、より好ましくは約１０℃〜約３０℃、さらに好ましくは約１５℃〜約２５℃である。乾燥時間は特に限定されず、目視により液体の残存がなく、コーティングの表面が乾燥していることを確認できた時点で乾燥を終了することができる。細胞培養器具の形状、コーティング溶液の組成、乾燥方法、乾燥温度等の条件に応じて、予め最適な乾燥時間を設定することが好ましい。本工程は、クリーンルーム内、クリーンベンチ内などの無菌環境下で行うことが好ましい。
コーティングされた蛋白質を乾燥する工程の後に、乾燥した蛋白質を滅菌する工程を設けてもよい。滅菌方法としては、ガンマー線滅菌、電子線滅菌、エックス線滅菌などの放射線滅菌、紫外線滅菌などが好ましく用いられる。蛋白質を変性させる恐れがある滅菌法、例えばエチレンオキサイドガス滅菌などの化学的滅菌や、高熱をかける高圧蒸気滅菌などは用いないほうがよい。滅菌工程を設けることにより、本発明の細胞培養器具の製造を厳密な無菌条件下で行う必要がなくなり、製造コストを抑制することができる。
このようにして製造された細胞培養器具は、密封包装することにより長期間安定に保存することができる。保存温度は室温以下であることが好ましく、より低温（例えば、約４℃）で保存することが好ましい。本発明者らは、コーティング蛋白質を乾燥後、密封包装して４℃で保存した細胞培養器具は、少なくとも２０週間経過後においても良好なインテグリンα６β１結合活性を有し、ヒトｉＰＳ細胞が良好に増殖したことを確認している。
〔哺乳動物細胞の培養方法〕
本発明は、上記本発明の細胞培養器具を用いて哺乳動物細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の細胞培養器具を用いることにより、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養することが可能となる。また、本発明の細胞培養器具を用いることにより、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散して培養することが可能となる。
本発明は、上記本発明の細胞培養器具を用いて哺乳動物細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の細胞培養器具を用いることにより、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養することが可能となる。また、本発明の細胞培養器具を用いることにより、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散して培養することが可能となる。
本発明の培養方法は、どのような哺乳動物細胞の培養にも適用できるが、幹細胞の培養に適用することが好ましい。幹細胞は、自己複製能と多分化能を持った細胞を意味し、体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。より好ましくは多能性幹細胞であり、さらに好ましくはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞である。また、本発明の培養方法は、上記幹細胞から分化した細胞の培養にも好適に用いることができる。幹細胞から分化した細胞には幹細胞を分化誘導した各種細胞が含まれる。すなわち、本発明の培養方法は、幹細胞から最終分化細胞に至る過程における種々の分化段階の細胞の培養に好適に用いることができる。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。すなわち、本発明の培養方法は、ヒト幹細胞およびヒト幹細胞から分化した細胞の培養に用いることが好ましい。また、本発明の培養方法を用いてヒト幹細胞またはヒト幹細胞から分化した細胞の培養を行う場合には、ヒト由来の改変ラミニンを用いることが好ましい。
本発明の培養方法で哺乳動物細胞を培養する際に使用する培地は特に限定されず、培養対象の細胞に応じて、推奨される公知の培地を用いることができる。また、具体的な培養手順は特に限定されず、培養対象の細胞に応じて、推奨される公知の培養手順に従い培養することが好ましい。
ヒト幹細胞を医療で利用するためには、細胞の培養法を標準化し、医療の現場で誰でもヒト幹細胞を培養できるようにする必要がある。そのためには、細胞培養法をできる限りルーチン化する必要があり、細胞培養器具についてもインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントが予めコーティングされたものが製品化され、利用できることが望ましい。本発明により、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメント（例えば、ラミニン５１１Ｅ８またはラミニン５２１Ｅ８）を至適濃度でコーティングした細胞培養器具を長期間安定に保存することが可能となるため、予めインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントがコーティングされた細胞培養器具の製品化が可能となる。このようなコーティング済みの培養器具を利用することにより、細胞培養操作を効率的に行えるだけでなく、コーティングの際の個人誤差を排除することができ、ヒト幹細胞を用いる医療の普及に大きく貢献することが期待される。
発明者らは、細胞培養器具の表面にコーティングしたラミニンフラグメントの活性を乾燥状態で長期間安定に維持するための技術開発を進める過程で、大過剰のゼラチン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等を同時にコーティングすることにより、ラミニンフラグメントの乾燥による活性低下が抑制され、乾燥していない場合と同等の活性が維持できることを見出した。常識的には、大過剰のゼラチン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等を同時にコーティングすれば、これらがラミニンフラグメントの培養器具への吸着を拮抗的に阻害し、結果としてラミニンフラグメントのコーティングが著しく損なわれると考えられる。しかし実際には、大過剰のゼラチン等の共存下でラミニンフラグメントをコーティングしても該ラミニンフラグメントのコーティング量および活性はほとんど影響をうけなかった。その理由は不明であるが、従来の技術常識に照らせば、全く予想外の結果であるといえる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８の作製〕
ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８（以下、「５１１Ｅ８」と記す）は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the
third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）に記載の方法に従い、以下のように作製した。
ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８（以下、「５１１Ｅ８」と記す）は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the
third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）に記載の方法に従い、以下のように作製した。
最初に、クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Stratagene社）を鋳型として、以下の３種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグをコードするＤＮＡ、またはＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡが挿入された３種類のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）をそれぞれ作製した。
(i) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（reverse、配列番号２）
(ii) ＨＡタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号３）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(iii) ＦＬＡＧタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号５）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(i) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（reverse、配列番号２）
(ii) ＨＡタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号３）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(iii) ＦＬＡＧタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号５）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
次に、α５鎖、β１鎖、γ１鎖の全長塩基配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004.）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、各鎖のα５（Ａｌａ2534−Ａｌａ3327）、β１（Ｌｅｕ1561−Ｌｅｕ1786）、γ１（Ａｓｎ1362−Ｐｒｏ1608）に相当する領域を増幅した。
(iv) α５鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（forward、配列番号６）
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’（reverse、配列番号７）
(v) β１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（forward、配列番号８）
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（reverse、配列番号９）
(vi) γ１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（forward、配列番号１０）
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（reverse、配列番号１１）
(iv) α５鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（forward、配列番号６）
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’（reverse、配列番号７）
(v) β１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（forward、配列番号８）
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（reverse、配列番号９）
(vi) γ１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（forward、配列番号１０）
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（reverse、配列番号１１）
増幅したｃＤＮＡを、タグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶ部位に挿入した後、５’側のタグをコードする配列を含めて増幅したｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（インビトロジェン）の当該部位に挿入し、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
５１１Ｅ８の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社より購入）に導入して行った。３００ｍｌの２９３Ｆ細胞（１．０×１０ ６個／ｍｌ）にトランスフェクション試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（商品名、インビトロジェン）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、インビトロジェン）を用いて各鎖発現ベクターを１８０μｇずつ同時にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培養液は１０００×ｇで１０分間遠心し、その上清をさらに１５，０００×ｇで３０分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清に５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン）を添加し一晩インキュベートして目的タンパク質を吸着させた。Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅを回収し、ＴＢＳ（−）（Ｃａ、Ｍｇを含まないトリス緩衝生理的食塩水）および１０ｍＭイミダゾ−ル／ＴＢＳ（−）で洗浄したのち２００ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（−）で溶出した。溶出画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により確認し、５１１Ｅ８が溶出された画分に２ｍｌのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（シグマ）を添加し、４℃で一晩旋回させた。ゲルをエコノカラムに移し１ｍＭ ＰＭＳＦを含むＴＢＳ（−）で洗浄後、１００μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（シグマ）を含むＴＢＳ（−）で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、５１１Ｅ８の溶出された画分を合わせてＴＢＳ（−）に対して透析を行った。
〔ヒト組換えラミニン５２１Ｅ８の作製〕
ヒト組換えラミニン５２１Ｅ８（以下、「５２１Ｅ８」と記す）は、上記ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８の作製方法に準じて作製した。すなわち、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の各発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収し、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメントの発現ベクターはＴａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）に記載の方法に従い、調製した。
ヒト組換えラミニン５２１Ｅ８（以下、「５２１Ｅ８」と記す）は、上記ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８の作製方法に準じて作製した。すなわち、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の各発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収し、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメントの発現ベクターはＴａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）に記載の方法に従い、調製した。
〔パールカンのヘパラン硫酸鎖結合ドメインを付加したラミニン５１１Ｅ８の作製〕
ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８のＮ末端部にヘパラン硫酸鎖結合部位を含むヒトパールカンのドメインＩ〜ＩＩＩ（以下、「Ｐｌｎ−Ｄ１／２／３」と記す）を融合させたラミニン改変体（以下、「Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８」と記す）、およびヒト組換えラミニン５１１Ｅ８のＣ末端部にヒトパールカンのドメインＩ（以下、「Ｐｌｎ−Ｄ１」と記す）を融合させたラミニン改変体（以下、「Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８」と記す）を作製した。
ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８のＮ末端部にヘパラン硫酸鎖結合部位を含むヒトパールカンのドメインＩ〜ＩＩＩ（以下、「Ｐｌｎ−Ｄ１／２／３」と記す）を融合させたラミニン改変体（以下、「Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８」と記す）、およびヒト組換えラミニン５１１Ｅ８のＣ末端部にヒトパールカンのドメインＩ（以下、「Ｐｌｎ−Ｄ１」と記す）を融合させたラミニン改変体（以下、「Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８」と記す）を作製した。
Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８の作製に用いるＰｌｎ−Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターは、国際公開公報第２０１２／１３７９７０号の記載に従い、５’側から順に、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド、Ｐｌｎ−Ｄ１／２／３、ＨＡタグ、β１鎖Ｅ８をそれぞれコードするＤＮＡ断片をつなぎ合わせて作製した。このＰｌｎ−Ｄ１／２／３融合ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）発現ベクターとヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）発現ベクターと混合してヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培地中に分泌されたＰｌｕｓ＃３ラミニンＥ８は、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８の作製に用いるＰｌｎ−Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターは、以下のようにして作製した。まず、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部分（Ｌｅｕ611−Ｐｒｏ813）とヒトラミニンα１鎖Ｇ３−Ｇ４ドメイン間リンカー配列（DAEDSKLLPEPRAFP、配列番号１２）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
(i) リンカー配列導入のための増幅用プライマー
5’-CCTCAAGCGGCTGAACACGACAGGCG-3’（forward、配列番号１３）
5’-ATATGGATCCTGGAAAAGCCCGGGGCTCTGGCAAGAGCTTGCTGTCCTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGG-3’
（reverse、配列番号１４、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｃＩ（この制限酵素の認識配列はヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列内に存在する）とＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ断片１とした。
(i) リンカー配列導入のための増幅用プライマー
5’-CCTCAAGCGGCTGAACACGACAGGCG-3’（forward、配列番号１３）
5’-ATATGGATCCTGGAAAAGCCCGGGGCTCTGGCAAGAGCTTGCTGTCCTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGG-3’
（reverse、配列番号１４、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｃＩ（この制限酵素の認識配列はヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部分をコードするＤＮＡ配列内に存在する）とＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡ断片１とした。
次に、ヒトパールカン発現ベクター（Shaoliang Li, Chisei Shimono, Naoko Norioka,
Itsuko Nakano, Tetsuo Okubo, Yoshiko Yagi, Maria Hayashi, Yuya Sato, Hitomi Fujisaki, Shunji Hattori, Nobuo Sugiura, Koji Kimata and Kiyotoshi Sekiguchi, “Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That Has Heparin/Heparan Sulfate
Binding Activity”, Journal of Biological Chemistry, 285(47), 36645-36655, 2010）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｌｎＤ１に相当する領域（Ｇｌｙ２５−Ｐｒｏ１９６）にＨｉｓタグをＣ末端に付加した配列をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
(ii) ＰｌｎＤ１配列増幅用プライマー
5’-ATATATATGGATCCGGGCTGAGGGCATACGATGGCTTGTCTCTG-3’
（forward、配列番号１５、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
5’-ATATATATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGTGGGAACTGGGGCACTGTGCCCAG-3’
（reverse、配列番号１６、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡ断片２とした。
ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを制限酵素ＡｓｃＩとＮｏｔＩで消化して得られたヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＮ末端部分（Ｍｅｔ1−Ａｓｐ610）を含む発現ベクター断片に、上記のＤＮＡ断片１および２を挿入し、Ｐｌｎ−Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを完成させた。
Itsuko Nakano, Tetsuo Okubo, Yoshiko Yagi, Maria Hayashi, Yuya Sato, Hitomi Fujisaki, Shunji Hattori, Nobuo Sugiura, Koji Kimata and Kiyotoshi Sekiguchi, “Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That Has Heparin/Heparan Sulfate
Binding Activity”, Journal of Biological Chemistry, 285(47), 36645-36655, 2010）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｌｎＤ１に相当する領域（Ｇｌｙ２５−Ｐｒｏ１９６）にＨｉｓタグをＣ末端に付加した配列をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
(ii) ＰｌｎＤ１配列増幅用プライマー
5’-ATATATATGGATCCGGGCTGAGGGCATACGATGGCTTGTCTCTG-3’
（forward、配列番号１５、制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列が含まれている）
5’-ATATATATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGTGGGAACTGGGGCACTGTGCCCAG-3’
（reverse、配列番号１６、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列が含まれている）
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡ断片２とした。
ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを制限酵素ＡｓｃＩとＮｏｔＩで消化して得られたヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメントのＮ末端部分（Ｍｅｔ1−Ａｓｐ610）を含む発現ベクター断片に、上記のＤＮＡ断片１および２を挿入し、Ｐｌｎ−Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを完成させた。
Ｐｌｎ−Ｄ１融合ヒトラミニンα５鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターを、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）発現ベクターおよびヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）発現ベクターと混合してヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収し、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
〔ヒト組換えラミニン２１１Ｅ８の作製〕
ヒト組換えラミニン２１１Ｅ８（以下、「２１１Ｅ８」と記す）は、上記ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８の作製方法に準じて作製した。すなわち、ヒトα２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の各発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトα２鎖Ｅ８フラグメントの発現ベクターはＴａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）に記載の方法に従い、調製した。
ヒト組換えラミニン２１１Ｅ８（以下、「２１１Ｅ８」と記す）は、上記ヒト組換えラミニン５１１Ｅ８の作製方法に準じて作製した。すなわち、ヒトα２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の各発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、ラミニン５１１Ｅ８と同様にＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトα２鎖Ｅ８フラグメントの発現ベクターはＴａｎｉｇｕｃｈｉらの方法（Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）に記載の方法に従い、調製した。
〔ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の培養方法〕
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手し（＃ＨＰＳ００６３）、推奨される培養方法に従って、マイトマイシンＣ処理により不活化したフィーダー細胞ＳＮＬ７６／７（ＥＣＡＣＣ ＃０７０３２８０１）上で４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、シグマ ＃Ｆ０２９１）を含む霊長類ＥＳ培養用培地（リプロセル ＃ＲＣＨＥＭＤ００１）を用いて維持培養した。評価試験のためには、維持培養している２０１Ｂ７細胞を、５１１Ｅ８をコーティングした６ウェルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４６）上に単一細胞に分散した状態で播種し、６〜８日無フィーダー細胞条件で培養後、使用した。
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手し（＃ＨＰＳ００６３）、推奨される培養方法に従って、マイトマイシンＣ処理により不活化したフィーダー細胞ＳＮＬ７６／７（ＥＣＡＣＣ ＃０７０３２８０１）上で４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、シグマ ＃Ｆ０２９１）を含む霊長類ＥＳ培養用培地（リプロセル ＃ＲＣＨＥＭＤ００１）を用いて維持培養した。評価試験のためには、維持培養している２０１Ｂ７細胞を、５１１Ｅ８をコーティングした６ウェルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４６）上に単一細胞に分散した状態で播種し、６〜８日無フィーダー細胞条件で培養後、使用した。
具体的には、フィーダー細胞上で維持培養した２０１Ｂ７細胞のコロニーから０．２５％トリプシン（ライフテクノロジーズ ＃１５０９０−０４６）／０．１ｍｇ／ｍＬタイプＩＶコラゲナーゼ（ライフテクノロジーズ ＃１７１０４−０１９）／２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替（ライフテクノロジーズ ＃１０８２８−０２８）／１μＭ ＣａＣｌ２溶液を用いてフィーダー細胞を除去した後、０．５×ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ ＃１２５６３−０１１）を加えて３７℃で４分間処理した。細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ライフテクノロジーズ ＃１００１０−０２３）で洗浄後、終濃度１０μＭ Ｙ２７６３２（メルクミリポア ＃６８８０００）を含むＴｅＳＲ２（ステムセル ＃０５８６０）とＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（バイオロジカルインダストリーズ ＃０５−１００−１）の１：１混合培地を加え、セルスクレーパーとピペッティングにより単一細胞に分散した。細胞数をカウントした後、５１１Ｅ８を０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングした６ウェルカルチャープレート上に細胞を１．３×１０４または２．６×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下でＹ２７６３２を含むＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地で培養した。播種後１、３日目および５日目以降の毎日、ＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地（Ｙ２７６３２不含）を交換し、６〜８日目において細胞が培養面積の８０％程度まで拡大した時点で実験に供した（フィーダー上での維持から５１１Ｅ８で一継代パッセージを経た細胞という意味で、以下、この細胞を５１１Ｅ８Ｐ１と呼ぶ）。
〔ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株の培養方法〕
ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株は、ＪＣＲＢ細胞バンクから入手し（＃ＪＣＲＢ１３３１）、推奨される培養方法に従って、マイトマイシンＣ処理により不活化した初代マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ、メルクミリポア ＃ＰＭＥＦ−Ｈ）フィーダー上で１０ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦを含むＴｉｃ維持用培地を用いて維持培養した。Ｔｉｃ維持用培地は、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替／非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ ＃１１１４０−０５０）／２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ ＃２５０３０−０８１）／０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ライフテクノロジーズ ＃２１９８５−０２３）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ライフテクノロジーズ ＃１２６６０−０１２）である。評価試験のためには、維持培養しているＴｉｃ細胞を、マトリゲルをコーティングした６ウェルカルチャープレート上に単一細胞に分散した状態で播種し、６〜８日無フィーダー細胞条件で培養後、使用した。
ヒトｉＰＳ細胞Ｔｉｃ株は、ＪＣＲＢ細胞バンクから入手し（＃ＪＣＲＢ１３３１）、推奨される培養方法に従って、マイトマイシンＣ処理により不活化した初代マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ、メルクミリポア ＃ＰＭＥＦ−Ｈ）フィーダー上で１０ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦを含むＴｉｃ維持用培地を用いて維持培養した。Ｔｉｃ維持用培地は、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清代替／非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ ＃１１１４０−０５０）／２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ ＃２５０３０−０８１）／０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ライフテクノロジーズ ＃２１９８５−０２３）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ライフテクノロジーズ ＃１２６６０−０１２）である。評価試験のためには、維持培養しているＴｉｃ細胞を、マトリゲルをコーティングした６ウェルカルチャープレート上に単一細胞に分散した状態で播種し、６〜８日無フィーダー細胞条件で培養後、使用した。
具体的には、フィーダー細胞上で維持培養したＴｉｃ細胞をディスパーゼＩＩ（ロシュアプライドサイエンス ＃４９４２０７８）を加えて３７℃で７分間処理後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ライフテクノロジーズ ＃１２６０５−０１０）を加え３７℃で４分間処理した。細胞は、終濃度１０μＭ Ｙ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１（ステムセル ＃０５８５０）を加え、セルスクレーパーとピペッティングにより単一細胞に分散した。細胞数をカウントした後、ヒトＥＳ細胞用マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン ＃３５４２７７）を３μｇ／ｃｍ２でコーティングした６ウェルカルチャープレート上に細胞を１．３×１０４または２．６×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下でＹ２７６３２を含むｍＴｅＳＲ１培地で培養した。播種後１、３日目および５日目以降の毎日ｍＴｅＳＲ１培地（Ｙ２７６３２不含）を交換し、６〜８日目において細胞が培養面積の８０％程度まで拡大した時点で実験に供した（フィーダー上での維持からマトリゲルコート上で一継代パッセージを経た細胞という意味で、以下、この細胞をＭＧＰ１と呼ぶ）。
〔実施例１：ヒトｉＰＳ細胞の増殖における５１１Ｅ８濃度依存性の確認〕
５１１Ｅ８をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ライフテクノロジーズ ＃１００１０−０２３）で０．５〜１６μｇ／ｍＬに希釈し、２４ウェルセルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４７、培養面積２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に終濃度が０．１２５〜４μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにウェルあたり５００μｌ加え、４℃で一晩（約１８時間）ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。コーティング後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地を加えて使用まで３７℃ ＣＯ２インキュベーター内で静置した。５１１Ｅ８Ｐ１の２０１Ｂ７細胞は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、０．５×ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加え３７℃で４分間処理し、１０μＭ Ｙ２７６３２を含むＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地中で単一細胞に分散した。細胞数をカウントした後、５１１Ｅ８をコーティングしてある２４ウェルカルチャープレート上に細胞を１．３×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下で培養した。播種後１、３、５、６日目にＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地（Ｙ２７６３２不含）を交換し、７日目にアルカリホスファターゼ染色により細胞の増殖と状態を評価した。アルカリホスファターゼ染色は白血球アルカリホスファターゼキット（シグマアルドリッチ ＃８６Ｒ−１ＫＴ）を用いて、添付の推奨プロトコールに従って行った。
５１１Ｅ８をＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ライフテクノロジーズ ＃１００１０−０２３）で０．５〜１６μｇ／ｍＬに希釈し、２４ウェルセルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４７、培養面積２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に終濃度が０．１２５〜４μｇ／ｃｍ２の範囲になるようにウェルあたり５００μｌ加え、４℃で一晩（約１８時間）ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。コーティング後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地を加えて使用まで３７℃ ＣＯ２インキュベーター内で静置した。５１１Ｅ８Ｐ１の２０１Ｂ７細胞は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、０．５×ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加え３７℃で４分間処理し、１０μＭ Ｙ２７６３２を含むＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地中で単一細胞に分散した。細胞数をカウントした後、５１１Ｅ８をコーティングしてある２４ウェルカルチャープレート上に細胞を１．３×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下で培養した。播種後１、３、５、６日目にＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地（Ｙ２７６３２不含）を交換し、７日目にアルカリホスファターゼ染色により細胞の増殖と状態を評価した。アルカリホスファターゼ染色は白血球アルカリホスファターゼキット（シグマアルドリッチ ＃８６Ｒ−１ＫＴ）を用いて、添付の推奨プロトコールに従って行った。
結果を図１に示した。図１に示す結果から、２０１Ｂ７細胞は０．１２５μｇ／ｃｍ２の低濃度５１１Ｅ８コートウェルでは十分に増殖できず、また２〜４μｇ／ｃｍ２のような高濃度でコートした場合にも、コロニーは形成されるものの十分に大きくならないことが明らかとなった。すなわち、２０１Ｂ７細胞の増殖には５１１Ｅ８を０．２５〜１μｇ／ｃｍ２の濃度でコートするのが適当であることが示された。また、アルカリホスファターゼ活性は未分化状態で活性が高く維持される未分化マーカーのひとつであり、すべての条件で増殖してきた細胞コロニーはアルカリホスファターゼ染色で陽性を示していたので、未分化状態が維持されていたものと考えられた。
〔実施例２：コーティング後の乾燥による５１１Ｅ８の活性低下〕
至適濃度（０．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした５１１Ｅ８が乾燥後に保存可能かどうか検証するために、コーティングしたプレートを１時間乾燥し、インテグリンの結合活性およびヒトｉＰＳ細胞の接着、増殖への影響を調べた。
プレートにコートした５１１Ｅ８に対するα６β１インテグリンの結合活性は、Ｉｄｏら（J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）に記載の方法に従って測定した。具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬに希釈した５１１Ｅ８を９６ウェルマイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０７２、培養面積０．３２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に終濃度０．５μｇ／ｃｍ２になるように８０μＬ加え、４℃で一晩（約１８時間）ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で１時間風乾した。乾燥していないプレートをコントロールとした。１０ｎＭ
α６β１インテグリンを１ｍＭ ＭｎＣｌ２存在下で３時間反応させた後の結合量を、４９０ｎｍでの発色基質の吸光度として測定した。
至適濃度（０．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした５１１Ｅ８が乾燥後に保存可能かどうか検証するために、コーティングしたプレートを１時間乾燥し、インテグリンの結合活性およびヒトｉＰＳ細胞の接着、増殖への影響を調べた。
プレートにコートした５１１Ｅ８に対するα６β１インテグリンの結合活性は、Ｉｄｏら（J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）に記載の方法に従って測定した。具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬに希釈した５１１Ｅ８を９６ウェルマイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０７２、培養面積０．３２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に終濃度０．５μｇ／ｃｍ２になるように８０μＬ加え、４℃で一晩（約１８時間）ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で１時間風乾した。乾燥していないプレートをコントロールとした。１０ｎＭ
α６β１インテグリンを１ｍＭ ＭｎＣｌ２存在下で３時間反応させた後の結合量を、４９０ｎｍでの発色基質の吸光度として測定した。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、０．５μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングされた５１１Ｅ８を１時間乾燥条件下にさらすことで、そのα６β１インテグリン結合活性は極端に低下することが明らかとなった。
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の５１１Ｅ８への接着は、α６インテグリンおよびβ１インテグリンに対する阻害抗体を同時に処理することで阻害される（Miyazaki et al. Nature Communications, 3:1236. doi:10.1038/ncomms2231, 2012）。プレートにコーティングされた５１１Ｅ８のα６β１インテグリン結合活性は乾燥によって低下するので、ヒトｉＰＳ細胞の接着や増殖にも影響がでることが予想される。この可能性を、実際に乾燥させた５１１Ｅ８プレートでヒトｉＰＳ細胞を培養することにより検証した。５１１Ｅ８を０．５μｇ／ｃｍ２の濃度で実施例１と同様に２４ウェルカルチャープレートにコーティングし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間風乾した。乾燥させていない５１１Ｅ８コーティングプレートをコントロールとした。５１１Ｅ８Ｐ１の２０１Ｂ７細胞およびＭＧＰ１のＴｉｃ細胞を実施例１と同様に単一細胞に分散させ、１．３×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種し、７日目にアルカリホスファターゼ染色で細胞の形態を観察した。
結果を図３に示した。（Ａ）は２０１Ｂ７細胞、（Ｂ）はＴｉｃ細胞の結果である。両細胞株とも５１１Ｅ８を乾燥させていないプレートでは増殖できたが、１時間乾燥したプレートでは十分に増殖できなかった。これは図２で示した乾燥によるα６β１インテグリン結合活性の低下によるものと考えられた。
〔実施例３：コーティング後の乾燥によるインテグリン結合活性低下の濃度依存性〕
図２で示した乾燥による５１１Ｅ８のインテグリン結合活性の低下が、どのようなコーティング濃度で起こるのかを検討した。実施例２と同様にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．２５〜１６μｇ／ｍＬに希釈した５１１Ｅ８を９６ウェルマイクロプレートに終濃度０．０６３〜２μｇ／ｃｍ２になるように８０μＬ加え、４℃で一晩コーティングを行った。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間風乾した。乾燥していないプレートをコントロールとした。実施例２と同様の方法で、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量を測定した。
図２で示した乾燥による５１１Ｅ８のインテグリン結合活性の低下が、どのようなコーティング濃度で起こるのかを検討した。実施例２と同様にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．２５〜１６μｇ／ｍＬに希釈した５１１Ｅ８を９６ウェルマイクロプレートに終濃度０．０６３〜２μｇ／ｃｍ２になるように８０μＬ加え、４℃で一晩コーティングを行った。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間風乾した。乾燥していないプレートをコントロールとした。実施例２と同様の方法で、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量を測定した。
結果を図４に示した。乾燥なしの場合のインテグリン結合量は０．５μｇ／ｃｍ２までコーティング濃度の増加に伴って上昇し、それ以上のコーティング濃度では同程度の結合が認められた。一方、乾燥させた場合０．５μｇ／ｃｍ２またはそれより低いコーティング濃度では図２に示した結果と同様に、インテグリン結合量は著しく低下したが、０．７５μｇ／ｃｍ２のコーティング濃度では乾燥なしの条件に比べて３０％程度しか結合量は低下せず、１μｇ／ｃｍ２以上のコーティング濃度では乾燥なしの条件に比べて同等またはそれ以上のインテグリン結合活性を示した。すなわち、プレートにコーティングされた５１１Ｅ８の乾燥に対する感受性はコーティング濃度に依存することが明らかとなった。
〔実施例４：活性低下抑制剤候補物質のスクリーニング〕
５１１Ｅ８をさまざまな物質と同時にコーティングし、乾燥条件下における５１１Ｅ８の活性低下を抑制できるかどうかを検証した。
活性低下抑制剤の候補として１０％グリセロール（和光純薬工業 ＃０７５−００６１６）、２０％スクロース（シグマ ＃２８−００１０）、２０％グルコース（和光純薬工業 ＃０４９−３１１６５）、２０％ソルビトール（シグマ ＃Ｓ−３８８９−５００Ｇ）、２０％トレハロース（林原 ＃ＴＨ２２３）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ ＃Ｐ５９２７）、１０％ポリエチレングリコール平均分子量４０００（ＰＥＧ４０００、シグマ
＃２４−３６８０）、１０％ポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６０００、ナカライテスク ＃２８２５４）、１０％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００、ＭＰバイオメディカルズ ＃２５３２２−６８−３）、１％アルギニン（ナカライテスク ＃０３３２１）、１％グリシン（シグマ ＃１２−１２１０−５）、１％リシン（ナカライテスク ＃２０８０６）、１％プロリン（ナカライテスク ＃２９００１）、０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ、シグマ ＃Ａ７９０６−１００Ｇ）、０．０５％ゼラチンｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ（シグマ ＃Ｇ１８９０−１００Ｇ）をそれぞれ２μｇ／ｍＬ（終濃度０．５μｇ／ｃｍ２）の５１１Ｅ８とＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合して９６ウェルマイクロプレート（培養面積０．３２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に８０μＬ加えて４℃で一晩コーティングし、乾燥後の５１１Ｅ８の活性を評価した。
５１１Ｅ８をさまざまな物質と同時にコーティングし、乾燥条件下における５１１Ｅ８の活性低下を抑制できるかどうかを検証した。
活性低下抑制剤の候補として１０％グリセロール（和光純薬工業 ＃０７５−００６１６）、２０％スクロース（シグマ ＃２８−００１０）、２０％グルコース（和光純薬工業 ＃０４９−３１１６５）、２０％ソルビトール（シグマ ＃Ｓ−３８８９−５００Ｇ）、２０％トレハロース（林原 ＃ＴＨ２２３）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ ＃Ｐ５９２７）、１０％ポリエチレングリコール平均分子量４０００（ＰＥＧ４０００、シグマ
＃２４−３６８０）、１０％ポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６０００、ナカライテスク ＃２８２５４）、１０％ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００、ＭＰバイオメディカルズ ＃２５３２２−６８−３）、１％アルギニン（ナカライテスク ＃０３３２１）、１％グリシン（シグマ ＃１２−１２１０−５）、１％リシン（ナカライテスク ＃２０８０６）、１％プロリン（ナカライテスク ＃２９００１）、０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ、シグマ ＃Ａ７９０６−１００Ｇ）、０．０５％ゼラチンｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ（シグマ ＃Ｇ１８９０−１００Ｇ）をそれぞれ２μｇ／ｍＬ（終濃度０．５μｇ／ｃｍ２）の５１１Ｅ８とＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合して９６ウェルマイクロプレート（培養面積０．３２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に８０μＬ加えて４℃で一晩コーティングし、乾燥後の５１１Ｅ８の活性を評価した。
実際には、５１１Ｅ８と各候補薬剤を混ぜてコーティングした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で２４時間乾燥させ、さらにプレート周囲をパラフィルムでシールした状態で密封型包装材（ドライキープアルミ袋、佐々木化学薬品 ＃Ｔ−ＰＥ−３０−２３１ＡＬ）で密閉して、４℃で１週間保存したプレートのα６β１インテグリン結合活性（１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量）を測定した。測定前日にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８を別の９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、その後乾燥させていないコーティングプレートでの１０ｎＭ α６β１インテグリン結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各候補薬剤存在下での乾燥後のインテグリン結合活性を比較した。
結果を図５に示した。５１１Ｅ８のみをコートして乾燥、保存した場合（図中、ｎｏｎｅ）では、５１１Ｅ８のみをコートして乾燥していないコントロールに比べて結合活性が１０％以下に低下していた。候補薬剤のうち、グルコースなどインテグリン結合活性が約４０％程度までにしか低下しなかったものも複数あったが、ＢＳＡまたはゼラチンを添加した場合には、ともにインテグリン結合活性が９０％程度で維持されていた。実際、クラスカルウォリス検定とＤｕｎｎの多重比較の結果、ＢＳＡまたはゼラチンはともに有意水準１％で有意差が認められた。この結果は、ＢＳＡやゼラチン、またはそれに類する蛋白質が、活性低下抑制剤として強い効果を有する可能性を示唆している。
〔実施例５：ＢＳＡ、ゼラチン以外の蛋白質による活性低下抑制効果〕
実施例４において活性低下抑制効果が高かったＢＳＡおよびゼラチンは蛋白質である。そこで、蛋白質であればいずれも乾燥条件で活性低下抑制効果があるのか、特定の蛋白質でのみ活性低下抑制効果があるのかを調べるため、複数の蛋白質について同様に乾燥条件下における５１１Ｅ８の活性低下抑制効果を検証した。
実施例４において活性低下抑制効果が高かったＢＳＡおよびゼラチンは蛋白質である。そこで、蛋白質であればいずれも乾燥条件で活性低下抑制効果があるのか、特定の蛋白質でのみ活性低下抑制効果があるのかを調べるため、複数の蛋白質について同様に乾燥条件下における５１１Ｅ８の活性低下抑制効果を検証した。
実施例４で用いたウシ血清アルブミンおよびゼラチンの他に、ヒト血清アルブミン（Ｂｉｏ−Ｐｕｒｅ ＨＳＡ、バイオロジカルインダストリーズ ＃０５−７２０−１Ｄ）、セリシン（Ｐｕｒｅ Ｓｅｒｉｃｉｎ、和光純薬工業 ＃１６７−２２６８１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ、サーモフィッシャーサイエンティフィック ＃２０２３７）、トランスフェリン（ベクトン・ディッキンソン ＃３５４２０４）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ、メルクミリポア ＃１３−１０４）、β−ラクトグロブリンＡ（シグマ ＃Ｌ７８８０）をそれぞれ終濃度５００μｇ／ｍＬになるように、２μｇ／ｍＬ（終濃度０．５μｇ／ｃｍ２）の５１１Ｅ８と混ぜて、実施例４と同様に９６ウェルマイクロプレート（培養面積０．３２ｃｍ２／ｗｅｌｌ）に８０μＬ加えて４℃一晩コーティングした。コーティングしたプレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。実施例４と同様に、５１１Ｅ８を終濃度０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングし、乾燥させていないプレートでの１０ｎＭ α６β１インテグリン結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各蛋白質存在下での乾燥後のインテグリン結合活性を比較した。
結果を図６に示した。いずれの蛋白質も活性低下抑制なしの条件（ＰＢＳ）より高いインテグリン結合活性を示したが、ＢＳＡ、ゼラチン以外では特にヒト血清アルブミン、トランスフェリンで強い活性低下抑制効果が認められた。すなわち、乾燥による５１１Ｅ８の活性低下に対する抑制効果は、ある特定の蛋白質によってのみ付与されるものではなく、強弱の程度はあるものの、蛋白質全般にそのような活性低下抑制効果があると考えられる。
〔実施例６：蛋白質成分による活性低下抑制効果の濃度依存性〕
実施例４および実施例５で９６ウェルマイクロプレートに０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングした５１１Ｅ８の希釈液濃度は２μｇ／ｍＬに相当し、活性低下抑制剤として用いたＢＳＡやゼラチンはそれぞれ５１１Ｅ８蛋白質量の５００倍および２５０倍多く加えていたことになる。そこで、吸着した５１１Ｅ８のインテグリン結合活性が活性低下抑制剤の量によって影響を受けないかを検証した。具体的には、５１１Ｅ８とゼラチンをそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、５１１Ｅ８は終濃度が０．２５、０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるように、ゼラチンは終濃度が１．７〜５００μｇ／ｍＬになるように混ぜて実施例４と同様に９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、乾燥せずに１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
実施例４および実施例５で９６ウェルマイクロプレートに０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングした５１１Ｅ８の希釈液濃度は２μｇ／ｍＬに相当し、活性低下抑制剤として用いたＢＳＡやゼラチンはそれぞれ５１１Ｅ８蛋白質量の５００倍および２５０倍多く加えていたことになる。そこで、吸着した５１１Ｅ８のインテグリン結合活性が活性低下抑制剤の量によって影響を受けないかを検証した。具体的には、５１１Ｅ８とゼラチンをそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、５１１Ｅ８は終濃度が０．２５、０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるように、ゼラチンは終濃度が１．７〜５００μｇ／ｍＬになるように混ぜて実施例４と同様に９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、乾燥せずに１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
結果を図７（Ａ）に示した。いずれの５１１Ｅ８濃度においてもゼラチンの増加によってインテグリン結合活性が低下することはなかった。０．２５μｇ／ｃｍ２の場合では最大５００倍量のゼラチンが存在しても、そのインテグリン結合活性は維持されており、むしろ、ゼラチンの添加によって高濃度の５１１Ｅ８と同等のレベルまで結合活性が上昇していた。ゼラチンがα６β１インテグリンに対する結合活性を持たないことは周知の事実であり、実際、図には示していないが、５００μｇ／ｍＬのゼラチンを単独でコーティングした場合、α６β１インテグリン結合活性はまったく検出されなかった。
次に、乾燥条件下における活性低下抑制効果の濃度依存性を調べた。図７（Ａ）と同じ組み合わせで５１１Ｅ８とゼラチンをコーティングし、１時間乾燥させた後の１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
結果を図７（Ｂ）に示した。実施例３でも示したように、１．０μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８単独では乾燥によってそれほど失活は認められず、その濃度でのゼラチン添加による結合活性の変化は認められなかった。０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８に対してはゼラチンによる活性低下抑制効果の濃度依存性が認められ、ゼラチン１６．７μｇ／ｍＬまではインテグリン結合活性は失活しており、１６７μｇ／ｍＬ以上の濃度では乾燥なしのときの結合活性が維持されていた。５０μｇ／ｍＬのゼラチン添加では弱い活性低下抑制効果が認められた。０．２５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８に対しては、５００μｇ／ｍＬのゼラチン添加でもインテグリン結合活性は７０％程度まで減弱しており、１６７μｇ／ｍＬでは４０％程度と活性低下抑制効果に濃度依存性は認められたものの効果の強さは０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８のときより全体的に弱かった。すなわち、蛋白質成分による活性低下抑制効果には濃度依存性があり、さらにその効果の強さには５１１Ｅ８の濃度も関係することが明らかとなった。
〔実施例７：活性低下抑制剤の添加時期の検討〕
活性低下抑制剤を添加する最適な時期を検証するために、５１１Ｅ８コーティングと同時、あるいはその前後に活性低下抑制剤を添加して、その後の乾燥における活性低下抑制効果を調べた。５１１Ｅ８は終濃度が０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加し、４℃で一晩９６ウェルマイクロプレートをコーティングした。活性低下抑制剤として終濃度３００μｇ／ｍＬのゼラチンを以下の３条件で添加した。（１）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した活性低下抑制剤をプレートに加え、室温で３時間プレコーティングした後、５１１Ｅ８を加える、（２）活性低下抑制剤と５１１Ｅ８をあらかじめ混合し、両者を同時にプレートに加えてコーティングする、（３）５１１Ｅ８を一晩コーティングした後、活性低下抑制剤を加えて室温で３時間ポストコーティングする。コーティング後は、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で２４時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。５１１Ｅ８を終濃度０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングし、乾燥させていないコーティングプレートでの１０ｎＭ α６β１インテグリン結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各条件での乾燥後のインテグリン結合活性を比較した。
活性低下抑制剤を添加する最適な時期を検証するために、５１１Ｅ８コーティングと同時、あるいはその前後に活性低下抑制剤を添加して、その後の乾燥における活性低下抑制効果を調べた。５１１Ｅ８は終濃度が０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加し、４℃で一晩９６ウェルマイクロプレートをコーティングした。活性低下抑制剤として終濃度３００μｇ／ｍＬのゼラチンを以下の３条件で添加した。（１）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した活性低下抑制剤をプレートに加え、室温で３時間プレコーティングした後、５１１Ｅ８を加える、（２）活性低下抑制剤と５１１Ｅ８をあらかじめ混合し、両者を同時にプレートに加えてコーティングする、（３）５１１Ｅ８を一晩コーティングした後、活性低下抑制剤を加えて室温で３時間ポストコーティングする。コーティング後は、プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、室温で２４時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。５１１Ｅ８を終濃度０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングし、乾燥させていないコーティングプレートでの１０ｎＭ α６β１インテグリン結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各条件での乾燥後のインテグリン結合活性を比較した。
結果を図８に示した。図中では、条件（１）はＧｅｌａｔｉｎ→５１１Ｅ８、条件（２）はＧｅｌａｔｉｎ＋５１１Ｅ８、条件（３）は５１１Ｅ８→Ｇｅｌａｔｉｎと表記した。図８から明らかなように、調べた３条件のうちゼラチンを同時に添加した場合（条件（２））がもっとも活性低下抑制効果が高く、２４時間という厳しい乾燥条件でもコントロールと同程度の結合活性を維持していた。図には示していないが、条件（１）で乾燥させずにα６β１インテグリンの結合を測定した場合は、５１１Ｅ８単独と同程度のインテグリン結合活性が認められることを確認してある。この結果から、活性低下抑制の効果は、同時にコーティングを行うことでもっとも発揮されやすいことが明らかとなった。
〔実施例８：活性低下抑制剤の効果の持続性〕
活性低下抑制剤によって５１１Ｅ８のインテグリン結合活性は乾燥後も維持されることが明らかになったが、その活性が乾燥状態で長期間維持されるかを次に検証した。２４ウェルセルカルチャープレートに終濃度０．５、１．０、２．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８を単独または３００μｇ／ｍＬのゼラチン存在下でコーティングし、室温で１時間乾燥させた後、実施例４と同様の方法で密封し、４℃で保管した。一定期間の保管後、プレートを取り出し、２０１Ｂ７細胞を実施例１と同様に単一細胞に分散させ、２．６×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種し、７日目にアルカリホスファターゼ染色で細胞の形態を観察した。
活性低下抑制剤によって５１１Ｅ８のインテグリン結合活性は乾燥後も維持されることが明らかになったが、その活性が乾燥状態で長期間維持されるかを次に検証した。２４ウェルセルカルチャープレートに終濃度０．５、１．０、２．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８を単独または３００μｇ／ｍＬのゼラチン存在下でコーティングし、室温で１時間乾燥させた後、実施例４と同様の方法で密封し、４℃で保管した。一定期間の保管後、プレートを取り出し、２０１Ｂ７細胞を実施例１と同様に単一細胞に分散させ、２．６×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種し、７日目にアルカリホスファターゼ染色で細胞の形態を観察した。
８週間保管したプレートの結果を図９に示した。図９から明らかなように、活性低下抑制剤がないと０．５μｇ／ｃｍ２ではヒトｉＰＳ細胞はほとんど増殖できず、１．０μｇ／ｃｍ２のウェルでも２．０μｇ／ｃｍ２の条件に比べて増殖の程度は悪かった。一方、活性低下抑制剤を添加したウェルではいずれの５１１Ｅ８の濃度でも、十分な増殖が認められた。以上の結果は、活性低下抑制剤とともに５１１Ｅ８をコーティングしたプレートは乾燥状態で長期間保管可能であることが示唆された。
〔実施例９：ＢＳＡの濃度依存的な活性低下抑制効果〕
実施例６と同様な方法で、終濃度０．５μｇ／ｃｍ２になるようＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８に３０００μｇ／ｍＬまでの各種濃度のＢＳＡを加えて９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で一晩乾燥した。４℃で１週間保管後に、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量を測定し、ＢＳＡの濃度による５１１Ｅ８の活性低下抑制効果の指標とした。測定前日にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８を別の９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、乾燥させずに測定した１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各ＢＳＡ濃度のインテグリン結合活性を比較した。
実施例６と同様な方法で、終濃度０．５μｇ／ｃｍ２になるようＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８に３０００μｇ／ｍＬまでの各種濃度のＢＳＡを加えて９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で一晩乾燥した。４℃で１週間保管後に、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量を測定し、ＢＳＡの濃度による５１１Ｅ８の活性低下抑制効果の指標とした。測定前日にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８を別の９６ウェルマイクロプレートに４℃で一晩コーティングし、乾燥させずに測定した１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％として、各ＢＳＡ濃度のインテグリン結合活性を比較した。
結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、図５および図６で示されたＢＳＡの活性低下抑制効果は、ゼラチンと同様に濃度依存性があり、１００μｇ／ｍＬ以上で高いインテグリン結合活性の維持が確認された。この結果から、活性低下抑制効果が認められた蛋白質全般に、その効果には濃度依存性があることが示唆された。
〔実施例１０：５１１Ｅ８および全長ラミニン５１１に対する活性低下抑制効果の検討〕
５１１Ｅ８に対する活性低下抑制剤の効果が他の蛋白質を培養基質としてコーティングする場合にも同様に認められるかを調べるために、全長ラミニン５１１を用いて効果の比較を行った。全長ラミニン５１１はＩｄｏら（J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004）に記載の方法に従い作製し、使用した。実施例４と同様の方法で実験を行った。すなわち、５１１Ｅ８の場合は終濃度が０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるように、全長ラミニンの場合は終濃度が１６．０または３２．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、終濃度３００μｇ／ｍＬのＢＳＡまたはゼラチンと混ぜて４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で２４時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
５１１Ｅ８に対する活性低下抑制剤の効果が他の蛋白質を培養基質としてコーティングする場合にも同様に認められるかを調べるために、全長ラミニン５１１を用いて効果の比較を行った。全長ラミニン５１１はＩｄｏら（J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004）に記載の方法に従い作製し、使用した。実施例４と同様の方法で実験を行った。すなわち、５１１Ｅ８の場合は終濃度が０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるように、全長ラミニンの場合は終濃度が１６．０または３２．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、終濃度３００μｇ／ｍＬのＢＳＡまたはゼラチンと混ぜて４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で２４時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
結果を図１１に示した。縦軸は各濃度の５１１Ｅ８または全長ラミニン５１１を単独でコーティングし、乾燥させずに測定した１０ｎＭ α６β１インテグリン結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％とした相対活性を示す。活性低下抑制剤を添加しない場合、２４時間の乾燥により、５１１Ｅ８、全長５１１ともにインテグリン結合活性の著しい低下が認められた。乾燥による活性低下に対する活性低下抑制剤の効果は、二元配置分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法で解析した。５１１Ｅ８では、ＢＳＡまたはゼラチンを添加した場合、どの条件でも有意水準０．１％で有意な活性低下の抑制が認められた。一方、全長ラミニン５１１に対してはどの条件でもその効果に有意性は認められなかった（有意水準５％）。この結果から、ＢＳＡやゼラチン等の活性低下抑制剤の効果は、他の蛋白質を培養基質としてコーティングする場合にも同様に認められるものではなく、該蛋白質の形状やアミノ酸配列等の分子的性状によって大きく異なることが示唆された。すなわち、５１１Ｅ８と同様な形状を持つ等、分子的性状の類似した他の蛋白質に対して、同様の効果を示すことが示唆された。
〔実施例１１：５２１Ｅ８に対する活性低下抑制効果〕
５１１Ｅ８以外のラミニンＥ８でも同様の活性低下抑制効果が得られるかを調べるために、５２１Ｅ８を用いて効果の比較を行った。５２１Ｅ８はラミニン５２１に由来するＥ８フラグメントで、α５鎖Ｅ８断片、γ１鎖Ｅ８断片は５１１Ｅ８と共通であるが、β鎖は５１１Ｅ８とは異なるβ２鎖Ｅ８断片からなる。実施例４と同様の方法で５１１Ｅ８および５２１Ｅ８を終濃度で０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、終濃度５００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ゼラチンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と混合して４℃で一晩コーティングした。プレートはＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
５１１Ｅ８以外のラミニンＥ８でも同様の活性低下抑制効果が得られるかを調べるために、５２１Ｅ８を用いて効果の比較を行った。５２１Ｅ８はラミニン５２１に由来するＥ８フラグメントで、α５鎖Ｅ８断片、γ１鎖Ｅ８断片は５１１Ｅ８と共通であるが、β鎖は５１１Ｅ８とは異なるβ２鎖Ｅ８断片からなる。実施例４と同様の方法で５１１Ｅ８および５２１Ｅ８を終濃度で０．５または１．０μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、終濃度５００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ゼラチンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と混合して４℃で一晩コーティングした。プレートはＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で１時間乾燥させ、１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合を測定した。
結果を図１２に示した。縦軸は各濃度の５１１Ｅ８を単独でコーティングし、乾燥させずに測定した１０ｎＭ α６β１インテグリンの結合量（４９０ｎｍの吸光度）を１００％とした相対活性を示す。なお、α６β１インテグリンに対する５１１Ｅ８と５２１Ｅ８の結合親和性はほぼ同じであることがＴａｎｉｇｕｃｈｉらにより既に報告されている（J. Biol. Chem., 284, 7820-7831, 2009）。本実施例においても、α６β１インテグリンの結合量を示す４９０ｎｍの吸光度は、乾燥させずに測定した場合、０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８、５２１Ｅ８でそれぞれ２．６２±０．０５（平均値±標準偏差）、２．７５±０．０２、１．０μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８、５２１Ｅ８でそれぞれ２．９６±０．０３、２．８３±０．１１であり、ほぼ同じであった。
図１２から明らかなように、乾燥処理を１時間行なった場合、５２１Ｅ８のインテグリン結合活性は５１１Ｅ８と同様の失活パターンを示した。すなわち、１．０μｇ／ｃｍ２でコーティングした場合は乾燥による失活がほとんど認められないのに対して、０．５μｇ／ｃｍ２でコーティングした場合には著しいインテグリン結合活性の低下が認められた。この乾燥による結合活性の低下は、ＢＳＡ、ゼラチンまたはＨＳＡを同時添加することにより、５１１Ｅ８の場合と同様、ほぼ完全に回避された。すなわち、これらの活性低下抑制剤の効果は５１１Ｅ８に限定されず、他のラミニンアイソフォームのＥ８フラグメントに対しても発揮されることが示された。
〔実施例１２：２１１Ｅ８の５１１Ｅ８に対する活性低下抑制効果〕
５１１Ｅ８以外のラミニンＥ８にも乾燥による活性低下を抑制する効果があるかを検討した。添加するＥ８フラグメントとしては、それ自体がα６β１インテグリン結合活性を持たないラミニン２１１のＥ８フラグメント（以下、２１１Ｅ８）を使用した。具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８（終濃度０．４μｇ／ｃｍ２）と２１１Ｅ８（終濃度を０、０．８、１．６μｇ／ｃｍ２に調製）を混合して４℃で一晩９６ウェルマイクロプレートをコーティングした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で２４時間乾燥させ、α６β１インテグリン（１０ｎＭ）の結合を測定した。なお、２１１Ｅ８がα６β１インテグリン結合活性を持たないことは、発明者らにより確認されている（Taniguchi et al. J. Biol. Chem., 284, 7820-7831, 2009）。
５１１Ｅ８以外のラミニンＥ８にも乾燥による活性低下を抑制する効果があるかを検討した。添加するＥ８フラグメントとしては、それ自体がα６β１インテグリン結合活性を持たないラミニン２１１のＥ８フラグメント（以下、２１１Ｅ８）を使用した。具体的には、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５１１Ｅ８（終濃度０．４μｇ／ｃｍ２）と２１１Ｅ８（終濃度を０、０．８、１．６μｇ／ｃｍ２に調製）を混合して４℃で一晩９６ウェルマイクロプレートをコーティングした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、室温で２４時間乾燥させ、α６β１インテグリン（１０ｎＭ）の結合を測定した。なお、２１１Ｅ８がα６β１インテグリン結合活性を持たないことは、発明者らにより確認されている（Taniguchi et al. J. Biol. Chem., 284, 7820-7831, 2009）。
結果を図１３に示した。α６β１インテグリン結合活性は、０．４μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８をコーティングし、乾燥させずに測定した場合の結合量（４９０ｎｍの吸光度が１．０７）を１００％とした相対値で表示した。図１３から明らかなように、２１１Ｅ８を０．８μｇ／ｃｍ２添加するとインテグリン結合活性が約３０％まで回復し、２１１Ｅ８を１．６μｇ／ｃｍ２添加すると約８０％までインテグリン結合活性が回復した。この結果から、５１１Ｅ８の活性低下抑制剤として他のラミニンＥ８を使用できることが示された。また、ＢＳＡ、ゼラチン等の蛋白質を活性低下抑制剤として使う場合と比べて、他のラミニンＥ８は極めて少量で乾燥時の活性低下を抑制する効果を発揮することが明らかとなった。
〔実施例１３：ラミニンフラグメント改変体に対する活性低下抑制効果（１）〕
ラミニンフラグメント改変体でも同様の活性低下抑制効果が得られるかを調べるために、パールカンのヘパラン硫酸鎖結合ドメインを付加した２種類の５１１Ｅ８改変体（Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８）を用いて効果の比較を行った。Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８はβ１鎖Ｅ８フラグメントのＮ末端部にパールカンのドメインＩ〜ＩＩＩを付加した５１１Ｅ８改変体であり、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８はα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部にパールカンのドメインＩを付加した改変体である。実施例４と同様の方法でＰｌｕｓ＃３ラミニンＥ８あるいはＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８を終濃度で０．５６μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；終濃度５００μｇ／ｍＬ）またはゼラチン（終濃度３００μｇ／ｍＬまたは２０００μｇ／ｍＬ）と混合したのち、９６ウェルマイクロプレート上に３７℃で１時間コーティングした。コーティングしたプレートは、コーティング液を除去した後、室温で２２時間乾燥させ、１０ｎＭのα６β１インテグリンの結合を測定した。なお、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８あるいはＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８を単独でコーティングした後、乾燥させずにα６β１インテグリンの結合を測定した値を対照として用いた。
ラミニンフラグメント改変体でも同様の活性低下抑制効果が得られるかを調べるために、パールカンのヘパラン硫酸鎖結合ドメインを付加した２種類の５１１Ｅ８改変体（Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８）を用いて効果の比較を行った。Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８はβ１鎖Ｅ８フラグメントのＮ末端部にパールカンのドメインＩ〜ＩＩＩを付加した５１１Ｅ８改変体であり、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８はα５鎖Ｅ８フラグメントのＣ末端部にパールカンのドメインＩを付加した改変体である。実施例４と同様の方法でＰｌｕｓ＃３ラミニンＥ８あるいはＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８を終濃度で０．５６μｇ／ｃｍ２になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；終濃度５００μｇ／ｍＬ）またはゼラチン（終濃度３００μｇ／ｍＬまたは２０００μｇ／ｍＬ）と混合したのち、９６ウェルマイクロプレート上に３７℃で１時間コーティングした。コーティングしたプレートは、コーティング液を除去した後、室温で２２時間乾燥させ、１０ｎＭのα６β１インテグリンの結合を測定した。なお、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８あるいはＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８を単独でコーティングした後、乾燥させずにα６β１インテグリンの結合を測定した値を対照として用いた。
Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８の結果を図１４に、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８の結果を図１５にそれぞれ示した。縦軸はα６β１インテグリンの結合量（４９０ｎｍの吸光度）を示す。図１４および図１５から明らかなように、Ｐｌｕｓ＃３ラミニンＥ８およびＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８をそれぞれ単独でプレートにコーティングした後に乾燥させると、インテグリン結合活性が著しく低下した。一方、ヒト血清アルブミンやゼラチンを添加して乾燥させた場合は、インテグリン結合活性の低下が抑制された。特に、図１５に示したように、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８では、ヒト血清アルブミンやゼラチンの添加により、乾燥後でも約９０％のインテグリン結合活性が保持されていた。これらの結果は、本発明の活性低下抑制剤の効果はラミニンフラグメントに限定されず、ラミニンフラグメント改変体に対しても発揮されることを示している。
〔実施例１４：ラミニンフラグメント改変体に対する活性低下抑制効果（２）〕
ラミニンフラグメント改変体に対する活性低下抑制剤の効果をさらに検証するため、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）をコーティングした２４ウェルセルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４７）およびＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；終濃度５００μｇ／ｍＬ）またはゼラチン（終濃度３００μｇ／ｍＬもしくは２０００μｇ／ｍＬ）を添加してコーティングした２４ウェルセルカルチャープレートを用意し、室温で２２時間乾燥させた後、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７細胞）を７×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ ２の密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下で１週間培養した。培地にはＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地を用いた。また、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）をコーティングした２４ウェルセルカルチャープレート上に乾燥工程を挟まずに２０１Ｂ７細胞を播種し、同様に１週間培養した。１週間培養後のヒトｉＰＳ細胞の増殖状態を、アルカリホスファターゼ染色により評価した。
ラミニンフラグメント改変体に対する活性低下抑制剤の効果をさらに検証するため、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）をコーティングした２４ウェルセルカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン ＃３５３０４７）およびＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；終濃度５００μｇ／ｍＬ）またはゼラチン（終濃度３００μｇ／ｍＬもしくは２０００μｇ／ｍＬ）を添加してコーティングした２４ウェルセルカルチャープレートを用意し、室温で２２時間乾燥させた後、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７細胞）を７×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ ２の密度で播種し、５％ ＣＯ２／９５％ Ａｉｒ、３７℃の湿潤条件下で１週間培養した。培地にはＴｅＳＲ２／ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ １：１混合培地を用いた。また、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８（終濃度０．５６μｇ／ｃｍ２）をコーティングした２４ウェルセルカルチャープレート上に乾燥工程を挟まずに２０１Ｂ７細胞を播種し、同様に１週間培養した。１週間培養後のヒトｉＰＳ細胞の増殖状態を、アルカリホスファターゼ染色により評価した。
結果を図１６に示した。図１６から明らかなように、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８をコーティングしたプレート上にヒトiＰＳ細胞を播種すると、５１１Ｅ８をコーティングしたプレート上と同等の細胞増殖が観察され、Ｐｌｕｓ＃５ラミニンＥ８がヒトiＰＳ細胞用の培養基質として有効であることが示された。生じたヒトｉＰＳ細胞のコロニーはアルカリホスファターゼ染色で均一な陽性反応を示しており、未分化性が維持されていると考えられた。一方、活性低下抑制剤を添加せずにＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８のみをコーティングしたプレートを乾燥させると、著しい細胞増殖の低下が観察された。しかし、終濃度３００μｇ／ｍＬ以上でヒト血清アルブミンやゼラチンを添加してＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８をコーティングした場合は、乾燥後でもヒトｉＰＳ細胞の増殖の低下は観察されず、乾燥せずにＰｌｕｓ＃５ラミニンＥ８をコーティングした場合と同等あるいはそれ以上の細胞の増殖が認められた。また、アルカリホスファターゼ染色の陽性所見から、細胞の未分化性も保持されていると考えられた。以上の結果は、本発明の活性低下抑制剤の効果はラミニンフラグメントに限定されず、ラミニンフラグメント改変体に対しても発揮されることを示している。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (12)
- 細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、以下の（１）、（２）または（３）であることを特徴とする細胞培養器具。
（１）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体のみが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（２）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントが乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具
（３）細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具 - 前記（１）において、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が０．７μｇ／ｃｍ２以上の濃度でコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- 前記（２）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その３倍以上の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- 前記（３）において、１．５μｇ／ｃｍ２以下の濃度のインテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体と、その２０倍以上の濃度のラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質がコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- インテグリンα６β１結合活性を有しないラミニンフラグメントがラミニンα２β１γ１のフラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器具。
- 細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングした後、乾燥させることにより製造されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養器具。
- 細胞と接触する表面に、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体が乾燥状態でコーティングされている細胞培養器具の製造方法であって、該ラミニンフラグメントがラミニンα５β１γ１およびラミニンα５β２γ１から選択される少なくとも１種のフラグメントであり、
（Ａ）コーティングされる蛋白質を含むコーティング溶液を調製する工程、
（Ｂ）細胞培養器具の細胞と接触する表面に所望の全蛋白質をコーティングする工程、および
（Ｃ）コーティングされた蛋白質を乾燥する工程
を含むことを特徴とする製造方法。 - 哺乳動物細胞の培養方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養器具を用いることを特徴とする培養方法。
- 哺乳動物細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞もしくは体性幹細胞またはこれらの細胞から分化した細胞である請求項１０に記載の培養方法。
- ゼラチン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、コラーゲンおよびラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントからなる群より選択される１種以上を有効成分とし、インテグリンα６β１結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の乾燥によるインテグリンα６β１結合活性の低下を抑制する活性低下抑制剤。
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| JPN6014033685; ＭＡＴＲＩＸ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ． ２５, 2006, ｐｐ． １８９-１９７ * |
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