JP2017006058A - 培養装置及び培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト多能性幹細胞の培養において、遠心分離を必要とせずに継代を実現する手段の提供。【解決手段】第１培養容器及び第２培養容器へそれぞれ供給及び排出する液体給排機構と、液体給排機構を制御する給排制御部を具備し、該液体給排機構にヒト多能性幹細胞が培養された上記第１培養容器から培地を流出させる工程、培地が排出された該第１培養容器に剥離液を流入させる工程、該第１培養容器から剥離液を流出させる工程と、剥離液が排出された該第１培養容器に培地を流入させて細胞を剥離する工程と、該第１培養容器から細胞懸濁液を流出させ、該細胞懸濁液に含まれる細胞塊を崩壊させる工程と、崩壊された細胞塊を含む該細胞懸濁液を上記第２培養容器へ流入させ移動させる工程と、細胞懸濁液が流入された該第２培養容器において細胞が第２培養容器に十分に接着した後、該第２培養容器の培地を交換する工程とを実行する、ヒト多能性幹細胞の培養装置。【選択図】図３

Description

本発明は、ヒト多能性幹細胞を培養する培養装置及び培養方法に関する。

細胞培養においては、培養容器中の細胞を他の培養容器に移し替える工程や、培養容器中の培地を交換する工程が行われる。このような細胞培養の各工程は、無菌状態で行われる必要がある。また、細胞培養は、数日から数週間に渡って行われ、この期間の間に前述された各工程が複数回行われる。細胞培養において人が行う作業を簡略化したり、大量の細胞を培養したりすることを目的として、細胞培養における各工程を機械により行う装置が公開されている（特許文献１，２）。

特開２００９−２９１１０４号公報 特開２００７−２９０４１号公報

継代において、培養容器から細胞を剥離して別の培養容器に移動させる行程において、培養容器に剥離液が供給されて、培養容器から細胞が剥離される。得られた細胞懸濁液は、剥離液中に細胞が浮遊した状態であるので、細胞と剥離液とを分離するために遠心分離が行われる。しかしながら、培養装置において、遠心分離機能を実現しようとすると、装置が大型化したり、コスト高になったりするという問題がある。

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒト多能性幹細胞の培養において、遠心分離を必要とせずに継代を実現する手段を提供することにある。

(1) 本発明に係る培養装置は、液体が流通するポートをそれぞれ有しており、各内部空間においてヒト多能性幹細胞の培養が可能な第１培養容器及び第２培養容器と、上記第１培養容器及び上記第２培養容器へ液体をそれぞれ供給及び排出する液体給排機構と、上記液体給排機構を制御する給排制御部と、を具備する。上記給排制御部は、上記液体給排機構に、ヒト多能性幹細胞が培養された上記第１培養容器から培地を流出させる培地排出ステップと、培地が排出された上記第１培養容器に剥離液を流入させる剥離液供給ステップと、上記第１培養容器から剥離液を流出させる剥離液排出ステップと、剥離液が排出された上記第１培養容器に培地を流入させて細胞を剥離する細胞剥離ステップと、上記第１培養容器から細胞懸濁液を流出させ、当該細胞懸濁液に含まれる細胞塊を崩壊させる分散ステップと、崩壊された細胞塊を含む上記細胞懸濁液を上記第２培養容器へ流入させる細胞懸濁液移動ステップと、細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器において細胞が第２培養容器に十分に接着した後、当該第２培養容器の培地を交換する培地交換ステップと、を実行する。

第１培養容器の内部空間においてヒト多能性幹細胞が培養される。継代に際して、培地排出ステップにより第１培養容器から培地が排出される。そして、剥離液供給ステップにより、第１培養容器に剥離液が流入される。これにより、第１培養容器の内面に付着しているヒト多能性幹細胞に剥離液が作用するが、ヒト多能性幹細胞は、第１培養容器の内面から完全に剥離されない。剥離液排出ステップにより、第１培養容器から剥離液が流出された後、細胞剥離ステップにより、第１培養容器に培地が供給される。これにより、第１培養容器の内面からヒト多能性幹細胞が剥離され、第１培養容器の内部空間には、ヒト多能性幹細胞と培地との細胞懸濁液が作製される。培地の供給による培地の流れを受けて第１培養容器の内面から細胞が剥離するので、剥離のために細胞に付与される力が穏やかである。分散ステップにより、第１培養容器から流出された細胞懸濁液に含まれる細胞塊がシングルセルあるいはシングルセルに近い状態まで崩壊される。培地の流れを受けて細胞塊が崩壊されるので、容易且つ穏やかに細胞塊が崩壊される。細胞懸濁液移動ステップにより、第１培養容器から第２培養容器に細胞懸濁液が移動される。培地交換ステップにおいて、第２培養容器の内面に細胞懸濁液中のヒト多能性幹細胞が十分に接着した後に、第２培養容器において培地が交換される。

(2) 好ましくは、上記液体給排機構は、液体が流通するチューブと、当該チューブに当接して当該チューブを撓ませつつ移動することによって、当該チューブ内の液体を移動させるチューブポンプと、を具備するものであり、上記給排制御部は、上記分散ステップにおいて、ヒト多能性幹細胞の細胞塊を含む細胞懸濁液を上記チューブポンプに流通させることによって、細胞塊を崩壊させる。

チューブポンプにより、第１培養容器から第２培養容器へ細胞懸濁液が移動されると共に、ヒト多能性幹細胞の細胞塊が崩壊される。そのため、フィルタのような細胞塊を崩壊させるための部材を別途に設ける必要がないので、培養装置の構成が簡略化される。

(3) 好ましくは、上記培地交換ステップは、細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器を５分から１２時間放置した後、当該第２培養容器の培地を交換するステップである。

培地交換ステップにおいて第２培養容器が５分から１２時間放置されている間に、第２培養容器の内面に細胞懸濁液に含まれる細胞が接着する。その後、第２培養容器の培地が交換される。

(4) 好ましくは、上記第１培養容器及び上記第２培養容器は、可橈性のシートによって上記内部空間が区画されたバッグ形状であって、上記チューブを通じて上記液体給排機構と閉鎖系で接続されており、上記剥離液排出ステップは、上記第１培養容器の内部空間を区画して対向するシートの内面の少なくとも一部が接触するまで剥離液を排出するステップである。

これにより、第１培養容器に残存する剥離液を少なくすることができる。また、第１培養容器は液体給排機構と閉鎖系で接続されているので、剥離液が排出された後、培地が流入されるまでの間に、第１培養容器内において細胞が乾燥することを抑制できる。また、剥離液が排出されると、第１培養容器において対向するシートの内面が接触しているので、シートの内面に付着している細胞が対向するシートによって挟み込まれ、シートから細胞が剥離することが抑制される。その後の細胞剥離ステップにおいて第１培養容器に培地が流入されるときには、対向して接触しているシートの間に培地が流れるので、シート間における培地の勢い（流速）を高めることができ、シートから細胞が剥離しやすい。

(5) 好ましくは、上記第１培養容器を保持する保持板、及び回転軸を有する容器保持部と、上記回転軸を支持して回転させる回転機構と、上記容器保持部を上記保持板における上記第１培養容器を支持する支持面が略水平方向に沿った第１姿勢、及び上記支持面が略水平方向に沿っておらず且つ上記ポートが上記回転軸より重力方向の下方に位置する第２姿勢となるように、上記回転機構の回転を制御する回転制御部と、を更に備え、上記回転制御部は、上記剥離液排出ステップにおいて、上記容器保持部が上記第２姿勢となるように上記回転機構を回転させ、上記細胞剥離ステップにおいて、上記容器保持部が上記第１姿勢となるように上記回転機構を回転させる。

第１姿勢において第１培養容器が安定して容器保持部に支持されるので、第１培養容器に培地が供給されるときに、第１培養容器の姿勢変化が少ない。また、第２姿勢により、第１培養容器に貯留された剥離液が重力によってポートへ移動するので、第１培養容器から剥離液が排出されるときに、第１培養容器に残留する剥離液を少なくすることができる。

(6) 好ましくは、上記第１培養容器は、可橈性のシートによって上記内部空間が区画されたバッグ形状であって、上記内部空間を区画しており、且つ上記ポートが配置されている上記シートの縁部が、上記ポートへ向かって上記内部空間が外方へ拡がる形状である。

これにより、第２姿勢において、第１培養容器の内部空間において重力により剥離液がポートへ向かって流れる。

(7) 好ましくは、上記第１培養容器及び上記第２培養容器は、内部空間を区画する内面にヒトラミニンの活性フラグメントがコーティングされたものである。

(8) 本発明に係る培養方法は、ヒト多能性幹細胞が培養された第１培養容器から培地を流出させる培地排出ステップと、培地が排出された上記第１培養容器に剥離液を流入させる剥離液供給ステップと、上記第１培養容器から、上記第１培養容器の内部空間を区画して対向するシートの内面が接触するまで剥離液を排出させる剥離液排出ステップと、剥離液が排出された上記第１培養容器に培地を流入させて細胞を剥離する細胞剥離ステップと、上記第１培養容器から細胞懸濁液を流出させ、当該細胞懸濁液に含まれる細胞塊を崩壊させる分散ステップと、崩壊された細胞塊を含む上記細胞懸濁液を上記第２培養容器へ流入させる細胞懸濁液移動ステップと、細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器を５分から１２時間放置した後、当該第２培養容器の培地を交換する培地交換ステップと、を含む。

(9) 好ましくは、上記分散ステップにおいて、液体が流通するチューブに当接して当該チューブを撓ませつつ移動することによって、当該チューブ内の液体を移動させるチューブポンプに、ヒト多能性幹細胞の細胞塊を含む細胞懸濁液を流通させることによって、細胞塊を崩壊させる。

(10) 好ましくは、上記剥離液排出ステップにおいて、上記第１培養容器を支持する容器保持部の支持面が略水平方向に沿っておらず且つ上記ポートが上記内部空間より重力方向の下方に位置する姿勢とし、上記細胞剥離ステップにおいて、上記支持面が略水平方向に沿った姿勢とする。

本発明によれば、ヒト多能性幹細胞の培養において、遠心分離を必要とせずに継代を実現できる。

図１は、培養装置１０の概略図である。 図２は、培養部１４の内部の斜視図である。チューブ３８は省略されている。また説明のために制御部１１が示されている。 図３は、培養部１４の内部の上方から見た概略図である。第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２及び第３バッグ保持部３３の上面の保持板４２は省略されている。 図４は、第３バッグ保持部３３の分解斜視図である。 図５（Ａ）は、チューブ９９の斜視図である。図５（Ｂ）は、チューブ９９を切断面Ｖ−Ｖで切断した断面図である。 図６は、細胞培養方法のフローチャートである。 図７は、第１バッグ保持部３１の第１姿勢を説明するための概略図である。 図８は、第１バッグ保持部３１の第３姿勢を説明するための概略図である。 図９は、第１バッグ保持部３１の第４姿勢を説明するための概略図である。 図１０は、第１バッグ保持部３１の第２姿勢を説明するための概略図である。 図１１は、継代ステップのフローチャートである。 図１２は、実施例における観察結果を示す図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

［培養装置１０の概要］
図１に示されるように、培養装置１０は、制御部１１、冷蔵保存部１２、常温保存部１３及び２つの培養部１４を備える。冷蔵保存部１２及び常温保存部１３は、培養部１４の外部に設けられている。２つの培養部１４は、上下に分かれて配置されている。制御部１１は、ディスプレイ１５を備えている。ディスプレイ１５は、培養装置１０の前面に配置されている。制御部１１は、不図示のデータ入力部を有しており、データ入力部を通じて制御部１１に細胞培養に関する種々の条件などが入力される。

培養装置１０は、制御部１１に入力され保存されたデータに従い自動で細胞を培養する装置である。以下、培養装置１０の構成要素が詳細に説明される。以下の説明において、図１における上下に沿って上下方向１０１が定義され、図１における左右に沿って左右方向１０２が定義され、上下方向１０１及び左右方向１０２と垂直な方向（図１の紙面に垂直な方向）に沿って前後方向１０３が定義される。

図２，３に示されるように、制御部１１は、回転制御部２０、培養制御部２１、及び給排制御部２２を有する。回転制御部２０、培養制御部２１、及び給排制御部２２は、それぞれの制御対象の動作を制御するための演算装置であり、予めプログラムや情報が格納されている。培養制御部２１は、回転制御部２０及び給排制御部２２に制御情報を出力する。また、培養制御部２１は、培養部１４の環境温度を制御するための制御情報を出力する。回転制御部２０は、回転機構３４と電気的に接続されており、回転機構３４の駆動を制御するための制御情報を出力する。給排制御部２２は、液体給排機構３７と接続されており、液体給排機構３７の各駆動部、すなわち供給ポンプ９１，排出ポンプ９２、及びバルブＶ１〜Ｖ１８を駆動するための制御情報を出力する。

図１に示されるように、冷蔵保存部１２は、内部に試薬又は培地を貯留した容器を積置するための棚が形成された筐体である。冷蔵保存部１２の前面には、筐体の前面に設けられた開口を開閉可能な扉が設けられている。冷蔵保存部１２は、不図示の冷却機構を備える所謂冷蔵庫である。冷却機構により、冷蔵保存部１２の内部の温度は、常温より低い任意の設定温度、例えば、約１０℃や約４℃などに保たれる。常温保存部１３は、内部に試薬又は培地を貯留した容器を積置するための棚が形成された筐体である。

冷蔵保存部１２及び常温保存部１３の内部に積置された容器は、試薬又は培地を液密に貯留可能なものである。容器としては、例えば、バッグ、ボトル、カセットなどが挙げられる。各容器は、内部の液体を流出可能にチューブなどが接続されており、液体給排機構３７によって貯留された液体が流出可能である。

［培養部１４］
２つの培養部１４は、装置における配置が異なる他は同様の構造なので、以下、１つの培養部１４を例に詳細な構成が説明される。培養部１４は、培養装置１０の内部に形成された空間であり、当該空間は、培養装置１０の筐体フレームと、トレイ１７により区画されている。トレイ１７は、培養装置１０の前面から手前へ引き出し可能である。トレイ１７が引き出されることにより、培養部１４が開放され、培養部１４に設けられた各構成にアクセス可能となる。

培養部１４は、所定の温度及びＣＯ_２濃度に保持可能である。各図には示されていないが、培養部１４には、加温装置及びＣＯ_２供給装置が設けられている。また、培養部１４には、温度センサ及びＣＯ_２濃度センサが設けられている。培養制御部２１は、温度センサ及びＣＯ_２濃度センサの出力に基づいて、培養部１４の内部を設定された温度及びＣＯ_２濃度にすべく加温装置及びＣＯ_２供給装置を駆動する。細胞培養において、培養部１４は、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２の環境に保持可能である。

図２，３に示されるように、トレイ１７には、第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３（それぞれ容器保持部の一例）が左右方向１０２に並んで設けられている。第１バッグ保持部３１の前後方向１０３の後方には、回転機構３４が設けられている。回転機構３４によって、第１バッグ保持部３１が所定の回転姿勢に回転される。同様に、第２バッグ保持部３２の前後方向１０３の後方に回転機構３４が設けられており、また、第３バッグ保持部３３の前後方向１０３の後方に回転機構３４が設けられている。トレイ１７の前側には、液体給排機構３７が設けられている。また、第１バッグ保持部３１と同軸で回転可能に第１バッグ保持部３１と連結された濃縮装置支持部１０４が設けられている。また、トレイ１７の左右方向１０２の左側には、容器収納部２７，２８が設けられており、右側には、容器収納部２９が設けられている。

［第３バッグ保持部３３］
第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３は、配置及び寸法が異なる他は、基本的に同様の構成なので、以下には、第３バッグ保持部３３を一例として詳細な構成が説明される。なお、第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３の外形及び寸法は、保持可能な培養バッグの外形に合わせて設計されている。

図４及び図５に示されるように、第３バッグ保持部３３は、保持板４２，４３、ホルダ４４，４５、スペーサー４６，４７及び回転軸４８，４９を備える。保持板４２，４３は、矩形の平板である。保持板４２，４３には、厚み方向に貫通する孔が複数形成されている。この孔は、保持板４２，４３に挟まれて保持された培養バッグ９０へ培養部１４内の気体からの熱伝導を高めるためのものである。保持板４２，４３は、相互に対向して配置される。保持板４２，４３において相互に対向する面が、支持面６５，６６である。

保持板４２，４３の間であって、培養バッグ９０のポート７３，７４が配置される一対の対向する縁部には、スペーサー４６，４７が配置されている。スペーサー４６，４７は、保持板４２，４３の間隔を維持するためのものである。スペーサー４６，４７は、それぞれが四角柱形状である。スペーサー４６，４７の長手方向の長さは、保持板４２，４３の一対の縁部の長さとほぼ同じである。また、スペーサー４６，４７は、断面形状が長手方向に渡って一定である。スペーサー４６，４７の長手方向の中央には、長手方向と直交する方向へ凹む凹部４６Ａ，４７Ａが形成されている。凹部４６Ａ，４７Ａは、培養バッグ９０のチューブ９９がそれぞれ挿入される空間である。なお、スペーサー４６，４７は、保持板４２，４３の一方と一体に構成されていてもよい。

ホルダ４４，４５は、スペーサー４６，４７を介在させた状態の保持板４２，４３を挟み込んで一体に保持するものである。ホルダ４４，４５は、断面が横向きＵ時形状の細長な部材であり、横向きＵ時形状の内側に、スペーサー４６，４７を介在させた状態の保持板４２，４３の縁部が挿入される。ホルダ４４，４５に挿入される保持板４２，４３の縁部は、スペーサー４６，４７が介在されない一対の縁部である。ホルダ４４，４５のそれぞれの長手方向の両端側には、ネジ孔が形成されており、そのネジ孔にネジ１８が螺合されている。ネジ１８の先端は、ホルダ４４，４５の横向きＵ時形状の内側に突出されている。ホルダ４４，４５の横向きＵ時形状の内側に挿入されたホルダ４４，４５の一方が、ネジ１８によって押圧されることにより、ホルダ４４，４５がスペーサー４６，４７を介在させた状態に保持板４２，４３を保持する。この状態において、保持板４２，４３の支持面６５，６６の間に形成された空間が培養バッグ９０を保持する空間となる。なお、ホルダ４４，４５は、保持板４２，４３の一方と一体に構成されてもよい。また、保持板４２，４３は、ホルダ４４，４５の一方により蝶番のごとく回動自在に連結されていてもよい。

ホルダ４４，４５には、長手方向の中央付近から、保持板４２，４３が保持される側と反対向きに突出する回転軸４８，４９がそれぞれ設けられている。回転軸４８，４９は、ホルダ４４，４５が保持板４２，４３を保持した状態において、同軸に延びる。回転軸４８，４９が延びる方向は、保持板４２，４３の支持面６５，６６と平行である。

第１バッグ保持部３１及び第２バッグ保持部３２の詳細な構成については、図を用いて詳細には説明されないが、第３バッグ保持部３３と同様に、保持板ホルダ、スペーサーを備える。

図２に示されるように、トレイ１７において、第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、第３バッグ保持部３３、及び濃縮装置支持部１０４が配置される箇所には、回転する第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、第３バッグ保持部３３、及び濃縮装置支持部１０４との干渉を避けるために開口１７Ａが３箇所に形成されている。

各開口１７Ａの前後方向１０３の前方及び後方には、一対の軸受部２４がそれぞれ配置されている。一対の軸受部２４は、第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、第３バッグ保持部３３、及び濃縮装置支持部１０４の各回転軸４８，４９を前後方向１０３に沿った状態でそれぞれ回転自在に支持する。これにより、第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３の各保持板４２，４３、並びに濃縮装置支持部１０４は、回転軸４８，４９を回転中心として回転可能である。

［回転機構３４］
図２及び図３に示されるように、トレイ１７において、各軸受部２４の前後方向１０３のそれぞれ後方には、回転機構３４がそれぞれ設けられている。回転機構３４は、回転軸支持部１６及び不図示のステッピングモータを有する。回転軸支持部１６は、前後方向１０３の後方に向かって延びており、各軸受部２４に支持された回転軸４９と同軸に連結されている。各図には示されていないが、ステッピングモータには、電源から電力が供給されている。また、ステッピングモータと回転軸支持部１６とは、公知の減速ギアなどによって駆動伝達されている。回転制御部２０から出力される制御信号に基づいた電力がステッピングモータに供給されることにより、回転軸支持部１６が所定の回転角だけ回転する。

なお、ステッピングモータには、原点位置、すなわち第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３の保持板４２，４３の支持面６５，６６が水平方向に沿った状態となる回転位置を検出するためのセンサが設けられていてもよい。回転制御部２０は、このセンサの出力に基づいて、支持面６５，６６が水平方向に沿った状態となるようにステッピングモータを駆動することができる。なお、ステッピングモータは回転機構３４の駆動源の一例であり、ステッピングモータに代えて、例えば回転量を検出可能なエンコーダを有する直流モータなど他の駆動源が採用されてもよい。また、駆動源の回転位置はレゾルバなどの他の検知手段により検知されてもよいし、第１バッグ保持部３１などの回転位置を直接検出できるセンサが設けられてもよい。

［液体給排機構３７］
図２，３に示されるように、液体給排機構３７は、供給ポンプ９１、排出ポンプ９２、及び複数のバルブＶ１〜Ｖ１８を有する。供給ポンプ９１及び排出ポンプ９２は、可橈性を有する軟質のチューブを、回動するローラによって撓ませつつ扱くように移動ことによってチューブ内において液体を移動させるチューブポンプである。供給ポンプ９１及び排出ポンプ９２には電源から電力が供給されている。給排制御部２２は、供給ポンプ９１及び排出ポンプ９２に供給される電力を制御することにより、供給ポンプ９１及び排出ポンプ９２を一定時間駆動させることができる。

複数のバルブＶ１〜Ｖ１８は、供給ポンプ９１に関連するバルブＶ１〜Ｖ１１と、排出ポンプ９２に関連するバルブＶ１２〜Ｖ１８とに大別される。供給ポンプ９１及びバルブＶ１〜Ｖ１１が、液体給排機構３７における液体供給に関するバルブであり、排出ポンプ９２及びバルブＶ１２〜Ｖ１８が、液体給排機構３７における液体排出に関するバルブである。各バルブＶ１〜Ｖ１８は、給排制御部２２から出力される制御信号に基づいてオン／オフが切り替えられる。各バルブＶ１〜Ｖ１８のオン／オフによって、培養バッグ７０，８０，９０などに連結されている各チューブ３８における液体の流れを開閉することができる。バルブＶ１〜Ｖ１８としては、例えば、電磁弁が採用される。

［培養回路］
図３に示されるように、培養回路は、３つの培養バッグ７０，８０，９０（第１培養容器及び第２培養容器の一例）と、２つのサーババッグ３９，４０と、回収バッグ４１と、濃縮装置１２０と、冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に保持される貯留容器１１６，１１７と、これらを液体が流通可能に連結する複数のチューブ３８と、を有する。培養バッグ７０は、第１バッグ保持部３１に設置されるものである。培養バッグ８０は、第２バッグ保持部３２に設置されるものである。培養バッグ９０は、第３バッグ保持部３３に設置されるものである。濃縮装置１２０は、濃縮装置支持部１０４に設置されるものである。回収バッグ４１は、培養部１４内に設置されるものである。培養バッグ７０が、培養バッグ８０，９０と比べて容量が小さいほかは、各培養バッグ７０，８０，９０は同様の構成なので、以下、培養バッグ９０を例に詳細な構成が説明される。

図４に示されるように、培養バッグ９０は、合成樹脂製の２枚の矩形のシートの周縁が熱溶着などの公知の方法で張り合わされることにより、バッグ形状に形成されたものである。２枚の矩形のシートにおいて対向する一対の端部７７，７８の中央付近にそれぞれ合成樹脂製のチューブ９９が配置されている。図４，５（Ａ）、（Ｂ）に示されるように、各チューブ９９において、培養バッグ９０の内部空間に位置する部分は、培養バッグ９０の内部空間に位置する端から縁部８７，８８へ向かって切欠部１０５が形成されている。図１０に示されるように、切欠部１０５は、培養バッグ９０の内部空間を画定する内面と対向しない位置、すなわち、２枚の矩形のシートにおける一対の端部７７，７８以外の端部を向いている箇所に位置している。仮に、培養バッグ９０から液体が流出されるときに、内部空間に負圧が生じて内面が相互に近づいたとしても、チューブ９９付近においては内面の間にチューブ９９が存在することにより、対向する内面同士が接触し難くなる。他方、チューブ９９において内面と対向しない箇所には切欠部１０５が形成されているので、切欠部１０５を通じて、内部空間の縁部８７，８８付近に残存する液体は、チューブ９９の内部空間へ流入可能である。

図４に示されるように、チューブ９９の内部空間を通じて、培養バッグ９０の内部空間が外部と連通されている。すなわち、各チューブ９９によってポート７３，７４が形成されている。培養バッグ９０の内部空間を区画する縁のうち、チューブ９９が配置されている縁部８７，８８は、ポート７３，７４から離れるに従って縁部８７，８８間の距離が小さくなるテーパ形状である。換言すれば、縁部８７，８８は、チューブ９９が配置されている中央へ向かって、培養バッグ９０の内部空間が外方へ拡がるように膨らんでいる。培養バッグ９０が第１バッグ保持部３１に保持された状態において、チューブ９９は、回転軸４８，４９と直交する方向へ延びる。すなわち、ポート７３，７４は、回転軸４８，４９と直交する方向へ延びる。

培養バッグ９０に用いられる合成樹脂シートとしては、可撓性を有し、培地を入れたときにバッグ形状が維持できる曲げ剛性を有するものであり、例えば、低密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、環状ポリオレフィン系樹脂、またはこれら及び他の材料とのラミネート構造を有するものが挙げられる。

培養バッグ９０の内面は、ヒト多能性幹細胞を培養するに適した細胞接着性を有する。詳細には内面は、例えばプラズマ処理などによって細胞接着性官能基が露出されている。細胞接着性官能基としては、例えば、アミノ基、アミン基、水酸基、スルホン基、スルフェン基、スルフィン基、エーテル基、カルボキシル基、カルボニル基などが挙げられる。これらのうち、細胞との接着性が高いアミノ基及びカルボキシル基が好ましい。また、培養バッグ９０の内面には、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどがコーティングされることが好ましく、細胞の接着性及び増殖性の観点からコーティング材として特に好ましいのは、ラミニン 511-E8（iMatrix）である。

図３に示されるサーババッグ３９，４０、回収バッグ４１、貯留容器１１６，１１７は、合成樹脂製のシートが張り合わされてバッグ形状に形成されたものであり、少なくとも１つのポート９４〜９８を有する。サーババッグ３９，４０は、培地を貯留するためのものである。回収バッグ４１は、細胞懸濁液を回収するためのものである。貯留容器１１６，１１７は、剥離液やプライミング液を貯留するためのものである。サーババッグ３９，４０、回収バッグ４１、及び貯留容器１１６，１１７は、公知のバッグのほか、培地や細胞懸濁液を貯留可能な公知の容器が採用されうる。

図３に示されるように、培養バッグ７０，８０，９０、サーババッグ３９，４０、回収バッグ４１、貯留容器１１６，１１７の各ポートには、チューブ３８がそれぞれ連結されている。培養バッグ７０，８０，９０のそれぞれの一方のポート７３に接続された各チューブ３８、濃縮装置１２０の流入ポートに接続されたチューブ３８、サーババッグ３９，４０の各ポート９４，９５に接続された各チューブ３８、貯留容器１１６，１１７の各ポート９７，９８に接続された各チューブ３８は、供給ポンプ９１へ延出されている。これら各チューブ３８は、供給ポンプ９１へ到達する前にコネクタを介して１本のチューブ３８にまとめられて閉鎖系の液体供給回路を構成している。また、これら各チューブ３８は、１本のチューブ３８にまとめられる前に、それぞれがバルブＶ６〜Ｖ１１に通されており、各バルブＶ６〜Ｖ１１によってチューブ３８の内部空間を液体が流通可能な開状態と、液体が流通できない閉状態とに変化可能である。

培養バッグ７０，８０，９０のそれぞれの他方のポート７４に接続された各チューブ３８、濃縮装置１２０の流出ポートに接続された各チューブ３８，回収バッグ４１のポート９６に接続されたチューブ３８は、排出ポンプ９２へ延出されている。これら各チューブ３８は、排出ポンプ９２へ到達する前にコネクタを介して１本のチューブ３８にまとめられて閉鎖系の液体排出回路を構成している。また、これら各チューブ３８は、１本のチューブ３８にまとめられる前に、それぞれがバルブＶ１２及びＶ１４〜Ｖ１８に通されており、各バルブＶ１２及びＶ１４〜Ｖ１８によってチューブ３８の内部空間を液体が流通可能な開状態と、液体が流通できない閉状態とに変化可能である。

供給ポンプ９１に通ずるチューブ３８は、再び分岐されて各々がバルブＶ１〜Ｖ５を通じて冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に置かれたバッグや容器に接続されている。これらバッグや容器には、細胞懸濁液や培地、剥離液などの試薬が貯留されている。排出ポンプ９２に通ずるチューブ３８は、廃液容器１９へ接続されている。

［培養装置１０を用いた細胞培養方法］
以下に、培養装置１０を用いた細胞培養方法が説明される。培養装置１０を用いた細胞培養は、培養バッグ７０，８０，９０のいずれか一つ又は複数を任意に選択して行うことができるが、以下には、培養バッグ７０及び培養バッグ８０を用いた細胞培養方法が説明される。培養装置１０を用いた細胞培養方法は、以下に示される各ステップを含む。
（１）培養バッグ７０内で細胞を増幅する培養ステップ。
（２）培養バッグ７０内の培地を交換する培地交換ステップ。
（３）培養バッグ７０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液を移動する継代ステップ。
（４）培養バッグ８０から細胞懸濁液を回収する細胞懸濁液回収ステップ。

培養装置１０には、予め、培養回路がセットされる。詳細には、図３に示されるように、培養バッグ７０，８０，９０が第１バッグ保持部３１、第２バッグ保持部３２、及び第３バッグ保持部３３にそれぞれセットされ、濃縮装置１２０が濃縮装置支持部１０４にセットされ、サーババッグ３９，４０が容器収納部２７，２８にそれぞれ保持され、回収バッグ４１が容器収納部２９に保持される。また、貯留容器１１６，１１７が冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に保持される。また、回路の各チューブ３８が各バルブＶ１〜Ｖ１８、供給ポンプ９１、排出ポンプ９２にセットされる。

培養制御部２１には、培養ステップ、培地交換ステップ、培養ステップ、継代ステップ、細胞懸濁液回収ステップが順次行われるように、予めユーザが設定を行っている。培養ステップにおける培養時間や、培地交換ステップにおける培地交換量、継代ステップにおける剥離液及び培地の供給量や放置時間、細胞懸濁液回収ステップにおける剥離液との反応時間などの各種設定も、予めユーザが設定を行う。培養制御部２１は、培養ステップにおいて各種設定情報を含む第１情報を出力し、培地交換ステップにおいて各種設定情報を含む第２情報を出力し、細胞懸濁液回収ステップにおいて各種設定情報を含む第３情報を出力する。回転制御部２０は、培養制御部２１から出力される各情報に基づいて回転機構３４の駆動を制御する。給排制御部２２は、培養制御部２１から出力される各情報に基づいて液体給排機構３７の駆動を制御する。

図６に示されるように、培養装置１０における培養部１４は、培養制御部２１が培養開始の入力を受け付けることにより、予備動作を行う。詳細には、培養制御部２１からの制御情報に基づいて加温装置及びＣＯ_２供給装置が駆動されることにより、培養部１４の温度が３７℃に、二酸化炭素の濃度が５％に調節される（ステップＳ１１）。続いて、回転制御部２０は、第１バッグ保持部３１が第１姿勢であるか否かを判定する（ステップＳ１２）。第１バッグ保持部３１が第１姿勢でない場合、すなわち回転機構３４におけるステッピングモータが原点位置にないと回転制御部２０が判定したときは（ステップＳ１２：Ｎｏ）回転制御部２０が回転機構３４のステッピングモータを原点位置となるまで回転する。これにより、図７に示されるように、第１バッグ保持部３１が、支持面６５，６６を水平方向に沿った第１姿勢で停止する（ステップＳ１３）。第１バッグ保持部３１が第１姿勢であるときは（ステップＳ１２：Ｙｅｓ）、回転制御部２０は回転機構３４を駆動しない。なお、第１姿勢における支持面６５，６６は、ほぼ水平方向に沿っていればよく、厳密に水平方向に沿っている必要はない。また、各バルブＶ１〜Ｖ１８は、チューブ３８を閉状態とする。

続いて、給排制御部２２は、培養バッグ７０に、ヒト多能性幹細胞を含む細胞懸濁液を供給する（ステップＳ１４）。ヒト多能性幹細胞としては、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞が挙げられる。給排制御部２２は、第１バッグ保持部３１が第１姿勢で停止しているときに、液体給排機構３７を駆動させて、培養バッグ７０に液体を供給する。図７に示されるように、第１姿勢とは、第１バッグ保持部３１の支持面６５，６６がほぼ水平方向に沿っている状態である。

細胞懸濁液の供給において、バルブＶ６，Ｖ９が開状態とされる。続いて、供給ポンプ９１が駆動される。サーババッグ４０には、予めヒト多能性幹細胞を含む細胞懸濁液が貯留されている。したがってサーババッグ４０から細胞懸濁液が、ポート７３を通じて培養バッグ７０へ供給される。サーババッグ４０から培養バッグ７０へ、予め定められた量の細胞懸濁液が供給されると、給排制御部２２は、供給ポンプ９１を停止する。なお、ステップＳ１４において、培養バッグ７０に細胞懸濁液を供給しているが、ステップＳ１４を省略し、手動で予め培養バッグ７０に細胞懸濁液を充填してもよい。

続いて、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第１バッグ保持部３１を第１姿勢から反時計回りに９０度回転する。これにより、図８に示されるように、第１バッグ保持部３１は、支持面６５，６６が鉛直方向に沿い、かつポート７４が内部空間より上方にあり、ポート７３が内部空間より下方にある第３姿勢となる（ステップＳ１５）。第３姿勢の第１バッグ保持部３１に保持された培養バッグ７０おいて、上方にあるポート７４の縁部８８には、内部空間に進入した気体が集まる。縁部８８は、ポート７４へ向かうテーパ形状なので、縁部８８に沿って移動する気体がポート７４に集まる。なお、第３姿勢における支持面６５，６６は、概ね鉛直方向に沿っていればよく、必ずしも厳密に鉛直方向に沿っている必要はない。

第１バッグ保持部３１が第３姿勢にされた後、給排制御部２２は、バルブＶ６，Ｖ９を閉状態とし、バルブＶ１３，Ｖ１５を開状態とする。続いて、給排制御部２２は、排出ポンプ９２を駆動する。これにより、培養バッグ７０のポート７４から液体又は気体が排出される。培養バッグ７０に細胞懸濁液が供給されるときに、培養バッグ７０の内部空間に気体が残っているときにはポート７４を通じて内部空間から気体が排出される（ステップＳ１６）。これにより、予備動作が終了する。

予備動作が終了した後、培養制御部２１は、培養ステップ（ステップＳ１７）、培地交換ステップ（ステップＳ１８）、培養ステップ（ステップＳ１９）、継代ステップ（ステップＳ２０），細胞懸濁液回収ステップ（ステップＳ２３）を順次行う。

［培養ステップ］
以下、培養ステップが説明される。培養ステップが行われるときには、培養制御部２１は、第１情報を回転制御部２０及び給排制御部２２に出力する。回転制御部２０は、回転機構３４を駆動させて、第１バッグ保持部３１を第１姿勢とする。これにより、培養バッグ７０において、一方の内面が上方となり、他方の内面が下方となる。培養バッグ７０の内部空間には、ヒト多能性幹細胞と培地とを含む細胞懸濁液が貯留されている。内部空間において、ヒト多能性幹細胞は、細胞懸濁液中を重力により降下して他方の内面に接触する。これにより、他方の内面にヒト多能性幹細胞が付着して培養される。

回転制御部２０は、予め設定された時間が経過した後、図９に示されるように、回転機構３４を駆動させて、第１姿勢の第１バッグ保持部３１を培養装置１０の前方から視て時計回りに１８０度回転する。これにより、第１バッグ保持部３１は、支持面６５，６６が水平方向に沿っており、かつ培養バッグ７０の他方の内面が上方であり、一方の内面が下方となる第４姿勢となる。培養バッグ７０において、他方の内面が上方となり、一方の内面が下方となると、培養バッグ７０の内部空間に貯留された細胞懸濁液に含まれており、かつ他方の内面に付着していないヒト多能性幹細胞は、細胞懸濁液内を重力により降下して一方の内面に接触する。これにより、一方の内面にヒト多能性幹細胞が付着して培養される。回転制御部２０は、予め設定された時間が経過するまで、第１バッグ保持部３１を第４姿勢に維持する。予め設定された時間が経過すると、培養ステップが終了する。

［培地交換ステップ］
培養制御部２１から第２情報を受信した回転制御部２０及び給排制御部２２は、冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に保存された新鮮培地を貯留する貯留容器１１７と接続されているチューブ３８が通されたバルブＶ１とバルブＶ７を開状態として、供給ポンプ９１を駆動して、サーババッグ３９に新鮮培地を供給する。その後、給排制御部２２は、供給ポンプ９１を停止し、バルブＶ１を閉状態とし、バルブＶ６を開状態とする。給排制御部２２は、サーババッグ３９，４０と接続されているチューブ３８が通されたバルブＶ６，Ｖ７を開状態として、供給ポンプ９１を逆向きに駆動して、サーババッグ４０に新鮮培地を供給する。その後、給排制御部２２は、供給ポンプ９１を停止し、バルブＶ６，Ｖ７を閉状態とする。新鮮培地は、サーババッグ４０において３７℃に加温されるべく保持される。

図１０に示されるように、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第４姿勢の第１バッグ保持部３１を、培養装置１０の前方から視て第１姿勢から時計回りに３０度回転した状態とする。これにより、第１バッグ保持部３１は、支持面６５，６６が水平方向に対して鋭角をなす角度が３０度となり、かつポート７３が内部空間より上方にあり、ポート７４が内部空間より下方にある第２姿勢となる。なお、第２姿勢は、支持面６５，６６が水平方向に対して鋭角をなす角度が３０度に限定されず、支持面６５，６６が水平方向及び鉛直方向に沿っていなければ任意に設定されてよい。好ましくは、第２姿勢において、支持面６５，６６が水平方向に対して鋭角をなす角度は、２０度以上７０度以下である。さらに好ましくは、３０度以上６０度以下である。

続いて、給排制御部２２は、培養バッグ７０から培地を排出する。詳細には、給排制御部２２は、第１バッグ保持部３１が第２姿勢で停止しているときに、液体排出機構８２を駆動させて、バルブＶ１３，Ｖ１５を開状態として、排出ポンプ９２が駆動する。制御部１１は、排出ポンプ９２が駆動されてから予め設定された時間が経過したかを監視する。時間としては、排出ポンプ９２が培養バッグ７０から半量の液体を排出するに十分な時間より長い時間が設定されている。制御部１１は、排出ポンプ９２が駆動されてから予め設定された時間が経過したと判定すると、給排制御部２２は、排出ポンプ９２を停止し、バルブＶ１３，Ｖ１５を閉状態とする。これにより、培養バッグ７０に貯留された培地の半分が、培養バッグ７０の内部空間から排出される。第１バッグ保持部３１が第２姿勢に維持されることにより、ポート７４から培地が排出されやすくなり、また培地の半分が培養バッグ７０から排出されても、培養バッグ７０の内面同士が接触し難い。

培養バッグ７０から半分の培地が排出された後、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第１バッグ保持部３１を第１姿勢とする。第１バッグ保持部３１が第１姿勢にされた後、バルブＶ６，Ｖ９が開状態とされ、培養バッグ７０への培地の供給が、前述された液体供給ステップと同様に行われる。これにより、サーババッグ４０に貯留されている新鮮培地が、培養バッグ７０へ供給される。培養バッグ７０へ供給される新鮮培地の量は、先に培養バッグ７０から排出された量と同じ、すなわち内部空間に貯留されていた培地の半分である。給排制御部２２は、培養バッグ７０に新鮮培地が供給された後、供給ポンプ９１を停止して、バルブＶ６，Ｖ９を閉状態とする。

培養バッグ７０へ新鮮培地が供給された後、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第１姿勢の第１バッグ保持部３１を第３姿勢とし、給排制御部２２は、バルブＶ１３，Ｖ１５を開状態として、排出ポンプ９２を駆動する。これにより、培養バッグ７０の内部空間から、ポート７４を通じて培地とともに気体が排出される。そして、排出ポンプ９２が停止され、バルブＶ１３，Ｖ１５が閉状態とされて、培地交換ステップ（ステップＳ１８）が終了する。培地交換ステップ（ステップＳ１８）が終了すると、前述と同様にして培養ステップ（ステップＳ１９）が行われる。

［継代ステップ］
以下、継代ステップについて説明する。継代ステップにおいて、培養バッグ７０において培養されたヒト多能性幹細胞が回収される（ステップＳ２０）。細胞懸濁液の回収が行われるときには、培養制御部２１は、第３情報を回転制御部２０及び給排制御部２２に出力する。図１１に示されるように、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第４姿勢の第１バッグ保持部３１を第３姿勢とする（ステップＳ４１）。なお、本実施形態においては、第１バッグ保持部３１の支持面６５，６６が鉛直方向に沿っている姿勢であれば、ポート７３，７４のいずれかが上方又は下方にあっても、第３姿勢と称している。

第１バッグ保持部３１が第３姿勢にされた後、培養バッグ７０からの培地の排出が行われる。給排制御部２２は、バルブＶ１３，Ｖ１５を開状態として、排出ポンプ９２を駆動する。これにより、培養バッグ７０に貯留された培地の全量が、ポート７４と通じて内部空間から排出される（ステップＳ４２：培地排出ステップの一例）。培養バッグ７０から培地の全量が排出された後、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第３姿勢の第１バッグ保持部３１を第１姿勢にする（ステップＳ４３）。

第１バッグ保持部３１が第１姿勢にされた後、培養バッグ７０への剥離液の供給が行われる。給排制御部２２は、冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に保存された剥離液を貯留する容器と接続されているチューブ３８が通されたバルブＶ３〜Ｖ５のいずれかと、バルブＶ９とを開状態として、供給ポンプ９１を駆動する。これにより、培養バッグ７０の内部空間へポート７３を通じて剥離液が供給される（ステップＳ４４：剥離液供給ステップの一例）。

培養バッグ７０へ剥離液が供給された後、給排制御部２２は、供給ポンプ９１を停止して、開状態としたバルブＶ３〜Ｖ５のいずれかと、Ｖ９を閉状態とする。回転制御部２０は、予め設定された時間が経過するまで（ステップＳ４５：Ｎｏ）、第１バッグ保持部３１を第１姿勢に維持する。剥離液によって、培養バッグ７０の各内面に付着していたヒト多能性幹細胞の各内面への接着が弱まる。このような各内面に対してヒト多能性幹細胞の接着を弱める作用は、剥離液の種類や濃度、各内面の接触時間、第１バッグ保持部３１などの姿勢などが適宜設定されることによって実現される。剥離液としては、例えば、ＥＤＴＡ、Trypsin、TrypLE select、TrypLE Express、Dispase、Collagenase、ＣＴＫ液などが用いられる。

回転制御部２０は、予め設定された時間が経過した後（ステップＳ４５：Ｙｅｓ）、回転機構３４を駆動して、第１バッグ保持部３１を第１姿勢から第３姿勢とする（ステップＳ４６）。第１バッグ保持部３１が第３姿勢にされた後、培養バッグ７０からの剥離液の排出が行われる。給排制御部２２は、バルブＶ６，Ｖ９を開状態として、供給ポンプ９１を逆向きに駆動する。これにより、培養バッグ７０において剥離液がポート７３を通じて内部空間から廃液容器１９へ排出される（ステップＳ４７：剥離液排出ステップの一例）。培養バッグ７０から剥離液の全量が排出された、培養バッグ７０の内面の少なくとも一部、好ましくは培養バッグ７０の内面におけるチューブ９９の周囲を除く部分が接触した後、回転制御部２０は、回転機構３４を駆動して、第１バッグ保持部３１を第３姿勢から第１姿勢とする（ステップＳ４８）。なお、培養バッグ７０から剥離液が排出されるときの第１バッグ保持部３１の姿勢は、第３姿勢でなく、第２姿勢であってもよい。すなわち、本実施形態における第２姿勢及び第３姿勢のいずれもが、本発明における第２姿勢の一例である。また、培養バッグ７０から剥離液の全量が排出されたときに培養バッグ７０の内面同士が接触する部分の割合は多いほどの好ましいが、必ずしも各内面の全てが接触する必要はない。すなわち、剥離液が作用した培養バッグ７０の内面において、接着が弱まった細胞が対向するシートに挟まれていれば、培養バッグ７０の内面から細胞が剥離することが抑制される。

第１バッグ保持部３１が第１姿勢にされた後、培養バッグ７０への培地の供給が行われる。給排制御部２２は、冷蔵保存部１２又は常温保存部１３に保存された培地を貯留する容器と接続されているチューブ３８が通されたバルブＶ３〜Ｖ５のいずれかと、バルブＶ９とを開状態として、供給ポンプ９１を駆動する。これにより、培養バッグ７０の内部空間へポート７３を通じて培地が供給される（ステップＳ４９：細胞剥離ステップの一例）。培地としては、mTeSR1、TeSR2、TeSR-E8、Essential E8 Medium、StemPro、N2B27、CELRENA、S-Medium、StemSure、StemFitなどが用いられる（特開２０１１−７８３７０号公報）。培養バッグ７０に供給された培地は、チューブ９９付近から相互に接触している培養バッグ７０の内面同士の間を流通しつつ、培養バッグ７０の内部空間に貯留される。このような培地の流れによって、培養バッグ７０の内面から細胞が剥離される。

培養バッグ７０へ培地が供給された後、給排制御部２２は、供給ポンプ９１を停止して、開状態としたバルブＶ３〜Ｖ５のいずれかと、Ｖ９を閉状態とする。回転制御部２０は、予め設定された時間が経過するまで（ステップＳ５０）、第１バッグ保持部３１を第１姿勢に維持する。前述されたように、培地の供給によって、培養バッグ７０の各内面に付着していたヒト多能性幹細胞が剥離される。培地の供給による各内面からのヒト多能性幹細胞の剥離は、培地の流速や、第１バッグ保持部３１などの姿勢、放置時間などが適宜設定されることによって実現される。なお、培養バッグ７０へ培地が供給された後、必要があれば、前述と同様にして培養バッグ７０の内部空間から気体が排出されてもよい。また、培養バッグ７０の各内面から剥離したヒト多能性幹細胞は、複数個の細胞が相互に付着して一体となった細胞塊（コロニー）を形成している。

回転制御部２０は、予め設定された時間が経過した後（ステップＳ５０）、回転機構３４を駆動して、第１バッグ保持部３１を第１姿勢から第３姿勢とする（ステップＳ５１）。第１バッグ保持部３１が第３姿勢にされた後、培養バッグ７０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液が移動される。給排制御部２２は、バルブＶ６，Ｖ９を開状態として、供給ポンプ９１を逆向きに駆動する。これにより、培養バッグ７０において細胞懸濁液がポート７３を通じて内部空間から排出され（ステップＳ５２）、細胞塊を崩壊させてサーババッグ４０に回収される。すなわち、分散ステップが実行される。なお、分散ステップは、培養バッグ７０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液が移動するまでに実行されればよい。続いて、給排制御部２２は、バルブＶ６，Ｖ１０とを開状態として、供給ポンプ９１を駆動する。これにより、サーババッグ４０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液が供給される（ステップＳ５３）。すなわち、細胞懸濁液移動ステップが実行される。

培養バッグ７０からサーババッグ４０へ細胞懸濁液が移動されるとき、及びサーババッグ４０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液が移動されるときに、細胞懸濁液は供給ポンプ９１によって流動する。供給ポンプ９１において、チューブにローラが当接しつつ回転することによって、チューブが撓みつつ扱かれることにより、供給ポンプ９１を流通する細胞懸濁液に含まれる細胞塊が崩壊される。なお、細胞塊の崩壊は、必ずしも細胞塊が単一のヒト多能性幹細胞となるまで行われる必要はなく、単一に分散されたヒト多能性幹細胞のほか、数個から数十個程度のヒト多能性幹細胞が接着した状態にまで崩壊されていればよい。

細胞懸濁液が培養バッグ８０に移動された後、第２バッグ保持部３２が第１姿勢で５分から１２時間放置された後、前述と同様にして培地交換ステップ（ステップＳ１８）が行われる。第２バッグ保持部３２が第１姿勢で放置されている間に、細胞懸濁液に含まれる細胞が培養バッグ８０の内面に十分に接着する。なお、第２バッグ保持部３２は、放置されている間に第１姿勢から第４姿勢に姿勢変化されてもよい。その後、培養バッグ８０において、前述と同様に培養ステップ（ステップＳ１９）が行われる。培養バッグ８０における培養が行われた後、前述と同様にして細胞懸濁液回収ステップ（ステップＳ２０）が行われ、継代が行われないのであれば（ステップＳ２１：Ｎｏ）、必要に応じて細胞懸濁液の濃縮ステップ（ステップＳ２３）が行われて、細胞培養が終了する。

［本実施形態の作用効果］
本実施形態によれば、培養バッグ７０の内部空間においてヒト多能性幹細胞が培養される。継代に際して、培地排出ステップ（ステップＳ４２）により培養バッグ７０から培地が排出される。そして、剥離液供給ステップ（ステップＳ４４）により、培養バッグ７０に剥離液が流入される。これにより、培養バッグ７０の各内面に付着しているヒト多能性幹細胞に剥離液が作用するが、ヒト多能性幹細胞は、各内面から完全に剥離されない。剥離液排出ステップ（ステップＳ４７）により、培養バッグ７０から剥離液が流出された後、細胞剥離ステップ（ステップＳ４９）により、培養バッグ７０に培地が供給される。これにより、培養バッグ７０の各内面からヒト多能性幹細胞が剥離され、培養バッグ７０の内部空間には、ヒト多能性幹細胞と培地との細胞懸濁液が作成される。培地の供給による培地の流れを受けて培養バッグ７０の内面から細胞が剥離するので、剥離のために細胞に付与される力が穏やかである。分散ステップにより、培養バッグ７０から流出された細胞懸濁液に含まれる細胞塊がシングルセルあるいはシングルセルに近い状態まで崩壊される。培地の流れを受けて細胞塊が崩壊されるので、容易且つ穏やかに細胞塊が崩壊される。細胞懸濁液移動ステップ（ステップＳ５２，Ｓ５３）により、培養バッグ７０から培養バッグ８０に細胞懸濁液が移動される。その後、培地交換ステップ（ステップＳ１８）が行われるまでに、培養バッグ８０が５分から１２時間放置されている間に、培養バッグ８０の内面に細胞懸濁液中にヒト多能性幹細胞が付着する。そして、培養バッグ８０において、培地が交換される（ステップＳ１８）。これにより、ヒト多能性幹細胞の培養において、遠心分離を必要とせずに継代を実現できる。

また、供給ポンプ９１により、培養バッグ７０から培養バッグ８０へ細胞懸濁液が移動されると共に、ヒト多能性幹細胞の細胞塊が崩壊される。そのため、フィルタのような細胞塊を崩壊させるための部材を別途に設ける必要がないので、培養装置１０の構成が簡略化される。

また、第１姿勢において培養バッグ７０が安定して第１バッグ保持部３１に支持されるので、培養バッグ７０に培地が供給されるときに、培養バッグ７０の姿勢変化が少ない。また、第１バッグ保持部３１が第２姿勢又は第３姿勢とされることにより、培養バッグ７０に貯留された剥離液が重力によってポート７３へ移動するので、培養バッグ７０から剥離液が排出されるときに、培養バッグ７０に残留する剥離液を少なくすることができる。

また、剥離液排出ステップにおいて、培養バッグ７０の内部空間を区画して対向するシートの内面の少なくとも一部が接触するまで剥離液が排出されるので、培養バッグ７０に残存する剥離液を少なくすることができる。また、培養バッグ７０は閉鎖系の液体供給回路及び液体排出回路と接続されているので、剥離液が排出された後、培地が流入されるまでの間に、培養バッグ７０内において細胞が乾燥することを抑制できる。また、剥離液が排出されると、培養バッグ７０において対向するシートの内面が接触しているので、シートの内面に付着している細胞が対向するシートによって挟み込まれ、シートから細胞が剥離することが抑制される。その後の細胞剥離ステップにおいて培養バッグ７０に培地が流入されるときには、対向して接触しているシートの間に培地が流れるので、シート間における培地の勢い（流速）を高めることができ、シートから細胞が剥離しやすい。

また、培養バッグ７０は、各縁部８７，８８がそれぞれポート７３，７４へ向かって内部空間が外方へ拡がる形状なので、第２姿勢又は第３姿勢において、培養バッグ７０の内部空間において重力により剥離液がポート７３，７４へ向かって流れる。

［変形例］
なお、本実施形態では、培養制御部２１に、培養ステップ、培地交換ステップ、培養ステップ、継代ステップ、細胞回収ステップが順次行われるように設定されている例が説明されたが、各ステップは任意に設定される。また、各ステップは、それぞれが個別独立して行われるように設定されていてもよい。すなわち、各ステップ毎に培養装置１０の動作が停止され、次に行うべき培養装置１０の動作をユーザが任意に入力するように設定されていてもよい。また、継代ステップ以外の各ステップ、すなわち、培養ステップ、培地交換ステップ、培養ステップ、細胞回収ステップは、任意の他の設定に変更されてもよい。

また、細胞培養において、培養バッグ７０，８０，９０のいずれもが任意に使用することができる。また、サーババッグ３９，４０や回収バッグ４１などは任意の構成であり、必要に応じて用いられればよい。

また、培養バッグ７０には、２つのポート７３，７４が形成されているが、ポートは１つのみ形成されていてもよい。また、第１バッグ保持部３１の支持面６５，６６が鉛直方向に沿っている姿勢であれば、ポート７３，７４のいずれかが上方又は下方にあっても、第３姿勢と称しているが、ポートが１つのみ形成されている場合において、細胞懸濁液回収ステップにおいて、培養バッグ７０から細胞懸濁液を排出するときは、ポートが内部空間より下方にある姿勢のみが第３姿勢とされる。

また、本実施形態では、培養容器として培養バッグ７０が用いられたが、培養容器はバッグ形状のものに限定されず、可撓性を有するボトルやカセットなどの形状のものが採用されてもよい。

培養装置１０の培養バッグ７０において、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）をｍＴｅＳＲ１培地を用いて培養した後、前述された継代ステップを行った。剥離液としては、ＥＤＴＡとTrypLE selectを用いた。剥離液の排出条件、及び培養バッグ８０へ細胞懸濁液を移行してから培地交換までの時間を、下記の条件１，２，３として、培養バッグ８０における細胞コロニーの接着性を顕微鏡を用いて観察した。その結果を、図１２に示す。

［表１］ 条件

図１２において白三角（△）で示される箇所は、細胞コロニーの接着が不良と認められる箇所であり、黒三角（▲）で示される箇所は、細胞コロニーが十分に接着していると認められる箇所である。図１２から明らかなように、条件１では、細胞の接着が不良である箇所が多く、条件２では、細胞の接着が不良である箇所と、細胞が十分に接着している箇所とが混在しており、条件３では、細胞が十分に接着している箇所が多かった。

１０・・・培養装置
２０・・・回転制御部
２１・・・培養制御部
２２・・・給排制御部
３１，３２，３３・・・バッグ保持部（容器保持部）
３４・・・回転機構
３７・・・液体給排機構
４２，４３・・・保持板
４８，４９・・・回転軸
６５，６６・・・支持面
７０，８０，９０・・・培養バッグ（第１培養容器、第２培養容器）
７３・・・ポート
７４・・・ポート
７５・・・内部空間
７７，７８・・・端部
８７，８８・・・縁部
９１・・・供給ポンプ（チューブポンプ）

Claims (10)

1. 液体が流通するポートをそれぞれ有しており、各内部空間においてヒト多能性幹細胞の培養が可能な第１培養容器及び第２培養容器と、
   上記第１培養容器及び上記第２培養容器へ液体をそれぞれ供給及び排出する液体給排機構と、
   上記液体給排機構を制御する給排制御部と、を具備しており、
   上記給排制御部は、
   上記液体給排機構に、ヒト多能性幹細胞が培養された上記第１培養容器から培地を流出させる培地排出ステップと、
   培地が排出された上記第１培養容器に剥離液を流入させる剥離液供給ステップと、
   上記第１培養容器から剥離液を流出させる剥離液排出ステップと、
   剥離液が排出された上記第１培養容器に培地を流入させて細胞を剥離する細胞剥離ステップと、
   上記第１培養容器から細胞懸濁液を流出させ、当該細胞懸濁液に含まれる細胞塊を崩壊させる分散ステップと、
   崩壊された細胞塊を含む上記細胞懸濁液を上記第２培養容器へ流入させる細胞懸濁液移動ステップと、
   細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器において細胞が第２培養容器に十分に接着した後、当該第２培養容器の培地を交換する培地交換ステップと、を実行する培養装置。
2. 上記液体給排機構は、液体が流通するチューブと、当該チューブに当接して当該チューブを撓ませつつ移動することによって、当該チューブ内の液体を移動させるチューブポンプと、を具備するものであり、
   上記給排制御部は、上記分散ステップにおいて、ヒト多能性幹細胞の細胞塊を含む細胞懸濁液を上記チューブポンプに流通させることによって、細胞塊を崩壊させる請求項１に記載の培養装置。
3. 上記培地交換ステップは、細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器を５分から１２時間放置した後、当該第２培養容器の培地を交換するステップである請求項１又は２に記載の培養装置。
4. 上記第１培養容器及び上記第２培養容器は、可橈性のシートによって上記内部空間が区画されたバッグ形状であって、上記チューブを通じて上記液体給排機構と閉鎖系で接続されており、
   上記剥離液排出ステップは、上記第１培養容器の内部空間を区画して対向するシートの内面の少なくとも一部が接触するまで剥離液を排出するステップである請求項２に記載の培養装置。
5. 上記第１培養容器を保持する保持板、及び回転軸を有する容器保持部と、
   上記回転軸を支持して回転させる回転機構と、
   上記容器保持部を上記保持板における上記第１培養容器を支持する支持面が略水平方向に沿った第１姿勢、及び上記支持面が略水平方向に沿っておらず且つ上記ポートが上記回転軸より重力方向の下方に位置する第２姿勢となるように、上記回転機構の回転を制御する回転制御部と、を更に備え、
   上記回転制御部は、
   上記剥離液排出ステップにおいて、上記容器保持部が上記第２姿勢となるように上記回転機構を回転させ、
   上記細胞剥離ステップにおいて、上記容器保持部が上記第１姿勢となるように上記回転機構を回転させる請求項１から４のいずれかに記載の培養装置。
6. 上記第１培養容器は、可橈性のシートによって上記内部空間が区画されたバッグ形状であって、上記内部空間を区画しており、且つ上記ポートが配置されている上記シートの縁部が、上記ポートへ向かって上記内部空間が外方へ拡がる形状である請求項５に記載の培養装置。
7. 上記第１培養容器及び上記第２培養容器は、内部空間を区画する内面にヒトラミニンの活性フラグメントがコーティングされたものである請求項１から６のいずれかに記載の培養装置。
8. ヒト多能性幹細胞が培養された第１培養容器から培地を流出させる培地排出ステップと、
   培地が排出された上記第１培養容器に剥離液を流入させる剥離液供給ステップと、
   上記第１培養容器から、上記第１培養容器の内部空間を区画して対向するシートの内面が接触するまで剥離液を排出させる剥離液排出ステップと、
   剥離液が排出された上記第１培養容器に培地を流入させて細胞を剥離する細胞剥離ステップと、
   上記第１培養容器から細胞懸濁液を流出させ、当該細胞懸濁液に含まれる細胞塊を崩壊させる分散ステップと、
   崩壊された細胞塊を含む上記細胞懸濁液を上記第２培養容器へ流入させる細胞懸濁液移動ステップと、
   細胞懸濁液が流入された上記第２培養容器を５分から１２時間放置した後、当該第２培養容器の培地を交換する培地交換ステップと、を含む培養方法。
9. 上記分散ステップにおいて、
   液体が流通するチューブに当接して当該チューブを撓ませつつ移動することによって、当該チューブ内の液体を移動させるチューブポンプに、ヒト多能性幹細胞の細胞塊を含む細胞懸濁液を流通させることによって、細胞塊を崩壊させる請求項８に記載の培養方法。
10. 上記剥離液排出ステップにおいて、上記第１培養容器を支持する容器保持部の支持面が略水平方向に沿っておらず且つ上記ポートが上記内部空間より重力方向の下方に位置する姿勢とし、
    上記細胞剥離ステップにおいて、上記支持面が略水平方向に沿った姿勢とする請求項８又は９に記載の培養方法。

Images