JPWO2018062392A1

JPWO2018062392A1 - ダウン症モデルラット及びその作製法

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Publication number: JPWO2018062392A1
Application number: JP2018542860A
Authority: JP
Inventors: 康宏香月; 光雄押村
Original assignee: Trans Chromosomics Inc
Current assignee: Trans Chromosomics Inc
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2019-08-22
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: EP3520609A4; US11825817B2; EP3520609A1; US20200029539A1; AU2017335058A1; AU2017335058B2; WO2018062392A1; JP7011228B2; CA3038638A1

Abstract

この出願は、ヒト２１番染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット、或いは、ヒト２１番染色体もしくはその断片、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片、を含み、前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット、並びに、上記ダウン症モデルラットの作製方法を提供する。

Description

本発明は、ダウン症の症状をもつ新規モデルラット及びその作製方法に関する。

ダウン症（「ダウン症候群」とも称する。）は、ヒト発生過程における２１番染色体トリソミーを原因とする先天性疾患であり、精神遅滞、心奇形、早発性アルツハイマー病、小児白血病、免疫系異常などの障害性の表現型をもたらすことが知られている。さらにダウン症は染色体異常であるため治療法がないし、またダウン症の各種の障害が起こる機序についてもほとんど分かっていない。さらにまた、ダウン症患者の表現型に関して、どのような遺伝子（群）がダウン症候群に見られる症状に対応しているのか、すなわち表現型と遺伝子型の相関関係についても明らかになっていない。

このような情況において、ダウン症の発症機序の解明、症状軽減のための治療法の開発などのために、ダウン症モデルマウスが作製されてきた。例えば、Ｔｓ１Ｃｊｅマウス及びＴｓ６５Ｄｎマウスは染色体再構成したマウス１６番染色体を有するモデルマウスである（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。Ｔｓ６５Ｄｎマウスは、雄マウスの精巣に照射後、それらのマウスを交配し、染色体再構成のあるトリソミーマウスを選抜することによって作製された。また、それらとは別に、ヒト２１番染色体を含むダウン症モデルマウスが作製され、それらがダウン症に見られる行動異常や心臓異常を示すことが記載されている（非特許文献４、非特許文献５）。このマウスは、ヒト２１番染色体を導入したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞をマウス８細胞期胚や胚盤胞期胚に注入したのち、子宮に移植し、生まれたキメラマウス、それらの後代のなかから選抜された。

しかし、ラットについては、洗練された認知機能テストを行うことができることからマウスに代わるモデル動物として好ましいことが分かっているが、ラットモデルの作製が非常に難しいことから、ダウン症モデルラットはこれまで作製されていない。

Ｍ．Ｔ．Ｄａｖｉｓｓｏｎｅｔａｌ．，"Ｓｅｇｍｅｎｔａｌｔｒｉｓｏｍｙｏｆｍｕｒｉｎｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１６：ａｎｅｗｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇＤｏｗｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，"ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２１ａｎｄＤｏｗｎＳｙｎｄｒｏｍｅ，Ｄ．ＰａｔｔｅｒｓｏｎａｎｄＣ．Ｊ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｅｄｓ．，ｐｐ．２６３−２８０，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ，１９９０Ｌ．Ｅ．Ｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＤｙｎａｍｉｃｓ２００４；２３０（３）：５８１−５８９Ｇ．Ｎ．Ｖａｃａｎｏｅｔａｌ．，"ＴｈｅｕｓｅｏｆｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆＤｏｗｎＳｙｎｄｒｏｍｅａｎｄａｇｉｎｇ，"ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＧｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｒｉａｔｒｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ２０１２，ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ７１７３１５，ＨｉｎｄａｗｉＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＴ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ２００１；１０（１１）：１１６３−１１７５Ａ．Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５；３０９：２０３３−２０３７

本発明の目的は、ダウン症モデルラット及びその作製法を提供することである。

前述したとおり、モデルマウスと異なりダウン症モデルラットの作製は非常に難しいことが知られている。その理由として、子孫伝達可能なラットＥＳ細胞を得ることができなかったことが挙げられる。また、たとえ、上記の非特許文献５と同様に、ラットＥＳ細胞にヒト２１番染色体を導入し、初期胚に注入し、子宮に移植したとしても、子孫伝達可能なダウン症モデルラットを作製することは難しい。さらにまた、非特許文献４に記載される方法で作製されたダウン症モデルマウスでは、ヒトで見られるような症状と必ずしも対応しなかった。もしそのようなモデルラットが作製できれば、マウスと比べて洗練された認知機能などの高次脳機能テストを行うことができる可能性が高いため、行動異常等の表現型の異常を検索し、その原因遺伝子を同定することなどが可能になるため、ダウン症の原因解明や治療剤開発などの面で有用性が高いと考えられる。

本発明者らは、今回、鋭意研究の結果、ラットＥＳ細胞（雄系統）の作製、微小核細胞融合（ＭＭＣＴ）法、卵子内円形精子注入（ＲＯＳＩ）法などを組み合わせる手法を駆使することによって、子孫伝達可能なダウン症モデルラットの作製に初めて成功し、それによって本発明を完成させた。

したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）ヒト２１番染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
（２）ヒト２１番染色体もしくはその断片、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片、を含み、当該ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
（３）上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、子孫ラットの組織内で８０〜９０％以上の保持率で保持されている、上記（２）に記載のダウン症モデルラット。
（４）正常ラットと比較して、不安様行動又は記憶障害を含む行動異常を有する、上記（２）又は（３）に記載のダウン症モデルラット。
（５）上記ヒト２１番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ１０〜３４Ｍｂのサイズを有する、上記（２）〜（４）のいずれかに記載のダウン症モデルラット。
（６）上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、上記（２）〜（５）のいずれかに記載のダウン症モデルラット。
（７）上記（２）〜（６）のいずれかに記載の子孫伝達可能なダウン症モデルラットの作製方法であって、ヒト２１番染色体もしくはその断片を含む、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含む、ミクロセルと雄系統のラットＥＳ細胞とを微小核細胞融合法により融合し、それによりヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を含み、上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであるＥＳ細胞を作製する工程、上記ＥＳ細胞をラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚に導入し、得られた胚をラット仮親の子宮に移植してキメララットを作製する工程、得られた雄キメララットから得た円形精子細胞をラットの卵子に卵子内円形精子注入法（ＲＯＳＩ）により顕微受精し、或いは卵子内延長精子細胞注入法（ＥＬＳＩ）により上記雄キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精し、或いは卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）により上記雄キメララットの精子とラットの卵子を顕微受精し、子孫ラットを作製する工程、並びに、上記子孫ラットからヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する子孫伝達可能なラットを選別する工程を含む方法。
（８）上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、上記（７）に記載の方法。
（９）上記ヒト２１番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ１０〜３４Ｍｂのサイズを有する、上記（７）又は（８）に記載の方法。

本発明により、子孫伝達可能なダウン症モデルラットが提供される。当該ラットは、それに導入されたヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片は極めて安定に保持されるため、ダウン症モデル動物として有用であり、ダウン症に対する医薬品開発、治療法開発、発症機序の解明などのために有用である。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６−１９０４２２号の開示内容を包含する。

図１ａは、実施例１の手順の模式図を示す。図１ｂは、組換え前のｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰアレルの部分構造、ＥＧＦＰ導入ベクター（Ｉ−ＥＧＦＰ−Ｉ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ）、及び、当該ベクターによりＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換えが行われた改変ヒト２１番染色体（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）のアレルの部分構造を示す。図中、ＣＨＯはチャイニーズハムスター卵巣細胞を表し、ｈＣｈｒ．２１はヒト２１番染色体を表し、ＥＧＦＰは蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを表し、ＨＰＲＴもしくはｈｐｒｔはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を表し、Ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子を表し、及びＴＫはチミジンキナーゼ遺伝子を表す。ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのラットＥＳ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）クローンのｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒＦＩＳＨ解析結果を示す。矢印は、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰの存在を示す。ラットＥＳ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）から作製したキメララットの作製結果のまとめを示す。表中、ＧＴは、ジャームライン・トランスミッション（生殖細胞系列伝達）が生じた雄個体の数を示す。ラットＥＳ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）から作製したキメララット雄個体の一部（４０％以上キメラ）における、ＥＳ細胞の毛色寄与率、全身でのＧＦＰ陽性有無、精細管ＧＦＰ陽性有無を示す。精細管ＧＦＰ陽性がわずかに１個体（＃１７５３−２）得られたことが分かる。キメラ個体番号＃１７５３−２、＃１７５３−３における精巣の明視野およびＧＦＰ蛍光写真を示す。＃１７５３−２精細管の一部でＧＦＰ陽性（矢印で表示した。）であることがわかる。ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの血液培養細胞のｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒＦＩＳＨ解析結果（核型解析結果）を示す。図中、ｈＣｈｒ．２１はヒト２１番染色体を表す。ＴＣ（２１ＨＡＣ２）マウスとＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの末梢血におけるＦＣＭ解析によるＧＦＰ陽性率（％）の測定結果を示す。ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット各組織における明視野およびＧＦＰ蛍光視野を示す。蛍光視野の各パネルにおいて、白く光っている部分がＧＦＰ陽性である。数字は露光時間を示す。ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの末梢血、骨髄、脾臓における各血液細胞系譜におけるＦＡＣＳ解析によるＧＦＰ陽性率（％）の測定結果を示す。ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡをプローブとしたときのＦＩＳＨ解析によるＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット各組織におけるヒト２１番染色体（ｈＣｈｒ．２１）保持率（％）の測定結果を示す。ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット各組織におけるヒト２１番染色体上の遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析の結果を示す。明暗往来試験（Ａ；総運動量（回数）、Ｂ；移所回数、Ｃ；明箱滞在時間（秒）、Ｄ；移所潜時間（秒））の結果を示す。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは正常ラット対照を表し、またＤＳはダウン症モデルラットを表す。また、*、**、***はそれぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１を示す。オープンフィールド試験（中心滞在時間（秒）と総移動距離（メートル）の比率）の結果を示す。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは正常ラット対照を表し、またＤＳはダウン症モデルラットを表す。高架式十字迷路試験（Ａ；総移動距離（メートル）、Ｂ；オープンアーム進入回数、Ｃ；オープンアーム滞在時間（秒））の結果を示す。図中、Ｃｏｎｔｒｏｌは正常ラット対照を表し、またＤＳはダウン症モデルラットを表す。

本発明をさらに具体的に説明する。
１．ダウン症モデルラットの作製
本発明のダウン症モデルラットは、ラットＥＳ細胞（雄系統）の作製、微小核細胞融合（ＭＭＣＴ）、卵子内円形精子注入（ＲＯＳＩ）もしくは卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）もしくは卵子内延長精子細胞注入（ＥＬＳＩ）、並びに選別を組み合わせた方法によって作製することができる。

具体的には、本発明の子孫伝達可能なダウン症モデルラットは、次のようにして作製できる。その方法は、ヒト２１番染色体もしくはその断片を含む、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含む、ミクロセルと雄系統のラットＥＳ細胞とを微小核細胞融合法により融合し、それによりヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を含み、上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであるＥＳ細胞を作製する工程、上記ＥＳ細胞をラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚に導入し、得られた胚をラット仮親の子宮に移植してキメララットを作製する工程、得られた雄キメララットから得た円形精子細胞をラットの卵子に卵子内円形精子注入（ＲＯＳＩ）法により顕微受精し、或いは卵子内延長精子細胞注入（ＥＬＳＩ）法により上記雄キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精し、或いは卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）法により上記雄キメララットの精子とラットの卵子を顕微受精し、子孫ラットを作製する工程、並びに、前記子孫ラットからヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する子孫伝達可能なラットを選別する工程を含む。

本発明の一実施形態により、上記の方法において上記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片は、当該染色体を選別するための選択マーカー遺伝子、例えば蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ（「蛍光遺伝子」という）を含むことができる。

或いは、本発明のダウン症モデルラットは、ヒト２１番染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラットであってもよい。

本明細書中の「ヒト２１番染色体もしくはその断片」という用語は、特に断らない限り、実質的に完全なヒト２１番染色体、完全なヒト２１番染色体の、セントロメアを含む約１０Ｍｂ〜約３４Ｍｂサイズの染色体断片、或いは、当該実質的に完全なヒト２１番染色体又はその染色体断片の塩基配列中に外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡを含むその改変体、又は当該実質的に完全なヒト２１番染色体、当該染色体断片、もしくは当該改変体においてそのヒトセントロメアがマウスセントロメア（例えばマウス１１番若しくは１６番染色体のセントロメア）に置換された改変体、のいずれかを示す意味で使用される。

ここで、「実質的に完全なヒト２１番染色体」とは、好ましくは無傷の（すなわち、完全な）ヒト２１番染色体を指すが、染色体導入操作の過程で、又は、モデルラットの細胞核内で偶発的に起こりうるマイナーな（すなわち、ダウン症の表現型に影響を与えない程度の）塩基配列上の変更を含んでもよいヒト２１番染色体を意味する。

ここで、「完全なヒト２１番染色体の、セントロメアを含む約１０Ｍｂ〜約３４Ｍｂサイズの染色体断片」について、当該染色体断片は、染色体としての機能を保持するための領域とダウン症の表現型に影響する長腕領域とを含むことが好ましい。「染色体としての機能を保持するための領域」には、セントロメア領域の他に、テロメア領域、全てのもしくは一部の長腕領域などが含まれる。また、「ダウン症の表現型に影響する長腕領域」は、そのような表現型が多様であるためその領域を完全に特定することは難しいが、少なくとも現時点で推定されている領域、例えば、精神遅滞などに関連すると推定されるｑ２２．１、ｑ２２．２などの領域が含まれる。上記染色体断片は、完全ヒト２１番染色体の、セントロメアを含む約１０Ｍｂ〜約３４Ｍｂ、好ましくは約２０Ｍｂ〜約３４Ｍｂ、より好ましくは約３０Ｍｂ〜約３４Ｍｂサイズの染色体断片である。完全ヒト２１番染色体のゲノム解読（Ｍ．Ｈａｔｔｏｒｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２０００；４０５：３１１−３１９）がされており、約３４Ｍｂのなかに少なくとも２２５個の遺伝子が存在していることが分かっている。

ここで、「実質的に完全なヒト２１番染色体又はその染色体断片の塩基配列中に外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡを含むその改変体」について、当該外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡは、上記のとおり、好ましくは上記染色体又はその染色体断片を含む細胞を選別するための選択マーカー遺伝子、例えば蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ（「蛍光遺伝子」）である。

本明細書中で使用される「ヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片」とは、ヒト２１番染色体もしくはその断片上の遺伝子と相同なラット遺伝子を含む外因的に細胞核内に導入されたラット染色体もしくはその断片、より好ましくはダウン症候補領域（ＤｏｗｎＳｙｎｄｒｏｍｅＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｇｉｏｎ（ＤＳＣＲ））上の遺伝子と相同なラット遺伝子を含む外因的に細胞核内に導入されたラット染色体もしくはその断片をいう。このラット染色体もしくはその断片は、上記のヒト２１番染色体もしくはその断片と同様に、特に断らない限り、実質的に完全なラット染色体、完全なラット染色体の、セントロメアを含む少なくとも約１０Ｍｂの染色体断片、或いは、当該実質的に完全なラット染色体又はその染色体断片の塩基配列中に外来遺伝子もしくは外来ＤＮＡを含むその改変体、又は当該実質的に完全なラット染色体、当該染色体断片、もしくは当該改変体においてそのラットセントロメアがマウスセントロメア（例えばマウス１１番もしくは１６番染色体のセントロメア）に置換された改変体、のいずれかを示す意味で使用される。

本発明に関する、ヒト２１番染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラットには、上で説明した、ヒト２１番染色体もしくはその断片又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含むダウン症モデルラットの他に、上記の少なくとも１つ、好ましくは複数のラット遺伝子が二重に内因性ラット染色体上に含まれることで遺伝子的にトリソミーとなるようなダウン症モデルラットも包含される。染色体での遺伝子の二重化（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）技術は、例えばＬ．Ｅ．Ｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００４，３０６：６８７−６９０に記載される技術を含む。

以下において当該方法をさらに具体的に説明する。
（１）ラットＥＳ細胞（雄系統）の作製
ラットのＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞の場合と同様に（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓａｎｄＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ１９８１；２９２（５８１９）：１５４−１５６）、ラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚の内部細胞塊から樹立される、多分化能と自己複製能をもつ細胞株である。例えば、卵透明帯を溶解したラット胚盤胞を、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含有する培地を用いてマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー上で培養し、７〜１０日後に胚盤胞から形成されるアウトグロウス（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を分散し、これをＭＥＦフィーダー上に移して培養し、約７日後、ＥＳ細胞が出現する。ラットＥＳ細胞の作製については、例えばＫ．Ｋａｗａｈａｒａｄａｅｔａｌ．，ＷｏｒｌｄＪＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２０１５；７（７）：１０５４−１０６３に記載されている。

ＥＳ細胞には雌系統と雄系統があるが、本発明では雄系統のラットＥＳ細胞、より好ましくは雑種のラットから作製した雄系統のラットＥＳ細胞、を使用することがよく、そのようなＥＳ細胞とＲＯＳＩ法及び蛍光選別法とを用いることによって子孫伝達可能なモデルラットを得ることができる。雄系統のＥＳ細胞は、作製されたＥＳ細胞株についてＸＹ核型をＸＹ染色体プローブ（例えばＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅＬａｂｏＩｎｃ．などから入手可能）を用いて分析することによって選別することができる。本明細書における「雄系統のＥＳ細胞」又は「ＥＳ細胞（雄系統）」とは、ＸＹ核型を有するＥＳ細胞をいう。

上記の非特許文献４及び５では、ダウン症モデルマウスを作製するときに雌系統のＥＳ細胞を使用しているが、雄系統のＥＳ細胞を使用した場合、子孫伝達可能なマウスの樹立に失敗している（非特許文献５）。この点からみても、本発明のダウン症モデルラットの作製のために、種々の試行錯誤が繰り返されたことが分かる。すなわち、実際、そのようなモデルラットが樹立されていなかったからである。

ＥＳ細胞と類似した幹細胞として人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が知られている（Ｋ．ＴａｋａｈａｓｈｉａｎｄＳ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ２００６；１２６（４）：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２００７；１３１（５）：８６１−８７２）。ラットｉＰＳ細胞もまた同様の手法で作製されている（Ｗ．Ｌｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２００９；４：１６−１９；Ｓ．Ｈａｍａｎａｋａｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ２０１１；６：ｅ２２００８）。すなわち、Ｗ．Ｌｉら（上記）によると、ＷＢ−Ｆ３４４ラット肝内皮細胞をレトロウイルスを介してＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４によって形質導入したのち、ＬＩＦを含有する慣用のマウスＥＳ細胞用培地中、ＭＥＦフィーダー細胞上で培養することによってラットｉＰＳ細胞が作製される。したがって、本発明では、ＥＳ細胞の代替としてラットｉＰＳ細胞を使用することも可能である。

（２）微小核細胞融合（ＭＭＣＴ）
微小核細胞融合法は、ミクロセル仲介染色体移入（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ−ＭｅｄｉａｔｅｄＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＴｒａｎｓｆｅｒ；ＭＭＣＴ）とも称される。

ミクロセルは、細胞（供与細胞）を微小核化して得られた微小核化細胞を脱核することによって作製され、少量の細胞質と１個又は少数の染色体を含む微小核を含有する細胞である。このミクロセルは、受容細胞と融合させることによって単一の染色体又は染色体断片のようなメガベースサイズの核酸を該細胞へ導入することを可能にする。このような融合法は、一般に、ミクロセル融合法又は微小核細胞融合法と呼ばれている（例えば特開２０１１−１７７１４５号公報）。

ミクロセルを誘導可能にする供与細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり、細胞の種類については、ミクロセルを誘導することができるならば制限はない。動物細胞は、例えば初代細胞、株化細胞、継代細胞、培養細胞、体細胞、幹細胞などのいずれの形態の細胞も包含する。また、動物細胞は、例えば昆虫細胞などの無脊椎動物由来細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞などの哺乳動物由来細胞、鳥類由来細胞、両生類由来細胞、爬虫類由来細胞、魚類由来細胞などの脊椎動物由来細胞、好ましくはげっ歯類細胞（ＣＨＯ細胞、マウスＡ９細胞、等）を含む。

ミクロセルと受容細胞が融合したミクロセルハイブリッドクローンを選抜するために、ヒト２１番染色体の改変体（例えば、ヒト２１番染色体の例えばセントロメア領域などの領域に選択マーカー遺伝子（例えば蛍光遺伝子）を挿入するためのｌｏｘＰ配列を有する。）を保有する供与細胞に予めさらに、選択マーカー遺伝子（例えば蛍光遺伝子）とｌｏｘＰ配列をもつベクター、並びに、Ｃｒｅ発現ベクターを共導入することができる。このＣｒｅ−ｌｏｘＰ法によってヒト２１番染色体に選択マーカー遺伝子（例えば蛍光遺伝子）が挿入される。また、選択マーカー遺伝子（例えば蛍光遺伝子）を有するヒト２１番染色体は、選択特性（例えば蛍光特性）を利用してジャームライントランスミッションが起こったか否かを確認するために有用である。ここで蛍光遺伝子は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡであり、蛍光タンパク質の例は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｋｅｉｍａ、ＤｓＲｅｄなどであるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質のアミノ酸配列及び蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のジーンバンクや、既知の文献から入手可能である。例えばＥＧＦＰのアミノ酸配列及び塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＬＣ００８４９２に記載されている（Ｓ．Ｎａｋａｄｅｅｔａｌ．，ＮａｔＣｏｍｍｕｎ５，５５６０（２０１４））。また、ＧＦＰ、ＹＦＰの配列は、例えばＷＯ２０１２／０６３８９７Ａ１に記載されている。外因性ラット染色体の場合にも、ヒト２１番染色体の場合と実質的に同様の操作を実施することができる。

微小核細胞融合法は、上記のとおり、例えば単一もしくは少数の染色体又はその断片などの１Ｍｂ以上の巨大核酸を供与細胞から受容細胞へ移入可能にする技術である。この方法は、供与細胞を微小核化する第１工程、微小核化細胞を脱核する第２工程、ミクロセルを単離する第３工程、ミクロセルと受容細胞を融合する第４工程、及び、生存するミクロセルハイブリッドクローンを選択する第５工程を包含する。

供与細胞の微小核化は、動物細胞を、コルセミドなどの微小核細胞誘導剤を含有する培地中で長時間培養することによって行うことができる。ここで微小核細胞誘導剤は、染色体の脱凝縮と核膜の再形成を誘起する能力をもつ。微小核細胞誘導剤の濃度は、微小核化が起こるならば制限されないが、例えばコルセミドの場合、受容細胞約５×１０^６個あたり約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜０．５μｇ／ｍｌである。微小核化によって、供与細胞から、少量の細胞質と１個又は少数の染色体を含む微小核を含有する細胞、すなわちミクロセルが形成される。培養は、供与細胞の培養条件を使用するものとし、培地として一般に動物細胞用培地が使用される。動物細胞用培地には、例えばイーグル培地（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地などが含まれる。培地には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）、代替血清（ＳｔｅｍＳｕｒｅ^(R) ＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、等）などを添加してもよい。温度は、室温〜約３７℃であり、また培養時間は、約４０〜８０時間が適当である。

微小核化細胞の脱核は、サイトカラシンＢを用いて行う。微小核化した細胞を含む培養液を遠心管に入れ、サイトカラシンＢを約１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３４℃で約１１，９００×ｇで遠心分離を行う。沈降したミクロセルを無血清培地に懸濁して回収する。ミクロセルの精製は、限外ろ過によって行うことができる。孔径８μｍ、５μｍ及び３μｍの３種類のメンブレンを用意し、順番にろ過する。

ミクロセルと受容細胞との融合は、完全にコンフルエントになる前で培養を終了した受容細胞に精製ミクロセルを重層して培養する。ミクロセル融合細胞は、薬剤耐性株を選択するなどの手法で行うことができる。

当該融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）法、レトロ法など（Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉｅｔａｌ．，ＰＬＯＳＯＮＥ，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１５７１８７（２０１６））の方法、ＭＶ法（Ｍ．Ｋａｔｏｈｅｔａｌ．，ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１０，１０：３７）などを用いて行うことができる。レトロ法は、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）もしくは両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ＭＬＶ由来のＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｌｅｔｅｄＥｎｖ（ＥｎｖΔＲ）を使用してミクロセルと受容細胞の融合を行う方法であり、最もげっ歯類細胞で効率のよい方法である。また、ＭＶ法は、はしかウイルス・フソゲン（ｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓｆｕｓｏｇｅｎ）であるヘマグルチニンタンパク質（ＭＶ−Ｈ）とヒュージョンタンパク質（ＭＶ−Ｆ）を用いてミクロセル融合を促進する方法であり、予めＭＶ−ＨプラスミドとＭＶ−Ｆプラスミドによって形質転換された供与細胞から作製されたミクロセルは、細胞膜表面に発現されたフソゲンの存在のために受容細胞との細胞−細胞融合が起こりやすくなる。

好適には、供与細胞に予め外来核酸として例えばヒト染色体を導入しておく。この場合、該ヒト染色体はミクロセルに移動し、ミクロセル融合によって受容細胞内に導入される。その結果、該受容細胞はヒト染色体によって形質転換される。

一般に、ミクロセル融合は、１Ｍｂ以上のサイズの核酸、特にメガベースサイズの特定の染色体又は染色体断片を細胞から別の細胞に移入（又は、導入）するために好ましく使用できる。本発明では、上記のとおり、染色体断片は、ヒト２１番染色体の断片又は、それと相同な（１つ又は複数の）遺伝子が存在する外因性ラット染色体の断片であり、セントロメア領域を含む約１０Ｍｂ〜約３４Ｍｂのサイズを有することが好ましい。

（３）卵子内円形精子注入（ＲＯＳＩ）法などの顕微授精法
ラットＥＳ細胞を胚盤胞期胚に導入し、仮親の子宮に移植してキメララットを作製し、キメララットから交配により子孫を得たところ、蛍光遺伝子発現陽性ラット、すなわち子孫伝達ラットが得られなかった。このため、ＲＯＳＩ法による子孫伝達の可能性を検討したところ、非常に低い確率で目的の子孫伝達可能なヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を安定に保持するラットを得ることができた。

ＲＯＳＩ（ＲｏｕｎｄＳｐｅｒｍａｔｉｄＩｎｊｅｃｔｉｏｎ）法は、上記キメララット（雄）の精巣から取り出した精細管を切り刻み懸濁液を作製した中から円形精子細胞をピペット内に吸引し、ピペット内で核と細胞質をバラバラにしたのち、これをラット卵子に注入し顕微授精する方法である（Ｃ．Ｔｓｕｒｕｍａｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍａｍｍ．ＯｖａＲｅｓ．２００９；２６：８６−９３（Ｊｐ））。或いは、円形精子細胞は、ラットから射精によって得ることも可能である。さらに、受精した卵子を仮親の子宮に移植し、キメララットを出産させたのち、ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する雌ラット（もしくは雄ラット）を用いて純系又は雑種、好ましくは雑種の雄ラット（もしくは雌ラット）と交配し、ラットの各種組織内で約８０〜９０％以上の細胞核でヒト染色体が保持された核型安定なトリソミーラットを得ることができる。

ＲＯＳＩ法に代えて、公知の卵細胞質内精子注入法（ＩｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＳｐｅｒｍＩｎｊｅｃｔｉｏｎ；ＩＣＳＩ）によってラットの卵子と上記キメララットの精子を顕微授精することも可能である。或いは、公知の卵子内延長精子細胞注入法（ＥｌｏｎｇａｔｅｄＳｐｅｒｍａｔｉｄＩｎｊｅｃｔｉｏｎ；ＥＬＳＩ）により上記キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精することも可能である。

（４）選別
上記（３）で交配によって作製されたラットの中から子孫伝達可能なダウン症モデルラットを選別する方法は、蛍光遺伝子発現の陽性率を血液細胞や、末梢血、骨髄又は脾臓でＦＣＭ測定すること、尻尾ＤＮＡ等を用いてＰＣＲやＣＧＨアレイや次世代シークエンサー等を用いて網羅的な解析を行い、ヒト２１番染色体もしくはその断片の保持領域を解析すること、各種組織（例えば、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、精巣など）をＦＩＳＨ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により解析し、ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の保持又は保持率を測定すること、明暗試験、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験などにより行動異常、認知機能異常などを測定すること、ＭＲＩ、ＣＴなどにより脳や心臓の異常を測定すること、ヒト２１番染色体もしくはその断片上の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、次世代シークエンス法により確認することなどを含む。ＦＩＳＨ法では、蛍光標識した特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒト２１番染色体もしくはその断片上の遺伝子とハイブリダイゼーションさせ蛍光顕微鏡を用いて当該染色体を検出する。このような手法によって、選抜されたラットは、ダウン症の表現型をもつ、ヒト２１番染色体もしくはその断片を安定的に有し、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラットであると判定することができる。

本明細書の「子孫伝達可能」であるとは、上記定義のヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片がジャームライントランスミッションにより後代（子孫）に安定的に伝達されることをいう。

（５）具体的な作製手順
具体的な作製手順は、例えば次のようなステップを含むことができる。
（ステップ１）
ＣＨＯ細胞等のげっ歯類細胞中において、セントロメア領域にｌｏｘＰを保持する上記定義のヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上にＥＧＦＰ遺伝子をＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて導入し、ヒト２１番染色体領域もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が保持されているかをＰＣＲ法およびＦＩＳＨ法で確認する。
（ステップ２）
上記改変ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を微小核細胞融合法にてラットＥＳ細胞（雄系統）に導入し、ヒト２１番染色体もしくはその断片の領域又は外因性ラット染色体もしくはその断片の領域が保持されているかをＰＣＲ法およびＦＩＳＨ法で確認する。
（ステップ３）
上記ラットＥＳ細胞を胚盤胞期胚に注入し、仮親の子宮に移植することによってキメララットを作製する。
（ステップ４）
上記キメララット雄からの円形精子細胞、精子又は延長精子細胞とラット雌からの卵子を用いて、卵子内円形精子細胞注入法、卵細胞質内精子注入法又は卵子内延長精子細胞注入法により顕微授精を行って子孫伝達ラットを作製し、尻尾のＤＮＡ及び細胞を用いて、ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が保持されているかをＰＣＲ法およびＦＩＳＨ法で確認する。
（ステップ５）
交配によりトリソミーラットを繁殖させる。
（ステップ６）
ＦＣＭ解析により、血液細胞でのＧＦＰ陽性率を測定する。
（ステップ７）
血液細胞系譜特異的な各種抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析により、血液細胞系譜での蛍光遺伝子発現陽性率を測定する。
（ステップ８）
各組織を採取し、ＦＩＳＨ解析によりヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の保持率を測定する。
（ステップ９）
各組織におけるヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認する。
（ステップ１０）
各種行動解析、脳や心臓の異常解析等により、正常ラットとの比較を行う。

２．ダウン症モデルラットの特徴
本発明のダウン症モデルラットの特徴は、以下のとおりである。

一般にダウン症モデルマウスと対比すると、電気生理学的実験や脳幹の核など特定の場所に薬剤等の物質を注入する場合、ラットの脳の大きさが適当であること、マウスでは自発活動量が高いため認知機能等のテストの結果が判然としないことが多いのに対し、ラットの方が、自発活動量が低く、知能がより高いため高次脳機能障害に関する洗練された認知機能テストを行うことができることなど、ラットを用いることの利点が知られている。

本発明のダウン症モデルラットは、従来作製されたことがなく、その理由については上述したとおり作製が非常に困難であったことが挙げられるが、今回作製されたラットは、外因的に導入されたヒト２１番染色体もしくはその断片又はラット染色体もしくはその断片（好ましくは１つ）を核内に安定に保持すること、または導入されたヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの、好ましくは複数の、遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであること、ダウン症表現型を有すること、子孫伝達可能であること、などの特徴を有する。ここで、「相同」とは、成熟遺伝子の塩基配列について約７０％以上の配列同一性を有するか、或いは生物学的機能が実質的に同等であることを指す。配列同一性は、ヒト遺伝子の成熟配列とラット遺伝子の成熟配列を最も高い一致率となるように整列し比較したときの、ギャップを含む総塩基数に対する一致した塩基数のパーセンテージ（％）をいう。また、上記トリソミーについて、ラットの１１番、２０番染色体上にヒト２１番染色体遺伝子と相同な領域が存在することが知られているため、内因性ラット遺伝子（２コピー）と外因性ヒト遺伝子（１コピー）もしくは外因性ラット遺伝子（１コピー）とで遺伝子的にトリソミーとなる。例えばこのような遺伝子相同領域を含むヒト２１番染色体断片を含むモデルラットは、遺伝子的にトリソミーとなる。

それぞれの特徴について、さらに説明する。

（１）ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を細胞核内に安定に保持する
上記定義のヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の遺伝子類（例えば非特許文献４及び５に記載される遺伝子類）の存在をＰＣＲ解析によって確認できる。また、ラットの血液細胞及び各種の組織においてヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の存在や保持率をＦＩＳＨ解析、又はフローサイトメトリー解析によって確認できる。

末梢血、骨髄、脾臓のいずれにおいてもＣＤ６１^＋／ＣＤ４５ＲＡ⁻（ＮＫ細胞様）、ＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４５Ｒ^＋（Ｂ細胞様）細胞などの免疫細胞内のヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体の保持率が９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。

さらにまた、各組織（例えば脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、精巣、骨髄など）におけるヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片の保持率が８０〜９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。

上記の通り、ダウン症モデルラットは、完全なもしくは実質的に完全なヒト２１番染色体又は外因性ラット染色体、或いはヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子、がトリソミーを形成するように、ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を細胞核内に安定に保持している。

（２）ダウン症表現型を有する
ダウン症ラットモデルには、行動解析により不安様行動、記憶障害などの表現型が認められる。

（３）子孫伝達可能である
ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が後代（子孫）にジャームライントランスミッションにより子孫伝達される。ダウン症モデルラットではヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が極めて安定に保持されている。

本発明を以下の実施例を参照しながらさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。以下の実施例では、ヒト２１番染色体もしくはその断片を含むダウン症モデルラットについて具体的に説明するが、上記の外因性ラット染色体もしくはその断片を含むダウン症モデルラットも同様の手法によって作製可能である。

［実施例１］ＥＧＦＰ搭載ヒト２１番染色体ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰの作製［Ａ］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰのＣＨＯ細胞への移入
［Ａ．１］微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
レシピエント細胞にはヒト２１番染色体の長腕セントロメア近傍にｌｏｘＰ配列の導入された改変ヒト２１番染色体を保持するＫａｚｕｋｉら（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ, １８：３８４−３９３，２０１１）に記載のＤＴ４０（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ）を用いた。ＤＴ４０（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ）を細胞培養皿で培養し、コンフルエントになった時点で２０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、１０−４Ｍ２−メルカプトエタノール、０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、さらに１２時間培養してミクロセルを形成させた。培養液を２４ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に置換し、予め１００μ／ｍｌのポリＬ−リジンでコートした遠心用２５ｃｍ^２フラスコ１２本（コーニング）に２ｍｌずつ分注し、３７℃で３０分培養し、細胞をフラスコの底に付着させた。上清を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ及び３μｍフィルターにて精製した。精製後、１７００ｒｐｍで１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。

ドナー細胞にはＣＨＯｈｐｒｔ欠損細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク(大阪、日本国）より入手、登録番号ＪＣＲＢ０２１８）であるＣＨＯ（ＨＰＲＴ⁻）を用いた。精製した微小核細胞をＰＨＡ−Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、培養上清液［１０％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を除去したＣＨＯ細胞上に静かに播種した。プレートを３７℃、１５分間インキュベートした。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）溶液［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１ｍｌ添加して濾過滅菌する］を１ｍｌで正確に１分間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を４ｍｌで４回洗浄し、通常のＣＨＯ細胞の培養液５ｍｌ加えてオーバーナイトでインキュベートした。ＰＢＳ（−）で細胞表面を２回洗浄後にトリプシン処理により細胞を分散させ、直径１０ｃｍ細胞培養皿５枚に播種し、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌになるように加え、１〜２週間選択培養した。２回の微小核細胞融合で得た合計６個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ＨＰＲＴ⁻；ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ））。

［Ａ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ａ．２．１］ＰＣＲ解析
Ｇ４１８耐性株のゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰがＣＨＯ細胞に導入できているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
#21CEN<1>2L：5'-aaatgcatcaccattctcccagttaccc -3'（配列番号１）
PGKr1：5'-ggagatgaggaagaggagaaca-3'（配列番号２）
D21S265-L: 5'-gggtaagaaggtgcttaatgctc-3'（配列番号３）
D21S265-R: 5'-tgaatatgggttctggatgtagtg-3'（配列番号４）
D21S261-L: 5'-gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga-3'（配列番号５）
D21S261-R: 5'-acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg-3'（配列番号６）
D21S268-L: 5'-caacagagtgagacaggctc-3'（配列番号７）
D21S268-R: 5'-ttccaggaaccactacactg-3'（配列番号８）
D21S266-L: 5'-ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt-3'（配列番号９）
D21S266-R: 5'-gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt-3'（配列番号１０）
D21S1259-L: 5'-gggactgtaataaatattctgttgg-3'（配列番号１１）
D21S1259-R: 5'-cactggctctcctgacc-3'（配列番号１２）
CBR-L：5'-gatcctcctgaatgcctg-3'（配列番号１３）
CBR-R：5'-gtaaatgccctttggacc-3'（配列番号１４）

ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸＴａｑ（タカラバイオ、京都、日本国）を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。ＰＣＲの結果、６クローンのうち、６クローンが全てのプライマーのセットで陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。

［Ａ．２．２］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ⁻；ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ））のうち６クローンについて松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社（東京、日本国）、１９９４）に記された方法でｈｕｍａｎｃｏｔＩＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ６クローン中、３クローンで８０％以上の割合でＣＨＯ（ＨＰＲＴ⁻；ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ）がＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。

上記の結果から、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰがＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。

［Ｂ］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ含有ＣＨＯ細胞におけるＥＧＦＰ遺伝子のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによるｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰへの挿入
［Ｂ．１］トランスフェクション及びＨＡＴ耐性クローンの単離
上記で得られたＣＨＯ（ＨＰＲＴ⁻；ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ）−３にリポフェクション法を用いて遺伝子導入を行い、９０％コンフルエント状態になった６ウエル（ｗｅｌｌ）の細胞に対して、Ｃｒｅ１μｇとＫａｚｕｋｉら（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１８：３８４−３９３，２０１１）に記載のＥＧＦＰ挿入ベクター（Ｉ−ＥＧＦＰ−Ｉ−ｌｏｘＰ−３’ＨＰＲＴ）２μｇを市販（インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。ＨＡＴ選択培養下で２週間培養すると、耐性コロニーが出現し、１回の導入で得た合計６個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：ＣＨＯ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ））。

［Ｂ．２］薬剤耐性クローンの選別
［Ｂ．２．１］蛍光顕微鏡観察によるＧＦＰ挿入体の確認
クローニングした６個のコロニーを蛍光顕微鏡下にて観察したところ、全てのクローンにてＧＦＰ陽性細胞が観察され、その陽性率はほぼ１００％であった。

［Ｂ．２．２］ＰＣＲ解析
ＨＡＴ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として組換え体を選別するため以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、部位特異的にＧＦＰ遺伝子の挿入が起こっているかを確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
TRANS L1：5'-tggaggccataaacaagaagac-3'（配列番号１５）
TRANS R1：5'-ccccttgacccagaaattccA-3'（配列番号１６）

ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＬＡＴａｑ（タカラバイオ）を用い、2ｘＧＣＩバッファー、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は９８℃１分の熱変性後、９４℃１０秒、６０℃３０秒、７２℃３分を３０サイクル行った。ＰＣＲの結果、６クローン全てが陽性であり、この６クローンで以降の解析を行った。

［Ｂ．２．３］ｍｏｎｏ−ｃｏｌｏｒＦＩＳＨ解析
上記で得られたＣＨＯ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ））のうち６クローンについて松原ら（ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に記載された方法でｈｕｍａｎｃｏｔＩＤＮＡをプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、６クローン中、６クローンで８０％以上の割合でｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰが１コピーＣＨＯ細胞に導入されていることを確認した。

以上の結果から、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰがＣＨＯ細胞に導入できたと結論付けた。

［実施例２］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ導入ラットＥＳ細胞の作製
ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持するキメララットを作製するために、実施例１で得られたｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持するＣＨＯ細胞からラットＥＳ細胞へ微小核細胞融合法により導入した。

Ｔｏｍｉｚｕｋａら（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１６：１３３−１４３，１９９７）の方法に従い、約１０^８個のｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）１）からミクロセルを精製し、ＤＭＥＭ５ｍｌに懸濁した。約１０^７個のラットＥＳ細胞をトリプシン処理により剥がし、ＤＭＥＭで３回洗浄後ＤＭＥＭ５ｍｌに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタッピングにより十分ほぐし、１：１．４のＰＥＧ溶液［５ｇＰＥＧ１０００（和光純薬（大阪、日本国））、１ｍｌＤＭＳＯ（シグマ）をＤＭＥＭ６ｍｌに溶解］０．５ｍｌを加え、約１分３０秒間、十分攪拌した。その後、ＤＭＥＭ１０ｍｌをゆっくり加え、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心し、３０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、予めフィーダー細胞を播いた直径１００ｍｍシャーレ（コーニング）３枚に分注し、培養した。２４時間後、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に交換し、約１週間選択培養した。その結果、合計２個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った。

２クローンともにｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ領域を検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記の２クローンについて、ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１６：１３３−１４３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に検出され、かつラットの核型が正常なクローンは１クローンであった（図２）。以上のことから、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ保持ラットＥＳ細胞が１クローン得られたと結論付けた。

以上の結果から、ヒト２１番染色体が導入されたラットＥＳ細胞が構築できたと結論付けた。

［実施例３］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ導入ラットの作製
［Ａ］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持するキメララットの作製
上記実施例２で得られたｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ保持ラットＥＳ細胞クローンを用いてＨｉｒａｂａｙａｓｈｉらの方法（ＭｏｌＲｅｐｒｏｄＤｅｖ．２０１０Ｆｅｂ；７７（２）：９４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｒｄ．２１１２３．）でキメララットを作製した。宿主としてはＣｒｌｊ：ＷＩラット（白色、日本チャールスリバー社（横浜、神奈川、日本国）より購入）の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。注入胚を仮親に移植した結果生まれる仔ラットは毛色によりキメラであるかどうかを判定できる。ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ保持ＥＳクローン（例えばＲａｔＥＳ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）２、上記実施例２で取得したもの）を注入した１２５個の胚を仮親に移植した結果、６５匹のキメララット（毛色に濃茶色の部分の認められる）が誕生した。そのうち５３匹は毛色が有色と観察できるキメラ個体であった（図３）。すなわち、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持するラットＥＳ細胞株はキメラ形成能を保持している、すなわちラット個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。

［Ｂ］ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰを保持する子孫伝達ラットの作製
上記キメララットから交配により繁殖させようと試みたが、ＧＦＰ陽性個体得られなかった。次に上記原因はトリソミー個体の雄の不妊が考えられたことから、精細管におけるＧＦＰ陽性率を観察した結果、１８匹中１匹で陽性個体が観察された（図４、図５）。上記ＧＦＰ陽性キメラマウス雄（キメラ個体番号＃１７５３−２）（図５上図）のＧＦＰ陽性の精細管から円形精子細胞を取り出し、ＦＡＣＳにてＧＦＰ陽性画分をソーティングしてから以下の実験に用いた。

Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ（ＥｘｐＡｎｉｍ．２００８Ｊｕｌ；５７（４）：４０１−４０５）らの方法に従い、円形精子細胞卵子内注入法を用いて卵子にＧＦＰ陽性の円形精子細胞を注入し、４０個の胚を仮親に移植し、１３匹のラットを作製した。そのうち、ＧＦＰ陽性個体は５匹であった。さらに、５匹中４匹において、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ領域を検出する前出のプライマーを用いたＰＣＲで陽性であった。さらに、上記個体の血液を採血し、培養後の染色体標本を用いて、ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡを用いてＦＩＳＨ解析（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．１６：１３３−１４３，１９９７）を行った結果、上記プローブにより特異的に１本独立に検出され、かつラットの核型が正常であった（図６）。上記個体の末梢血の血液細胞でＦＣＭ解析を行った結果、９８．８％のＧＦＰ陽性率であった。一方、以下の文献（Ｋａｚｕｋｉｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１８：３８４−３９３，２０１１）に記載されたＥＧＦＰが搭載された２１番染色体由来のＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ２）を保持するマウスでは、２４．４％のＧＦＰ陽性率であった（図７）。すなわち、マウスの末梢血の血液細胞ではヒト染色体（断片）は不安定であるが、ラットではヒト染色体（断片）は安定であることが示された。さらに、上記個体のうち雌個体３匹を用いて、交配によりｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ保持ラットを繁殖させることに成功した。一方、雄個体は精子数が極めて少なく、全て不妊であった。以上のことから、子孫伝達可能なｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ保持ラット系統が樹立できたと結論付けた。ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰが子孫伝達されたラット系統をＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）と呼ぶ。

［実施例４］ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの遺伝子解析
［Ａ］実体蛍光顕微鏡観察
上記で得られたＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットについて脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、骨格筋及び精巣を実体蛍光顕微鏡観察下にて観察したところ、全ての組織にてＧＦＰ陽性が観察され、その陽性率は１００％であった。その代表的な結果を図８に示す。

［Ｂ］血液系細胞のＦＡＣＳ解析
末梢血でのＧＦＰ陽性率が９０％以上であった個体について、血液細胞系譜特異的な各種抗体（バイオレジェンド、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたＦＣＭ解析により、血液細胞系譜でのＧＦＰ陽性率を検討したところ、末梢血、骨髄及び脾臓のいずれにおいてもＣＤ６１^＋／ＣＤ４５ＲＡ⁻（ＮＫ細胞様）、ＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４５Ｒ^＋（Ｂ細胞様）におけるＧＦＰ陽性率は９０％以上であった。その代表的な結果を図９に示す。

［Ｃ］蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析
上記と同様の個体の組織において、Ｓｈｉｎｏｈａｒａらの報告（ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３−１１７５，２００１）に記された方法でＨｕｍａｎＣｏｔＩＤＮＡ^（Ｒ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をプローブにしたＦＩＳＨ解析を行ったところ、視覚的にｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰの存在を確認し、８４〜１００％の細胞でｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰが存在していることが確かめられた。その代表的な結果を図１０に示す。

［Ｄ］ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット系統の伝達率
ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）雌ラットとＣｒｌｊ：ＷＩラット（白色、日本チャールスリバー社（横浜、神奈川、日本国）より購入）雄を交配することで伝達率を検討した。Ｆ２世代からＦ６世代までで３０９匹の仔ラットが得られ、１８１匹がＧＦＰ陰性、１２８匹がＧＦＰ陽性個体であった（伝達率は４１．４％）。すなわち、伝達率はメンデル遺伝の法則（理論値５０％）よりも少し低下しているものの、ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ形質が４１．４％の頻度で出現したことが確かめられ、卵子におけるｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰの保持率が８０％以上であることが示された。

［Ｅ］ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット系統におけるヒト２１番染色体上の遺伝子発現
ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、骨格筋及び精巣において、トータルＲＮＡを市販のプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従い抽出後、市販のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、ｃＤＮＡ合成を行い、それを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒト２１番染色体上の遺伝子発現を検出した。そのプライマー配列を以下に示す。
ヒト２１番染色体上の遺伝子発現検出用プライマー：
APP-L：5'-gccccgtaaaagtgttaca-3'（配列番号１７）
APP-R：5'-acgtttgtttcttcgtgcct-3'（配列番号１８）
SOD1-1L：5'-attctgtgatctcactctcagg-3'（配列番号１９）
SOD1-1R：5'-tcgcgactaacaatcaaagt-3'（配列番号２０）
IFNAR2-1L：5'-cgaagtttcagtcggtgag-3'（配列番号２１）
IFNAR2-1R：5'-ggcattcaggttttatccc-3'（配列番号２２）
TTC3-1L：5'-tggacaaatataaggcatgttca-3'（配列番号２３）
TTC3-1R：5'-gtcaccttcctctgcctttg-3'（配列番号２４）
ETS2-1L：5'-taccatgccaatggtttataagg-3'（配列番号２５）
ETS2-1R：5'-atgtgactgggaacatcttgc-3'（配列番号２６）
PCP4-1L：5'-gaattcactcatcgtaacttcattt-3'（配列番号２７）
PCP4-1R：5'-ccttgtaggaaggtatagacaatgg-3'（配列番号２８）
MX1-1L：5'-tggactgacgacttgagtgc-3'（配列番号２９）
MX1-1R：5'-ctcatgtgcatctgagggtg-3'（配列番号３０）
TFF3-1L：5'-ggctgtgattgctgccag-3'（配列番号３１）
TFF3-1R：5'-gtggagcatgggacctttat-3'（配列番号３２）
TFF1-1L：5'-cagggatctgcctgcatc-3'（配列番号３３）
TFF1-1R：5'-atcgatctcttttaatttttaggcc-3'（配列番号３４）
コントロール遺伝子発現検出用プライマー:
GAPDH-F: 5’-ccatcttccaggagcgaga-3’（配列番号３５）
GAPDH-R: 5’-tgtcataccaggaaatgagc-3’（配列番号３６）

ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＧｅｎｅＡｍｐ９６００を、ＴａｑポリメラーゼはＥＸＴａｑ（タカラバイオ（京都、日本国））を用い、バッファーやｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）は添付のものを推奨条件に従って用いた。温度、サイクル条件は、９３℃５分の熱変性後、９３℃１分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとして３５サイクルで行った。

その結果ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットにおいて、ＰＣＰ４は脳でのみ、ＴＦＦ１は小腸でのみ、そのほかのプライマーセットでは調べた全ての組織で発現を検出できた。また、コントロールのＧＡＰＤＨは全ての組織で検出された。その代表的な結果を図１１に示す。Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．（ＨＭＧ，１０：１１６３−１１７５，２００１）の報告の通りにヒト２１番上の遺伝子はヒトと同様に組織特異的に発現していた。このようにヒトでみられるような組織特異的発現が認められた。

［実施例５］ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの行動解析
［Ａ］明暗往来試験
ＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラット系統を用い、ＧＦＰ陽性の個体をダウン症モデルラット（以下、「ＤＳ」と称する。）、ＧＦＰ陰性の個体をコントロール（以下、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と称する。）として使用した。１０週齢の雄を各グループ７匹ずつ準備した。実験者に触られることによるストレスを減らすため、９週齢の時点でヒトへの馴化（ハンドリング５分）を行った。これらの動物を使用して、ＲＩＫＥＮのウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｊａ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｌａｂ／ｂｐｍｐ／ＳＯＰｓ／ｉｎｄｅｘ＿ｍｃ．ｈｔｍｌ）に記された方法を参考にして明暗往来試験を実施した。

小動物行動解析装置ＳＣＡＮＥＴ（ＭＶ−４０，メルクエスト社）にラット用明暗ケージ（ＬＤＫ−Ｒ，メルクエスト社）をセットし、小動物行動解析システム用ソフトウェア（ＳＣＬ−４０，メルクエスト社）により明暗ケージ内の動物の行動データを取得した。ＳＣＡＮＥＴの不感帯設定は１０とした。昼光色の電球を用い、明箱の中心の光量を２００〜２１３ルクスに設定した。

行動解析部屋に動物を慣れさせるため、飼育部屋から行動解析部屋に動物を移動してから１時間以上経過して実験を開始した。明箱、暗箱間に仕切り板がある状態で暗箱に動物を入れて蓋を閉め、直後に仕切り板を外してから測定を開始した。５分間の移動距離に比例したカウント数（総運動量＝６ｍｍ間隔で設置された赤外線センサーを通過した回数を示す）、明箱と暗箱の往来回数（移所回数）、明箱滞在時間、明箱に入るまでの時間（移所潜時間）を解析した所、移所回数、明箱滞在時間がＤＳで有意に小さく、移所潜時間がＤＳで有意に大きかった（図１２、Ｗｅｌｃｈ’ｓｔ−ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。以上の結果から、ＤＳで不安様行動の増加が強く示された。

［Ｂ］オープンフィールド試験
１０週齢のＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの雄をＤＳ，ｃｏｎｔｒｏｌグループそれぞれで７匹ずつ準備した。９週齢の時点でヒトへの馴化（ハンドリング５分）を行い、明暗往来試験終了後１日以上空けてオープンフィールド試験を行った。Ｋａｌｏｕｄａらの報告（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｅｈａｖｉｏｒ，１３８：１１１−１１６，２０１５）に記された方法を参考にして、以下のようにオープンフィールド試験を実施した。行動解析部屋に動物を慣れさせるため、飼育部屋から行動解析部屋に動物を移動してから１時間以上経過して実験を開始した。昼光色の電球により装置中央の光量を３０ルクスに設定されたラット用角型オープンフィールド（７０ｃｍ×７０ｃｍ、室町機械株式会社（東京、日本国））の角から壁に沿って動物を入れ、１０分間の動物の行動データをビデオトラッキングソフトウェア（ＡＮＹ−ｍａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社）により取得した。総移動距離に対する中心滞在時間（中心エリア：３０ｃｍ×３０ｃｍ）を解析したところ、ＤＳでその割合が低い傾向にあった（図１３）。以上の結果から、ＤＳで不安様行動増加が示された。

［Ｃ］高架式十字迷路試験
１０週齢のＴＣ（ｈＣｈｒ．２１−ｌｏｘＰ−ＥＧＦＰ）ラットの雄をＤＳ，ｃｏｎｔｒｏｌグループそれぞれで６匹ずつ準備した。９週齢の時点でヒトへの馴化（ハンドリング５分）を行い、明暗往来試験、オープンフィールド試験に使用した動物を高架式十字迷路試験にも使用した。

ＧｌｏｍｂｉｋらやＡｙｄｉｎらの報告（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＤＯＩ１０．１００７／ｓ１２０３５−０１６−９８０７−４，２０１６、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＤＯＩ１０．１００７／ｓ１２０３５−０１６−９６９３−９，２０１６）に記された方法を参考にして、以下のように高架式十字迷路試験を実施した。行動解析部屋に動物を慣れさせるため、飼育部屋から行動解析部屋に動物を移動してから１時間以上経過して実験を開始した。昼光色の電球により装置中央の光量を３９〜４２ルクスに設定されたラット用高架式十字迷路（アームの幅１０ｃｍ、アームの長さ５０ｃｍ、アームの高さ４０ｃｍ、ニュートラルゾーン１０ｃｍｘ１０ｃｍ、室町機械株式会社）を用意した。動物の頭をクローズドアームに向けてニュートラルゾーンに置き、５分間の動物の行動データをビデオトラッキングソフトウェア（ＡＮＹ−ｍａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社）により取得した。総移動距離（ｍ）、オープンアーム進入回数、オープンアーム滞在時間（ｓ）を解析したところ、オープンアーム滞在時間がＤＳで低い傾向にあった（図１４）。以上の結果から、ＤＳで不安様行動増加が示された。

本発明のダウン症モデルラットは、ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を安定して子孫伝達可能であるうえに、ダウン症の症状（行動異常など）を有するため洗練された認知機能テストを行うことができるため、治療薬開発や発症機序解明のためのモデル動物として産業上有用である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

ヒト２１番染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と相同なラット遺伝子がトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
ヒト２１番染色体もしくはその断片、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片、を含み、前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーである、かつ、子孫伝達可能であることを特徴とするダウン症モデルラット。
前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、子孫ラットの組織内で８０〜９０％以上の保持率で保持されている、請求項２に記載のダウン症モデルラット。
正常ラットと比較して、不安様行動又は記憶障害を含む行動異常を有する、請求項１、２又は３に記載のダウン症モデルラット。
前記ヒト２１番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ１０〜３４Ｍｂのサイズを有する、請求項２〜４のいずれか１項に記載のダウン症モデルラット。
前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載のダウン症モデルラット。
請求項２〜６のいずれか１項に記載の子孫伝達可能なダウン症モデルラットの作製方法であって、ヒト２１番染色体もしくはその断片を含む、又はヒト２１番染色体もしくはその断片と相同なラット遺伝子が存在する外因性ラット染色体もしくはその断片を含む、ミクロセルと雄系統のラットＥＳ細胞とを微小核細胞融合法により融合し、それによりヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を含み、前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片上の少なくとも１つの遺伝子と、当該遺伝子と相同な内因性ラット遺伝子とが加わりトリソミーであるＥＳ細胞を作製する工程、前記ＥＳ細胞をラット胚盤胞期胚又は８細胞期胚に導入し、得られた胚をラット仮親の子宮に移植してキメララットを作製する工程、得られた雄キメララットから得た円形精子細胞をラットの卵子に卵子内円形精子注入法（ＲＯＳＩ）により顕微受精し、或いは卵子内延長精子細胞注入法（ＥＬＳＩ）により上記雄キメララットの延長精子細胞とラットの卵子を顕微受精し、或いは卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）により上記雄キメララットの精子とラットの卵子を顕微受精し、子孫ラットを作製する工程、並びに、前記子孫ラットからヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片を保持する子孫伝達可能なラットを選別する工程を含む方法。
前記ヒト２１番染色体もしくはその断片又は外因性ラット染色体もしくはその断片が、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
前記ヒト２１番染色体の断片又は外因性ラット染色体の断片が、セントロメア領域を含み、かつ１０〜３４Ｍｂのサイズを有する、請求項７又は８に記載の方法。