CN112226501A - 一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用 - Google Patents

一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用，本发明通过提取样本中的肠道菌群的DNA基因组并测序从而获得肠道菌群的种类和丰度特征，并基于肠道菌群的丰度特征进行重症肌无力的诊断。

Description

一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用。
背景技术
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是神经-肌肉接头信号传递障碍所引起的获得性自身免疫性疾病，出现骨骼肌无力及易疲劳现象(Hong Y,Zisimopoulou P,Trakas N,et al.Multiple antibody detection in seronegative'myasthenia gravis patients[J].Eur J Neurol,2017,24(6):844-850.)。MG患者外周血中常常可以检测到多种自身抗体，据此常将MG患者根据其血清中所检测到抗体进行分类，其中最常见的是AchR抗体阳性的类型(约85％-90％)，这部分患者中约60％-80％伴有胸腺异常(Truffault F,deMontpreville V,Eymard B,et al.Thymic Germinal Centers and Corticosteroids inMyasthenia Gravis:an Immunopathological Study in1035Cases and a CriticalReview[J].Clin Rev Allergy Immunol,201752(1):108-124.)。其他少见的抗体还包括肌肉特异性激酶(muscle specific kinase,MUSK)抗体、低密度脂蛋白受体相关蛋白4(lipoproteinreceptor-associated protein 4,LRP4)抗体、聚集蛋白(agrin)抗体等(Gilhus NE,Verschuuren JJ.Myasthenia gravis:subgroup classification andtherapeutic strategies[J].Lancet Neurol,2015,14(10):1023-1036.)。
作为一种多病因所致综合征，重症肌无力确切的发病机制还尚不明确者认为其发病与遗传、免疫、内分泌等相关。有研究表明，肠道菌群在重症肌无力的发生发展中起着重要作用，但是目前有关研究尚少。研究肠道菌群与重症肌无力的关系，对于揭示重症肌无力的发病机制以及实现重症肌无力的无创诊断具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种诊断重症肌无力的肠道菌群标志物。
本发明的目的之二在于提供一种诊断重症肌无力的产品。
本发明的目的之三在于提供一种预测重症肌无力的系统。
本发明的目的之四在于提供一种治疗重症肌无力的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种重症肌无力的肠道菌群标志物，所述肠道菌群标志物选自Sutterella_wadsworthensis和/或Sutterella_parvirubra。
本发明的第二方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在制备诊断重症肌无力的产品中的应用，所述产品包含检测肠道菌群标志物的试剂。
进一步，所述试剂是对所述肠道菌群标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
本发明的第三方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物预测重症肌无力的系统，包括：
核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；
测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；
数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；
结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。
利用该系统，可以确定本发明的生物标志物在肠道菌群中的相对丰度。因此，可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象个体为重症肌无力个体或者为健康个体的概率。
本发明的第四方面提供了一种诊断重症肌无力的产品，所述产品包括检测本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物丰度的试剂。
进一步，所述试剂包括检测所述肠道菌群标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
进一步，所述产品还包括提取微生物基因组DNA、微生物蛋白或菌体成分的试剂。
本发明的第五方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在构建预测重症肌无力的计算模型中的应用。
本发明的第六方面提供了本发明的第一方面所述的肠道菌群标志物在制备治疗重症肌无力的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括降低所述的肠道菌群标志物丰度的试剂。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了Sutterella_wadsworthensis和Sutterella_parvirubra与重症肌无力相关，其丰度在重症肌无力患者和健康人群中呈现显著性差异，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将Sutterella_wadsworthensis或Sutterella_parvirubra作为检测标志物应用于重症肌无力患者的诊断。以Sutterella_wadsworthensis或Sutterella_parvirubra作为检测标志物，完全无创，准确性高。
附图说明
图1是α多样性和β多样性分布的小提琴图；其中，A-C是基于shannon指数的α多样性在门(A)、属(B)和种(C)水平上的分布图；D-F是基于Bray-Curtis距离的β多样性在门(D)、属(E)和种(F)水平上的分布图。
图2是所有参与者在不同分类水平的相对丰度的PcoA，其中图A-F分别是在门、纲、目、科、属、种分类水平的相对丰度的PcoA，红点和蓝色三角形分别代表MG和HC。
图3是肠道菌群标志物Sutterella_wadsworthensis的丰度情况图。
具体实施方式
为了评估肠道共生菌群组成能否作为重症肌无力的预测因子，本发明通过收集重症肌无力患者和健康人的样本，进行全基因组测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测重症肌无力患者。本发明通过全基因组测序，首次发现了Sutterella_wadsworthensis或Sutterella_parvirubra在重症肌无力患者和健康人中呈现显著性差异，说明Sutterella_wadsworthensis或Sutterella_parvirubra可作为重症肌无力的预测因子。
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本文中使用的术语“扩增”表示现有技术已知的用于复制目标核酸且由此增大所选择的核酸序列的拷贝的数量的一种或多种方法。扩增可以是以指数的或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列形成“扩增子”。尽管下文描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“PCR”)进行扩增，但在现有技术中已知用于扩增核酸的很多其他方法(例如，等温法、滚环法等)也包括在本发明中。本领域的技术人员将理解，这些其他的方法可以替代PCR方法使用或者可以与PCR方法一起使用。
本文中使用的术语“诊断”指的是区分或确定疾病、综合征或病症，或者指的是区分或确定患有特定的疾病、综合征或病症的人。在本发明的说明性实施方式中，基于分析样本中的菌群标志物来诊断对象中的重症肌无力。
本文中使用的术语“杂交”或“特异性杂交”指的是两个互补的核酸链在适当严格的条件下彼此退火结合。通常利用探针长度的核酸分子来进行杂交。核酸杂交技术在现有技术中是公知的。本领域的技术人员了解如何估计和调整杂交条件的严格度，使得具有至少所需程度的互补性的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列将不能稳定地杂交。
本文中使用的术语“严格性”用来指进行核酸杂交的温度、离子强度和其他化合物的存在的条件。在高严格性条件下，将仅在具有含高频率的互补碱基序列的足够长的片段的核酸之间发生核酸碱基配对。示例性的杂交条件如下。高严格性通常指的是这样的条件：在65℃下且在0.018M的NaCl中，仅允许那些形成稳定的杂交产物的核酸杂交。例如，可以通过以下来提供高严格性条件：在50％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC(盐水柠檬酸钠)、0.2％的SDS(十二烷基硫酸钠)中且在42℃下杂交，之后在0.1×SSC和0.1％SDS中且在65℃下洗涤。中度严格性指的是等效于以下的条件：在50％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC、0.2％的SDS中且在42℃下杂交，之后在0.2×SSC和0.2％的SDS中且在65℃下洗涤。低严格性指的是等效于以下的条件：在50℃下，在10％的甲酰胺、5×Denhardt溶液、6×SSC、0.2％的SDS中杂交，之后在1×SSC和0.2％的SDS中洗涤。
本文中使用的用于扩增的“引物”是特异性地退火结合至目标核苷酸序列或标记核苷酸序列的寡核苷酸。该引物的3’核苷酸应当与相对应的核苷酸位置的目标序列或标记序列相同以通过聚合酶实现最佳的引物延伸。
在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。
本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。
本发明的方法和组合物可以用来利用获取自个体的生物样本来检测与各种细菌有关的核酸。可以根据本领域的技术人员所熟知的任何方法将该核酸(DNA或RNA)从所述样本中分离出来。可以通过标准步骤来获取生物样本并且可以立即使用所述生物样本，或者可以在适于该类型的生物样本的条件下储存该生物样本以备后续使用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1筛选与重症肌无力相关的肠道菌群
1、研究对象和样本收集
研究在河北省石家庄市第一医院重症肌无力治疗中心收集的55例儿童重症肌无力患者和36例相应年龄、性别的健康对照(HC)。样本信息如表1所示。
诊断标准：(1)临床表现:眼睑下垂、复视、斜视；(2)新斯的明试验阳性：(3)乙酰胆碱受体抗体抗体阳性：(4)肌电图：面神经低频衰减，高频无递增。符合(1)+(2)或(3)或(4)其中一项者可以明确诊断。
分型：参照2000年美国重症肌无力协会(MGFA)提出新的临床分型与定量重症肌无力评分(QMG)标准型。
纳入标准：患者明确诊断为重症肌无力眼肌型，符合以上诊断标准。
排除标准：(1)年龄<2岁10个月或无年龄信息；(2)3个月内使用β-内酰胺类除外的抗生素；(3)服用其他治疗疾病的药物/激素；(4)使用抗炎药物或未知的中草药。
表1样本临床特征
Figure BDA0002683161290000061
2、DNA抽提和测序
使用DNA提取试剂盒自样本中提取DNA，操作步骤按说明书进行。采用荧光计或微量平板读取器(如Qubit Fluorometer,Invitrogen)检测DNA的浓度，采用琼脂糖凝胶电泳法(琼脂糖凝胶浓度：1％V，电压：150V，电泳时间：40min)检测样品的完整性和纯度。使用Covaris随机打断基因组DNA，用磁珠筛选出平均大小为200-400bp的片段化的基因组DNA。将得到的DNA片段进行末端修复，将3’端进行腺苷酸化，并将接头连接到3’端腺苷酸化的片段的末端，然后进行PCR扩增。使用磁珠对PCR产物进行纯化。双链PCR产物进行热变形，并用夹板寡核苷酸序列进行环化，将单链环状DNA(SsCir DNA)格式化构建最终文库，并对文库质量进行质控。用phi29对文库进行扩增，得到一个分子拷贝数超过300个的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内(固定在阵列化的硅芯片上)，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)和多重置换扩增的双末端测序法(MDA-PE)得到读长为100bp/150bp的双末端序列。
3、质量控制
对测得的数据进行质控处理，最终得到优质的数据进行后续的分析，质控步骤如下：1)过滤低质量的reads；2)去除人类基因组序列的污染，使用FastP(REF21)及其默认参数筛选出低质量的reads和序列适配序列，用Bowtie2(REF22)将reads与人类基因组(Hg38)比对，并使用Samtools筛选出不能与人类基因组比对的成对reads，作为后续分析中使用的clean reads。
4、分类注释和功能注释
使用Metlan2将高质量的reads映射到mpa_v20标记基因数据库，得到每个样本不同分类水平的分类丰度图谱。使用merge_metlan_tables.py组合所有样本的结果，并使用内部脚本获得不同物种级别的组合丰度谱表。另一方面，使用humann2将高质量的reads映射到uniref90和chocophlan，以获得基因丰度和通路丰度图谱。然后，分别使用Humann2_Join_Tables、humann2_renorm_table和humann2_Split_Strayfied_table合并所有样品的丰度，并对丰度进行标准化和进行分层分类注释。此外，使用humann2_regroup_table和humann2进行KEGG和GO富集分析。
5、统计分析
根据样本的分组情况，使用R中的Wilcox.test Two.Side函数对所有丰度结果进行差异分析。每次结果中的P值将根据BH方法进行校正，以获得q值(FDR)，用于筛选明显呈现显著性差异的物种和通路。使用Shannon指数计算每个样本的α多样性。在相同的输入下，使用参数为‘method＝dist_method’的R中Vegan包来计算β多样性。同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。
对分类图谱进行主成分分析(PCA)，使用R的Ade4软件包计算PCA的eig结果，dudi.pca函数得到不同PC的特征向量，li结果得到每个样本在PC轴上的坐标，cl得到每个PC在总方差中的贡献百分比。
为了将差异性物种与样本的临床表型联系起来，按照参数‘method＝Spearman，use＝pairwise，adjust＝BH’，采用R包中的corr.tes方法来计算特征与临床表型之间的Spearman相关性。
6、结果
基于Shannon指数的不同分类水平的α多样性和β多样性在患者和健康人群之间没有显著差异(图1)。
PCA和PcoA结果显示，患者和健康人没有显著的聚集分布(图2)。
物种差异性结果分析显示，呈现显著性差异的物种有20个，其中ROC检测AUC值>0.7的有11个，具体情况如表2所示。对20个差异菌群的联合诊断分析，结果如表3所示。其中，Sutterella_wadsworthensis在MG患者中显著增加(图3)，其AUC值为0.727，诊断阈值为0.003，在最佳临界点的特异性为0.833，Sutterella_parvirubra在MG患者中显著增加，其AUC值为0.681(阈值为0.001，特异性为0.944)，说明使用上述2个菌诊断重症肌无力具有较高的准确性和特异性。分析上述菌群的联合诊断效能，发现Sutterella_wadsworthensis与Sutterella_parvirubra联合具有较高的诊断效能(AUC值为0.802)，说明将上述菌群单独或者联合作为检测指标能有效的区分重症肌无力患者和健康人。
表2差异菌群及AUC值
species AUC值
Bacteroides_massiliensis 0.671
Paraprevotella_unclassified 0.691
Prevotella_bivia 0.697
Prevotella_copri 0.805
Prevotella_stercorea 0.816
Lachnospiraceae_bacterium_2_1_46FAA 0.728
Clostridium_bartlettii 0.741
Dialister_succinatiphilus 0.710
Megamonas_funiformis 0.731
Megamonas_hypermegale 0.731
Megamonas_rupellensis 0.699
Megamonas_unclassified 0.704
Fusobacterium_mortiferum 0.715
Ralstonia_unclassified 0.6
Sutterella_parvirubra 0.681
Sutterella_wadsworthensis 0.727
Helicobacter_cinaedi 0.639
Providencia_alcalifaciens 0.609
Vibrio_alginolyticus 0.609
Pyramidobacter_piscolens 0.732
表3联合诊断AUC值
Figure BDA0002683161290000081
Figure BDA0002683161290000091
Figure BDA0002683161290000101
Figure BDA0002683161290000111
Figure BDA0002683161290000121
Figure BDA0002683161290000131
实施例2验证基因组测序的准确性
按照实施例1的方式收集重症肌无力的样本19例以及健康人的样本13例，患者信息如表4所示。
表4样本临床特征
Figure BDA0002683161290000132
随机选择差异菌群Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi进行测序验证，计算其应用于重症肌无力的诊断效能。
结果显示，Prevotella_copri、Clostridium_bartlettii、Fusobacterium_mortiferum、Helicobacter_cinaedi的AUC值分别为0.736842105、0.672064777、0.821862348、0.615384615，与前述检测的结果相当，说明宏基因组的测序数据准确。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种重症肌无力的肠道菌群标志物，其特征在于，所述肠道菌群标志物选自Sutterella_wadsworthensis和/或Sutterella_parvirubra。
2.一种权利要求1所述的肠道菌群标志物在制备诊断重症肌无力的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含检测肠道菌群标志物的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂是对所述肠道菌群标志物具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述重症肌无力为儿童重症肌无力。
5.一种利用权利要求1所述的肠道菌群标志物预测重症肌无力的系统，其特征在于，包括：
核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；
测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；
数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；
结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。
6.一种诊断重症肌无力的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1所述的肠道菌群标志物丰度的试剂。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂包括检测所述肠道菌群标志物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于，所述产品还包括提取微生物基因组DNA、微生物蛋白或菌体成分的试剂。
9.权利要求1所述的肠道菌群标志物在构建预测重症肌无力的计算模型中的应用。
10.权利要求1所述的肠道菌群标志物在制备治疗重症肌无力的药物组合物中的应用。
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