CN108949994A - 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents
一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108949994A CN108949994A CN201810955321.5A CN201810955321A CN108949994A CN 108949994 A CN108949994 A CN 108949994A CN 201810955321 A CN201810955321 A CN 201810955321A CN 108949994 A CN108949994 A CN 108949994A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- braf gene
- mutation
- detection
- braf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基因突变的检测产品,具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用,所述引物探针组合包括检测引物探针,所述引物探针组合包括ddPCR检测BRAF基因V600E突变的引物探针组合,所述引物探针组合包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对和BRAF基因特异性探针。本发明对BRAF基因突变特异性强、灵敏度高,能够实现核苷酸的绝对定量和稀有等位基因的检测,针对ctDNA等微量物质的检测效果明显优于新一代测序技术,可以对肿瘤组织样本进行检测,能够辅助临床治疗,具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及一种基因突变的检测产品,具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用。
背景技术
鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogenehomolog B 1,BRAF)基因突变驱动肿瘤细胞的增殖、生长和分化,尤其在结直肠癌、甲状腺乳头状癌、多毛细胞白血病、脑肿瘤和黑色素瘤中占比突出。
目前检测到的BRAF突变已逾30种,其中V600E占80%以上,是最常见的BRAF激活突变。BRAF V600E突变可导致RAF/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的持续性激活,引起肿瘤细胞分化增殖、代谢、生长的改变。在病理诊断中,BRAF V600E在多种肿瘤中均有表达,研究及相关文献均表明,其对于多种肿瘤的预后管理、鉴别诊断及治疗等都有很好的临床价值,BRAF突变检测对肿瘤预后评估、靶向治疗等均意义重大;此外,BRAF突变与靶向药物西妥昔单抗及帕尼单抗的耐药相关。
结直肠癌(CRC)位列男性常见恶性肿瘤的第三位和女性常见恶性肿瘤的第二位,大约5%-15%的结直肠癌会发生BRAF位点特异性突变,其中超过90%为BRAF V600E突变,BRAF V600E可用于结直肠癌的鉴别诊断。BRAF V600E突变可以排除林奇综合征(LS),指示为散发型结直肠癌(SCRC)。BRAF V600E检测有效简化了林奇综合征的诊断流程,采用错配修复基因(MMR)蛋白免疫组化染色法对疑似患者进行筛查。若MMR蛋白表达正常,可排除LS;而在MMR蛋白表达缺失的情况下,需具体分析MLH1、MSH2、MSH6及PMS2四种蛋白的具体表达情况。如MLH1缺失,则进行BRAF突变分析,若为V600E阳性则预示着很可能患有SCRC。欧洲临床肿瘤协会(ESMO)和美国国立综合癌症网络(NCCN)指南建议,当MLH1基因缺失时,应检测BRAF V600E以排除SCRC。此外,BRAF V600E还可帮助临床医生进行结直肠癌的预后管理和指导治疗。BRAF V600E突变会导致CRC患者预后不良的概率提升,预示着更低的总生存期,尤其对于晚期患者而言,V600E突变阳性预示预后非常差。尽管尚存在争议,目前有限的资料提示,V600E突变患者抗EGFR单抗治疗应答率明显低于BRAF野生型患者。
BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本在V600E检测体系中具有特异性的扩增,灵敏度和特异性均较高。AGAP3-BRAF融合基因会导致BRAF V600E突变的黑色素瘤对维莫非尼产生耐药。在BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞系中表达AGAP3-BRAF融合基因,会导致维莫非尼耐药,然而,这些细胞仍然对MEK抑制剂(丝裂原活化抑制剂)较为敏感。BRAF基因是一种原癌基因,如果出现了突变,身体患癌的可能性就比较大。而V600E代表的是BRAF基因最容易癌变的一个位点。
经过大量研究证实,BRAF V600E基因突变与甲状腺癌的诊断、治疗和判断预后都有重要联系。BRAF V600E突变发生在40%-70%的PTC中,而在FTC、MTC、嗜酸性细胞腺癌、腺瘤和良性甲状腺增生中极少发现,因此BRAF V600E可作为PTC临床鉴别诊断指标。因BRAFV600E与PTC恶性特征具有相关性,与肿瘤大小等高风险特征呈正相关,可辅助PTC诊断。在PTC的诊断中,甲状腺细针穿刺活检(FNAB)单独诊断其敏感性仅为63.3%,而采用FNAB与BRAF V600E联合检测,敏感性可提升至80%。美国甲状腺协会(ATA)管理指南建议,有甲状腺结节的患者在细胞学活检不确定时,建议使用分子标志物(如BRAF、RAS、RET/PTC等)进行辅助诊断。细针穿刺是诊断甲状腺癌最好的手段之一,创伤小,准确率也比较高。但是仍然有20-30%的患者不能完全确诊。如果联合检测BRAF V600E基因,如果检测到基因突变,那么就基本可能诊断为甲状腺乳头状癌,特异性几乎可以达到100%。诊断甲状腺乳头状癌后,需要接受规范的治疗。如果治疗前就检测到BRAF-V600E基因突变,说明肿瘤侵袭性比较强,可能合并多个病灶,所以在手术方案的选择上,就倾向于更大范围的手术方案,以保证手术彻底性。如果手术后,检测到BRAF-V600E基因突变,说明该肿瘤可能侵袭性比较强,复发转移概率比没有BRAF-V600E基因突变的更高,所以要密切随访观察。BRAF V600E突变与PTC的侵袭性及不良预后有关,可为PTC治疗提供参考。术前检查PTC的BRAF V600E基因突变可辅助预测术后复发风险、指导手术切除范围及术后后继治疗。在PTC预后方面,BRAFV600E突变长期预后差,预示着更差的碘摄入及更高的复发概率和病死率。NCCN于2014年第2版甲状腺癌指南中指出,肿瘤的组织学类型、肿瘤大小、局部浸润及坏死、血管浸润以及BRAF基因突变状态和转移是影响预后的重要变量。
循环肿瘤基因(循环肿瘤DNA),即ctDNA(circulating tumor DNA),是指肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统,是一种特征性的肿瘤生物标记。通过ctDNA检测,能够检出血液中的肿瘤踪迹。ctDNA作为一种新的肿瘤标志物,将在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用,尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤,可避免复杂的、具有创伤性的活检,能够多次取样便于疾病的动态检测。随着基因测序的飞速发展,目前,已能在血液中对其进行检测并计数。ctDNA基因测序对于发现早期或癌前阶段肿瘤踪迹具有重要意义,为肿瘤的治疗提供时机,基于ctDNA的超早期肿瘤基因检测将是未来肿瘤疾病预防、治疗的研究和发展方向。
一代PCR就是我们目前最常用的终点PCR技术,通过凝胶电泳获得定性的结果。风靡全球的实时定量PCR(Q-PCR)技术为第二代,它利用荧光试剂监控扩增,来实现相对定量。在开展基因表达分析时,需要标准曲线或参考基因来协助定量。数字PCR(dPCR)技术则为第三代PCR,与Q-PCR技术不同,数字PCR采用绝对定量的方式,不依赖于标准曲线和参照样本,直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性的优势,dPCR迅速得到了广泛的应用。目前普遍认为dPCR在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有其他技术不可比拟的优势,同时其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等方面具有的广阔应用前景。微滴式数字PCR(ddPCR)可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴技术让数字PCR更低成本,且更实用。ddPCR是一种对PCR反应物进行有限稀释,随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增,最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。相对于传统的QPCR而言,dPCR是一种高度灵敏的存在,能够实现核酸的绝对定量和稀有等位基因的检测。与新一代测序(NGS)技术相比,NGS的流程复杂,周转时间长,且检测成本高,并且往往难以检测体液中5%以下的突变。dPCR可实现高度灵敏的核酸绝对定量,不容易受到PCR抑制剂的干扰,并且比NGS的流程更加简单和经济。
相对于传统的QPCR而言,dPCR是一种高度灵敏的存在,能够实现核酸的绝对定量和稀有等位基因的检测。与新一代测序(NGS)技术相比,NGS的流程复杂,周转时间长,且检测成本高,并且往往难以检测体液中5%以下的突变。dPCR可实现高度灵敏的核酸绝对定量,不容易受到PCR抑制剂的干扰,并且比NGS的流程更加简单和经济。ddPCR和NGS比较,ddPCR对ctDNA等微量物质检测优于NGS,而NGS同时检测大规模样本的能力强于ddPCR。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用,所述引物探针组合具有准确率高、灵敏度高、能够达到绝对定量的特点。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种BRAF基因突变检测的引物探针组合,所述引物探针组合包括ddPCR检测BRAF基因V600E突变的引物探针组合,所述引物探针组合包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对和BRAF基因特异性探针;
其中,所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示,所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,具体序列如下:
正向引物(SEQ ID NO.1):5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’;
反向引物(SEQ ID NO.2):5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’;
特异性探针(SEQ ID NO.3):GAACAGAGAAAG.
本发明通过ddPCR技术,配合特异性的突变引物和探针序列,协同增效,对BRAF基因突变进行检测,灵敏度高,能够实现核苷酸的绝对定量和稀有等位基因的检测,针对ctDNA等微量物质的检测效果明显优于新一代测序技术,有效拓展了样本来源,血液、唾液、尿液、脑脊液或关节滑液等体液均可用作检测样本。
优选地,所述所述BRAF基因特异性探针的5’端带有荧光基团。
优选地,所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合,优选为FAM。
本发明中,所述荧光基团包括FAM基团、HEX基团、TET基团、JOE基团、NED基团、VIC基团、CY3基团、CY5基团、ROX基团或TAMRA基团,优选为FAM基团,FAM基团即羟基荧光素,绿色荧光,是荧光素衍生物的一种,和其他荧光素衍生物相比,FAM与氨基反应更快,产物更稳定,使用更加普遍,提高探针的灵敏度。
优选地,所述BRAF基因特异性探针的3’端带有淬灭基团。
优选地,所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合,优选为MGB。
本发明中,针对BRAF基因的V600E突变位点上下游特定区域,设计PCR上下游引物和高特异性的突变检测探针,通过对探针的修饰,在探针3’端添加淬灭基团,筛选出于探针匹配性更高的引物,组合匹配引物和探针,提高检测的灵敏度和检测精度,对BRAF基因V600E位点的突变进行准确检测,能有效检出低频突变。
第二方面,本发明提供一种检测BRAF基因突变的试剂盒,所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
优选地,所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。
优选地,所述阴性质控为无菌水。
优选地,所述阳性质控为含有突变位点的BRAF基因片段,所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,具体序列如下:
含有突变位点的BRAF基因片段(SEQ ID NO.4)为AATTCATACAGAACAATCCCAAATGCATATACATCT。
优选地,所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
本发明提供的检测BRAF基因突变的试剂盒能应用于肿瘤检测试剂盒或癌症基因检测设备中,能够实时获得BRAF基因V600E位点的突变信息,结合患者个体差异,辅助医生进行个体治疗方案制定,选择治疗药物,提高预后效果,提高患者生活质量,延长患者生存时间。
第三方面,本发明提供一种BRAF基因突变的检测体系,包括BRAF基因突变的ddPCR检测体系,所述ddPCR检测体系包括如第一方面所述的引物探针组合。
优选地,所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的浓度为0.2-1μM,例如可以是0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1μM。
优选地,所述BRAF基因特异性探针的浓度为0.1-0.5μM,例如可以是0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM。
优选地,所述检测体系还包括模板、10×PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、阳性质控和阴性质控。
优选地,所述模板的来源包括血液、唾液、尿液、脑脊液或关节滑液中的任意一种或至少两种的组合,例如可以是血液和唾液的组合,尿液和脑脊液的组合,或血液和关节滑液的组合。
优选地,所述模板中的基因组DNA的浓度为0.3-3.3ng/μL,例如可以是0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1ng/μL、1.2ng/μL、1.5ng/μL、1.6ng/μL、1.8ng/μL、1.9ng/μL、2ng/μL、2.2ng/μL、2.5ng/μL、2.7ng/μL、2.9ng/μL、3ng/μL、3.1ng/μL或3.3ng/μL。
优选地,所述dNTPs的浓度为50-200μmol/L,例如可以是50μmol/L、55μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L、110μmol/L、120μmol/L、130μmol/L、140μmol/L、150μmol/L、160μmol/L、170μmol/L、180μmol/L、190μmol/L或200μmol/L。
优选地,所述Taq酶的浓度为1-4U/100μL,例如可以是1U/100μL、1.5U/100μL、2U/100μL、2.5U/100μL、3U/100μL、3.5U/100μL或4U/100μL。
优选地,所述阳性质控的浓度为40-100U/100μL,例如可以是40U/100μL、45U/100μL、50U/100μL、55U/100μL、60U/100μL、65U/100μL、70U/100μL、75U/100μL、80U/100μL、85U/100μL、90U/100μL、95U/100μL或100U/100μL。
第四方面,本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的检测体系用于检测BRAF基因突变的方法,包括如下步骤:
(1)配制ddPCR混合液;
(2)制作PCR反应液微滴;
(3)PCR扩增。
优选地,步骤(3)所述的PCR扩增的条件为:
a)93-98℃预变性3-8min;
b)93-98℃变性15-45s,55-60℃退火15-45s,70-75℃延伸30-60s,35-45个循环;
c)70-75℃延伸8-12min。
步骤(a)所述预变性温度为93-98℃,例如可以是93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃,优选为95℃。
步骤(a)所述预变性时间为3-8min,例如可以是3min、4min、5min、6min、7min或8min,优选为5min。
步骤(b)所述变性温度为93-98℃,例如可以是93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃,优选为95℃。
步骤(b)所述变性时间为15-45s,例如可以是15s、18s、20s、25s、30s、35s、40s或45s,优选为30s。
步骤(b)所述退火温度为55-60℃,例如可以是55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃,优选为57℃。
步骤(b)所述退火时间为15-45s,例如可以是15s、18s、20s、25s、30s、35s、40s或45s,优选为30s。
步骤(b)所述延伸温度为70-75℃,例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃,优选为72℃。
步骤(b)所述延伸时间为30-60s,例如可以是30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s,优选为45s。
步骤(b)所述循环数为35-45个,例如可以是35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个或45个,优选为40个。
步骤(c)所述延伸温度为70-75℃,例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃,优选为72℃。
步骤(c)所述延伸时间为8-12min,例如可以是8min、9min、10min、11min或12min,优选为10min。
优选地,步骤(3)所述的PCR扩增的条件为:
a)95℃预变性5min;
b)95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,40个循环;
c)72℃延伸10min。
第五方面,本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合、如第二方面所述的试剂盒或如第三方面所述的检测体系用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或甲状腺癌诊断试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有的有益效果:
(1)本发明通过ddPCR技术,配合特异性的突变引物和探针序列,协同增效,对BRAF基因突变进行检测,灵敏度高,能够实现核苷酸的绝对定量和稀有等位基因的检测,针对ctDNA等微量物质的检测效果明显优于新一代测序技术;
(2)本发明提供的检测试剂盒通过设计特异性的突变引物和探针序列,组合配比试剂盒内各组分的浓度,所得试剂盒高效简洁,具有高灵敏度和特异性,操作简单易行,耗时短,结果准确度高;
(3)本发明提供的检测体系不容易受到PCR抑制剂的干扰,比新一代测序技术的检测流程更加简单快捷,且准确度高,检测成本低;
(4)本发明提供的检测方法能够检测ctDNA中微量的BRAF基因V600E突变,有效拓展了样本来源,血液、唾液、尿液、脑脊液或关节滑液等体液均可用作检测样本。
附图说明
图1(a)为阳性标准品质控一维图;图1(b)为阳性标准品检测结果图;
图2(a)为阴性标准品质控一维图;图2(b)为阴性标准品检测结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 试剂盒的组装
引物探针组合的设计,具体序列如下表1所示:
表1引物探针的序列
编号 | 序列 | |
正向引物 | SEQ ID NO.1 | 5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’ |
反向引物 | SEQ ID NO.2 | 5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’ |
特异性探针 | SEQ ID NO.3 | FAM-GAACAGAGAAAG-MGB |
阴性质控品:无菌水;
阳性质控品:含有突变位点的BRAF基因片段,所述基因片段的核苷酸序列如SEQID NO.4所示;
含有突变位点的BRAF基因片段(SEQ ID NO.4):AATTCATACAGAACAATCCCAAATGCATATACATCT;
辅助试剂:Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液;
将上述组分、说明书及离心管组装后装入试剂盒中;
阳性质控和阴性质控的验证结果如图1(a)-(b)和图2(a)-(b)所示,由图1(a)-(b)和图2(a)-(b)可知,阳性质控和阴性质控符合质控标准,能够对检测结果起到指示作用。
实施例2 BRAF基因突变检测
(1)根据BRAF基因的V600E的上下游区域进行特异性引物设计,所得上下游特异性引物序列具体如下:
SEQ ID NO.1:5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3’;
SEQ ID NO.2:5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’;
BRAF基因的V600E突变位点的特异性探针在5’和3’端分别添加FAM基团和MGB基团,所得特异性探针序列如下:
特异性探针(SEQ ID NO.3):FAM-GAACAGAGAAAG-MGB.
(2)配制探针法定量反应体系,振荡混匀,离心除气泡,反应体系见表2:
表2 PCR反应体系的配制
组分 | 体积/μL |
模板DNA | 4 |
10×PCR缓冲液 | 2.5 |
dNTP | 2 |
上游引物 | 0.5 |
下游引物 | 0.5 |
Taq酶 | 0.5 |
H2O | 14 |
探针 | 1 |
总计 | 25 |
(3)将20ul样品反应体系加入到微滴发生器盒(DG8cartridge)中间一排的8个孔内,不足8个样品时用缓冲液补足。在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油(DG Oil);
(4)将以上微滴发生器盒夹持器(holder)轻轻地平稳放置于微滴生成仪中,开始生成微滴;
(5)转移油滴进入96孔板内完成后,用预热好的PX1热封仪对其进行封膜,封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应;
(6)PCR反应条件:预变性95℃5min,95℃30s;退火57℃30s;72℃延伸45s,循环40次,最后72℃延伸10min。
(7)完成PCR的96孔板放入板夹(plate holder)中组装好,平稳放入微滴读取仪中读取实验结果。
实施例3
与实施例2相比,除了PCR反应条件为预变性98℃3min,93℃45s;退火55℃45s;75℃延伸30s,循环45次,最后70℃延伸12min之外,其他条件同实施例2。
实施例4
与实施例2相比,除了PCR反应条件为预变性93℃8min,98℃15s;退火60℃15s;70℃延伸60s,循环35次,最后75℃延伸8min之外,其他条件同实施例2。
综上所述,本发明通过ddPCR技术,配合特异性的突变引物和探针序列,协同增效,对BRAF基因突变进行检测,灵敏度高,能够实现核苷酸的绝对定量和稀有等位基因的检测,针对ctDNA等微量物质的检测效果明显优于新一代测序技术,组合配比试剂盒内各组分的浓度,所得试剂盒高效简洁,具有高灵敏度和特异性,操作简单易行,耗时短,结果准确度高,有效拓展了样本来源,血液、唾液、尿液、脑脊液或关节滑液等体液均可用作检测样本。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津脉络医学检验有限公司
<120> 一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用
<130> 2018
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
tcataatgct tgctctgata gga 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
ggccaaaaat ttaatcagtg ga 22
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
gaacagagaa ag 12
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
aattcataca gaacaatccc aaatgcatat acatct 36
Claims (10)
1.一种BRAF基因突变检测的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合包括ddPCR检测BRAF基因V600E突变的引物探针组合,所述引物探针组合包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对和BRAF基因特异性探针;
其中,所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示,所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,所述BRAF基因特异性探针的5’端带有荧光基团;
优选地,所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合,优选为FAM;
优选地,所述BRAF基因特异性探针的3’端带有淬灭基团;
优选地,所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合,优选为MGB。
3.一种检测BRAF基因突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂;
优选地,所述阴性质控为无菌水;
优选地,所述阳性质控为含有突变位点的BRAF基因片段,所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
优选地,所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
5.一种BRAF基因突变的检测体系,其特征在于,包括BRAF基因突变的ddPCR检测体系,所述ddPCR检测体系包括如权利要求1或2所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的检测体系,其特征在于,所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的浓度为0.2-1μM;
优选地,所述BRAF基因特异性探针的浓度为0.1-0.5μM;
优选地,所述检测体系还包括模板、10×PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、阳性质控和阴性质控;
优选地,所述模板的来源包括血液、唾液、尿液、脑脊液或关节滑液中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述模板中的基因组DNA的浓度为0.3-3.3ng/μL。
7.根据权利要求5或6所述的检测体系,其特征在于,所述dNTPs的浓度为50-200μmol/L;
优选地,所述Taq酶的浓度为1-4U/100μL;
优选地,所述阳性质控的浓度为40-100U/100μL。
8.一种利用如权利要求1或2所述的引物探针组合、如权利要求3或4所述的试剂盒或如权利要求5-7中任一项所述的检测体系用于检测BRAF基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配制ddPCR混合液;
(2)制作PCR反应液微滴;
(3)PCR扩增。
9.根据根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的PCR扩增的条件为:
a)93-98℃预变性3-8min;
b)93-98℃变性15-45s,55-60℃退火15-45s,70-75℃延伸30-60s,35-45个循环;
c)70-75℃延伸8-12min;
优选地,步骤(3)所述的PCR扩增的条件为:
a)95℃预变性5min;
b)95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸45s,40个循环;
c)72℃延伸10min。
10.一种如权利要求1或2所述的引物探针组合、如权利要求3或4所述的试剂盒或如权利要求5-7中任一项所述的检测体系用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或甲状腺癌诊断试剂和/或药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810955321.5A CN108949994A (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810955321.5A CN108949994A (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108949994A true CN108949994A (zh) | 2018-12-07 |
Family
ID=64473690
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810955321.5A Pending CN108949994A (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108949994A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015187512A1 (en) * | 2014-06-01 | 2015-12-10 | Trovagene, Inc. | Monitoring treatment of histiocytosis with vemurafenib and dabrafenib |
CN108277263A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-07-13 | 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 | 一种检测braf基因v600e的引物探针组合物及其检测方法 |
-
2018
- 2018-08-21 CN CN201810955321.5A patent/CN108949994A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015187512A1 (en) * | 2014-06-01 | 2015-12-10 | Trovagene, Inc. | Monitoring treatment of histiocytosis with vemurafenib and dabrafenib |
CN108277263A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-07-13 | 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 | 一种检测braf基因v600e的引物探针组合物及其检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ASHLEIGH C. MCEVOY 等: "Droplet Digital PCR for Mutation Detection in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Melanoma Tissues A Comparison with Sanger Sequencing and Pyrosequencing", 《THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》 * |
MIGUEL F. SANMAMED 等: "Quantitative Cell-Free Circulating BRAFV600E Mutation Analysis by Use of Droplet Digital PCR in the Follow-up of Patients with Melanoma Being Treated with BRAF Inhibitors", 《CLINICAL CHEMISTRY》 * |
NIRMAL RAJASEKARAN 等: "Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalinfixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN100523216C (zh) | Pcr方法 | |
CN108949990B (zh) | 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法 | |
CN103710460B (zh) | 定量检测egfr基因突变的试剂盒及其用途 | |
US20050069906A1 (en) | Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer | |
CN110724741B (zh) | 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒 | |
EP2121988B1 (en) | Prostate cancer survival and recurrence | |
CN107868828A (zh) | 检测egfr基因t790m位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法 | |
CN108315431A (zh) | 数字PCR技术检测c-MET基因扩增的引物、探针及其检测方法 | |
CN107937496A (zh) | 一种利用数字pcr技术检测egfr g719x基因变异的方法 | |
CN108342464A (zh) | 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法 | |
CN109055555A (zh) | 一种肺癌早期转移诊断标志物及其试剂盒和应用 | |
CN109182529B (zh) | 检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒 | |
CN105463111A (zh) | 用于检测人类pik3ca基因5种突变的探针、引物及试剂盒 | |
CN106636376A (zh) | 用于检测人类ros1融合基因的核酸、试剂盒及方法 | |
CN109996891A (zh) | 用于进行结肠癌和/或结肠癌前体细胞的早期检测和用于监测结肠癌复发的方法 | |
CN107574246A (zh) | 检测TBLR1‑RARα和PRKAR1A‑RARα融合基因相对表达量引物探针方法 | |
CN109983135A (zh) | 表皮细胞生长因子受体基因突变检测用组合物及包含其的试剂盒 | |
KR102052398B1 (ko) | 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
CN109554475A (zh) | 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 | |
CN108949994A (zh) | 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 | |
CN110358825A (zh) | 检测人bcr-abl融合基因的试剂盒及其使用方法 | |
CN106811537A (zh) | 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用 | |
CN108251523A (zh) | 一种非小细胞肺癌分子标志物及其应用 | |
CN110157806A (zh) | 一种检测eml4-alk的试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN110684849A (zh) | 基于ddPCR检测人循环肿瘤细胞KRAS基因突变的引物、探针、试剂盒及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181207 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |