CN105296616A - 一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，属于别嘌呤醇用药检测技术领域。本发明在LAMP基础上采用等位基因特异性LAMP方法，针对rs9262570的T等位基因设计了特异引物和试剂盒，利用rs9262570的T等位基因与HLA-B*5801的关联性判断患者是否携带HLA-B*5801等位基因，从而指导别嘌呤醇个体化用药，避免直接测试HLA-B*5801，解决了现有的检测方法中杂合子的干扰。

Description

一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒
技术领域
本发明涉及别嘌呤醇个体化用药检测技术领域，尤其涉及一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒。
背景技术
别嘌呤醇，是临床上用来治疗原发性和继发性高尿酸血症，反复发作或慢性痛风以及尿酸性肾结石和/或尿酸性肾病等疾病的常用药物。然而，别嘌呤醇在某些个体中会引起严重的皮肤不良反应，即Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)。其中，SJS的死亡率可达5％，而TEN的死亡率则可高达35％，并且50％的TEN患者在预后会有远期的后遗症。显然不同的个体对别嘌呤醇的耐受有极大的差别。
现已研究证实，服用别嘌呤醇的患者中发生SJS/TEN的危险性与HLA-B*5801等位基因的存在与否密切相关，因此CIPC规定凡是HLA-B*5801阳性的患者禁止服用别嘌呤醇，以避免SJS/TEN的发生。我国2015年发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》明确指出，“携带HLA-B*5801等位基因者慎用别嘌呤醇，以免引起SJS/TEN”。
HLA的分型、检测目前有PCR-RFLP，PCR-SSO，PCR-SSP和PCR-SBT等方法。其中PCR-RFLP只能区分有限的多态性；PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂(引物),且不能识别非经典的HLA基因和假基因；PCR-SBT法由于有杂合子的干扰，因此很难区分出不同的单倍型，而且需要昂贵的设备和试剂，不适宜大规模推广。以上这些方法都不能解决杂合子的问题，而且由于都需要开管检测，很可能会带来样本间的交叉污染，而且大规模的操作也非常的繁琐。因此，有必要寻求一种新的检测方向和检测方法。
发明内容
本发明要解决的问题是现有的别嘌呤醇个体化用药检测方法难以解决杂合子的问题，且可能带来样本间的交叉感染、检测操作繁琐、成本高，不适于大范围推广使用。
环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技术是日本科学家于2000年开发出来的一种恒温扩增技术，实验针对靶基因的六个区域设计四条特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，可在十几分钟到一小时之内产生109-1010数量级的产物，反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。
最近的研究发现，在中国人中，HLA-B*5801与rs9262570的T等位基因紧密连锁，其敏感性可达100％，特异性达97.4％。因此可以通过只检测rs9262570的T等位基因而实现HLA-B*5801的检测，大大降低了检测难度和检测成本。
本发明在LAMP的基础上采用等位基因特异性环介导等温扩增(Allele-SpecificLAMP)技术，针对rs9262570的T等位基因设计特异引物，并设计出了检测用的试剂盒及方法，用于指导别嘌呤醇个体化用药。
本发明的第一个目的在于提供一种别嘌呤醇个体化用药检测引物，用于检测rs9262570的T等位基因，包括以下引物：
5′-CCCTGGTCTTGTAACTCC-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-ATACCTCCTTGAGATAGAAACT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-AGAAGTCTGACCCCAGAGCTACCTGGGATATGGAATAATGC-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-ATCGTTGTTCCACTACCTACTAACTGATAGGTAAATTGAGGTTTAGAGAAG-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
本发明提供的引物中，FIP是针对rs9262570的T等位基因的特异引物，同时又在特异引物中人为加入一个点突变，提高了引物的特异性，降低了非特异扩增的可能性，提高了检测的准确性。
优选地，所述F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
本发明的第二个目的在于提供一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，包括用于别嘌呤醇个体化用药的检测组合物。所述组合物包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
进一步地，所述组合物还包括用于显示组合物颜色的指示剂。
优选地，所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。
进一步地，所述组合物还包括甜菜碱或二甲基亚砜中的一种。其中，甜菜碱的浓度大于0，小于等于1M。二甲基亚砜的浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。
优选地，所述组合物中甜菜碱的浓度为0.8M。
优选地，所述组合物中，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM。
进一步地，所述缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。
优选地，若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM。若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
优选地，所述组合物中dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。
本发明的第三个目的在于提供一种别嘌呤醇个体化用药的检测方法。所述检测方法，使用上述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，具体为：将待检测的核酸加入到所述组合物中，得到的反应体系于55～70℃下反应，反应结束后观察体系的变化。
进一步地，所述待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。
优选地，反应结束后，将反应体系进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增。
优选地，反应温度为60℃。
优选地，反应时间为40～120min。
在本发明的反应体系中，反应前体系为澄清状态，发生阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，体系产生肉眼可见的沉淀，变为浑浊状态。观察体系状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。
当体系中存在指示剂时：(1)若指示剂为羟基萘酚蓝，反应前体系中的镁离子与dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色；(2)若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物时，反应前钙黄绿素与氯化锰中的锰离子结合，体系呈现黄色；当有阳性反应时，副产物焦磷酸与锰离子结合生成沉淀，钙黄绿素与体系中的镁离子结合，体系颜色逐渐由黄色变为荧光绿色。观察反应体系颜色和/或状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。
本发明具有的优点和积极效果是：(1)本发明在LAMP基础上采用等位基因特异性LAMP技术，针对rs9262570的T等位基因设计了特异引物和包含该引物的试剂盒，利用rs9262570的T等位基因与HLA-B*5801的关联性判断患者是否携带HLA-B*5801等位基因，从而指导别嘌呤醇个体化用药，解决了现有的检测方法中杂合子的干扰。(2)本发明运用Allele-SpecificLAMP技术，设计了特异引物，测试后，观察反应体系的状态变化(是否有沉淀或者颜色的变化)即可判断是否发生阳性反应，简便易判断。(3)使用本发明提供的检测引物、试剂盒和方法进行检测，所需要的设备仅是水浴锅或金属浴或者热循环仪，检测成本低；检测耗时较短；且本检测方法不需要额外的开管检测，因此有效避免了交叉污染的产生，提高了检测的准确性。本发明提供的检测试剂盒和方法成本低廉、检测时间短、准确性高，易于推广。
附图说明
图1是检测样本1-9经LAMP反应得到的产物的电泳图。
图2-图10分别是检测样本1-9用PCR-测序法得到的rs9262570位点的测序图谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的描述。
一种别嘌呤醇个体化用药检测引物，用于检测rs9262570的T等位基因，包括以下引物：
5′-CCCTGGTCTTGTAACTCC-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-ATACCTCCTTGAGATAGAAACT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-AGAAGTCTGACCCCAGAGCTACCTGGGATATGGAATAATGC-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-ATCGTTGTTCCACTACCTACTAACTGATAGGTAAATTGAGGTTTAGAGAAG-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
上述的F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，包括别嘌呤醇个体化用药检测组合物。所述组合物包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、指示剂、甜菜碱或二甲基亚砜中的一种。组合物中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置。作为一种实施方案，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM，dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。若组合物中有甜菜碱，其浓度浓度大于0，小于等于1M；若组合物中有二甲基亚砜，其浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。作为优选，甜菜碱的浓度为0.8M。作为一种实施方案，缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM。若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
一种别嘌呤醇个体化用药的检测方法，使用上述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒。具体为：将待检测的核酸加入到上述组合物中，得到的反应体系。反应体系于55～70℃下反应40～120min。反应结束后，将反应体系进行灭活处理。灭火处理使得体系中的酶失活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增。反应结束后观察体系的变化。作为优选，待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。反应温度为60℃，恒温反应。
具体实施时，抽取8人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存，每管取200uL血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的样本，样本记为模板T。上述8个样本分别顺序编号1-8，除上述8组外，还加入了已知rs9262570的T等位基因阳性的质粒作为阳性对照，编号9。
对模板T进行采用Allele-SpecificLAMP反应，用本发明提供的试剂盒，检测rs9262570位点的基因型。将模板Tn(n为组别编号，1-9)分别加入到试剂盒的组合物中，得到反应体系。反应体系在60℃下反应60min，之后升温至80℃进行灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化即可。
作为一种实施方案，反应体系总容积为25μL，各组分和其规格如下表所示：
反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如下表所示：
由上表可知，编号为1-8的样本反应体系均保持紫罗兰色，证明其未发生阳性反应，提示这8个样本在rs9262570位点的基因型为C。根据HLA-B*5801与rs9262570的T等位基因的关联性，检测样本1-8不携带HLA-B*5801等位基因，适用别嘌呤醇。
为进一步验证反应的准确性，对上述组别的LAMP产物进行电泳，用2％的琼脂糖凝胶，6v/cm电压下电泳30min。得到的电泳图如附图1所示。第9组的阳性反应呈现典型的梯状条带，而阴性反应则没有条带。与本发明的试剂盒的检测结果相同。
将上述9个实验组别的模板分别用PCR-测序法对rs9262570进行分型，得到的测序图谱如图2-图10所示，对比基因测序图谱和本发明提供的试剂盒和方法的检测结果可知，二者的检测吻合率100％。可验证本发明的结果精准。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims (16)

1.一种别嘌呤醇个体化用药检测引物，其特征在于：包括以下引物：
5′-CCCTGGTCTTGTAACTCC-3′(SEQIDNo.1，以下简称F3)
5′-ATACCTCCTTGAGATAGAAACT-3′(SEQIDNo.2，以下简称B3)
5′-AGAAGTCTGACCCCAGAGCTACCTGGGATATGGAATAATGC-3′(SEQIDNo.3，以下简称FIP)
5′-ATCGTTGTTCCACTACCTACTAACTGATAGGTAAATTGAGGTTTAGAGAAG-3′(SEQIDNo.4，以下简称BIP)。
2.根据权利要求1所述的别嘌呤醇个体化用药检测引物，其特征在于：所述F3、B3、FIP、BIP均为HPLC纯化法纯化后的引物。
3.一种别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，包括用于别嘌呤醇个体化用药的检测组合物，所述组合物包括如权利要求1或2所述的引物，其特征在于：所述组合物还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
4.根据权利要求3所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括用于显示组合物颜色的指示剂。
5.根据权利要求4所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。
6.根据权利要求3所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括甜菜碱或二甲基亚砜中的一种；
其中，甜菜碱的浓度大于0，小于等于1M；
二甲基亚砜的浓度大于0，小于等于10％(体积分数)。
7.根据权利要求6所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述甜菜碱的浓度为0.8M。
8.根据权利要求3-6任一所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述组合物中，F3和B3均为0.4μM，FIP和BIP均为1.6μM。
9.根据权利要求3-6任一所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括：Tris-HCl20mM，KCl50mM，(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，Tween-200.1％(体积分数)。
10.根据权利要求5所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物，钙黄绿素为25μM，氯化锰为0.5mM；
若指示剂为羟基萘酚蓝，其为120μM。
11.根据权利要求3-6任一所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：所述组合物中dNTP为1.4mM，Bst聚合酶为8U。
12.一种别嘌呤醇个体化用药的检测方法，使用权利要求3-11任一所述的别嘌呤醇个体化用药检测试剂盒，其特征在于：将待检测的核酸加入到所述组合物中，得到的反应体系于55～70℃下反应，反应结束后观察体系的变化。
13.根据权利要求12所述的别嘌呤醇个体化用药的检测方法，其特征在于：所述待检测的核酸在反应体系中的浓度为0.8～4ng/μL。
14.根据权利要求12或13所述的别嘌呤醇个体化用药的检测方法，其特征在于：反应结束后，将反应体系进行灭活处理。
15.根据权利要求12或13所述的别嘌呤醇个体化用药的检测方法，其特征在于：反应温度为60℃。
16.根据权利要求12或13所述的别嘌呤醇个体化用药的检测方法，其特征在于：反应时间为40～120min。
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