CN102899406B

CN102899406B - 定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1a1基因分型的测序引物对及其试剂盒

Info

Publication number: CN102899406B
Application number: CN201210347972.9A
Authority: CN
Inventors: 周姗
Original assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Current assignee: CHANGSHA 3G BIOTECH CO LTD
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: CN102899406A

Abstract

本发明提供一种定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反应液、PCR扩增引物、焦磷酸测序引物、以及阳性对照品；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。

Description

定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的测序引物对及其试剂盒

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)基因分型的测序引物对及其试剂盒。

背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（uridinediphosphoglucuronate glucucronosyltransferase,UGT）是生物体内进行第Ⅱ相生物转化时最重要的酶之一，属于糖基转移酶超家族。UGT共有2个亚家族，UGT1A和UGT2家族。UGT1A1是一种对许多内源性和外源性物质进行解毒，加强其排泄的重要酶类，UGT1A1基因的遗传多态性对减轻药物的毒副作用有重要的临床意义。目前发现的多态性主要包括（TA）n重复序列启动子（UGT1A1*28）的多态性和UGT1A1*6基因序列的多态性。在中国人中，UGT1A1*28只发现两种类型：（TA）6和（TA）7，可组合成TA6/6、TA6/7和TA7/7三种等位基因。相对于TA6/6表型患者，TA7/7表型患者的UGT1A1酶活性降低约50%。UGT1A1*6基因突变主要发生在第一号外显子第211核苷酸上G突变成A，导致其编码的甘氨酸变为精氨酸（G71R）。UGT1A1基因表达减少会增加人体对某些药物的敏感性，可能发生未预期的毒性。

伊立替康（Irinotecan，CPT-11），是DNA拓扑异构酶I抑制剂，可诱导单链DNA损伤，从而阻断DNA复制叉，阻止DNA链的重新组装，引起DNA双链的断裂，造成细胞死亡。主要治疗成人晚期转移性大肠癌，对小细胞和非小细胞肺癌、宫颈癌和卵巢癌亦有疗效。伊立替康为前体药物，在体内经过羧酸酯酶转化为活性代谢物。羧酸酯酶将伊立替康分子10位的哌啶侧链裂解，产生7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38），其活性较伊立替康强100到1000倍。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-GT，主要由UGT1A1、UGT1A7和UGT1A9代谢）葡萄糖醛酸化灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G），从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。但UGT1A1酶的UGT1A1*28的形式不能催化SN-38，结果聚集在体内的SN-38引发腹泻或嗜中性白血球减少症等其他毒性，UGT1A1*28的突变使UGT1A1的转录活性下降三分之二，UGT1A1*6的突变导致酶活性降为野生型的49%，因此，2005年，美国FDA要求在伊立替康药品标签上加入警示，建议患者在使用伊立替康前先检查是否带有UGT1A1*28突变。

目前医院用于UGT1A1基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法,但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。

焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的

目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行UGT1A1的基因多态性检测的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)基因分型的测序引物对及其试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)基因分型的测序引物对，所述引物对为如下引物：

UGT1A1*6正向扩增引物：5′-CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3′（SEQ IDNO.1）；

UGT 1A1*6反向扩增引物：5′-CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3′（SEQ IDNO.2）

UGT1A1*6测序引物：5′-CTTCAAGGTGTAAAATGC-3′（SEQ ID NO.3）

UGT1A1*28正向扩增引物：5′-TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3′（SEQID NO.4）

UGT1A1*28反向扩增引物：5′-TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3′（SEQID NO.5）

UGT1A1*28测序引物：5′-CGCCCTCTCCTACTTA-3′（SEQ ID NO.6）

其中，UGT1A1*6正向扩增引物（SEQ ID NO.1）和UGT1A1*28（SEQ IDNO.4）正向扩增引物的5′端分别进行生物素标记。

一种定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO.2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO.5所示反向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。

进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA（SEQ ID NO.7）（control oligo）和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。

进一步地，所述试剂盒还包括UGT1A1*6阳性对照品1，UGT1A1*6阳性对照品2，UGT1A1*6阳性对照品3；UGT1A1*28阳性对照品1，UGT1A1*28阳性对照品2，UGT1A1*28阳性对照品3；

所述UGT1A1*6阳性对照品1为插有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的UGT1A1*6野生纯合子质粒；所述UGT1A1*6阳性对照品2为插有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的UGT1A1*6突变纯合子质粒；UGT1A1*6阳性对照品3为由所述UGT1A1*6突变纯合子质粒和所述UGT1A1*6野生纯合子质粒组成的UGT1A1*6质粒混合物；

所述UGT1A1*28阳性对照品1为插有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的UGT1A1*28野生纯合子质粒；UGT1A1*28阳性对照品2为插有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的UGT1A1*28突变纯合子质粒；UGT1A1*28阳性对照品3为由所述UGT1A1*28突变纯合子质粒和所述UGT1A1*28野生纯合子质粒组成的UGT1A1*28质粒混合物；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述UGT1A1*6质粒混合物中UGT1A1*6 突变纯合子质粒和所述UGT1A1*6野生纯合子质粒的数量比为1:1；所述UGT1A1*28质粒混合物中UGT1A1*28突变纯合子质粒和所述UGT1A1*28野生纯合子质粒的数量比为1:1。

所述的PCR反应液1和PCR反应液2中其他组分为常规的10x PCR Buffer、dNTP和H₂O，各组分按常规体积比配置（10x PCR Buffer、dNTP、H₂O和反应液中引物的体积比为5:3:37.5:1）。

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明提供的定量检测UGT1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观。

2）本发明提供的定量检测UGT1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性高；

3）本发明提供的定量检测UGT1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；

4）本发明提供的定量检测UGT1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；

5）本发明提供的定量检测UGT1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。

6）本发明的试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，能更好的确保检测结果的准确性。

由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对UGT1A1基因分型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。

附图说明

图1为临床样本UGT1A1*6野生型的焦磷酸测序图；

图2为临床样本UGT1A1*6突变杂合型的焦磷酸测序图；

图3为临床样本UGT1A1*6突变纯合型的焦磷酸测序图；

图4为临床样本UGT1A1*28野生型的焦磷酸测序图。

图5为临床样本UGT1A1*28突变杂合子型的焦磷酸测序图。

图6为临床样本UGT1A1*28突变纯合子型的焦磷酸测序图。

图7为临床质控品control oligo的焦磷酸测序结果图；

图8为临床空白对照的焦磷酸测序结果图；

图9为多组设计引物的凝胶电泳图；图中①、②表明非特异性条带，③表明特异性和片段大小均比较合适，④表明目的带片段大小不对。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

1.引物的设计与合成

研究表明目前针对UGT1A1基因多态性主要是UGT1A1*6和UGT1A1*28两种基因多态性，UGT1A1*6基因突变主要发生在第一号外显子第211核苷酸上G突变成A，导致其编码的甘氨酸变为精氨酸（G71R），UGT1A1*28的多态性是（TA）n重复序列启动子，使用PyroMark Assay Design2.0软件，根据这两个突变位点（表1）设计并确定了PCR扩增引物和焦磷酸测序引物（表2），试剂盒中最主要的影响试剂盒的准确性的就是引物，包括扩增引物和测序引物，在设计的初期，我们设计了多组引物进行比较（见图9）；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中UGT1A1*6正向扩增引物（SEQ ID NO.1）和UGT1A1*28（SEQ ID NO.4）正向扩增引物的5′端分别进行生物素标记。

表1.突变位点与类型

Mutation	Base change
		G71R	G>A
（TA）n	TA6/6、TA6/7和TA7/7

表2.特异性扩增引物与测序引物序列

2．对照品选择

使用人工合成的一段寡聚核苷酸链control oligo为质控品SEQ ID NO.7（TAYGGTTTGCA）；DNAase RNA-free水为空白对照；阳性对照品为本公司自制。

4．PCR反应液组成

表3.UGT1A1*6PCR反应液组成

表4.UGT1A1*28PCR反应液组成

本试剂盒提供PCR反应液，用于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)基因分型检测。

实施例2：试剂盒的使用

1．样本扩增

分别取空白对照、阳性对照和样本DNA，分别作为PCR反应模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、特异性PCR反向扩增引物、及含有PCR正向扩增引物的PCR反应液中，组成PCR反应体系，进行PCR扩增。

UGT1A1*6体系各主要成分如下：

UGT1A1*28体系各主要成分如下：

2．PCR反应程序

设置好PCR反应程序，将反应管放入荧光PCR仪（ABI7500）开始扩增，反应程序如下：

表3.PCR反应程序

检测位点一（UGT1A1*6）退火温度设置为61℃，检测位点二（UGT1A1*28）退火温度设置为59℃。

1.焦磷酸测序

①PCR扩增产物预处理

分别取PCR扩增产物20μL，加入含Binding Buffer 40μL、水18μL及2μLBeads的体系中，按照QIAGEN PyroMark Q24测序仪的标准操作规程开机，对产物进行预处理。

②产物检测

分别添加Annealing Buffer 24μL、测序引物1.2μL到PyroMark Q24板上。质控品Control Oligo为自带测序引物，加Annealing buffer 25μL到PyroMark Q24板上。

③运行程序

在QIAGEN PyroMark Q24测序仪上按下表选择对应的工作模式，输入待检序列，在USB存储器上选择运行程序运行。

表5.工作模式及待检序列

4．结果判断

仪器软件自动给出频率分析结果；

UGT1A1*6的DNA测序峰值图中，G的频率≧90%，A的频率≦10%，即认为UGT1A1*6野生型；30%≦G的频率≦70%，30%≦A的频率≦70%，即认为UGT1A1*6突变杂合型；A的频率≧90%，G的频率≦10%，即认为UGT1A1*6突变纯合型；

UGT1A1*28的DNA测序峰值图中，TA重复6/6次，即为UGT1A1*28野生型；TA重复6/7次，即为UGT1A1*28突变杂合型，TA重复7/7次，即为UGT1A1*28突变纯合型。

5．质控标准

各类对照质控品判断结果如下表：

表6.质控品标准检测结果

6.结果报告：

结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，样本结果的判断标准如下：

表6.报告样本检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙三济生物科技有限公司

<120> 定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的测序引物对

及其试剂盒

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

cagcagaggg gacatgaaat 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ctttggaatg gcacagggta c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

cttcaaggtg taaaatgc 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

tgaaagtgaa ctccctgcta cc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

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<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

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<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

tayggtttgc a 11

<210> 8

<211> 104

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

cagcagaggg gacatgaaat agttgtccta gcacctgacg cctcgttgta catcagagac 60

ggagcatttt acaccttgaa gacgtaccct gtgccattcc aaag 104

<210> 9

<211> 104

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

cagcagaggg gacatgaaat agttgtccta gcacctgacg cctcgttgta catcagagac 60

agagcatttt acaccttgaa gacgtaccct gtgccattcc aaag 104

<210> 10

<211> 257

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

tgaaagtgaa ctccctgcta cctttgtgga ctgacagctt tttatagtca cgtgacacag 60

tcaaacatta acttggtgta tcgattggtt tttgccatat atatatatat aagtaggaga 120

gggcgaacct ctggcaggag caaaggcgcc atggctgtgg agtcccaggg cggacgccca 180

cttgtcctgg gcctgctgct gtgtgtgctg ggcccagtgg tgtcccatgc tgggaagata 240

ctgttgatcc cagtgga 257

<210> 11

<211> 259

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

tgaaagtgaa ctccctgcta cctttgtgga ctgacagctt tttatagtca cgtgacacag 60

tcaaacatta acttggtgta tcgattggtt tttgccatat atatatatat ataagtagga 120

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cacttgtcct gggcctgctg ctgtgtgtgc tgggcccagt ggtgtcccat gctgggaaga 240

tactgttgat cccagtgga 259

Claims

1.一种定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示引物的5’端进行生物素标记。

2.一种定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO.2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO.5所示反向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5所示引物的5’端进行生物素标记。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEQ ID NO.7所示的质控品和空白对照品。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括UGT1A1*6阳性对照品1，UGT1A1*6阳性对照品2，UGT1A1*6阳性对照品3；UGT1A1*28阳性对照品1，UGT1A1*28阳性对照品2，UGT1A1*28阳性对照品3；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述UGT1A1*6质粒混合物中UGT1A1*6突变纯合子质粒和所述UGT1A1*6野生纯合子质粒的数量比为1:1。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述UGT1A1*28质粒混合物中UGT1A1*28突变纯合子质粒和所述UGT1A1*28野生纯合子质粒的数量比为1:1。