KR101057128B1 - 유디피-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1에이 족 유전자군의다형성 및 기능적 변이형을 결정하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A 족 유전자군의 기능적 변이형 및 약물 감수성과 관련된 다형성을 확인하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성 관련 다형성을 분석하는 경우, 지금까지 확인된 바 없는 한국인의 UGT1A 족 유전자군의 다형성을 근거로 얻어진 최적의 탐색 세트를 이용하여 시간 및 비용 효율적으로 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성 관련 다형성을 용이하게 확인할 수 있으므로, 한국인 뿐 아니라 한국인과 유전적 특성이 유사한 일본, 중국 등의 아시아권 인종의 UGT1A 족 유전형 분석에도 유용하게 활용될 수 있다.
Description
도 1 내지 4는 한국인 50명을 대상으로 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 분석한 결과로서 (이때, X축은 단일염기다형성 (SNP)의 위치, Y축은 SNP의 피크 높이를 의미하고, 빨강색: T, 검은색: C, 파랑색: G 및 초록색: A를 의미한다),
도 1은 UGT1A1 (a) 및 UGT1A3 (b) 족 유전자의 기능적 변이형을 분석한 결과이고,
도 2는 UGT1A4 (a) 및 UGT1A6 (b) 족 유전자의 기능적 변이형을 분석한 결과이고,
도 3은 UGT1A7 족 유전자의 기능적 변이형을 분석한 결과이고,
도 4는 UGT1A9 족 유전자의 기능적 변이형을 분석한 결과이며,
도 5는 한국인 50명을 대상으로 UGT1A1, UGT1A6 및 UGT1A9 족 유전자의 이리노테칸 감수성 관련 다형성을 분석한 결과로서,
(a)는 UGT1A1에서 211G>A, 233C>T 및 686C>A; UGT1A6에서 19T>G, 541A>G 및 552A>C; 및 UGT1A9에서 726T>G 및 766G>A가 모두 야생형일 경우이고,
(b)는 UGT1A1에서 211G>A 및 233C>T가 야생형, 686C>A가 이형 (hetero); UGT1A6에서 19T>G 및 552A>C가 이형, 541A>G가 야생형; 및 UGT1A9에서 726T>G 및 766G>A가 야생형일 경우이고,
(c)는 UGT1A1에서 211G>A, 233C>T 및 686C>A가 야생형; UGT1A6에서 19T>G, 541A>G 및 552A>C가 이형; 및 UGT1A9에서 726T>G가 이형, 766G>A가 야생형일 경우이며,
(d)는 UGT1A1에서 211G>A 및 233C>T가 이형, 686C>A가 야생형; UGT1A6에서 19T>G, 541A>G 및 552A>C가 이형; 및 UGT1A9에서 726T>G 및 766G>A가 야생형일 경우이다.
본 발명은 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성과 관련된 다형성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 (UDP-glucuronosyltransferase; UGT)는 생체 내에서 내인성 및 외인성 물질에 글루쿠론산이 접합하는 반응을 촉매하는 효소로서, 페놀, 알코올, 아민 및 지방산 화합물 등과 같이 생체독성을 갖는 여러 물질들의 글루쿠론산 접합체를 생성시킴으로써 수용성 물질로 전환시켜 담즙이나 소변으 로 배출되도록 한다 (Parkinson A, Toxicol Pathol., 24:48-57, 1996).
이러한 UGT는 간세포의 소포체 및 핵막에 주로 존재하는 것으로 보고되고 있으며, 신장 및 피부와 같은 다른 조직에서도 그 발현이 보고 된 바 있다. UGT 효소는 일차 아미노산 서열간의 유사성을 토대로 크게 UGT1 및 UGT2의 아족으로 구분할 수 있고, 이 중 인간 UGT1A 족의 경우에는 9종류 (UGT1A1, 및 UGT1A3 내지 UGT1A10)의 이성질체가 보고되었으며, 그 중 5종류 (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, 및 UGT1A9)가 간에서 발현되는 것으로 알려져 있다.
이러한 UGT1A 족 유전자는 사람마다 유전적 다형성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 최근까지 UGT1A 족의 유전적 다형성은 UGT1A1, 및 UGT1A3 내지 UGT1A10 각각에 따라 여러 종류가 존재하는 것으로 알려져 있다 (http://galien.pha.ulaval.ca/alleles/alleles.html). UGT1A 족 유전자군의 다형성은 특히 종족 간에 뚜렷한 차이를 보이고 있으며, 이러한 다형성에 따라 효소의 활성이 다르게 나타나는 것으로 확인되어 약물치료 등에 대한 감수성을 결정하는 요인으로 중요시되고 있다. 또한, UGT1A1*6와 UGT1A1*28은 길버트 (Gilbert) 증후군과 관련이 있으며 (Monaghan G, Lancet, 347:578-81, 1996). 이외에도 여러 질병과 관련된 다양한 기능적인 변이형이 보고되고 있다.
따라서, 이러한 UGT1A 족 유전자군의 다형성 및 기능적 변이형을 효율적으로 결정할 수 있는 방법에 대한 여러 연구가 진행되고 있으나, 한국인을 포함하여 서양인 및 동양인에서 최소한의 주요 기능적인 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP) 조차 연구가 미흡하여 UGT1A 족 유전자군의 변이 진단에 드는 분석시간 및 비용 등의 효율성을 낮은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 UGT1A 족 유전자군 변이 진단에서의 분석시간 및 비용 등의 효율성을 증대시키기 위해 예의 연구한 결과, 한국인에서 주로 발견되는 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 선별하여 구성한 최소한의 표지 세트를 통해 UGT1A 족 유전형을 결정하는 방법이 시간 및 비용 등의 효율성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 한국인에서의 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 시간 및 비용 효율적으로 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장암 치료용 항암제인 이리노테칸 (Irinotecan)에 대한 감수성을 결정하는 UGT1A 족 유전자군의 다형성을 시간 및 비용 효율적으로 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은
1) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1에서 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2에서 추출된 핵산을 이용하여 인간 UGT1A 족 개별 유전자들을 증폭하는 단계; 및
4) 상기 단계 3에서 증폭된 유전자의 염기서열을 분석하여 UGT1A1에서의 -39(TA)6>(TA)7, 211G>A, 233C>T 및 686C>A; UGT1A3에서의 31T>C, 133C>T 및 140T>C; UGT1A4에서의 31C>T, 142T>G 및 292C>T; UGT1A6에서의 19T>G, 541A>G 및 552A>C; UGT1A7에서의 387T>G, 391C>A, 392G<A, 622T>C 및 701T>C; 및 UGT1A9에서의 -118T9>T10, 726T>G 및 766G>A로 이루어진 군중에서 선택된 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형의 존재유무를 확인하는 단계를 포함하는, UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 결정하는 방법을 제공한다.
또한 상기 다른 목적에 따라, 본 발명은
1) 인간으로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
2) 상기 단계 1에서 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2에서 추출된 핵산을 이용하여 인간 UGT1A 족 유전자들을 증폭하는 단계; 및
4) 상기 단계 3에서 증폭된 유전자들의 염기서열을 분석하여 UGT1A1에서의 211G>A, 233C>T 및 686C>A; UGT1A6에서의 19T>G, 541A>G 및 552A>C; 및 UGT1A9에서의 -118T9>T10, 726T>G 및 766G>A로 이루어진 군 중에서 선택된 UGT1A 족 유전자 변이형의 존재유무를 확인하는 단계를 포함하는, 이리노테칸 (Irinotecan)에 대한 감수성과 관련된 UGT1A 족 유전자의 다형성을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "aN>M" 또는 "NaM" (이때, a는 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다)은 유전자 염기서열에서 a번째 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미하며, "aNn>Nn+1" 또는 "ainsN" (이때, a는 정수이고, n은 1 이상의 정수이며, N은 A, C, T 또는 G이다)은 유전자 염기서열에서 a번째에 N 염기가 하나 더 삽입된 것을 의미한다. 예를 들면, "-118T9>T10" 또는 "-118insT"는 유전자의 염기서열에서 -118번째 T 염기가 하나 더 삽입된 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 방법은 한국인에서 주로 발견되는 UGT1A 족 유전자군의 다형성을 근거로 하여 선별된, 최적의 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성을 결정하는 다형성 표지 세트를 이용하는 것을 특징으로 하므로, 기존 방법과 비교하여 한국인을 대상으로 시간 및 비용 효율적으로 분석할 수 있는 효과를 제공한다.
본 발명의 단계 1에서는, 인간, 바람직하게는 한국인, 중국인 및 일본인 등의 아시아인, 더 바람직하게는 한국인으로부터 생물학적 시료를 채취하는데, 상기 생물학적 시료는 혈액, 피부 세포, 점막 세포 또는 모발 등, 바람직하게는 혈액일 수 있다.
본 발명의 단계 2에서는, 상기 단계 1에서 채취된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 등일 수 있으며, 바람직하게는 DNA, 보다 바람직하게는 게놈 (genomic) DNA일 수 있다. 또한, 채취된 시료로부터 핵산을 추출하는 공정은 특별히 한정되지는 않으나, 당업계에 공지된 기술에 따라 수행하거 나, 시판되고 있는 추출용 키트, 예를 들면, 퀴아젠 (Quiagen, 미국) 사 또는 스트라타젠 (Stratagene, 미국) 사에서 시판되고 있는 DNA 또는 RNA 추출용 키트를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 단계 3에서는, 상기 단계 2에서 추출된 핵산을 주형으로 인간 UGT1A 족의 각 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 UGT1A 족 유전자들을 증폭하게 된다. 이때, 상기 단계 2에서 추출된 핵산이 RNA인 경우에는 역전사를 이용하여 cDNA로 전환시켜 이를 주형으로 사용하며, 상기 각 프라이머는 인간 UGT1A족 유전자 또는 이의 단편의 염기서열을 근거로 하여 공지의 방법으로 적절히 설계하고 제작하여 사용할 수 있다.
본 발명의 단계 3에서, UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 결정하는 방법의 경우에는, UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 및 UGT1A9 족의 각 유전자를 증폭하는 것이 바람직하며, 이리노테칸 (Irinotecan)에 대한 감수성을 결정하는 UGT1A 족 유전자군의 다형성을 결정하는 방법의 경우에는, UGT1A1, UGT1A6 및 UGT1A9 족의 각 유전자를 증폭하는 것이 바람직하다.
본 발명의 단계 4에서는, 상기 단계 3에서 증폭된 각 UGT1A 족 유전자들을 사용하여 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성과 관련된 다형성을 분석하게 된다. 이때, 상기 분석에서는 당분야에 공지된 다형성 분석 방법을 수행할 수 있으며, 예를 들면, 스냅샷 (SNaPshot) 분석, 전기영동 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing) 또는 이들의 조합을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 분석할 UGT1A 유전자의 변이형이 단일염기다형성인 경우에 는 스냅샷 분석을 수행하는 것이 바람직하며, 이때 스냅샷 분석은, 공지된 바와 같이, 단일염기다형성 (SNP) 위치의 인접부위에 어닐링 (annealing)될 수 있는 프라이머 및 ddNTP를 이용하여 PCR 반응을 수행하는 분석 방법이다. 이때, 스냅샷 분석에서 사용되는 상기 프라이머는 UGT1A 족 유전자의 단일염기다형성을 토대로 하여 공지에 방법에 따라 설계 및 제작한 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 공지에 방법에 따라, 단일염기다형성 위치의 바로 옆 염기가 3′ 말단이 되고, 인접부위에 어닐링되는 서열을 포함하며, 5′ 말단에는 T 염기가 부가되도록 설계 및 제작하여 사용할 수 있다. 이때, 어닐링되는 서열은 약 20 bp의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 한 번에 여러 개의 단일염기다형성을 구분하고자 하는 경우 각 단일염기다형성에 대한 스냅샷 프라이머들의 5′ 말단 T 염기의 길이를 각각 다르게 설계하여 PCR 산물의 길이를 각각 다르게 할 수 있으므로, 한 번에 여러 개의 SNP 식별이 가능하다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 확인하는 스냅샷 분석에서는 서열번호: 48 내지 67의 서열을 갖는 프라이머들을 사용할 수 있으며, UGT1A 족 유전자군의 이리노테칸 감수성 관련 다형성을 확인하는 스냅샷 분석에는 서열번호: 68 내지 75의 서열을 갖는 프라이머들을 사용할 수 있다.
한편, 스냅샷 분석으로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 공지된 서열분석법으로 분석할 수 있으며, 특별히 한정되지는 않으나 바람직하게는 자동염기서열분석법을 통해 분석할 수 있다.
또한, 분석할 UGT1A 유전자의 변이형이 단일염기다형성이 아닌 경우 (예를 들면, UGT1A1에서의 -39(TA)6>(TA)7 형)에는 스냅샷 분석 대신 공지의 파이로시퀀싱 (pyrosequencing) 분석을 수행할 수 있으며, 이때 파이로시퀀싱은, 공지된 바와 같이, DNA가 중합되는 동안 방출되는 PPi (무기 파이로인산염)의 발광정도를 측정하여 분석을 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, UGT1A1 족 유전자의-39(TA)6>(TA)7 형을 확인하는 파이로시퀀싱 분석에는 서열번호: 45 내지 47의 서열을 갖는 프라이머들을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 한국인 유래의 UGT1A족 유전자군의 변이 유전자 선별
단계 1) 유전체 DNA의 분리
50명의 한국인을 대상으로 혈액을 각각 채취한 후, 유전체 DNA 분리 키트 (Qiagen 사)를 이용하여 채취된 각 혈액 시료로부터 유전체 DNA를 분리하였다.
단계 2) UGT1A 족 유전자군의 증폭 및 전장 염기서열 분석
상기 단계 1에서 분리된 총 50개의 유전체 DNA 시료를 각각 주형으로 사용하고, 하기 표 1에 기재된 각 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행함으로써, 각 인간 UGT1A족 유전자들을 증폭하였다. 이때, 증폭된 UGT1A족의 유전자명, 위치, 사용된 프라이머명, 이의 서열번호, 크기, 및 PCR 반응조건은 하기 표 1에 각각 나타낸 바와 같다.
| 유전자 | 위치 | 프라이머명 | 서열번호 | 크기 (bp) | 어닐링 온도 (℃) |
| UGT1A1 | 프로모터 (promoter) | UGT1A1 P-For | 1 | 588 | 63 |
| UGT1A1 P-Rev | 2 | ||||
| 엑손 (exon) |
UGT1A1-For | 3 | 1042 | 61 | |
| UGT1A1-Rev | 4 | ||||
| UGT1A3 | 프로모터 | UGT1A3 P-For | 5 | 740 | 60 |
| UGT1A3 P-Rev | 6 | ||||
| 엑손 | UGT1A3-For | 7 | 1203 | 61 | |
| UGT1A3-Rev | 8 | ||||
| UGT1A4 | 프로모터 | UGT1A4 P-For | 9 | 789 | 60 |
| UGT1A4 P-Rev | 10 | ||||
| 엑손 | UGT1A4-For | 11 | 1183 | 61 | |
| UGT1A4-Rev | 12 | ||||
| UGT1A5 | 프로모터 | UGT1A5 P-For | 13 | 780 | 63 |
| UGT1A5 P-Rev | 14 | ||||
| 엑손 | UGT1A5-For | 15 | 1171 | 61 | |
| UGT1A5-Rev | 16 | ||||
| UGT1A6 | 프로모터 | UGT1A6 P-For | 17 | 610 | 57 |
| UGT1A6 P-Rev | 18 | ||||
| 엑손 | UGT1A6-For | 19 | 1164 | 61 | |
| UGT1A6-Rev | 20 | ||||
| UGT1A7 | 프로모터 | UGT1A7 P-For | 21 | 590 | 67 |
| UGT1A7 P-Rev | 22 | ||||
| 엑손 | UGT1A7-For | 23 | 1278 | 61 | |
| UGT1A7-Rev | 24 | ||||
| UGT1A8 | 프로모터 | UGT1A8 P-For | 25 | 616 | 63 |
| UGT1A8 P-Rev | 26 | ||||
| 엑손 | UGT1A8-For | 27 | 1330 | 61 | |
| UGT1A8-Rev | 28 | ||||
| UGT1A9 | 프로모터 | UGT1A9 P-For | 29 | 1249 | 58 |
| UGT1A9 P-Rev | 30 | ||||
| 엑손 | UGT1A9-For | 31 | 1082 | 59 | |
| UGT1A9-Rev | 32 | ||||
| UGT1A10 | 프로모터 | UGT1A10 P-For | 33 | 620 | 65.2 |
| UGT1A10 P-Rev | 34 | ||||
| 엑손 | UGT1A10-For | 35 | 1254 | 61 | |
| UGT1A10-Rev | 36 | ||||
| UGT1A | 엑손 | Exon2-For | 37 | 329 | 58 |
| Exon2-Rev | 38 | ||||
| UGT1A | 엑손 | Exon3-For | 39 | 366 | 57 |
| Exon3-Rev | 40 | ||||
| UGT1A | 엑손 | Exon4-For | 41 | 479 | 61 |
| Exon4-Rev | 42 | ||||
| UGT1A | 엑손 | Exon5-For | 43 | 424 | 58 |
| Exon5-Rev | 44 |
단계 3) 각 UGT1A 족 유전자의 변이형 분석
상기 단계 2에서 증폭시킨 각 UGT1A 족 유전자의 전장 서열을 대상으로 공지된 3100 유전자 분석기 (3130x Genetic Analyzer, Applied Biosystems)를 이용하여 서열을 분석하였으며, 그 결과를 각각 야생형 UGT1A 족 유전자의 염기서열 (GenBank accession No.: NT_005120)과 비교였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 유전자 | 위치 | 핵산 변이 | 아미노산 변이 | 개체수 | 빈도수 | ||
| 야생형 | 이형 | 동형 | |||||
| UGT1A8 | 엑손 1 | A711C | T237T | 47 | 1 | 2 | 0.05 |
| A765G | T255T | 46 | 2 | 2 | 0.06 | ||
| UGT1A10 | 엑손 1 | C605T | T202I | 49 | 1 | 0 | 0.01 |
| C693T | A231A | 45 | 4 | 1 | 0.06 | ||
| UGT1A9 | 프로모터 | T-440C | 1 | 1 | 48 | 0.97 | |
| C-331T | 1 | 1 | 48 | 0.97 | |||
| -118insT | 6 | 27 | 17 | 0.61 | |||
| 엑손 1 | G588T | G196G | 97 | 3 | 0 | 0.015 | |
| T726G | Y242X | 99 | 1 | 0 | 0.005 | ||
| UGT1A7 | 프로모터 | T-382C | 44 | 6 | 0 | 0.06 | |
| C-341T | 45 | 5 | 0 | 0.05 | |||
| T-57G | 36 | 13 | 1 | 0.15 | |||
| 엑손 1 | C33A | P11P | 33 | 14 | 3 | 0.2 | |
| T387G | N129K | 18 | 25 | 7 | 0.39 | ||
| C391A | R131K | 18 | 25 | 7 | 0.39 | ||
| G392A | 18 | 25 | 7 | 0.39 | |||
| T622C | W208R | 32 | 15 | 3 | 0.21 | ||
| T701C | I234T | 49 | 1 | 0 | 0.01 | ||
| G756A | L252L | 37 | 12 | 1 | 0.14 | ||
| 유전자 | 위치 | 핵산변이 | 아미노산 변이 | 개체수 | 빈도수 | ||
| 야생형 | 이형 | 동형 | |||||
| UGT1A6 | 프로모터 | G-427C | 39 | 10 | 1 | 0.12 | |
| 엑손 1 | T19G | S7A | 34 | 15 | 1 | 0.17 | |
| C105T | D35D | 46 | 4 | 0 | 0.04 | ||
| A315G | L105L | 43 | 7 | 0 | 0.07 | ||
| T480C | A160A | 49 | 1 | 0 | 0.01 | ||
| A541G | T181A | 36 | 14 | 0 | 0.14 | ||
| A552C | R184S | 33 | 16 | 1 | 0.18 | ||
| G627T | V209V | 46 | 4 | 0 | 0.04 | ||
| UGT1A5 | 프로모터 | C-369T | 42 | 8 | 0 | 0.08 | |
| -246insC | 42 | 8 | 0 | 0.08 | |||
| 엑손 1 | T143C | L48S | 35 | 14 | 1 | 0.16 | |
| C150G | D50E | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| T188C | L62P | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C424A | H142N | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C473G | A158G | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C645T | L215L | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C657T | A219A | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C673T | H225Y | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| C742A | L248I | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| G745C | V249L | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| G775C | G259R | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| T783C | F261F | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| T792C | D264D | 25 | 19 | 6 | 0.31 | ||
| UGT1A4 | 프로모터 | C-457T | 37 | 12 | 1 | 0.14 | |
| G-419A | 37 | 12 | 1 | 0.14 | |||
| C-219T | 37 | 12 | 1 | 0.14 | |||
| G-163A | 37 | 12 | 1 | 0.14 | |||
| 엑손 1 | C31T | R11W | 49 | 1 | 0 | 0.01 | |
| T142G | L48V | 39 | 10 | 1 | 0.12 | ||
| C292T | Q98X | 49 | 1 | 0 | 0.01 | ||
| G804A | P268P | 35 | 14 | 1 | 0.16 | ||
| 인트론 1 | C910T | 38 | 11 | 1 | 0.13 | ||
| UGT1A3 | 프로모터 | A-486G | 48 | 2 | 0 | 0.02 | |
| A-204G | 25 | 19 | 6 | 0.31 | |||
| T-66C | 25 | 19 | 6 | 0.31 | |||
| 엑손 1 | T31C | W11R | 36 | 13 | 1 | 0.15 | |
| G81A | E27E | 36 | 13 | 1 | 0.15 | ||
| C133T | R45W | 46 | 4 | 0 | 0.04 | ||
| T140C | V47A | 46 | 3 | 1 | 0.05 | ||
| A477G | A159A | 46 | 4 | 0 | 0.04 | ||
| 인트론 1 | A918T | 32 | 18 | 0 | 0.18 | ||
| UGT1A1 | 프로모터 | C-364T | 39 | 7 | 4 | 0.15 | |
| G-64C | 48 | 2 | 0 | 0.02 | |||
| -39insTA | 39 | 8 | 3 | 0.14 | |||
| 엑손 1 | G211A | G71R | 43 | 7 | 0 | 0.07 | |
| C233T | T78M | 49 | 1 | 0 | 0.01 | ||
| C686A | P229Q | 48 | 2 | 0 | 0.02 | ||
| 인트론 2 | T6893C | 48 | 2 | 0 | 0.02 | ||
| 엑손 5 | T1456G | Y486D | 49 | 1 | 0 | 0.01 | |
단계 4-1) UGT1A 족 유전자의 기능적 변이형 선별
상기 단계 3에서 얻어진 한국인 50 인에서 발견된 UGT1A 족 유전자의 다형성을 근거로 하여, 효소 활성의 증가 또는 감소와 같이 기능적으로 관련된 것으로 보고된 변이형들을 선별하여 하기 표 3에 나타내었다. 이때, UGT1A9에서의 G766A 변이형은 단계 3에서는 확인되지 않았으나, 일본인에서 보고된 기능적 변이형이므로 하기 표 3에 추가하였으며, 'truncated protein'은 단백질이 번역과정 중간에 돌연변이에 의해 비정상적으로 번역 종결되는 것을 의미한다.
| 유전자 | 대립 형질명 |
핵산 변이형 |
보고된 관련 효소 활성 | 빈도 | |
| 생체내 | 시험관내 | ||||
| UGT1A1 | 1A1*28 | -39insTA | 감소 | 감소 | 0.13 |
| 1A1*6 | G211A | 감소 | 감소 | 0.06 | |
| C233T | 감소 | 0.01 | |||
| 1A1*27 | C686A | 감소 | 감소 | 0.02 | |
| UGT1A6 | 1A6*3a | T19G | 0.18 | ||
| 1A6*5 | A541G | 0.14 | |||
| 1A6*9 | A552C | 0.18 | |||
| UGT1A9 | 1A9*22 | -118insT | 증가 | 0.61 | |
| 1A9*4 | T726G | truncated protein | 0.003 (n=150) |
||
| 1A9*5 | G766A | 감소 | N.D | ||
| UGT1A7 | T387G | 0.39 | |||
| C391A | 0.39 | ||||
| G392A | 0.39 | ||||
| 1A7*4 | T622C | 감소 | 0.21 | ||
| T701C | 감소 | 0.01 | |||
| UGT1A4 | 1A4*4 | C31T | 0.01 | ||
| 1A4*3b | T142G | 감소 | 0.12 | ||
| C292T | 소실 | 0.01 | |||
| UGT1A3 | A17G | ||||
| T31C | 0.15 | ||||
| 1A3*4 | C133T | 감소 | 0.04 | ||
| T140C | 0.05 | ||||
단계 4-2) UGT1A 족 유전자의 약물 감수성 관련 다형성 선별
상기 단계 3에서 얻어진 한국인 50 인에서 발견된 UGT1A 족 유전자의 다형성을 근거로 하여, 대장암 치료용 항암제인 이리노테칸 (Irinotecan)의 대사에 관여한다고 알려진 UGT1A1, UGT1A6 및 UGT1A9의 다형성을 선별하여 하기 표 4에 나타내었다. 이때, UGT1A9에서의 G766A 변이형은 단계 3에서는 확인되지 않았으나, 일본인에서 보고된 기능적 변이형이므로 하기 표 4에 추가하였다.
| 유전자 | 대립형질명 | 핵산 변이 | 아미노산 변이 |
| UGT1A1 | 1A1*6 | G211A | G71R |
| C233T | T78M | ||
| 1A1*27 | C686A | P229Q | |
| UGT1A6 | 1A6*3a | T19G | S7A |
| 1A6*5 | A541G | T181A | |
| 1A6*9 | A552C | R184S | |
| UGT1A9 | 1A9*4 | T726G | Y242X |
| 1A9*5 | G766A | D256N |
실시예 2: UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 및 약물 감수성 관련 다형성 분석
2-1) UGT1A 족 유전자의 기능적 변이형 분석
상기 실시예 1의 피험자 중 각 UGT1A 족 유전자의 야생형, 이형의 대립형질을 갖는 변이형, 동형의 대립형질을 갖는 변이형을 갖는 사람들로부터의 혈액을 대상으로, 다음과 같이 본 발명에 따른 인간 UGT1A 족 유전자의 기능적 변이형을 확인하였다.
상기 실시예 1의 단계 1 및 2와 동일한 방법으로 UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 및 UGT1A9 족 유전자들의 서열을 각각 증폭하였다. 그 후, 얻어진 각 UGT1A 족 유전자들의 PCR 산물 5 ㎕ 당 엑소SAP-IT (ExoSAP-ITTM, USB Corporation) 2 ㎕ 씩을 가한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 잔여 프라이머 등을 제거하였다. 얻어진 반응물을 80℃에서 15분간 반응시켜 남아있는 엑소SAP-IT를 비활성화시킨 후, 이를 2 ㎕씩 취하여 스냅샷 멀티플렉스 레디 리액션 믹스 (SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix, ABI) 1㎕, 할프 텀 용액 (Half term buffer, 조성: 200 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH 9) 4㎕ 및 하기 표 5에 제시된 각 스냅샷 프라이머와 혼합하여 스냅샷 반응 용액을 얻었으며, 이때 전체 반응 용액의 양은 10 ㎕이 되도록 하였다.
| 유전자 | 핵산변이형 | 프라이머명 | 서열번호 | 농도 (pmol) |
| UGT1A1 | G211A | 1A1_G211A_F | 48 | 2 |
| C233T | 1A1_C233T_R | 49 | 2 | |
| C686A | 1A1_C686A_R | 50 | 2 | |
| UGT1A6 | T19G | 1A6_T19G_F | 51 | 2 |
| A541G | 1A6_A541G_R | 52 | 2 | |
| A552C | 1A6_A552C_R | 53 | 2 | |
| UGT1A9 | -118insT | 1A9_-118insT_R | 54 | 2 |
| T726G | 1A9_T726G_R | 55 | 2 | |
| G766A | 1A9_G766A_F | 56 | 2 | |
| UGT1A7 | T387G | 1A7_T387G_F | 57 | 2 |
| C391A | 1A7_C391A_F | 58 | 2 | |
| G392A | 1A7_G392A_R | 59 | 2 | |
| T622C | 1A7_T622C_R | 60 | 2 | |
| T701C | 1A7_T701C_F | 61 | 2 | |
| UGT1A4 | C31T | 1A4_C31T_R | 62 | 2 |
| T142G | 1A4_T142G_R | 63 | 2 | |
| C292T | 1A4_C292T_F | 64 | 2 | |
| UGT1A3 | T31C | 1A3_T31C_R | 65 | 2 |
| C133T | 1A3_C133T_R | 66 | 2 | |
| T140C | 1A3_T140C_F | 67 | 2 |
상기 각 반응용액을 [96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초]의 40 사이클 반복 조건하에 PCR 반응시켰으며, 반응이 끝난 반응용액 10 ㎕ 에 SAP (shrimp alkaline phosphatase) (USB 사) 1 ㎕씩을 가하여 37℃에서 1시간, 65℃에서 15분간 반응시켰다. 이를 각각 0.5 ㎕씩 취한 후, LIZ120 (ABI) 0.2 ㎕ 와 Hi-Di 폼아마이드 (ABI) 9.3 ㎕와 혼합하여 96 웰 플레이트에 분주하였다. 분주된 반응 시료들을 95℃에서 2분간 반응시킨 후, 3130x 유전자 분석기 (3130x Genetic Analyzer, Applied Biosystems)로 분석하여 그 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다.
그 결과, 도 1 내지 4에 나타낸 바와 같이, 각 UGT1A 족 유전자들의 기능적 변이형에 따라 피크 색과 위치가 다르게 표시되어 야생형, 이형의 대립형질을 갖는 변이형 (이형), 동형의 대립형질을 갖는 변이형 (동형)을 용이하게 식별할 수 있음을 확인하였으며, 얻어진 피크의 크기와 종류가 상기 실시예 1에서 서열분석으로 얻어진 표 1의 결과와 100% 일치하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 분석 방법을 통해 시간 및 비용 효율적이면서 용이하게 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 분석할 수 있음을 알 수 있다.
또한, UGT1A1 족 유전자의 -39insTA 유전형은 단일염기 변이에 해당하지 않아 상기 같은 스냅샷 분석이 불가능하므로, 다음과 같은 PCR-파이로시퀀싱법을 수행하여 변이형을 확인하였다. 이때, 분석에 사용한 프라이머의 서열을 하기 표 6에 나타내었으며, 이때 프라이머 UGT1A1*28 F의 경우 5' 말단에 바이오틴이 부착되어 있고 (서열번호: 45 참조), 파이로시퀀싱에 사용된 프라이머는 문헌 [Clin Chem., Jul;49(7):1182-5, 2003]을 참고하였다.
구체적으로, 서열번호 45와 46을 이용하여 수득한 PCR 산물을 주형으로 하여 서열번호 47의 염기서열 분석용 프라이머를 반응시킨 후 파이로시퀀서 (Pyrosequencing사)를 이용하여 변이유무 여부를 확인하였다.
수득한 PCR산물에 바인딩 버퍼 37 ㎕ (Binding buffer pH 7.6, 조성: 10 mM Tris-HCI, 2 M NaCI, 1 mM EDTA, 0.1% Tween20)에 세파로스 비드 (Streptavidin SepharoseTM High performance : Amersham Bioscience) 3 ㎕ 넣어 섞은 후, 96 웰 플레이트에 분주하여 상온에서 1,4000 rpm으로 5분간 반응시켰다. 그리고, 하기의 서열번호 47의 프라이머 (100 pmol) 0.3 ㎕당 100 ㎕ 어닐링 버퍼 (1X annealing buffer pH 7.6, 조성: 20 mM Tris acetate, 2 mM MgAc2)를 96 웰 플레이트에 분주하였다. 반응시킨 샘플을 진공 프랩 툴 (vacuum Prep Tool)을 이용하여 시료를 준비한 후, 90℃에서 3분간 가열한 다음 상온에서 냉각하였다. 냉각 플레이트에 Pyro Gold Reagent kit (Biotage)에서 제공하는 효소 혼합물 (enzyme mixture), 기질 혼합물 (substrate mixture), dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 넣은 다음 파이로시퀀서를 이용하여 변이 유무를 확인하였다.
| 유전형 | 프라이머명 | 서열번호 |
| UGT1A1의 -39insTA | UGT1A1*28 F | 45 |
| UGT1A1*28 R | 46 | |
| UGT1A1*28 pyrosequencing primer | 47 |
2-2) UGT1A 족 유전자의 기능적 변이형 분석
상기 표 5에 제시된 프라이머 대신, 하기 표 7에 제시된 프라이머를 동시에 사용한 것을 제외하고, 상기 2-1)에서의 스냅샷 분석과 동일한 공정을 수행하여 이리노테칸 감수성과 관련된 UGT1A 족 다형성을 분석하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 표 7에 제시된 프라이머들을 5′ 말단에 서로 다른 길이의 T 반복 서열을 부착하여 각각의 길이를 다르게 하였다.
| 유전자 | 핵산변이형 | 프라이머명 | 서열번호 | 농도 (M) |
| UGT1A1 | G211A | 1A1_G211A_F | 68 | 0.1 |
| C233T | 1A1_C233T_R(T8) | 69 | 0.1 | |
| C686A | 1A1_C686A_R(T40) | 70 | 0.1 | |
| UGT1A6 | T19G | 1A6_T19G_F(T12) | 71 | 0.1 |
| A541G | 1A6_A541G_R(T16) | 72 | 0.5 | |
| A552C | 1A6_A552C_R(T24) | 73 | 0.1 | |
| UGT1A9 | T726G | 1A9_T726G_R(T28) | 74 | 0.1 |
| G766A | 1A9_G766A_F(T32) | 75 | 0.1 |
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, UGT1A 족의 이리노테칸 감수성 관련 여러 다형성을 한 번에 용이하게 식별할 수 있음을 확인하였으며, 얻어진 피크의 크기와 종류가 상기 실시예 1에서 서열분석으로 얻어진 표 1의 결과와 100% 일치하는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성 관련 다형성을 분석하는 방법은 지금까지 확인된 바 없는 한국인의 UGT1A 족 유전자들의 다형성을 근거로 얻어진 최적의 탐색 세트를 이용하여 시간 및 비용 효율적으로 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형 또는 약물 감수성 관련 다형성을 용이하게 확인할 수 있는 방법이므로, 한국인 뿐 아니라 한국인과 유전적 특성이 유사한 일본, 중국 등의 아시아권 인종의 UGT1A 족 유전자들의 유전형 분석에도 유용하게 활용될 수 있다.
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gcaggcaagt agaccacttt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A9 P-Rev
<400> 30
gacacacaca tagaggaagg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A9-For
<400> 31
gctggtattt ctcccaccta 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A9-Rev
<400> 32
acgagtacac gcattggcac 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A10 P-For
<400> 33
gcctctcagg gtttggatat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A10 P-Rev
<400> 34
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A10-For
<400> 35
ctccaaggcg aagaccataa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGT1A10-Rev
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exon2-For
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Exon2-Rev
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<213> Artificial Sequence
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<223> Exon3-For
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<220>
<223> Exon3-Rev
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<213> Artificial Sequence
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<223> Exon4-For
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<223> Exon5-Rev
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<222> (1)
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<220>
<223> UGT1A1*28 R
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<220>
<223> UGT1A1*28 pyrosequencing primer
<400> 47
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A6_A552C_R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A9_-118insT_R
<400> 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> 1A7_T387G_F
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A7_G392A_R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A7_T622C_R
<400> 60
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A7_T701C_F
<400> 61
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A4_C31T_R
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<220>
<223> 1A4_T142G_R
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tctggcatgg agctcccgca 20
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<220>
<223> 1A4_C292T_F
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A3_T31C_R
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<220>
<223> 1A3_C133T_R
<400> 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A3_T140C_F
<400> 67
ctggctcagc atgcgggagg 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A1_G211A_F
<400> 68
cctcgttgta catcagagac 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 1A1_C233T_R(T8)
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A1_C686A_R(T40)
<400> 70
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttc tgaggcaagg gttgcatac 59
<210> 71
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A6_T19G_F(T12)
<400> 71
tttttttttt ttggatggcc tgcctccttc gc 32
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A6_A541G_R(T16)
<400> 72
tttttttttt ttttttgtct gggcttctgc tgaatg 36
<210> 73
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A6_A552C_R(T24)
<400> 73
tttttttttt tttttttttt tttttaggac acagggtctg ggct 44
<210> 74
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A9_T726G_R(T28)
<400> 74
tttttttttt tttttttttt ttttttttga tgtgtggctg tagagatc 48
<210> 75
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1A9_G766A_F(T32)
<400> 75
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttcaatttgg ttgttgcgaa cg 52
Claims (11)
1) 한국인 또는 이와 유사한 유전학적 특성을 갖는 아시아인으로부터 채취된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1에서 추출된 핵산을 이용하여 한국인 또는 이와 유사한 유전학적 특성을 갖는 아시아인 UGT1A(UDP-glucuronosyl1-transferase 1A) 족 유전자들을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2에서 증폭된 유전자의 염기서열을 분석하여 UGT1A1에서의 -39(TA)6>(TA)7, 211G>A, 233C>T 및 686C>A; UGT1A3에서의 31T>C, 133C>T 및 140T>C; UGT1A4에서의 31C>T, 142T>G 및 292C>T; UGT1A6에서의 19T>G, 541A>G 및 552A>C; UGT1A7에서의 387T>G, 391C>A, 392G<A, 622T>C 및 701T>C; 및 UGT1A9에서의 -118T9>T10, 726T>G 및 766G>A로 이루어진 군에서 선택된 UGT1A 족 유전자의 기능적 변이형의 존재유무를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 UGT1A 족 유전자군의 기능적 변이형을 결정하는 방법.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 생물학적 시료가 혈액, 피부 세포, 점막 세포 또는 모발인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 1에서 상기 핵산이 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 핵산이 유전체 (genomic) DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 2에서 UGT1A 족 유전자가 UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 및 UGT1A9 족으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
단계 3에서 상기 분석이 스냅샷 (SNaPshot) 분석, 전기영동 분석, 파이로시퀀싱 (pyrosequencing) 분석 또는 이들의 조합을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 3에서 상기 분석이 서열번호: 48 내지 67의 서열을 갖는 프라이머들을 사용하는 스냅샷 분석 또는 서열번호: 45 내지 47의 서열을 갖는 프라이머들을 사용하는 파이로시퀀싱 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
단계 3에서 상기 분석이 서열번호: 68 내지 75의 서열을 갖는 프라이머들을 사용하는 스냅샷 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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