KR101277793B1

KR101277793B1 - 한국인의 ｕｇｔ1ａ1 유전자의 일배체형을 이용한 ｕｇｔ1ａ1 유전자의 발현 예측 방법

Info

Publication number: KR101277793B1
Application number: KR1020100092900A
Authority: KR
Inventors: 김승희; 한순영; 정면우; 나한성; 신희정; 박현주; 강태선
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-09-24
Filing date: 2010-09-24
Publication date: 2013-06-25
Also published as: KR20120031387A

Abstract

본 발명은 한국인을 대상으로 UGT1A1를 암호화하는 유전자의 프로모터 부위내에 위치한 단일염기다형성(SNP)로부터 특정 일배체형(Haplotype)을 결정하였으며, 이 특정 일배체형(Haplotype)을 분석할 수 있는 상기 유전자 프로모터의 증폭용 프라이머를 포함하는 UGT1A1 유전자 프로모터의 일배체형의 분석키트 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 분석키트 및 분석 방법을 이용하면, UGT1A1 유전자의 발현 정도를 예측할 수 있으며, 또한, 이에 따라 개인간 유전형의 차이에 따른 맞춤의약을 포함하여 UGT1A1에 의하여 대사되는 약물의 개발에 널리 활용할 수 있다.

Description

한국인의 ＵＧＴ1Ａ1 유전자의 일배체형을 이용한 ＵＧＴ1Ａ1 유전자의 발현 예측 방법 {METHODS OF ESTIMATING UGT1A1 GENE EXPERSSION USING UGT1A1 GENE HAPLOTYPE IN KOREAN}

본 발명은 UGT1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1)을 암호화하는 유전자의 일배체형의 분석키트 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 UGT1A1을 암호화하는 유전자의 프로모터 부위 내에 위치한 단일염기다형성(SNP)으로부터 한국인에게 많이 발생하는 일배체형(haplotype)을 결정하였으며, 이러한 일배체형을 분석할 수 있는 상기 유전자 프로모터의 증폭용 프라이머를 포함하는 UGT1A1 유전자 프로모터의 일배체형 분석키트 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것이다.

인간의 유전자는 전체 유전자 중 오직 0.1%만 개체 간에 차이가 있으며, 이러한 유전적 차이는 사람의 특성이나 외모(피부색, 키) 등의 상당부분을 결정하는 것으로 알려져 있다(Werner Kalow, Pharmacogenomics Second Edition. Taylor & Francis. 493-514, 2002). 또한 이러한 유전자의 개체 차이가 의약품 복용시 약물반응(약물이상반응 및 효능 등)의 개인간 민족간의 차이를 유발하는 것으로 알려지면서 이에 대한 관심이 크게 증가하고 있다(Jun JB, Cho DY, Kang C, Bae SC., Thiopurine S-methyltransferase polymorphisms and the relationship between the mutant alleles and the adverse effects in systemic lupus erythematosus patients taking azathioprine, Clinical and experimental rheumatology, 2005, 23(6), 873-6). 인종과 민족간에 약물반응과 관련한 유전자의 변이 및 그 빈도가 다르게 나타나며, 이에 따라 인종과 민족 간의 약물반응이 다르다는 것을 규명한 외국 연구 자료는 상당수에 이른다. 이러한 외국의 자료와는 별도로 한국인의 약물유전정보를 확보하고 이 유전자 타입에 따른 약물반응의 차이를 규명하는 것은 한국인의 경우에 대한 약물복용의 안전성과 유효성을 재고하기 위하여 매우 중요한 일이다.

약물의 반응은 유전적 요인뿐 아니라 환경적 요인, 임상적인 소인이 복합적으로 결합되어 나타나는 현상으로, 개인 간, 인종 간에서 발생하는 약물반응의 차이를 규명하기 위해서는 유전적 요소 외에도 다양한 변수들을 고려해야 한다. 개인의 유전형 정보를 이용해 보다 예측력이 높은 결과를 얻기 위해서는 환자 개인의 유전정보와 임상 정보가 결합된 알고리즘을 개발해야 하며 이러한 예는 와파린 연구에서 잘 규명되었다. 이처럼 보다 복잡한 알고리즘을 개발하기 위해서는 개인별 유전정보를 확보하는 것이 필수적인 조건이다. 한국인에서 주요 유전형의 분포도를 확보하고, 이를 바탕으로 약물반응과 관련이 있는 유전형(SNP 및 haplotype)의 기능을 규명해 마커를 선별하여 임상정보와 결합 시키는 과정이 매우 중요한 단계라 할 수 있다. 이와 같이, 약물유전정보는 약물 개발을 위한 독창적 접근법으로서 FDA의 주요방침 운용계획(Critical Path Initiative)나 EMEA의 로드맵에서 약물 개발, 진단 및 선별에서 독창적인 생체지표의 사용을 확대하고 기존의 임상시험 디자인 및 약물 평가를 위한 통계적 도구를 검토하기 위한 중요한 위치를 차지하고 있다.

약물반응의 차이를 유발하는 유전적 다형성을 지닌 유전자로는, 예를 들면 약물대사효소 유전자로는 CYP2C9, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP2E1, dihydropyrimidine dehydrogenase(DPD), plasma pseudocholinesterase, N-acetyltransferase(NAT2), thiopurine methyltransferase(TPMT), UDP-glucuronosyltransferase(UGT1A1) 등이 있으며, 수송체 및 수용체로는 multidrug-resistance gene(MDR1), β2-adrenergic receptor(β2AR), sulfonylurea receptor (SUR1) 등이 있다(Lee SY, Nam MH, Kim JS, Kim JW, A case report of a patient carrying CYP2C9*3/4 genotype with extremely low warfarin dose requirement, Journal of Korean medical science, 2007, 22(3), 557-9; Cho HJ, Koh WJ, Ryu YJ, Ki CS, Nam MH, Kim JW, et al., Genetic polymorphisms of NAT2 and CYP2E1 associated with antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in Korean patients with pulmonary tuberculosis, Tuberculosis, 2007, 87(6), 551-6; Lee SY, Kim JS, Kim JW, A case of intolerance to warfarin dosing in an intermediate metabolizer of CYP2C9, Yonsei medical journal, 2005, 46(6), 843-6).

한국인을 대상으로 질병 관련 유전자 등에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나, 약물반응과 관련된 주요 유전자에 대한 한국인 약물유전정보는 아직까지 실험적 연구에 그치고 있어, 신약 허가 심사 및 시판 의약품의 안전성, 유효성에 적용하기 위한 실용화 연구는 전무하며 관련 지침 마련도 시급한 실정이다. 미국 FDA의 “Table of Valid Genomic Biomarkers in the Context of Approved Drug Labels” (http://www.fda.gov/cder/genomics/genomic_biomarkers_table.htm)에서 제시하는 주요 약물유전정보의 내용을 국내 의약품 허가사항에 반영된 약물유전정보과 비교하였을 때, 50% 정도의 약물 유전정보만이 국내 의약품 허가사항에 반영되어있었으며, 한국인을 대상으로 한 관련 실험 역시 33% 정도에 지나지 않았다 (정면우, 의약품평가자를 위한 약물유전체학, 2009, 131-163).

FDA와 EMEA 두 기관 모두 의약품 표기에 약물유전정보를 포함하는 신규 승인의 수가 증가하는 추세이다. 예를 들면, EMEA는 신의약품의 20%가 그 의약품표기에 유전자 자료를 포함하고 있으며, 미국에는 이미 약 60개의 상이한 의약품 표기에 대한 유전자 가이드라인(CYP450 유전자 관련)이 있다. 또한 승인된 의약품의 재 표기에 약물유전정보 자료의 사용을 강화하는 것은 FDA의 전략적 계획의 중추적 부분으로 최근의 아래와 같은 의약품 재 표기 결정 및 권고사항이 진행되었다. 외국 규제기관들의 의약품 표기, 승인된 의약품의 재표기에 있어서 약물유전정보 사용의 증가와 국내의약품에 반영된 약물유전정보의 질적 수준 및 양을 고려하였을 때 허가사항 반영을 위한 한국인의 유전형을 고려한 약물유전체 실험 및 기초 자료들이 필요한 실정이다.

한편, 같은 염색체상의 인접한 단일염기다형성(SNP) 세트는 블록 단위로 유전되는 경향이 있으며, 한 블록 내의 단일염기다형성(SNP)들의 패턴을 일배체형(haplotype)이라 한다. 일배체형은 하나의 집단 내에서 발견된 여러 부위의 단일염기다형성을 통계학적인 개연성에 근거하여 조합한 유전형으로, 개개의 단일염기다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전정보를 제공한다.

본 발명자들은 개별 단일염기다형성과 유전자의 발현 및 효소의 활성을 조사하였던 기존의 연구들의 한계를 벗어나고자 UGT1A1 유전자에서 한국인에게 높은 빈도로 존재하는 일배체형을 분석한 후, 일배체형에 따른 효소의 활성 및 발현량과의 상관성을 분석하였다. 유전자의 발현 및 효소의 활성에 영향을 미친다고 보고된 기존의 단일염기다형성 및 유전형들은 그 빈도가 매우 낮고, 특히 정상인에서는 발견하기 어려운 유전형들이 대부분이다. 이러한 한계를 극복하고 한국인을 대표할 수 있는 유전형을 구하기 위해 UGT1A1 유전자에 존재하는 단일염기다형성을 분석하였으며, 5% 이상의 빈도를 보이는 단일염기다형성 중 강한 연관관계를 보이는 단일염기다형성을 선별하여 일배체형을 구성하고, 한국인에서 발생하는 주요 일배체형(10% 빈도 이상)의 기능을 기능 유전체 연구를 통하여 분석하여 UGT1A1 유전자의 프로모터에 존재하는 유전형이 발현에 미치는 영향을 규명하였다(도 1 참고).

이러한 일배체형의 정보는 한국인에서 높은 빈도로 존재하는 유전형을 대표할 수 있으며, 일배체형을 구성하는 단일염기다형성간에 강한 연관관계가 존재하기 때문에 세대를 거듭해도 유전형의 변화 없이 일정하게 유지되는 장점을 지니고 있다. 일배체형을 이용한 상관성 연구는 개별 단일염기다형성 정보만으로는 확인하기 어려운 결과를 단일염기다형성의 조합을 통해 분석할 수 있다. 이상반응 또는 효소의 활성과 상관성이 존재하는 일배체형이 규명되면 일배체형 내의 단일염기다형성 중 어떤 단일염기다형성이 질병 또는 효소 활성 변화의 원인이 되는 단일염기다형성(causative SNP)인지 선별할 수 있는 가능성을 제공할 수 있다. 이러한 연구는 향후 약물반응을 예측하기 위한 알고리즘 개발 및 개인별 맞춤약물요법을 수행하는데 있어 매우 중요한 자료로서 활용될 것이다.

GT1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1)는 UGT1A 유전좌위에 존재하는 9개의 동위효소 중 한 종류로, Phase Ⅱ 간대사효소의 superfamily에 속한다. UGT1A1은 글루쿠로닌결합반응 (glucuronidation reaction)의 촉매로 작용하여 생체이물질(xenobiotics)이나 내인성 화합물(endogenous compounds)을 배설이 가능한 수용성 분자로 만드는 역할을 한다.

UGT1A1은 결장, 창자 위 등의 부위에서도 발현되지만, 주로 간에서 발현되어 빌리루빈 대사에 관여한다. 또한, 에스트로겐이나 갑상선 호르몬 같은 내인성 화합물의 대사, 그리고 의약품 등의 생체 이물질 화합물의 대사에도 관여한다(DeCrosse, 1977). UGT1A1의 주된 기질 의약품은 항암제 이리노테칸(Irinotecan), 백혈병 치료제 에토포사이드(Etoposide), 알러지 치료제 트라닐라스트(Tranilast), 에이즈 치료제 아타자나비어(Atazanavir) 등이 있다.

UGT1A계 효소는 선택적 스플라이싱을 통해 엑손 2-5를 공통적으로 가지고 있으며, 독특한 프로모터와 엑손 1을 포함하고 있다 (2342bp, 533 Amino acid; van Es et al., 1993). UGT1A1의 프로모터와 엑손 1 부위는 가장 일반적으로 존재하는 다형성을 포함하고 있으며, 문헌(Metz, 1972)에 따르면, UGT1A1*28 대립유전자에서의 (TA)₆/(TA)₇의 삽입/결실, 또는 UGT1A1*6 대립유전자에서의 non-synonymous coding variant G71R 등이 있다. UGT1A1 유전자에 존재하는 주요 SNP 및 인종별 MAF는 하기 표 1에 요약되어 있다.

UGT1A1 *28 대립유전자

UGT1A1 효소는 미국 FDA에서 제시하는 “Table of Valid Genomic Biomarkers in the Context of Approved Drug Labels"에 등록된 바이오마커로서, “UGT1A *28 동형접합체인 사람들은 캄프토사(camptosar, 대장암 치료제) 치료 시작 후 호중구감소증(neutropenia)의 위험이 증가하므로, 용량조절이 반드시 필요하다. 특히, UGT1A *28 동형접합체 환자들은 호중구감소증의 위험이 증가할 수 있으며, 임상결과가 다양하며, 그러한 환자들은 정상적인 초기 복용랑에 내성을 보여 왔다”라는 내용이 수록되어 있다.

UGT1A1 *28 대립유전자는 코카시아인 및 아프리카가 기원인 인종에서 빈번한 대립유전자로, 길버트 증후군(Gilbert syndrome)과 관련이 있다. UGT1A1 발현의 다양성은 SN-38G 형성에서 개인별 차이를 나타낸다. UGT1A1 프로모터 TATA 부위에는 2개 염기가 반복되어 나타난다. 즉, TA 반복 [(TA)_nTAA]에서 n=5, 6, 7, 8회 반복 중 (TA)₆TAA 대립형질이 가장 흔하고, (TA)₇TAA (UGT1A1 *28)는 가장 빈번한 변이 대립유전자이다. 반복되는 대립유전자가 길수록 UGT1A1 발현이 감소되어, (TA)₇TAA 대립유전자를 가지는 환자는 UGT1A1의 발현이 상당히 감소된다. UGT1A1 프로모터 부위에 6개 이상의 TA염기 반복은 SN-38G의 형성을 감소시켜, 세포내 SN-38농도를 상당한 수준으로 유지시켜 심각한 독성을 일으키게 된다. UGT1A1 *28 (TA)7TAA 대립유전자는 여러 인종에서 발견되는데, 아시아인 15%, 아프리카인 45%, 코카시안, 히스패닉, 아프리카-미국인 26~38%로 알려지고 있다(Mickelson et al., 1977).

UGT1A1 *6 대립유전자

UGT1A1 *6은 대부분 아시아 인종에서만 발견되며 13%~25%의 빈도를 갖는다. UGT1A1 *6 는 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)을 일으킬 수 있고, 한편, UGT1A1 *28 과 *6 변이형들은 UGT1A1 효소의 활성을 감소시키며, 이리노테칸 투여 치료시 심각한 간 독성 및 부작용을 증가 시킨다(Nagpal, 1972, Stangl et al., 1989).

이리노테칸은 항암제의 대표적인 예로 호중구 감소, 설사 등 부작용 유발 등이 보고되어 있으나, 한국에서는 의약품 허가사항에 반영이 되어 있지 않는 등, 연구의 필요성이 크다. 이와 관련하여, 한국인 비소세포폐암(Non-small-cell lung cancer, NSCLC) 환자 81명을 대상으로 UGT1A 유전형에 따른 이리노테칸 PK와 임상 결과의 연관성을 분석한 결과, UGT1A1 *6/*6, UGT1A7 *3/*3, UGT1A9 *1B/*1B 유전형에서 낮은 AUC(SN-38G)/AUN(SN-38) 비율을 나타낸다(각각 p=0.002, p=0.009, p=0.001) (Han et al, 2006)는 국내 연구결과가 있다. 또한, 이리노테칸을 투여 받은 암 환자에서 UGT1A1 *93(-3156G>A)과 3등급 이상의 심각한 호중구감소와 백혈구감소(P=0.0076), UGT1A1 *60, *28 (-3279T>G, TATA)과 3등급 이상의 심한 설사의 사이에 의미 있는 연관성을 보였다 (p=0.031). 유전체 연관성 불균형 (linkage disequilibrium) 분석 결과 *60, *93, *28에서 높은 연관성을 나타내었으며, *60, *93, *28에서 다형성 변이가 동시에 존재하는 환자들에서는 설사, 호중구감소, 백혈구감소가 빈번하게 발생함이 관찰 되었다 (p=0.015). 그 외 UGT1A1 *6에서 다형성 변이를 보이는 경우에도 다양한 수준의 백혈구 감소와 설사 증상이 확인된 바있다(강진형, 2006).

지금까지 UGT1A1을 대상으로 진행한 연구는 유전자의 코딩 부위에 존재하는 주요 변이형들을 위주로 이루어져 있으며 그 외의 부위에서 발견되는 유전형의 기능을 규명한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 발명에서는 한국인 UGT1A1 유전자의 프로모터에 존재하는 SNP를 발굴 한 후 일배체형을 구성해서 코딩 부위 외의 유전형이 UGT1A1 유전자의 발현에 미치는 기능을 규명하고자 한다.

또한, 본 발명자들은 UGT1A1에 의하여 대사되는 약물의 개발단계에서, 상기 약물을 대사하는 효소인 UGT1A1의 유전적 다형성을 분석할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, UGT1A1를 암호화하는 유전자의 일배체형을 유전적 다형성을 분석하는 지표로서 사용하여, 즉, 상기 일배체형을 분석할 수 있는 키트를 사용하여 UGT1A1의 유전적 다형성을 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 한국인의 UGT1A1 유전자의 신규한 일배체형을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 한국인의 UGT1A1 유전자의 일배체형을 분석할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 한국인의 UGT1A1 유전자 일배체형을 이용하여 UGT1A1 유전자의 발현을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는, 미국 FDA에서 제시하는 “Table of Valid Genomic Biomarkers in the Context of Approved Drug Labels”에 등록된 바이오마커 중 국내 의약품 허가사항에 반영이 되지 않은 유전자 및 약물대사에 중요한 비중을 차지하는 유전자 중, 인종 간 차이가 크고 기존 국내연구가 미진한 유전자를 우선순위로 하여 유전자를 선정하였다. 약물반응 관련 유전자에 대한 변이형 및 발생 빈도와 기능검사에 대한 정보를 수집하였으며, 바이오마커별 국가별 비교 및 국내외 실험동향 등을 조사 분석한 후 최종적으로 UGT1A1 유전자를 선정하였다.

본 발명에서는, 한국인 192명을 대상으로 UGT1A1 유전자의 프로모터 부위(~2kb)의 염기서열 분석을 통해 한국인에게 5% 이상의 빈도로 발생하는 SNP를 대상으로 일배체형을 구성하였다. 그 결과로, 하기 표 2와 같은 UGT1A1 유전자 프로모터의 SNP 및 일배체형 정보를 얻었으며, 한국인에 높은 빈도(10% 이상)로 존재하는 신규한 일배체형(Hap1~Hap3)을 기능유전체 분석에 사용하였다.

상기 표 2에서, “rs3755319” 등의 번호는 NCBI dbSNP에 공식적으로 등록되어 등록번호를 부여 받은 SNP의 번호를 나타낸다. 예를 들어, UGT1A1 유전자의 일배체형 2(Hap2)는, UGT1A1 유전자의 프로모터 염기서열에서 -1352 및 -997 염기 위치에 단일염기다형성이 있는 유전형을 말하는 것으로, 보다 구체적으로는 -1352 A>C 및 -997 G>A의 단일염기다형성을 가진다는 것을 나타낸다.

한편, 본 발명에서 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다)은 해당 유전자 염기서열의 n번째 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미한다.

일배체형의 빈도 및 종류를 예측하는 것은 당업계에 공지된 기술 프로그램 또는 시판되는 프로그램을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, 무료로 배포되는 Haploview 프로그램을 이용할 수 있고, SNPAlyze와 같은 상용화된 프로그램을 사용할 수도 있다. 상기 Haploview 소프트웨어는 당업계에 공지되어 있으며, 바람직하게는 인터넷 웹사이트인 http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview를 이용할 수 있다.

본 발명에서는, 상기의 각 일배체형에 따른 돌연변이 클론을 제작하여 HepG2 세포주에 트랜스펙션(transfection)시켜서 각 일배체형에 따른 유전자 발현량을 비교하였다. UGT1A1 유전자 프로모터의 Hap3(2.79±0.97)은 Hap1 (8.28±0.60) 및 Hap2 (6.60±0.15)와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소된 발현량을 보였다(p<0.05). 이러한 결과는 UGT1A1 유전자의 프로모터에 존재하는 유전형 또한 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있음을 제시한다.

이상의 결과로부터, UGT1A1 유전자 프로모터에 존재하는 연관된 SNP를 포함하는 일배체형을 각 그룹으로 분류할 경우, 분류된 그룹별로 UGT1A1 단백질의 발현정도가 각각 상이하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이에, 피검자에서 UGT1A1 단백질을 암호화하는 유전자 프로모터에 존재하는 연관된 SNP 및/또는 일배체형을 검출 또는 분석할 수 있는 키트를 제작하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

(a) 피험자의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 인간 UGT1A1 유전자 프로모터 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b) 상기 PCR로 얻은 DNA 산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및

(c) 상기 분석된 염기서열에서 -1352 A>C(서열번호 8의 3676번째 염기), -997 G>A(서열번호 8의 4031번째 염기), -364 C>T(서열번호 8의 4664번째 염기), -53 (TA)₇>(TA)₈(서열번호 8의 4975번째 염기)로 이루어진 군에서 선택되는 단일염기다형성(SNP)의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는 인간 UGT1A1 유전자의 일배체형 분석방법을 제공한다.

본 발명에 따른 분석 방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 유전자 증폭용 프라이머세트는 특별히 한정되지 않으나, 제1 프라이머세트로서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드; 제2 프라이머세트로서 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드; 및 제3 프라이머세트로서 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 분석 방법은 하기의 일배체형 Hap1 내지 Hap3에서 선택되는 일배체형의 분석에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 분석 방법에 있어서, 상기 단계 (b)에서 염기서열 분석은, 특별히 한정되지 않으나 직접 염기서열분석법(direct sequencing)을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 분석 방법에 있어서, 상기 단계 (c)에서 단일염기다형성(SNP)의 존재여부를 확인하는 것은, 야생형 UGT1A1 유전자 프로모터의 염기서열, 예를 들면 서열번호 7과 비교함으로써 달성할 수 있다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 인간 UGT1A1 유전자 프로모터의 -1352 A>C(서열번호 8의 3676번째 염기), -997 G>A(서열번호 8의 4031번째 염기), -364 C>T(서열번호 8의 4664번째 염기), -53 (TA)₇>(TA)₈(서열번호 8의 4975번째 염기)로 이루어진 군에서 선택되는 변이의 종류를 분석할 수 있는 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트 및 제3 프라이머 세트를 포함하는, 인간 UGT1A1 유전자의 일배체형의 분석 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 분석키트에 있어서, 상기 프라이머세트는 특별히 한정되지 않으나, 제1 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드이고, 제2 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드이고, 제3 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 분석키트는, 하기의 일배체형 Hap1 내지 Hap3에서 선택되는 일배체형을 분석할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 한국인의 유전정보로부터 UGT1A1 유전자 프로모터의 유전형을 분석하여, 한국인에게 10% 이상의 빈도를 보이는 한국인을 대표할 수 있는 일배체형 데이터를 확보하였는 바, 이 데이터에 의해 약물반응에 영향을 주는 한국인 유전형에 대한 정보를 제공하고, 가교시험 평가시 민족간 감수성 비교자료로서 활용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일배체형 분석키트 및 방법에 의하면, UGT1A1 유전자의 일배체형을 분석할 수 있도록, 상기 유전자 증폭용 프라이머를 포함하는 UGT1A1 유전자의 일배체형 분석키트 및 방법을 제공할 수 있는 바, 보다 용이하게 UGT1A1의 유전적 다형성을 분석할 수 있다. 따라서 개인간 유전형의 차이에 따른 맞춤의약을 포함하여, UGT1A1에 의하여 대사되는 약물의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은, 일배체형에 근거한 상관성 연구 모식도이다.
도 2는, UGT1A1 유전자의 프로모터 클로닝 및 일배체형 카세트(cassette) 제작방법에 관한 모식도이다.
도 3은, UGT1A1 유전자의 프로모터의 발현량이 DNA(플라즈미드) 농도 의존적임을 나타내는 그래프이다.
도 4는, UGT1A1 유전자의 프로모터의 유전형(HAP1~HAP3)에 따른 발현량 차이를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는, 본 발명의 일례일 뿐이므로 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: UGT1A1 유전자 프로모터 부위의 일배체형 결정

한국인 192명을 대상으로 UGT1A1 유전자의 프로모터 부위(～2kb)의 염기서열을 분석한 유전형 정보를 2006년도 식약청 용역연구사업 결과보고서(이종은, 2006)로부터 얻어, 5% 이상의 소수 대립인자 빈도(MAF; Minor Allele Frequency)를 갖는 SNP들로 각 유전자 프로모터의 일배체형을 구성하였다. 연관불균형(linkage disequilibirum, LD)은 Haploview 4.1을, 일배체형은 Phase 2.0 (GNU General Public, USA) 프로그램을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, UGT1A1 유전자 프로모터의 경우 5% 이상의 MAF를 갖는 SNP로 일배체형을 구성하였을 때 총 5개의 일배체형이 구성되었으며, 이중에서 한국인에서 10% 이상의 빈도를 나타내는 공통 일배체형 (Hap1~Hap3)을 기능유전체 분석에 사용하였다.

상기 표 2에서, rs3755319 등의 번호는, NCBI dbSNP에 공식적으로 등록되어 등록번호를 부여 받은 SNP의 번호를 나타낸다.

상기 표 2에서, -1352 A>C는 프로모터의 -1352번 염기(서열번호 7의 3676번째 염기) A가 C로 변이되었음을 나타내고, -997 G>A는 프로모터의 -997번 염기(서열번호 7의 4031번째 염기) G가 A로 변이되었음을 나타내고, -364 C>T는 프로모터의 -364번 염기(서열번호 7의 4664번째 염기) C가 T로 변이되었음을 나타내고, -53 (TA)₇>(TA)₈은 프로모터의 -53번 염기(서열번호 7의 4975번째 염기 이하) (TA)₇가 (TA)₈로 변이되었음을 나타낸다.

실시예 2: UGT1A1 유전자의 프로모터 클로닝 및 일배체형 카세트(cassette) 제작

UGT1A1 유전자의 프로모터를 클로닝하기 위해, 사람의 게놈 DNA를 주형으로 하여 UGT1A1 유전자의 프로모터 부위(~2kb)를 PCR 증폭한 후, 루시퍼라제 어세이 벡터(luciferase assay vector)인 pGL3 Basic vector (Promega)의 SacⅠ 및 XhoⅠ 부위에 삽입하여 UGT1A1를 클로닝하였다. 클로닝된 UGT1A1 유전자 프로모터의 염기서열을 직접 염기서열분석(direct sequencing)하여 염기서열을 확인하고, 확인된 염기서열을 기초로 프로모터의 점돌연변이 유발(point mutagenesis)을 진행하여 한국인에서 10% 이상의 빈도를 보였던 일배체형(Hap1~3) 카세트를 제작하였다(도 2 참조).

구체적인 실험방법은 다음과 같다.

UGT1A1 유전자의 프로모터 클로닝에 사용한 제한 효소는 Takara사의 제품을 사용하였고, 트랜스펙션에 필요한 리포펙타민(lipofectamine)은 Invitrogen사의 제품을 사용하였고, 루시퍼라제 어세이, β-갈락토시다제 어세이 키트는 Promega사의 제품을 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지 및 항생제는 Gibco사의 제품을 사용하였다. UGT1A1 유전자의 프로모터 증폭에 필요한 프라이머는 'Primer 3' (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)을 이용하여 설계하였으며, 구체적으로, UGT1A1 유전자 프로모터의 PCR 증폭용 프라이머 세트의 염기서열은 다음의 표 3에 나타낸 바와 같다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통한 UGT1A1 유전자의 프로모터 증폭시, PCR mix 조성 및 PCR 조건을 각각 하기 표 4 및 5에 나타내었다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)상에서 확인하고, PCR 산물 정제를 통해 과잉으로 남아 있는 프라이머나 dNTP 등을 제거하였다.

PCR을 통해 증폭된 UGT1A1 유전자의 프로모터를 SacⅠ과 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 말단을 자른 후, 루시퍼라제 어세이 벡터(luciferase assay vector)인 pGL3 Basic vector (Promega, CA, USA)의 다중클로닝부위(Multi Cloning Site) 내에 존재하는 SacⅠ 및 XhoⅠ 위치에 연결하여 클로닝하였다(도 2 참조).

이후, 얻어진 클론을, 상기 표 3의 프라이머 세트와 자동 염기서열 분석기(ABI 3730 XL system, Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 분석하여 참조 서열(reference sequence)을 결정하였다. site-directed mutagenesis kit(Stratagene, USA)를 이용해서 상기 참조 서열을 주형으로 하여 점돌연변이(point mutagenesis)시켜, Hap1~3 일배체형에 대한 카세트를 각각 제작하였다. 상기 site-directed mutagenesis에 사용된 프라이머 세트는 서열분석용(direct sequencing) 프라이머와 같다.

실시예 3: UGT1A1 유전자 프로모터의 활성 측정(발현 분석)

한국인 UGT1A1 유전자의 프로모터에 대한 Hap1~3 일배체형 각각이 유전자의 발현에 미치는 영향을 규명하기 위해, UGT1A1 유전자 프로모터의 야생형 구조물(casette)과 한국인에서 10% 이상의 빈도로 존재하는 공통 일배체형으로 구성된 돌연변이(Hap1~3) 구조물을, 각각 사람의 간 세포주인 HepG2 세포에 일시적으로 트랜스펙션하여 발현량의 차이를 규명하였다.

발현량을 비교하기 위해 각 프로모터에 의해 발현된 루시퍼라제의 양을 측정하였으며, 트랜스펙션시 효율의 차이를 보정하기 위해 β-갈락토시다제를 사용하였다. β-갈락토시다제 DNA의 양을 0.3㎍으로 고정하여 루시퍼라제의 양성 대조군(positive control) DNA를 농도별로(0.3~1.2㎍) 공동 트랜스펙션시켜 트랜스펙션 효율을 측정하였으며, 측정결과 트랜스펙션 효율 및 결과의 재현성이 양호하여 이 실험방법을 UGT1A1 유전자의 발현량 측정 실험에 적용하였다.

구체적인 실험방법은 다음과 같다.

1) 트랜스펙션(Transfection)

24 웰 플레이트(well plate)에 각 웰당 10%의 FBS(GIBCO, USA)가 포함된 RPMI 배지(GIBCO, USA) 500㎕을 넣은 후, 1×10⁵개의 HepG2 세포를 분주하고, CO₂ 배양기(incubator)에서 18시간 동안 37℃에서 배양하였다. HepG2 세포에 야생형 카세트와 각각의 일배체형 카세트의 DNA를 트랜스펙션시키기 위해, 하기 표 6의 조건으로 트랜스펙션 혼합물(mixture)을 제조하였다.

배양된 HepG2 세포에서 기존의 배지를 제거한 후, 상기 트랜스펙션 혼합물 50㎕를 첨가하였다. Opti-MEM 배지 (GIBCO, USA)를 웰 당 100㎕ 첨가한 후 CO₂ 배양기에서 5시간 동안 37℃로 배양하였다. 트랜스펙션 혼합물을 포함한 배지를 제거한 후 10%의 FBS와 항생제(streptomycin + penicillin)가 포함된 RPMI 배지 500㎕을 넣은 후 19시간 동안 37℃에서 배양하였다.

2) 세포 용해(lysis)

트랜스펙션이 완료된 세포에서 배지를 제거한 후 세정버퍼(washing buffer) (Promega, CA, USA) 250㎕를 첨가하여 세정하였으며, 용해 버퍼 (Promega, CA, USA) 100㎕를 첨가한 후 2시간동안 얼음에서 진탕(shaking)하였다. 웰에 넣은 용해 버퍼와 세포를 튜브에 넣은 후 상온에서 15초간 볼텍싱(vortexing)을 하였다. 원심분리 (12,000rpm, 2min, 4℃) 후 상층액을 분리한 후 브래드포드법(bradford)으로 총 단백질을 정량하여, 350㎍/㎖로 희석한 후 루시퍼라제 어세이(luciferase assay) 및 β-갈락토시다제 어세이(β-galactosidase assay)에 사용하였다.

3) 루시퍼라제 어세이(luciferase assay)

희석된 용해물 20㎕를 불투명한 96 웰 플레이트에 넣었다. 루시퍼라제 어세이 키트 (Promega, CA, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 루시퍼라제 어세이 반응을 30분간 수행하였으며 발광분석기(Luminometer)(VICTOR³ Multilabel counter, 1420, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

4) β-갈락토시다제 어세이(β-galactosidase assay)

희석된 용해물 10㎕를 투명한 96 웰 플레이트에 넣었다. β-갈락토시다제 어세이 키트 (Promega)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 β-갈락토시다제 어세이 반응을 30분간 수행하였으며 분광 광도계(Spectrophotometer)(VICTOR³ Multilabel counter, 1420, Perkin Elmer, USA)을 이용하여 420nm 파장에서 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다.

5) UGT1A1 유전자 프로모터의 활성분석

UGT1A1 유전자의 발현양은, 프로모터에 의해 발현된 루시퍼라제의 양을, 트랜스펙션시 효율의 차이를 보정하기 위해 사용한 β-갈락토시다제의 발현량으로 나누어 보정하였다. 각 일배체형군 간의 발현량의 차이는 T-test를 이용하여 α (유의 수준)=0.05에서 검정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, DNA 농도 의존적(0.3~1.2㎍)으로 루시퍼라제의 발현량이 증가함을 확인하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, UGT1A1 유전자 프로모터는 일배체형에 따른 발현량의 차이를 보였다. 구체적으로, Hap3 (2.79±0.97)은 Hap1 (8.28±0.60) 및 Hap2 (6.60±0.15)와 비교하여 통계적으로 유의하게 감소된 발현량을 보였으며, Hap2은 Hap1에 비하여 발현량이 감소하는 경향을 보였다

실시예 4: UGT1A1 유전자의 일배체형 분석키트 제작

실시예 3의 결과로부터, UGT1A1 유전자 프로모터에 존재하는 연관된 SNP를 포함하는 일배체형을 각 그룹으로 분류할 경우, 분류된 그룹별로 UGT1A1 단백질의 발현정도가 각각 상이하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이에, 피검자에서 UGT1A1 단백질을 암호화하는 유전자 프로모터에 존재하는 연관된 SNP 및/또는 일배체형을 검출 또는 분석할 수 있는 키트를 제작하였다. 본 키트를 이용하면, 일배체형에 따른 UGT1A1 유전자의 발현 정도를 예측할 수 있다.

우선, 인간 UGT1A1 유전자 프로모터의 염기서열에서 -1352 A>C(서열번호 8의 3676번째 염기), -997 G>A(서열번호 8의 4031번째 염기), -364 C>T(서열번호 8의 4664번째 염기), -53 (TA)₇>(TA)₈(서열번호 8의 4975번째 염기)로 이루어진 군에서 선택되는 단일염기다형성(SNP) 및/또는 Hap 1~3의 종류를 분석할 수 있도록, 제1 프라이머세트로서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드, 제2 프라이머세트로서 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드, 제3 프라이머세트로서 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 이를 포함하는 키트를 제작하였다.

또한, 상기 분석키트는, 하기의 일배체형 Hap1 내지 Hap3에서 선택되는 일배체형을 분석할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기의 단계를 포함하는 인간 UGT1A1 유전자의 일배체형 분석방법:
(a) 피험자의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 인간 UGT1A1 유전자 프로모터 또는 이의 단편을 증폭할 수 있는 프라이머세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
(b) 상기 PCR로 얻은 DNA 산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및
(c) 상기 분석된 염기서열에서, 야생형 UGT1A1 유전자 프로모터의 염기서열과 비교하여, -1352 A>C(서열번호 8의 3676번째 염기), -997 G>A(서열번호 8의 4031번째 염기), -364 C>T(서열번호 8의 4664번째 염기) 및 -53 (TA)₇>(TA)₈(서열번호 8의 4975번째 염기)로 이루어진 군에서 선택되는 단일염기다형성(SNP)의 존재여부를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 확인된 SNP를 이용하여, 피험자의 UGT1A1 유전자가 하기 일배체형 Hap1 내지 Hap3 중에서 어느 것에 해당하는지 동정하는 단계:
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 프라이머세트는, 제1 프라이머세트로서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드; 제2 프라이머세트로서 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드; 및 제3 프라이머세트로서 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 분석방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, (e) 상기 동정된 일배체형의 정보를 이용하여 UGT1A1 유전자의 활성을 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 염기서열 분석은, 직접 염기서열분석법(direct sequencing)을 이용하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
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인간 UGT1A1 유전자 프로모터의 염기서열에서 -1352 A>C(서열번호 8의 3676번째 염기), -997 G>A(서열번호 8의 4031번째 염기), -364 C>T(서열번호 8의 4664번째 염기) 및 -53 (TA)₇>(TA)₈(서열번호 8의 4975번째 염기)로 이루어진 군에서 선택되는 단일염기다형성(SNP)의 종류를 분석할 수 있는 제1 프라이머세트, 제2 프라이머세트 및 제3 프라이머세트를 포함하는 인간 UGT1A1 유전자의 일배체형 분석 키트로서,
상기 제 1 프라이머세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드이고, 제 2 프라이머세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드이고, 제 3 프라이머세트는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드이고,
상기 일배체형은 하기의 일배체형 Hap1 내지 Hap3에서 선택되는 인간 UGT1A1 유전자의 일배체형 분석키트:
삭제
삭제
하기 단계를 포함하는 인간의 UGT1A1 유전자의 발현 정도를 예측하는 방법:
(a) 제6 항의 분석키트를 이용하여, 피검체의 UGT1A1 유전자가 하기의 일배체형 Hap1 내지 Hap3 중 어느 것에 해당하는지 확인하는 단계; 및

(b) 확인된 일배체형의 정보를 이용하여, UGT1A1 유전자의 프로모터의 활성도를 예측하는 단계로서, 상기 활성은 일배체형이 Hap 1일 때 가장 높고, Hap 3일 때 가장 낮은 것을 특징으로 하는 단계.