CN102146475B

CN102146475B - 一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒

Info

Publication number: CN102146475B
Application number: CN 201110080695
Authority: CN
Inventors: 丁亚平; 毕少辉
Original assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd; SHENZHEN KANGMEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: BEIJING KANGMEI TIANHONG BIOTECHNOLOGY Co Ltd; SHENZHEN KANGMEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-03-31
Also published as: CN102146475A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒。本发明所述检测方法为在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针Prob-D，在缺失片段5′端设计一条反向引物Rq5及探针Prob-Q，提取待测样品DNA，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，然后根据实时荧光PCR扩增曲线分析待测样品。本发明所述试剂盒包括引物Fd5、Rd3和Rq5与标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q。本发明所述检测方法根据荧光信号强度在扩增的同时进行检测，节省了时间，提高了灵敏度，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的检测方法。

Description

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒。

背景技术

地中海贫血又称海洋性贫血，由于最初发现于地中海沿岸的国家，如意大利、希腊、马尔他等国而得名。它是一组遗传性溶血性贫血病，由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中α地中海贫血是最主要的地中海贫血类型之一，也是全世界最常见的遗传病之一。我国南方为α地中海贫血病的高发区，全国90万人的流行病学调查得出的总发病率为2.46％。

α地中海贫血是由位于人类16号染色体末端的α-珠蛋白基因缺陷所致，可划分为缺失型和非缺失型两大类，其中，缺失型发病率远高于非缺失型。α-珠蛋白基因的结构见图1，图中显示，编码α类珠蛋白基因串联在一起组成α-珠蛋白基因簇，从5′至3′依次为ξ2-ψξ1(假ξ)-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1。其中，ξ产生胎儿血红蛋白的组成成分ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达，后期至出生后，逐渐被α2，α1所代替。α2，α1是两个重要的功能基因，虽然二者的序列99.99％都完全相同，但研究表明，α2基因的表达要比α1强。其余四个基因即ψξ，ψα2，ψα1，θ1都是假基因，不表达蛋白，但其序列与α基因也高度同源。

迄今在亚洲地区和国家α地中海贫血患者中已发现多种大片段α基因的缺失，如，发现于菲律宾人群中的菲律宾型缺失(--Fil)和发生于泰国人群中的泰国型缺失(--Thai)。而在我国迄今发现三种缺失型：右侧缺失型(-α3.7)、左侧缺失型(-α4.2)和东南亚型(--SEA)。-α3.7型主要缺失的是α1基因，缺失片段长3.7Kb；-α4.2型缺失的是α2基因，缺失片段长4.2Kb；而东南亚型 (--SEA)2个功能基因即α2，α1全部缺失，缺失片段长达20Kb。--SEA型的携带者(--SEA/αα)的染色体中一条16号染色体上缺失20Kbα基因簇片段，而另一条正常，会显示一定的贫血症状，病理生理改变轻微，即轻型α地贫(α0-地贫)。而东南亚型(--SEA)的纯合子(--SEA/--SEA)，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少，是α-地贫中最为严重的一种，即重型α地贫。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4(Hb Bart′s)，Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，胎儿常于30～40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡。

目前对α地中海贫血尚无有效的治疗方法，因此开展遗传筛查和产前诊断选择性淘汰重症α地贫胎儿是控制该病发生最有效的预防措施。由于基因诊断取材不受组织器官特异性限制，怀孕早期的绒毛或中期的羊水均可用于检测，因此目前大都利用基因诊断技术进行遗传筛查和产前诊断。经典的Southern杂交技术能诊断Hb Bart′s水肿胎，但因该法操作繁琐、实验周期长、使用放射性核素标记等诸多限制，而不利于临床推广应用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是针对现有的检测方法的缺陷，提供一种简便、快捷，灵敏度高的检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法，为针对Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针Prob-D，在缺失片段5′端设计一条反向引物Rq5及探针Prob-Q，其中，所述引物Fd5为第155115至第155755位之间长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rd3为与第174721至第175321位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rq5为与第155395至第155895位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，所述Prob-D为与第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Prob-Q为与第155533至第155653位核苷酸序列区域互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Prob-D和Prob-Q标记不同波长的报告荧光基团；

提取待测样品DNA，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。

本发明所述东南亚缺失型α地中海贫血缺失为涵盖α-珠蛋白基因簇的约20Kb基因片段，即Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因的第155569位第174707位的核苷酸序列。

本发明所述检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法的原理如图2所示，针对Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因，在东南亚缺失型α地中海贫血缺失片段断端的两侧设计一对引物Fd5和Rd3及探针Prob-D，在缺失片段5′端设计一条反向引物Rq5及探针Prob-Q。荧光PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。当扩增正常基因时，由于没有缺失发生，位于断端两侧的引物Fd5和Rd3之间的距离大于20Kb，而一般PCR扩增无法扩增大于5Kb的片段，故引物Fd5和Rd3无法扩增得到PCR产物，而缺失片段上的引物Rq5与引物Fd5相邻，能够扩增出一段50bp～500bp的PCR产物，该PCR产物序列与可Prob-Q配对，Prob-Q标记的荧光基团发射荧光，且随着扩增循环数的增加，PCR产物不断增加，Prob-Q与PCR产物结合后发出的荧光信号不断加强。当扩增有东南亚缺失的α地中海贫血基因时，由于有缺失发生，位于断端两侧的引物Fd5和Rd3相互靠近，能够扩增一段长度在50～500bp之间的PCR产物，该PCR产物序列与Prob-D配对，Prob-D标记的荧光基团发射荧光，并且随着扩增循环数的增加，PCR产物不断增加，Prob-D与PCR产物结合后发出的荧光信号也不断加强。由于Prob-D和Prob-Q分别标记不同波长报告荧光基团，因此通过不同波长的通道进行检测可以判断与PCR产物结合的是那种探针，进而判断待测样品是否为东南亚缺失型，并且可以区分东南亚缺失型α地中海贫血纯合子和杂合子样本。

基因组DNA含有细胞中全部的遗传信息，因此，为了完成本发明的方法，首先需提取待测样品DNA，然后以提取的DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。目前在医学和生物学领域提取DNA的成熟方法有很多，本发明所述检测方法提取待测样品可以采用目前报道的任何一种成熟的提取人基因组DNA的方法，包括但不限于裂解沉淀法，煮沸裂解法以及离心柱纯化法。优选的，本发明所述提取待测样品DNA的方法为离心柱纯化法。

引物是在聚合作用的起始时，与反应物以共价键形式连接的一段短的单链核苷酸序列，作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。本发明所述检测方法包括三条引物分别为Fd5、Rd3和Rq5，其中，所述Fd5和Rd3为一对位于缺失片段断端两侧的引物，Fd5为缺失片段断端5′端的近端引物，Rd3为缺失片段断端3′端的近端引物，Rq5为缺失片段5′端与Fd5反向的引物。其中，Fd5为Genebank登录号为AE006462的基因序列的第155115至第155755位之间长度为15bp～30bp的核苷酸序列；Rd3为与Genebank登录号为AE006462的基因第174721至第175321位核苷酸互补的，长度为15bp～30bp的核苷酸序列；Rq5为与Genebank登录号为AE006462的基因序列的第155395至第155895位核苷酸互补的，长度为15bp～30bp的核苷酸序列。

优选的，所述引物Fd5为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，Rd3为SEQ IDNO：2所示核苷酸序列，Rq5为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

实时荧光PCR扩增时，在加入一对引物的同时需加入一个特异性的荧光探针，该探针为一段5′端和3′端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，可以特异性与PCR产物以共价键形式结合的寡核苷酸序列。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，探针与PCR产物结合，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告荧光基团发射荧光，荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

本发明所述检测方法包括标记不同波长报告荧光基团的探针Prob-D和Prob-Q，其中所述Prob-D与缺失片段断端3′端引物Rd3上游序列反向，为与Genebank登录号为AE006462的基因序列的第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列；所述Prob-Q与缺失片段5′端引物Rq5上游序列反向，为与Genebank登录号为AE006462的基因序列的第155533至第155653位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列。

优选的，所述Prob-D为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；Prob-Q为SEQID NO：5所示核苷酸序列。

Prob-D和Prob-Q的探针种类包括但不限于Taqman探针、Taqman-MGB探针和分子信标探针。优选的，在一个具体实施方案中，所述Prob-D和Prob-Q为Tapman探针。

探针标记的报告荧光基团包括但不限于以下荧光物质：FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、Oregon Green、CAL Red、Red640和Texas Red。探针标记的淬灭荧光基团包括但不限于TAMRA、DABCYL、ELIPSE和NFQ。

优选的，在一个具体实施方案中，所述Prob-D标记的报告荧光基团为VIC，淬灭荧光基团为HBQ；所述Prob-Q标记的报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为HBQ。

优选的，在一个具体实施方案中，本发明所述检测方法所述实时荧光PCR反应程序为：50℃，2min；95℃，10min；然后40个循环，每个循环95℃，30s；60℃，60s。

本发明所述检测方法需要在实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，根据实时荧光PCR的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为当待测样本只出现Prob-Q检测信号时，判别为无东南亚缺失的正常基因样本；当待测样本只出现Prob-D检测信号时，判别为东南亚缺失型α地中海贫血纯合子样本；当待测样本出现Prob-Q和Prob-D两种检测信号时，判别为东南亚缺失型α地中海贫血杂和子样本。

优选的，所述分析待测样品以3-15个CT值的荧光值作为基线范围。

优选的，所述分析待测样品Prob-Q探针标记的检测通道以缺失型质粒对照品为阴性设定阈值线，Prob-D探针标记的检测通道以正常基因扩增产物质粒对照品阴性设定阈值线。

本发明所述检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法采用引物Fd5、Rd3和Rq5与标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q形成的实时荧光PCR系统，以待测样品DNA为模板进行实时荧光PCR反应，在检测人类基因组DNA样本时，可以同时检测出东南亚缺失型α地中海贫血的纯和子与杂合子型，当待测样本只出现Prob-Q检测信号时，判别为无东南亚缺失的正常基因样本；当待测样本只出现Prob-D检测信号时，判别为东南亚缺失型α地中海贫血纯合子样本；当待测样本出现Prob-Q和Prob-D两种检测信号时，判别为东南亚缺失型α地中海贫血杂和子样本。本发明所述检测方法采用实时荧光PCR方法，根据荧光信号强度在扩增的同时进行检测，节省了时间，提高了灵敏度，是一种简单、快捷，灵敏度高，易于推广的检测方法，适用于东南亚缺失型α地中海贫血的人群筛查以及婚前或产前筛查。

本发明还提供了一种用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒，包括引物Fd5、Rd3和Rq5与标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q，其中，所述引物Fd5为第155115至第155755位之间长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rd3为与第174721至第175321位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rq5为与第155395至第155895位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，所述Prob-D为与第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Prob-Q为与第155533至第155653位核苷酸序列区域互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列。

优选的，所述Fd5为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，Rd3为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，Rq5为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，Prob-D为SEQ IDNO：4所示核苷酸序列，Prob-Q为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

优选的，在一个具体实施方案中，所述Prob-D和Prob-Q为Tapman探针。

优选的，所述Prob-D标记的报告荧光基团为VIC，淬灭荧光基团为HBQ；所述Prob-Q标记的报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为HBQ，即在一个具体实施方案中，本发明所述试剂盒中所述引物和探针分别为：

Fd5：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

Rd3：SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

Rq5：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

本发明所述试剂盒还包括对照样品，以验证所述引物和荧光探针是否可用，所述检测是否有效。所述对照样品包括正常人基因扩增产物对照质粒，东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒和由正常人基因扩增产物对照质粒与东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒等量混合形成的杂合子基因扩增产物对照质粒。其中，所述检测应符合下述条件才有效，否则应该重新检测：正常人基因扩增产物对照质粒在Prob-Q探针标记的信号通道上为阳性，在Prob-D探针标记的信号通道上为阴性；东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒在Prob-Q探针标记的信号通道上为阴性，在Prob-D探针标记的信号通道上为阳性；杂合子基因扩增产物对照质粒在Prob-Q和Prob-D探针标记的检测通道上都为阳性。

优选的，本发明所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂溶液和酶液。

更优选地是，本发明所述试剂盒还包括DNA提取试剂。

本发明所述用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定可靠、适用范围广，适用于东南亚缺失型α地中海贫血的人群筛查以及婚前或产前筛查。

本发明还提供了用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的引物组，包括三条引物Fd5、Rd3和Rq5，所述引物Fd5为第155115至第155755位之间长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rd3为与第174721至第175321位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Rq5为与第155395至第155895位核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列。

优选的，所述引物组中所述Fd5为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，Rd3为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，Rq5为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。

本发明还提供了用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的探针组，包括标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q，其中，所述Prob-D为与第174780至第174900核苷酸互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列，Prob-Q为与第155533至第155653位核苷酸序列区域互补的长度为15bp～30bp的核苷酸序列。

其中，探针种类包括但不限于Taqman探针、Taqman-MGB探针和分子信标探针。探针标记的报告荧光基团包括但不限于以下荧光物质：FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、Oregon Green、CAL Red、Red640和Texas Red。探针标记的淬灭荧光基团包括但不限于TAMRA、DABCYL、ELIPSE和NFQ。

优选的，所述探针组中所述Prob-D和Prob-Q分别为：

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

附图说明

图1示α-珠蛋白的结构图；

图2示本发明所述检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法的原理图；

图3示以东南亚缺失杂纯合子基因组为模板用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物Fd5和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物Rd3以及具有SEQ ID NO：3的引物Rq5引物组进行PCR扩增的凝胶电泳图，其中泳道1为DL1000分子标准物，泳道2为扩增产物；

图4示以正常人基因组为模板用用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物Fd5和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物Rd3以及具有SEQID NO：3的引物Rq5引物组进行PCR扩增的凝胶电泳图，其中泳道1为DL1000分子标准物，泳道2为扩增产物；

图5示本发明所述检测方法正常人基因扩增产物质粒对照品实时荧光PCR扩增曲线图，其中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光量，A为FAM荧光通道检测信号；

图6示本发明所述检测方法东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品实时荧光PCR扩增曲线图，其中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光量，B为VIC荧光通道检测信号；

图7示本发明所述检测方法东南亚缺失型杂合子基因扩增产物质粒对照品实时荧光PCR扩增曲线图，其中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光量，A为FAM荧光通道检测信号，B为VIC荧光通道检测信号。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：引物与探针的合成与纯化

以Genebank登录号为AE006462的α-珠蛋白基因作为PCR扩增的靶序列，设计合成了以下引物：

Fd5：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

Rd3：SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

Rq5：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

根据引物之间的序列设计合成了以下Taqman探针：

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

合成的引物采用PAGE纯化，合成的探针序列采用HPLC纯化。荧光探针Prob-Q采用FAM作为报告荧光；HBQ作为淬灭物；荧光探针Prob-D选用VIC做报告荧光；HBQ作为淬灭物。

实施例2：引物特异性和灵敏度分析

以东南亚缺失型纯合子基因组为模板用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物Fd5和具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物Rd3的引物组进行PCR扩增，凝胶电泳检测见图3，以正常人基因组为模板用具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的引物Fd5和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的引物Rq5的引物组进行PCR扩增，凝胶电泳检测见图4。由图3和图4所示，引物Fd5与Rd3和引物Fd5与Rq5扩增产物的凝胶电泳检测均为单一条带，扩增时生成的引物二聚体较少，表明引物特异性好。

回收引物Fd5与Rd3和Fd5与Rq5的扩增产物，送中美泰和生物工程公司测序，结果显示引物Fd5与Rd3的扩增产物与Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因第115337至第174888位长度为226bp的核苷酸片段序列一致，引物Fd5与Rq5的扩增产物与Genebank登录号为AE006462的α类珠蛋白基因第115337第155653位长度为317bp的核苷酸片段序列一致。测产物浓度并换算成拷贝数值，10倍倍比稀释制备成10²～10⁶拷贝的样品，常规凝胶电泳检测，结果显示10⁶拷贝的样品具有较强的单一条带，10²拷贝的样品具有微弱的单一条带，表明引物灵敏度高。

综合上述试验结果，本发明所述具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物Fd5、具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的引物Rd3和具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的引物Rq5特异性好、灵敏度高，可以应用于东南亚缺失型α地中海贫血的检测工作。

实施例3：对照品质粒的构建

1、正常人类基因扩增产物质粒对照品的制备：

收集正常样本，用商品化的全血基因组纯化试剂提取正常样本中的人类基因组。用Fd5与Rq5引物对，扩增正常人类基因组样本，得到的PCR产物克隆进入T-载体质粒。质粒经过转化进入JM109大肠杆菌，通过含有氨基苄青霉素的LB培养基筛选培养，选取单克隆，摇菌培养。提取质粒，经过纯化后，检测浓度，计算拷贝数，作为正常人类基因扩增产物质粒对照品备用。

2、东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品的制备：

收集东南亚缺失型α地中海贫血的样本，用商品化的全血基因组纯化试剂提取基因组。用Fd5与Rd3引物对，扩增东南亚缺失型基因组样本，得到含有大片段缺失的PCR产物，后续质粒克隆与纯化过程与人类基因扩增产物质粒相同。

3、东南亚缺失型杂合子基因扩增产物质粒对照品的制备：

将正常人类基因扩增产物质粒对照品与东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品等比例混合制成东南亚缺失型α地中海贫血杂合子质粒对照品。

实施例4：待测样品DNA的提取

采集被检测者的全血样本1～2mL，加入抗凝剂，用人类全血基因组DNA小量离心柱法提取试剂盒(北京康美天鸿生物科技有限公司)提取全血基因组，本试剂包括红细胞裂解液，细胞核裂解液，洗涤液，DNA溶解液，以及纯化离心柱。提取过程如下：

(1)取全血样本200μL，加入红细胞裂解液600μL，混匀，快速离心1min，弃去上清液。重复一次。

(2)向沉淀的有核细胞中加入裂解液，65℃孵育20min。

(3)将硅胶离心柱置于2mL离心管上，步骤2裂解有核细胞液体加入到离心柱中，8000g离心1min，弃去离心管内液体。

(4)向离心柱上加入500μL洗涤液1，离心同上，弃去离心管内液体。

(5)用洗涤液2再次离心洗涤一次。

(6)将离心柱放入干净的离心管中，加50uL洗脱液，离心1min。重新洗脱一次，离心3min。

(7)收集两次的洗脱液，4℃放置备用。

实施例5：实时荧光PCR反应

1、实时荧光PCR反应液的配制：

按照表1所示配方配制实时荧光PCRMix(所列为每个PCR反应的配方)。

表1实时荧光PCRMix配方

将根据上述配方配制的PCRMix分装，-20℃冻存，样本检测时，根据检测样本数取相应体积的PCRMix，再加上正常人基因扩增产物质粒对照品，东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品以及东南亚缺失型杂合子基因扩增产物质粒对照品。PCRMix的取量(μL)＝37.5×(N+4)，其中N为检测样本数，4包括三种质粒对照品加上1个样本的富余量。PCRMix中加入0.4×(N+4)μL的Taq酶，以及0.1×(N+4)μL的UNG酶，混匀。将加入Taq酶和UNG酶的PCRMix分别加入PCR反应8联管内，每个管内加入38μL。将事先纯化的待测样品以及三种质粒对照品分别加入不同的PCR反应管内，加入量为2μL，盖紧盖子，上机检测。

2、实时荧光PCR反应：

本发明所述实时荧光PCR仪没有特别要求，可以是ABI的荧光PCR，如ABI7000、ABI7500、ABI7300以及ABI9700等，也可以是BioRad公司的iCycler或Roche公司的Light-Cycler等同类检测仪器。本发明以ABI7500为例，先设置实时荧光PCR仪的检测荧光通道为FAM和VIC，然后将加好样的PCR八联管放入实时荧光PCR仪的96孔托槽内，关闭仪器，设置反应程序，反应程序如表2所示，设置60℃延伸为荧光信号收集期。

表2实时荧光PCR反应

实施例6：实时荧光PCR反应结果判断

分别显示ABI7500的FAM荧光通道和VIC荧光通道，以3-15个CT值的荧光值作为基线范围，也可通过仪器自动判断基线范围。各通道以37个CT值判断，小于37个CT时，出现指数扩增曲线判为阳性；大于37个CT仍未出信号峰，则判为阴性。FAM检测通道以东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品为阴性，设定阈值线。VIC检测通道以正常基因扩增产物质粒对照品为阴性，设定阈值线。正常人基因扩增产物质粒对照品，东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品以及东南亚缺失型杂合子基因扩增产物质粒对照品实时荧光PCR扩增曲线见图5～7。当FAM信号通道阳性，VIC信号通道阴性的样本，判为正常人基因组样本；当VIC信号通道阳性，FAM信号通道阴性的样本，判为东南亚缺失型α地中海贫血纯合子样本；当FAM和VIC信号通道均检测为阳性的样本，判为东南亚缺失型α地中海贫血杂合子样本。

所有检测应符合下述条件才算有效，否则应该重新检测：正常基因扩增产物质粒对照品在FAM信号通道上为阳性，在VIC信号通道上为阴性；东南亚缺失型纯合子基因扩增产物质粒对照品在FAM信号通道上为阴性，在VIC信号通道上为阳性；东南亚缺失型杂合子基因扩增产物质粒对照品在FAM和VIC检测通道上都为阳性。

实施例7：本发明所述用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒，包括三条PCR引物和两条荧光探针，其中所述引物和荧光探针序列分别为：

Fd5：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

Rd3：SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

Rq5：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

实施例8：本发明所述用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒，包括三条PCR引物、两条荧光探针和对照样品，其中，所述对照样品包括正常人基因扩增产物对照质粒，东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒和由正常人基因扩增产物对照质粒与东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒等量混合形成的杂合子基因扩增产物对照质粒。所述引物和荧光探针序列分别为：

Fd5：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

Rd3：SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

Rq5：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

实施例9：本发明所述用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒

一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒，包括三条PCR引物、两条荧光探针、对照样品、PCR反应液和氯仿-异戊醇法DNA提取试剂，其中，所述对照样品包括正常人基因扩增产物对照质粒，东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒和由正常人基因扩增产物对照质粒与东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒等量混合形成的杂合子基因扩增产物对照质粒。所述PCR反应液包括10×PCR buffer、dNTP、25mmol/L MgCl₂溶液和酶液。所述引物和荧光探针序列分别为：

Fd5：SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

Rd3：SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

Rq5：SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

Prob-D：5′-VIC-TTGGCCAGGTGCCGTGGCTT-HBQ-3′；

Prob-Q：5′-FAM-CCGGGATTCGGACGTCAGGC-HBQ-3′。

实施例10：临床样本的检测

按照本发明所述检测方法，利用本发明实施例9所述试剂盒，对10000份临床婚前或产前筛查样本进行检测，其中39份为东南亚缺失型α地中海贫血纯合子样本，115份东南亚缺失型α地中海贫血杂合子样本。为了进一步证实本发明所述方法的准确性，对上述154份样本利用Southern杂交技术和Gap-PCR进行复查，结果表明，复查结果与按照本发明所述检测方法检测的结果完全一致。可见本发明所述检测方法和试剂盒可满足于东南亚缺失型α地中海贫血的人群筛查和婚前或产前筛查。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种用于检测东南亚缺失型α地中海贫血的试剂盒，其特征在于，包括引物Fd5、Rd3和Rq5与标记不同波长报告荧光基团的Prob-D和Prob-Q，其中，所述Fd5为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，Rd3为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，Rq5为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，Prob-D为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，Prob-Q为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述Prob-D和Prob-Q为Tapman探针。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述Prob-D标记的报告荧光基团为VIC，淬灭荧光基团为HBQ；所述Prob-Q标记的报告荧光基团为FAM，淬灭荧光基团为HBQ。

4.根据权利要求1~3任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括对照样品，所述对照样品包括正常人基因扩增产物对照质粒，东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒和由正常人基因扩增产物对照质粒与东南亚缺失型基因扩增产物对照质粒等量混合形成的杂合子基因扩增产物对照质粒。

5.根据权利要求1~4任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括10×PCR buffer、dNTP、MgCl₂溶液和酶液。