CN104032025B - 用于kir基因快速分型的引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于KIR基因快速分型的引物、含有该引物的试剂盒以及采用该引物和试剂盒进行KIR基因快速分型的方法。本发明使用了KIR基因的特异性引物，增强了特异性的结合，完全可用于检测目前已知的16个KIR等位基因。此外，本发明将特异性引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，大大节省了操作时间和工作量，具有快速、简便、准确、直观的特点，在3小时内即可完成整个基因的分型实验，解决了KIR基因分型的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因编码一族激活性和抑制性KIR受体，表达在NK细胞和部分T细胞表面，通过特异性识别靶细胞表面的MHC-I类分子，转导激活或抑制信号，从而调节NK细胞和T细胞的活性，在抗感染、肿瘤监测、移植免疫和自身免疫性疾病等方面发挥重要作用。KIR基因属于常染色体共显性遗传，位于人类染色体19q13.42，长约100～200kb，具有高度多态性。目前已明确的KIR基因共l6个，包括14个功能基因(KIR2DL1-5、KIR3DL1-3、KIR2DS1-5、KIR3DS1)和2个假基因(KIR2DP1、KIR3DP1)，形成以KIR3DL2和KIR3DL3基因分列染色体端粒端和着丝粒端，KIR2DL和KIR3DP1基因居中的框架格局，各KIR基因的规律组合又可形成KIR基因A和B两种单倍型。KIR基因的表达产物——KIR受体对NK细胞和部分T细胞活性调节起着重要作用，故检测KIR基因对感染、肿瘤和自身免疫病发病机制的探讨、发病预测、治疗及造血干细胞移植都具有临床指导意义。
1997年Uhrberg等首次建立了采用PCR-SSP方法检测KIR基因。随后又出现了序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-SSOP)、RT-PCR等检测方法。但这些方法都存在一定的局限性，主要表现在PCR-SSOP与RT-PCR方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测KIR的试剂盒，但因其采用的均是既往的引物，因而不能检测出近年来新发现的KIR基因的等位基因和座位，且其扩增产物多为长片段，对样本基因组DNA的要求也高，存在漏检和误检的可能，远远不能满足对KIR基因获得中高分辨率的分型结果的要求。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的KIR基因数据库，重新设计了KIR基因的PCR-SSP分型方法并建立了一套结果判读格局图。本发明的分型方法准确可行，与长片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法相比，其对KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS1等基因均可获得中高分辨的分型结果。
为此，本发明一方面提供了一种用于KIR基因快速分型的引物，其包含SEQIDNO.1-46所示的检测引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46，其中检测引物KP-01和KP-02组成一组，依次按照顺序两两组合，组成23组引物组。
在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示的内对照引物NCXF和NCXR。
本发明另一方面提供了一种用于KIR基因快速分型的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液分别包含如上所述的23组引物组，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中用于KIR基因快速分型的引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46的浓度均为0.5μM。
在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上所述的内对照引物。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。
在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。
在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。
本发明另一方面提供了一种对KIR基因进行快速分型的方法，其包含以下步骤：
1、提取待检测样品的DNA溶液；
2、采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒，以步骤1中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增；
3、PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，当电泳结果均出现与目标片段大小一致的条带时，表明该基因为KIR基因阳性，否则表明该基因为KIR基因阴性。
本发明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的试剂盒在KIR基因快速分型中的应用。
由上述描述可知，本发明基于PCR-SSP技术开发的KIR基因分型试剂盒，由于使用了特异性引物，因此相比现有其他检测方法而言，具有快速、简便、准确、直观的特点，实验成本低，且仅需微量检材即可完成实验检测所需。同时，本发明的检测试剂盒可以很直观的根据扩增后电泳的条带的判读，即可判断KIR的等位基因型别，从而完成KIR基因的分型。
此外，本发明将引物，dNTPs，PCR缓冲液和染料预先混合，可大大节省实验者的操作时间和工作量。将等位基因的多对引物混合同时扩增，满足高通量的实验需求，直接得出分型和筛查结果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合格DNA样品的情况下，本发明在3小时内即可完成整个基因的分型实验，解决了KIR基因分型的问题。
附图说明
图1：KIR基因阳性样品凝胶电泳图，其中图1上的号码对应于图2判读格局图中相应的孔号。
图2：KIR-SSP结果判读格局图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：制备快速检测KIR基因的试剂盒
1、引物的合成
引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列分别如SEQIDNO.1-46所示。
同时，为了保证反应体系的正常进行，还设计了一对上下游引物NCXF(SEQIDNO.47)和NCXR(SEQIDNO.48)，作为内对照引物，其扩增片段大小为790bp。
具体序列情况如表1所示
表1.快速检测KIR基因的引物
2、PCR反应混合液的制备
将SEQIDNO.1-48所示的引物，dNTPs，染料甲酚红，PCR缓冲液混合。检测引物KP-01和KP-02为一组，依次按照顺序两两组合，组成23组引物组。检测引物SEQIDNO.1-46的浓度均为0.5μM，内对照引物SEQIDNO.47-48的浓度分别为0.2μM，染料甲酚红浓度为0.01％，dNTPs浓度为0.2mM。PCR缓冲液为：Tris-HCL浓度为10mM，氯化钾浓度为50mM，氯化镁浓度为1.5mM，明胶浓度为0.001％。将上述33组PCR反应混合液和Taq酶分装后包装，组成试剂盒。
实施例2：样本中KIR基因的定型检测
选取了覆盖16个KIR基因型别的阳性DNA样品。分别加入PCR管中，同时在每管中加入Taq酶。加样完成后将反应混合液混匀，短暂离心，进行PCR反应。
PCR反应的条件为：94℃5min；再依次按照以下程序运行30个循环，94℃1min，65℃2min，72℃1min；最后72℃10min，降温至15℃，可进行凝胶电泳检测。
使用0.5×TBE缓冲液，配置2％琼脂糖凝胶。取3ulPCR产物直接点样到凝胶孔上，电泳30分钟，然后在紫外光下拍照记录，具体凝胶电泳结果参见附图1。
结果判读：所有结果均出现与目标片段大小一致的条带，说明本发明的试剂盒具有很好的特异性。
序列表
<110>上海荻硕贝肯生物科技有限公司
<120>用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法
<130>PT20141228
<160>48
<170>PatentInversion3.3
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Claims (7)
1.一种用于KIR基因快速分型的引物组合，其由SEQIDNO.1-46所示的检测引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46以及SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示的内对照引物NCXF和NCXR组成，其中检测引物KP-01和KP-02组成一组，依次按照顺序两两组合，组成23组引物组。
2.一种用于KIR基因快速分型的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液分别包含权利要求1所述的23组引物组，所述Taq酶的浓度为5U/μL。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中用于KIR基因快速分型的引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46的浓度均为0.5μM。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。
5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其中PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料为甲酚红。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。
7.权利要求1所述的用于KIR基因快速分型的引物组合在制备用于KIR基因快速分型的试剂盒中的应用。
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