CN106222288A - 用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法 - Google Patents

用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及用于KIR基因的PCR‑SSP分型检测的引物组合及试剂盒及方法，其中所述引物组合由SEQIDNO.1‑65所示的检测引物组成，检测引物2DL1和2DL2组成一组，2DS3和2DP1组成一组，DRB1、3DS1和3DL1组成一组，3DP1、2DL5和2DS1组成一组，2DL3和2DL4组成一组，2DL3、2DS3和3DS1组成一组，2DS4、3DL1和2DL1组成一组，2DS4和2DS5组成一组，3DL3、2DS5和3DL2组成一组，2DP1和2DS2组成一组，2DS2组成一组，2DL4、3DL2和3DL3组成一组，共组成12组引物组。本发明准确和可靠，操作简单稳定，易判断结果。

Description

用于KIR基因PCR-SSP分型检测的引物组合及试剂盒及方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种用于KIR基因PCR-SSP分型检测的引物组合及试剂盒及方法。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异识别人类主要组织相容性抗原MHC I类分子的受体,对NK细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用.KIR由一组位于人类19q13.4染色体上的多态性丰富的多基因家族所编码,其结构和功能具有多样性.每一个体含有不同种类和数目的KIR基因,而同一位点的等位基因又具有丰富的多态性,已发现了15个KIR基因，包括(KIR2DL1,KIR2DL2/L3,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS2,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1/S1,KIR3DL2,KIR3DL3)和2个KIR假基因(KIR2DP1、KIR3DP1)。KIR基因的表达产物——KIR受体对NK细胞和部分T细胞活性调节起着重要作用，故检测KIR基因对感染、肿瘤和自身免疫病发病机制的探讨、发病预测、治疗及造血干细胞移植都具有临床指导意义。
Uhrberg等首次建立了采用PCR-SSP(sequence specific primer)方法检测KIR基因。PCR-SSP即序列特异引物引导的PCR反应。序列特异性引物是根据不同基因序列关键几处碱基的差异而设计。特异性引物仅和对应基因的特有序列结合，并起始扩增，产生特异性的PCR产物。该产物经琼脂糖电泳后，通过凝胶成像得以识别。
随后又出现了序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-SSOP)、RT-PCR等检测方法。但这些方法都存在一定的局限性，主要表现在PCR-SSOP与RT-PCR方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测KIR的试剂盒，但还是由于KIR基因本身的复杂性，当标本为某些基因型时，检测中存在着结果错判、漏判或不易判断结果，检测不稳定等的技术问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于KIR基因PCR-SSP分型检测的引物组合及试剂盒及方法，能够完整检测15个的已知的KIR基因((KIR2DL1,KIR2DL2/L3,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS2,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1/S1,KIR3DL2,KIR3DL3)和2个KIR假基因,KIR2DP1、KIR3DP1)，并可同时检测两种2DS4和3DP1常见的变异体，其中14个基因同时用两套引物检测，结果可相互核对，提高了准确性和可靠性，操作简单稳定，易判断结果。
解决以上技术问题的一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQIDNO.1-65所示的检测引物组成，其中检测引物2DL1和2DL2组成一组，2DS3和2DP1组成一组，DRB1T、3DS1和3DL1组成一组，3DP1、2DL5和2DS1组成一组，2DL3和2DL4组成一组，2DL3、2DS3和3DS1组成一组，2DS4、3DL1和2DL1组成一组，2DS4和2DS5组成一组，3DL3、2DS5和3DL2组成一组，2DP1和2DS2组成一组，2DS2组成一组，2DL4、3DL2和3DL3组成一组，共组成12组引物组。
本发明中还提供一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的试剂盒，其特征在于：包括GoTaq Green Mastermix(Promega，WI，USA)和权利要求1所述的引物组，所述GoTaqGreen Mastermix总量为65ul，每孔为5ul。
其中用于KIR基因快速分型的引物浓度均为10μM。
本发明中一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取受试者血液或组织的基因组DNA；
(2)引物准备：将引物稀释，经单位点引物对配制、多重引物对配制、和/或保存后备用；
(3)以步骤(1)提取的受试者的基因组DNA为模板，在含检测KIR单特异引物的PCR反应体系中进行PCR扩增；
(4)扩增结束后，将扩增后的样品在琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离，并进行结果判别：基因有扩增条带判断为阳性，无对应扩增条带判断为阴性；并且除2DS1，3DP1外每个KIR位点都有两组引物扩增，这两组引物的扩增阴性和阳性应当一致，不一致时重复实验。
本发明中所述PCR反应程序中反应体系如下：
ddH2O:20μl
DNA:6μl
Promega GoTaq green master mix:65μl
合计：91μl。
所述DNA总量在150-300ng，浓度为40ng/μl时最优，即DNA总量为240ng。
所述PCR反应程序中反应条件如下：
所述PCR扩增过程中PCR仪温度升到65℃以上后再将PCR板放入仪器。
本发明中所述引物准备为：
(1)引物稀释：离心28-32s后以TE将引物稀释到10μM，混匀；
(2)单位点引物对配制：每个位点的正反向引物按1:1比例混匀(各200μl，其中2DS1、3DP1有2条正向引物，1条反向引物，其正向引物各取100μl，反向引物取200μl)；
(3)多重引物对配制：每种单位点引物对取200μl放入PCR试剂孔中，配制各孔的多重引物，不足3种引物的以dH2O补足600μl；第四孔引物除2DS1外各加150μl，2DS1加入240μl，混匀；
(4)将引物和DNA样本从-20℃取出后，置于室温平衡30分钟，震荡混匀，离心备用。
所述琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
本发明能够完整检测15个的已知的KIR基因((KIR2DL1,KIR2DL2/L3,KIR2DL4,KIR2DL5A,KIR2DL5B,KIR2DS1,KIR2DS2,KIR2DS3,KIR2DS4,KIR2DS5,KIR3DL1/S1,KIR3DL2,KIR3DL3)和2个KIR假基因,KIR2DP1、KIR3DP1)，并可同时检测两种2DS4和3DP1常见的变异体，其中14个基因同时用两套引物检测，结果可相互核对，提高了准确性和可靠性，操作简单稳定，易判断结果。
附图说明
图1为本发明中的电泳图
图2为本发明中的KIR-SSP分型结果图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
本发明中以下实施例中所用设备和试剂如下：
设备：超净工作台(苏净安泰SW-CJ-2F(D))，PCR仪AB 9700，电泳仪(北京六一DYY6C)，凝胶成像仪(GE ImageQuant 300)。
试剂：KIR分型引物(上海英骏公司合成)，GoTaq Green Master Mix(美国Promega公司)，高纯琼脂糖(美国Invitrogen)。
实施例1：制备快速检测KIR基因的试剂盒
(1)引物的合成：
引物由上海英骏公司合成，序列表如SEQIDNO.1-65所示。
具体序列情况如表1所示：
表1.快速检测KIR基因的引物
本发明中的KIR基因多重PCR-SSP分型检测的试剂盒，包括GoTaq GreenMastermix(Promega，WI，USA)和上述的引物组，所述GoTaq Green Mastermix总量为65ul，。
(2)引物的预处理和制备：
引物稀释前10000g离心30s左右，小心开盖，避免引物干粉飞出。以TE(10mM Tri-HCl，PH8.0，1mM EDTA)将引物稀释到10μM，充分混匀。
单位点引物对配制：每个位点的正反向引物按1:1比例混匀(各200μl，其中2DS1、3DP1有2条正向引物，1条反向引物，其正向引物各取100μl，反向引物取200μl)
多重引物配制：每种单位点引物对取50μl，按表1配制各孔的多重引物，不足3种引物的以dH2O补足150μl；第四孔引物除2DS1外各加40μl，2DS1加入60μl。充分混匀，备用。
表1 引物组合配制表
引物稀释后可在4℃稳定保存2周；长期保存置于-20℃，可分装成小管，尽量避免反复冻融。避免反复冻融，具体做法为可配成多重引物后分装100μl-150μl到排管中存储，使用时以排枪加入96孔板中，也可直接分装到96孔板中保存。每一批引物制备完成后需以已知结果标本验证各孔引物是否有假阳性或假阴性。
2、PCR反应混合液的制备
将SEQIDNO.1-65所示的引物和GoTaq Green Mastermix混合。检测引物2DL1和2DL2组成一组，2DS3和2DP1组成一组，DRB1T、3DS1和3DL1组成一组，3DP1、2DL5和2DS1组成一组，2DL3和2DL4组成一组，2DL3、2DS3和3DS1组成一组，2DS4、3DL1和2DL1组成一组，2DS4和2DS5组成一组，3DL3、2DS5和3DL2组成一组，2DP1和2DS2组成一组，2DS2组成一组，2DL4、3DL2和3DL3组成一组，共组成12组引物组。
检测引物SEQIDNO.1-65的浓度浓度均为10μM。
将上述12组引物和GoTaq Green Mastermix分装后包装，组成试剂盒。
实施例2：样本中KIR基因的定型检测
选取了覆盖16个KIR基因型别的阳性DNA样品。分别加入PCR管中，同时在每管中加入Taq酶。加样完成后将反应混合液混匀，短暂离心，进行PCR反应。
其中，PCR反应体系为：
将引物和DNA样本从-20℃取出后，置于室温平衡30分钟，充分震荡混匀，瞬时离心，根据检测位点按以下体系配制PCR反应体系。
全位点PCR反应体系：将引物分装到96孔板中，每孔2μl引物。每个样本需要12孔(如A1-A12)，每个96孔板可完成8个标本分型(A-H，每行一个标本)。为方便采用窄孔凝胶电泳时以八道移液器加样，可按以下格局对引物分装：引物奇数孔(1、3、5、7、9、11号引物MIX)分别加入96孔板的1-6孔，偶数孔引物加入96孔板的7-12孔。电泳时用八道移液器将1-6孔产物分别加入凝胶的第1、3、5、7、9、11孔中，7-12孔产物加入凝胶偶数孔中电泳。
PCR反应的条件为：
可将待PCR仪温度升到65℃以上后再将PCR板放入仪器。
3、电泳检测
配制3％琼脂糖凝胶：3克琼脂糖加入100ml 0.5×TBE中，煮沸，冷却到65℃后，加入3μl浓度为10mg/ml的EB溶液，混匀，倒胶。
按96孔板上PCR反应的顺序，用排枪间隔上样，即96孔板上每个样本的1、2、3、4、5、6孔对应凝胶上的1、3、5、7、9、11孔；96孔板上每个样本的7、8、9、10、11、12孔对应凝胶上的2、4、6、8、10、12孔。每孔取4μl产物电泳即可。
根据环境温度，100V电压电泳55-65分钟。在凝胶成像仪上用UV观察电泳结果。
4、结果判读
在KIR多重PCR结果格局表中记录电泳条带，判断结果，并记录。
结果判读：根据结果判读格局表，观察电泳图，基因有扩增条带判断为阳性，无对应扩增条带判断为阴性；本方法中除2DS1，3DP1外每个KIR位点都有两组引物扩增，这两组引物的扩增阴性和阳性应当一致，才能判断结果，否则应当重复实验。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表

Claims (10)

1.一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQIDNO.1-65所示的检测引物组成，其中检测引物2DL1和2DL2组成一组，2DS3和2DP1组成一组，DRB1、3DS1和3DL1组成一组，3DP1、2DL5和2DS1组成一组，2DL3和2DL4组成一组，2DL3、2DS3和3DS1组成一组，2DS4、3DL1和2DL1组成一组，2DS4和2DS5组成一组，3DL3、2DS5和3DL2组成一组，2DP1和2DS2组成一组，2DS2组成一组，2DL4、3DL2和3DL3组成一组，共组成12组引物组。
2.一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的试剂盒，其特征在于：包括GoTaq GreenMastermix和权利要求1所述的引物组，所述GoTaq Green Mastermix总量为65ul。
3.根据权利要求2所述的一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的试剂盒，其特征在于：其中用于KIR基因快速分型的引物浓度均为10μM。
4.根据权利要求1中所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取受试者血液或组织的基因组DNA；
(2)引物准备：将引物稀释，经单位点引物对配制和多重引物对配制后备用；
(3)以步骤(1)提取的受试者的基因组DNA为模板，在含检测KIR单特异引物的PCR反应体系中进行PCR扩增；
(4)扩增结束后，将扩增后的样品在琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离，并进行结果判别：基因有扩增条带判断为阳性，无对应扩增条带判断为阴性；并且除2DS1，3DP1外每个KIR位点都有两组引物扩增，这两组引物的扩增阴性和阳性应当一致，不一致时重复实验。
5.根据权利要求4所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述PCR反应程序中反应体系如下：
ddH2O:20μl
DNA:6μl
Promega GoTaq green master mix:65μl
合计：91μl。
6.根据权利要求5所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述DNA的浓度为40ng/μl。
7.根据权利要求4所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述PCR反应程序中反应条件如下：
8.根据权利要求4所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增过程中PCR仪温度升到65℃以上后再将PCR板放入仪器。
9.根据权利要求4所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述引物准备为：
(1)引物稀释：离心28-32s后以TE将引物稀释到10μM，混匀；
(2)单位点引物对配制：每个位点的正反向引物按1:1比例混匀；
(3)多重引物对配制：每种单位点引物对取200μl放入PCR试剂孔中，配制各孔的多重引物，不足3种引物的以dH2O补足600μl；第四孔引物除2DS1外各加150μl，2DS1加入240μl，混匀；
(4)将引物和DNA样本从-20℃取出后，置于室温平衡30分钟，震荡混匀，离心备用。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的一种用于KIR基因的多重PCR-SSP分型检测的引物组合的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的质量浓度为3％。
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