JP6574279B2 - 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法 - Google Patents

改善された造血幹細胞および前駆細胞療法 Download PDF

Info

Publication number
JP6574279B2
JP6574279B2 JP2018031941A JP2018031941A JP6574279B2 JP 6574279 B2 JP6574279 B2 JP 6574279B2 JP 2018031941 A JP2018031941 A JP 2018031941A JP 2018031941 A JP2018031941 A JP 2018031941A JP 6574279 B2 JP6574279 B2 JP 6574279B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
hematopoietic stem
pge
cell population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2018031941A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018104457A (ja
JP2018104457A5 (ja
Inventor
シューメーカー ダニエル
シューメーカー ダニエル
ムルタニ プラティク
ムルタニ プラティク
デスポンツ キャロライン
デスポンツ キャロライン
エル． ロビンス デイビッド
エル． ロビンス デイビッド
グレイソン ポール
グレイソン ポール
メンドレイン ジョン
メンドレイン ジョン
Original Assignee
フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド
フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド, フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド filed Critical フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド
Publication of JP2018104457A publication Critical patent/JP2018104457A/ja
Publication of JP2018104457A5 publication Critical patent/JP2018104457A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6574279B2 publication Critical patent/JP6574279B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes

Description

関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７３，２１２号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
技術分野
本発明は一般に、細胞療法に関する。特に、本発明は、造血系のための細胞療法の改善に関する。より具体的に述べると、本発明は、個体の造血系を再構築するための改善法に関する。
関連技術の説明
再生医療とは、体内の特定の細胞、組織、および臓器を修復するかまたは回復させるための処置を開発する医療研究の分野である。究明されている再生療法の１つの側面は、増え続ける一連のがんおよび変性障害を処置するための造血幹細胞移植の使用である。米国国立骨髄ドナープログラム（登録商標）（ＮＭＤＰ）によれば、致死性の悪性疾患および非悪性疾患を伴う患者を処置するために、毎年世界中で、約２０，０００例の同種異系造血細胞移植を含めた、推定４５，０００〜５０，０００例の造血細胞移植（骨髄移植、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）移植、または臍帯血移植）が実施されている（非特許文献１）。さらに、毎年約４，８００例の患者が、ＮＭＤＰを介する非血縁ドナーまたは臍帯血ユニット（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｕｎｉｔ）を用いて移植を受けている。
１９８７年の創始以来、ＮＭＤＰは、患者に第２の生存チャンスを与えるために、３８，０００例を超える骨髄移植および臍帯血移植を推進してきた。従来は、多様な種類の白血病、貧血、リンパ腫、骨髄腫、免疫不全障害、および充実性腫瘍、例えば、乳がんおよび卵巣がんを患う患者を処置するのに、骨髄からの造血幹細胞移植が用いられた。しかし、骨髄移植は、ドナーにとって苦痛であり、さらに、とりわけ、特定の民族集団において必須の程度のＨＬＡドナー適合組織を見出すことは、しばしば困難であり、かつ時間を要する。加えて、同種異系の骨髄移植は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の著明な発症率と関連することが多い。
多くの場合、造血幹細胞移植を受ける患者は、致死性の進行がんまたは他の代謝性障害を有する。したがって、適切に適合したＨＬＡ組織型を有するドナーを見出すのに遅延が生じると、患者の転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）が損なわれる可能性があり、しばしば致死性をもたらす。したがって、近年、ＮＭＤＰによる非血縁ドナー移植数の増大は、とりわけ劇的であり、２００８年における４，３００例と比較して、２００９年だけでも４，８００例を超える移植がなされている。加えて、非血縁ドナーまたは臍帯血ユニットを用いる同種異系移植の比率も、着実に増大している。２００６年には、世界中で実施された同種異系移植のうちの３分の１超において、非血縁ドナーが用いられた。２００９年には、成人ドナーのうちの７５％（２，８００例を超える）が、ＮＭＤＰを介して患者にＰＢＳＣを提供した。２００９年には、ＮＭＤＰにより１，０５６例の臍帯血移植が推進されたが、これは、２００９年におけるＮＭＤＰによる総移植数のうちの２２％を占める。これは、ＮＭＤＰが８９８例の臍帯血移植を推進した２００８年より１８％の増大である。
臍帯血は容易に入手可能であり、レシピエントに対する移植片対宿主病の危険性が低く、ドナーにとって痛みがなく、ドナーとレシピエントとの間におけるＨＬＡ組織型の適合がそれほど必要とされないために、臍帯血を用いる同種異系の造血幹細胞移植が実施されている。
しかし、臍帯血移植に由来する造血幹細胞および前駆細胞が生着（ｅｎｇｒａｆｔ）しえない危険性を含め、ヒト臍帯血移植を用いることには２〜３の欠点が存在することが認知されている。
臍帯血移植を用いることの別の欠点は、患者において臍帯血細胞が生着するのにより長時間を要し、これにより、患者を感染症の高い危険性に置くことである。加えて、臍帯血移植は、より新規な処置アプローチである。したがって、医療者は、臍帯血移植後における患者の長期にわたる成果について、骨髄移植について有するほど多くの情報を有さないために、臍帯血移植を用いることを思いとどまらせる場合がある。さらに、臍帯血移植はまた、骨髄移植および末梢血移植と全く同じ危険性も有する。
加えて、臍帯血をヒト血液移植のための細胞供給源として用いることに対する著明な障壁は、患者のサイズに対して、または特定の適応を処置するのに、単一の臍帯血ユニット中の血液形成細胞では十分でないことが多いことでもある。単一の臍帯のサイズ（すなわち、単一の臍帯中の血液形成細胞数）は、血液移植に不十分であることが多いため、２つの臍帯が必要とされる場合があり、このことは、ＧＶＨＤおよび生着失敗の危険性を増大させる。したがって、多くの手法が、単離された移植片内における臍帯血中のヒト造血幹細胞および前駆細胞の数を、ｅｘ ｖｉｖｏの環境で増大させようと試みており、これにより、単一の臍帯を用いる移植が可能となる可能性もあるが、これらの努力が収めた成功は限定されたものである。
したがって、部分的には、有望な動物モデルのプロトコールをヒトにおける臨床実践へと移行させるのが困難であること、既存の臨床プロトコールの有効性が低いこと、合併症、例えば、移植片対宿主病の発症率が高いこと、および十分に適合したドナーが比較的少ないことのために、回復または再生のための造血幹細胞療法の見込みは実感されていない。
Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ＭＭ．、「Ｕｓｅｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｌｕｍｅ ＫＧ、Ｆｏｒｍａｎ ＳＪ、Ａｐｐｅｌｂａｕｍ ＦＲ編、「Ｔｈｏｍａｓ’Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、３版、Ｍａｌｄｅｎ、Ｍａｓｓ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ；２００４年：９〜１５頁
したがって、当技術分野では、造血幹細胞移植の適用可能性を拡大し、その成功を増大させるために、造血幹細胞および前駆細胞の骨髄への生着の効率を高めうる方法が必要とされている。本発明は、これらの問題に対する解決法を提供し、当業者に明らかとなる他の使用および利点もさらに提供する。
本発明は、改善された造血幹細胞移植法および前駆細胞移植法を提供する。さらに、本発明は、生着／生着の潜在能を増大させ、かつ／または増殖を増大させた、優れた造血幹細胞または前駆細胞の調製物も提供する。多様な実施形態では、細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増殖させる（ｅｘｐａｎｄｅｄまたはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）。他の多様な実施形態では、細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて処理し、被験体に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増殖させる（ｅｘｐａｎｄｅｄまたはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）。
一態様では、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、ａ）造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、ｂ）造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、ｃ）治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。
具体的な実施形態では、治療用組成物の造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大している。
一実施形態では、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞の収集物を含み、ＣＤ３４＋細胞の収集物におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、ＣＤ３４＋細胞の接触していない収集物と比較して少なくとも約３倍増大している。
別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して約３倍〜約８倍増大している。
治療用組成物のなお別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約４倍増大している。
治療用組成物のなお別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約６倍増大している。治療用組成物のさらに別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約７倍増大している。
治療用組成物の別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約８倍増大している。治療用組成物のなお別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１０倍増大している。
本発明のさらに別の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１２倍増大している。
本発明の付加的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１６倍増大している。
一部の実施形態では、治療用組成物を構成する造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して約８〜約１８倍増大している。
本発明の多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が、ｃＡＭＰエンハンサー、Ｇα−ｓ活性化因子、およびＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される。
具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が、ＰＧＥ２、またはＰＧＥ２類似体もしくはＰＧＥ２誘導体である。より具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
本発明の治療用組成物の一実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、少なくとも約１時間にわたり薬剤と接触させている。多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約１時間〜約６時間にわたり薬剤と接触させている。具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約２時間〜約６時間にわたり薬剤と接触させている。より具体的な実施形態では、治療用組成物に含まれる造血幹細胞または前駆細胞を、約２時間にわたり薬剤と接触させている。
本発明の具体的な実施形態では、治療用組成物に含まれる造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される。
より具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している。より具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している。
多様な実施形態では、治療用組成物に含まれる細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む。
一部の実施形態では、細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない。
多様な実施形態では、治療用組成物を、細胞集団を培養せずにポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）で生成させ、患者に投与する。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して２４時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して１２時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与して６時間以内に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、組成物の注入日に生成させる。
一部の実施形態では、治療用組成物が、薬剤を実質的に含まない。多様な実施形態では、治療用組成物が、５％ヒト血清アルブミンおよびデキストランの溶液中に懸濁させた造血幹細胞または前駆細胞を含む。
一部の実施形態では、治療用組成物が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の間葉系幹細胞を含む。具体的な実施形態では、治療用組成物が、約１０％以下の間葉系幹細胞を含む。
一部の実施形態では、治療用組成物が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の内皮前駆細胞を含む。具体的な実施形態では、治療用組成物が、約１０％以下の内皮前駆細胞を含む。
本発明の具体的な実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性である細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の、ＣＤ７３、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４、およびＶＷＦからなる群より選択される細胞表面マーカーについて陽性である細胞を含む。
具体的な実施形態では、本発明の治療用組成物に含まれる細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＶＷＦ＋細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含む。
より具体的な実施形態では、細胞集団が、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の、ＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞、ＶＷＦ＋細胞、ＣＤ７３＋細胞、およびＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性であり、ＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３、およびＣＤ１４０Ｂからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーについて陰性である。他の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性であり、細胞表面マーカーのＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３、およびＣＤ１４０Ｂについて陰性である。
本発明の多様な実施形態では、細胞集団内の細胞のうちの少なくとも約１５％が、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する。
一部の実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）から得られる。
具体的な実施形態では、細胞集団がＨＬＡハプロタイピング（ＨＬＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｄ）されている。より具体的な実施形態では、細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきＨＬＡハプロタイピングされている。一部の実施形態では、ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する。一部の実施形態では、ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する。
別の実施形態では、本発明が、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、ａ）造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で約２時間にわたり、１６，１６−ｄｍＰＧＥ２と接触しており、ｂ）造血幹細胞または前駆細胞が、ＣＤ３４＋細胞の収集物を含み、ＣＤ３４＋細胞の収集物におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していないＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大しており、ｃ）治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。
一部の実施形態では、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞の収集物を含み、ＣＤ３４＋細胞の収集物におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していないＣＤ３４＋細胞の収集物と比較して少なくとも約３倍増大している。
多様な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して約３倍〜約８倍増大している。より具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約４倍増大している。
他の具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約６倍増大している。他の具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約７倍増大している。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約８倍増大している。他の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１０倍増大している。他の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１２倍増大している。他の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約１６倍増大している。他の実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して約８〜約１８倍増大している。
一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される。
他の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している。
具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している。
他の実施形態では、細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％を超えるＣＤ３４＋細胞を含まない。より具体的な実施形態では、細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む。
多様な実施形態では、細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない。
具体的な実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる。
一部の実施形態では、細胞集団がＨＬＡハプロタイピングされている。
別の実施形態では、本発明は、少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含むハプロタイピングされている細胞集団を含む治療用組成物であって、ａ）造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、ｂ）造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、ｃ）治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、治療用組成物を提供する。
具体的な実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている。より具体的な実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＤＰＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている。一部の実施形態では、ハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する。多様な実施形態では、ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する。
一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大している。具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現と比較して約３倍〜約８倍増大している。他の具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約４倍増大している。
具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、Ｇα−ｓ活性化因子、およびＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される。より具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約１時間〜約６時間にわたり薬剤と接触させている。
一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される。
具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している。
他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している。他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約４倍増大している。他の実施形態では、シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約６倍増大している。
なお他の実施形態では、細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む。
より具体的な実施形態では、細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む。
一部の実施形態では、細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない。
他の実施形態では、治療用組成物を、細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約２４時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約１２時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、患者に組成物を投与する約６時間前より後に生成させる。一部の実施形態では、治療用組成物を、組成物の注入日に生成させる。
他の実施形態では、治療用組成物に含まれる細胞集団を、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得る。
別の実施形態では、本発明が、部分的に、造血幹細胞移植または前駆細胞移植において用いられる治療用組成物を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、約３７℃の温度で、造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現を改変するのに十分な条件下で接触させるステップを含み、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して、以下の遺伝子：ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１または複数の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーを含む造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらす、方法を意図する。
別の実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞または前駆細胞の生着を増大させる方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、ＰＧＥ２およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させる、方法を意図する。
一実施形態では、本発明が、部分的に、造血系再構築（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を必要とする被験体を処置する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、ＰＧＥ２およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、細胞集団を、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法を意図する。
付加的な実施形態では、本発明が、部分的に、造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法であって、造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を洗浄して薬剤を実質的に除去するステップと、接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含み、被験体における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする被験体を処置する、方法を意図する。
さらなる実施形態では、本発明が、部分的に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップを含み、ｉｎ ｖｉｖｏにおける接触させた造血幹細胞または前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、細胞集団を薬剤と接触させる、方法を意図する。
本発明の方法の具体的な実施形態では、細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる。
本発明の他の具体的な実施形態では、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、ｄｍＰＧＥ２、ｃＡＭＰ類似体もしくはｃＡＭＰエンハンサー、またはＧα−ｓ活性化因子である。
特定の実施形態では、薬剤がＰＧＥ２またはその類似体である。
特定の具体的な実施形態では、ＰＧＥ２類似体が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
他の具体的な実施形態では、薬剤がｃＡＭＰエンハンサーである。
本発明の特定の実施形態では、接触させた造血幹細胞または前駆細胞集団の遺伝子発現を改変する、生着または生着の潜在能を増大させる、または増殖を増大させるのに十分な条件が、細胞集団を、約１時間〜約６時間にわたり、１または複数の薬剤と接触させることを含み、薬剤のうちの少なくとも１つが、造血幹細胞または前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４のシグナル伝達を増大させる薬剤を含む。特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、約３７℃の温度で、約２時間にわたり、約１０μＭの濃度の、造血幹細胞または前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４のシグナル伝達を増大させる薬剤と接触させる。
他の実施形態では、造血幹細胞集団または前駆細胞集団を、約１０μＭ以上の濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と、約１時間〜約６時間にわたり接触させる。
付加的な実施形態では、細胞集団を、約１０μＭの濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と、約２時間にわたり接触させる。
具体的な実施形態では、細胞集団における接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着の潜在能の増大は、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較したときの、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１または複数の遺伝子発現の増大、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較したときの自己再生能の増大、および、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して細胞生存度の実質的な低下がないことを含む。
本発明の一部の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、ここで、この容器は、容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する。
造血幹細胞移植または前駆細胞移植のための細胞集団を調製するための方法、および造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製するための方法を含め、本発明のこれらの方法を含めた本発明の特定の実施形態では、接触させた細胞集団を、細胞療法を必要とする被験体など、それを必要とする被験体に投与するが、本発明の方法は、接触させた細胞集団を、それを必要とする被験体に投与するステップをさらに含む。
特定の具体的な実施形態では、被験体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症（ａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｓｉｓ）／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー（ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｍａｊｏｒ）、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、充実性腫瘍、慢性肉芽腫症、ムコ多糖症、またはダイアモンドブラックファン貧血を有する。
特定の他の具体的な実施形態では、被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する。
他の特定の実施形態では、被験体に、骨髄除去的化学療法（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）もしくは骨髄除去的放射線療法（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｂｌａｔｉｖｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、または非骨髄破壊的化学療法（ｎｏｎ−ｍｙｅｏｌａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）もしくは非骨髄破壊的放射線療法（ｎｏｎ−ｍｙｅｏｌａｂｌａｔｉｖｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を施している。
さらなる実施形態では、被験体が骨髄ドナーである。
具体的な実施形態では、細胞集団が、１または複数の臍帯血ユニットを含む。特定の実施形態では、被験体に、１または複数の臍帯血ユニットを投与する。他の実施形態では、被験体に、部分臍帯血ユニットを投与する。他の具体的な実施形態では、被験体に、１臍帯血ユニットを投与する。
他の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、被験体と同体（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）である。
特定の実施形態では、細胞集団が、被験体の末梢血または骨髄から動員される。
さらなる実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団が、被験体に対して同種異系である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、
ａ）上記造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、上記細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、
ｂ）上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、
ｃ）上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
（項目２）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大している、項目１に記載の治療用組成物。
（項目３）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、Ｇα−ｓ活性化因子、およびＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される、項目１に記載の治療用組成物。
（項目４）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、ＰＧＥ２、またはＰＧＥ２類似体もしくはＰＧＥ２誘導体である、項目１に記載の治療用組成物。
（項目５）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目１に記載の治療用組成物。
（項目６）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、少なくとも約１時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目１に記載の治療用組成物。
（項目７）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約１時間〜約６時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目１に記載の治療用組成物。
（項目８）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約２時間〜約６時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目１に記載の治療用組成物。
（項目９）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約２時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１０）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１１）
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している、項目１０に記載の治療用組成物。
（項目１２）
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している、項目１０に記載の治療用組成物。
（項目１３）
上記細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１４）
上記細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１５）
上記細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１６）
上記細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１７）
上記薬剤を実質的に含まない、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１８）
上記細胞集団が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の間葉系幹細胞を含む、項目１に記載の治療用組成物。
（項目１９）
上記細胞集団が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の内皮前駆細胞を含む、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２０）
上記細胞集団内の細胞のうちの少なくとも約１５％が、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２１）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２２）
上記細胞集団がＨＬＡハプロタイピングされている、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２３）
上記細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきＨＬＡハプロタイピングされている、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２４）
上記ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２５）
上記ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する、項目１に記載の治療用組成物。
（項目２６）
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を含む治療用組成物であって、
ａ）上記造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で約２時間にわたり、１６，１６−ｄｍＰＧＥ２と接触しており、
ｂ）上記造血幹細胞または前駆細胞が、ＣＤ３４＋細胞の収集物を含み、上記ＣＤ３４＋細胞の収集物におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していないＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大しており、
ｃ）上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
（項目２７）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目２８）
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目２９）
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３０）
上記細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３１）
上記細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３２）
上記細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３３）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３４）
上記細胞集団がＨＬＡハプロタイピングされている、項目２６に記載の治療用組成物。
（項目３５）
少なくとも約百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含むハプロタイピングされている細胞集団を含む治療用組成物であって、
ａ）上記造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、上記細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触しており、
ｂ）上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、
ｃ）上記治療用組成物が、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の、無菌で治療的に許容される懸濁液を含む、
治療用組成物。
（項目３６）
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目３７）
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＤＰＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目３８）
上記ハプロタイピングされている細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目３９）
上記ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する、項目３７に記載の治療用組成物。
（項目４０）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも約３倍増大している、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４１）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、Ｇα−ｓ活性化因子、およびＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的に結合する化合物からなる群より選択される、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４２）
上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる上記薬剤が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４３）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、約１時間〜約６時間にわたり上記薬剤と接触していた、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４４）
上記造血幹細胞または前駆細胞が、遺伝子発現シグネチャーを含み、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大しており、上記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４５）
上記シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つの発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５、１０、１５、または２０倍増大している、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４６）
上記シグネチャー遺伝子の各々の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における上記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも約２倍増大している、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４７）
上記細胞集団が、約０．１０、０．５０、１．０、３、５、１０、１５、２０、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４８）
上記細胞集団が、少なくとも約０．０１％かつ約５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目４９）
上記細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏにおいて増殖させない、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目５０）
上記細胞集団を培養せずにポイントオブケアで生成させ、患者に投与する、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目５１）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目３５に記載の治療用組成物。
（項目５２）
治療用組成物を調製する方法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、１または複数の薬剤と、約３７℃の温度で、上記造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現を改変するのに十分な条件下で接触させ、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較して、以下の遺伝子：ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１または複数の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーを含む造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらすステップを含む、方法。
（項目５３）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
上記１または複数の薬剤のうちの少なくとも１つが、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４のシグナル伝達を増大させる、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
上記１または複数の薬剤のうちの少なくとも１つが、ｃＡＭＰエンハンサー、Ｇα−ｓ活性化因子、およびＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的に結合する薬剤からなる群より選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
上記１または複数の薬剤が、ＰＧＥ２またはその類似体を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５７）
上記ＰＧＥ２類似体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
上記造血幹細胞または前駆細胞の上記遺伝子発現を改変するのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、約１時間〜約６時間にわたり、上記１または複数の薬剤と接触させることを含み、上記薬剤のうちの少なくとも１つが、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４のシグナル伝達を増大させる薬剤を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５９）
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約３７℃の温度で、約２時間にわたり、約１０μＭの濃度の、上記造血幹細胞または前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４のシグナル伝達を増大させる上記薬剤と接触させる、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
上記治療用組成物が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目５２に記載の方法。
（項目６１）
上記治療用組成物を、細胞療法を必要とする被験体に投与する、項目５２に記載の方法。
（項目６２）
上記被験体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、充実性腫瘍、慢性肉芽腫症、ムコ多糖症、またはダイアモンドブラックファン貧血を有する、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
上記被験体が骨髄ドナーである、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
被験体における造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させる方法であって、
（ａ）造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）上記細胞集団を洗浄して上記薬剤を実質的に除去するステップと、
（ｃ）上記細胞集団を被験体に投与するステップと
を含み、
上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
（項目６７）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
上記薬剤がＰＧＥ２またはその類似体である、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
上記ＰＧＥ２類似体が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
生着を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
（ａ）約１０μＭ以上の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、
（ｂ）約１時間〜約６時間にわたり
接触させることを含む、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、約２時間にわたり接触させる、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１または複数の遺伝子発現の増大を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において上記１または複数の薬剤と接触し、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目５２または６６に記載の方法。
（項目７４）
上記細胞集団が、１または複数の臍帯血ユニットを含む、項目６６に記載の方法。
（項目７５）
上記被験体に、１または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
上記被験体に、１臍帯血ユニットまたは部分臍帯血ユニットを投与する、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
上記被験体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目６６に記載の方法。
（項目７８）
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目６６に記載の方法。
（項目７９）
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目６６に記載の方法。
（項目８０）
上記被験体が骨髄ドナーである、項目６６に記載の方法。
（項目８１）
上記細胞集団が、上記被験体と同体である、項目６６に記載の方法。
（項目８２）
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目６６に記載の方法。
（項目８４）
造血系再構築を必要とする被験体を処置する方法であって、
（ａ）造血系再構築を必要とする被験体を選択するステップと、
（ｂ）造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）上記細胞集団を洗浄して上記薬剤を実質的に除去するステップと、
（ｄ）上記細胞集団を上記被験体に投与するステップと
を含み、
上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させ、これにより、造血系再構築を必要とする上記被験体を処置する、方法。
（項目８５）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
上記薬剤がＰＧＥ２またはその類似体である、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
上記ＰＧＥ２類似体が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目８４に記載の方法。
（項目８８）
上記生着を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
（ａ）約１０μＭ以上の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、
（ｂ）約１時間〜約６時間にわたり
接触させることを含む、項目８４に記載の方法。
（項目８９）
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、約２時間にわたり接触させる、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、またはＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１または複数の遺伝子発現の増大を含み、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して自己再生能の増大を含み、かつ、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して細胞生存度の実質的な低下を含まない、項目８４に記載の方法。
（項目９１）
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目８４に記載の方法。
（項目９２）
上記細胞集団が、１または複数の臍帯血ユニットを含む、項目８４に記載の方法。
（項目９３）
上記被験体に、部分臍帯血ユニットまたは１または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
上記被験体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目８４に記載の方法。
（項目９５）
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目８４に記載の方法。
（項目９６）
上記被験体が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目８４に記載の方法。
（項目９７）
上記被験体が骨髄ドナーである、項目８４に記載の方法。
（項目９８）
上記細胞集団が、上記被験体と同体である項目８４に記載の方法。
（項目９９）
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目８４に記載の方法。
（項目１０１）
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるための細胞集団を調製する方法であって、造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップを含み、ｉｎ ｖｉｖｏにおける上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
（項目１０２）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
上記薬剤がＰＧＥ２またはその類似体である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
上記ＰＧＥ２類似体が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０５）
上記薬剤がｃＡＭＰエンハンサーである、項目１０１に記載の方法。
（項目１０６）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける上記造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
（ａ）約１０μＭ以上の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、
（ｂ）約１時間〜約６時間にわたり
接触させることを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０７）
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、約２時間にわたり接触させる、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目１０６に記載の方法。
（項目１０９）
上記細胞集団を、細胞療法を必要とする被験体に投与する、項目１０６に記載の方法。
（項目１１０）
ｉｎ ｖｉｖｏの被験体における造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させる方法であって、
（ａ）造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、
（ｂ）上記細胞集団を被験体に投与するステップと
を含み、
ｉｎ ｖｉｖｏの上記被験体における上記接触させた造血幹細胞および前駆細胞の増殖を、接触していない造血幹細胞および前駆細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、上記細胞集団を上記薬剤と接触させる、方法。
（項目１１１）
上記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
上記薬剤がＰＧＥ２またはその類似体である、項目１１０に記載の方法。
（項目１１３）
上記ＰＧＥ２類似体が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、項目１１０に記載の方法。
（項目１１４）
上記薬剤がｃＡＭＰエンハンサーである、項目１１０に記載の方法。
（項目１１５）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける上記造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに十分な上記条件が、上記造血幹細胞および前駆細胞を、
（ａ）約１０μＭ以上の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、
（ｂ）約１時間〜約６時間にわたり
接触させることを含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１６）
上記造血幹細胞および前駆細胞を、約１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度で、約２時間にわたり接触させる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
上記細胞集団が、内毒素を含まない容器において調製され、上記容器が、上記容器の温度を示す信号をもたらす、少なくとも１つの温度計を備える温度表示デバイスと、少なくとも１つの経過時間表示器を備える経過時間表示デバイスとを備え、上記容器が、細胞の保存、細胞の処理、細胞の洗浄、および細胞の注入に適する、項目１１０に記載の方法。
（項目１１８）
上記細胞集団が、１または複数の臍帯血ユニットを含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１９）
上記被験体に、１または複数の臍帯血ユニットを投与する、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
上記被験体に、１臍帯血ユニットまたは部分臍帯血ユニットを投与する、項目１１８に記載の方法。
（項目１２１）
上記被験体が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有する、項目１１０に記載の方法。
（項目１２２）
上記被験体が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有する、項目１１０に記載の方法。
（項目１２３）
上記患者が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けた、項目１１０に記載の方法。
（項目１２４）
上記被験体が骨髄ドナーである、項目１１０に記載の方法。
（項目１２５）
上記細胞集団が、上記被験体と同体である項目１１０に記載の方法。
（項目１２６）
上記細胞集団が、上記被験体の末梢血または骨髄から動員される、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
上記細胞集団が、上記被験体に対して同種異系である、項目１１０に記載の方法。
図１は、造血幹細胞および前駆細胞に存在するプロスタグランジンＥ２受容体２／受容体４によるＧタンパク質結合型受容体細胞シグナル伝達経路についての概略図を示す。 図２は、異なるセットの実験条件下において１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した、精製されたＣＤ３４＋細胞集団またはヒト臍帯血の解析についての実験フローチャートを示す。 図３は、異なるセットの実験条件下において１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞でのｃＡＭＰアッセイについての結果を示す。 図４は、ｘ軸におけるビヒクルで処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現データを、ｙ軸における１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現データと対比させる散布図（ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）である。ビヒクルで処理した細胞と比較して、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞においては、ＣＲＥＭの発現が８倍増大し、ＣＸＣＲ４の発現が１８倍増大することが注目される。 図５は、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現における処理時間の解析についての実験フローチャートを示す。 図６は、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で５、１５、３０、６０、および１２０分間の処理時間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。遺伝子発現プロファイルは、１２０分間のインキュベーション期間の後に得た。 図７は、３７℃、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、または１００μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。 図８は、３７℃、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ、または５０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理した、臍帯血から精製されたＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。 図９は、３７℃（左パネル）または４℃（右上パネル）または２５℃（右下パネル）、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で６０分間（上パネル）または１２０分間（下パネル）にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させる遺伝子発現プロファイルを示す。 図１０は、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたＣＤ３４＋細胞が、ビヒクルで処理した細胞、または４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理した細胞と比較して細胞生存度を低下させないことを示す。 図１１は、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたＣＤ３４＋細胞が、ビヒクルで処理した細胞、または４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理した細胞と比較して、細胞がコロニー形成単位を形成する能力を低下させないことを示す。顆粒球−単球のコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球のコロニー形成単位（ＣＦＵ− Ｅ）、赤芽球バースト形成単位（ｂｕｒｓｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）（ＢＦＵ−Ｅ）、多系統のコロニー形成単位ミックス（ＣＦＵ−ＧＭ／Ｍ／Ｅｏｓｉ）。 図１２は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したヒト臍帯血を用いる臨床試験の概略図である。 図１３は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による処理プロトコールのゲノム全体の発現解析を示す。図１３Ａは、４℃で１時間にわたり処理した細胞における遺伝子発現を示す。細胞は、ＤＭＳＯ対照（Ｎ＝３）と比較される、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｙ軸、Ｎ＝３）で処理した。図１３Ｂは、３７℃で２時間にわたり処理した細胞における遺伝子発現を示す。細胞は、ＤＭＳＯ対照（Ｎ＝３）と比較される、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｙ軸、Ｎ＝３）で処理した。 図１４は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いる３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図１４Ａは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＲＰＣ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＦＧＦ９、ＧＮＡＬ、ＧＵＬＰ１、ＬＲＩＧ２、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＬＡＴ（１）、ＰＬＡＴ（２）、ＳＳＴＲ１、ＳＹＴ４、およびＴＭＣＣ３は、発現挙動が思わしくなく、図１４Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルＢに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＴＲ１、およびＱＡＲＳを用いた。図１４Ｃは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。 図１４は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いる３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図１４Ａは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＲＰＣ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＦＧＦ９、ＧＮＡＬ、ＧＵＬＰ１、ＬＲＩＧ２、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＬＡＴ（１）、ＰＬＡＴ（２）、ＳＳＴＲ１、ＳＹＴ４、およびＴＭＣＣ３は、発現挙動が思わしくなく、図１４Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルＢに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＴＲ１、およびＱＡＲＳを用いた。図１４Ｃは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。 図１４は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いる３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２によるインキュベーションで処理した細胞についての遺伝子発現解析検証研究を示す。図１４Ａは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における選択された遺伝子群の遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＲＰＣ２、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＦＧＦ９、ＧＮＡＬ、ＧＵＬＰ１、ＬＲＩＧ２、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＬＡＴ（１）、ＰＬＡＴ（２）、ＳＳＴＲ１、ＳＹＴ４、およびＴＭＣＣ３は、発現挙動が思わしくなく、図１４Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。パネルＢに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＴＲ１、およびＱＡＲＳを用いた。図１４Ｃは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で０、２０、４０、６０、８０、１２０、１８０、および２４０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。図１４のための全ての遺伝子発現プロファイルは、指定された時間にわたる細胞の処理後において、処理後におけるさらなる細胞のインキュベーションを伴わずに得た。 図１５は、完全な生物学的効果を駆動するのに十分な、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２のパルス処理で処理した細胞、またはＤＭＳＯで処理した細胞を示す。ＣＤ３４＋細胞を、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、示される通りの異なる時間（０、２０、４０、８０、および１２０分間）にわたりインキュベートした後、全インキュベーション時間が１２０分間となるように、３７℃で１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を伴わない回復時間を置いた。データは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いて解析した。図１５Ａおよび１５Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで５、１５、３０、６０、および１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＣＤＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＴＧＥＲ２、ＲＧＳ２、およびＹＰＥＬ４は、発現挙動が思わしくなく、図１５Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図１５Ｂに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＧ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。遺伝子発現プロファイルは、１２０分間のインキュベーション期間後に得た。 図１５は、完全な生物学的効果を駆動するのに十分な、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２のパルス処理で処理した細胞、またはＤＭＳＯで処理した細胞を示す。ＣＤ３４＋細胞を、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、示される通りの異なる時間（０、２０、４０、８０、および１２０分間）にわたりインキュベートした後、全インキュベーション時間が１２０分間となるように、３７℃で１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を伴わない回復時間を置いた。データは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いて解析した。図１５Ａおよび１５Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで５、１５、３０、６０、および１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＣＤＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＴＧＥＲ２、ＲＧＳ２、およびＹＰＥＬ４は、発現挙動が思わしくなく、図１５Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図１５Ｂに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＧ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。遺伝子発現プロファイルは、１２０分間のインキュベーション期間後に得た。 図１６は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の濃度またはＤＭＳＯによる処理の、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いる遺伝子発現に対する効果を示す。図１６Ａおよび１６Ｂは、３７℃、０、０．１、１、１０、５０、および１００μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＣＤＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＦＧＦＲ１、ＦＬＪ２７３５２、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＤＧ３Ｂ、およびＹＰＥＬ４は発現挙動が思わしくなく、図１６Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図１６Ｂに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。 図１６は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の濃度またはＤＭＳＯによる処理の、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現プラットフォームを用いる遺伝子発現に対する効果を示す。図１６Ａおよび１６Ｂは、３７℃、０、０．１、１、１０、５０、および１００μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子の平均遺伝子発現を、ビヒクルで処理した対照と比較して示す。以下の遺伝子：ＡＣＤＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＦＧＦＲ１、ＦＬＪ２７３５２、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＤＧ３Ｂ、およびＹＰＥＬ４は発現挙動が思わしくなく、図１６Ｂに示される平均遺伝子発現の決定からは除外した。図１６Ｂに示される平均遺伝子発現の決定における正規化のために、以下のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。 図１７は、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理した細胞についての遺伝子発現解析を、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較して示す。図１７Ａは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理した全臍帯血細胞についてのゲノム全体の発現解析を、ＤＭＳＯで処理した臍帯血細胞と比較して示す。図１７Ｂは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理したＬｉｎ＋ＣＤ３４＋細胞についてのゲノム全体の発現解析を、ＤＭＳＯで処理したＬｉｎ（＋）ＣＤ３４＋細胞と比較して示す。図１７Ｃは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理したＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞についてのゲノム全体の発現解析を、ＤＭＳＯで処理したＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞と比較して示す。図１７Ｄは、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理したＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋細胞についてのゲノム全体の発現解析を、ＤＭＳＯで処理したＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋細胞と比較して示す。 図１８は、異なる温度、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ａは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図１８Ｂは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ｃは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４を発現する細胞の百分率を示す。 図１８は、異なる温度、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ａは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図１８Ｂは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ｃは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４を発現する細胞の百分率を示す。 図１８は、異なる温度、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で異なる長さの時間にわたり処理した細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ａは、この実験系列で比較した実験条件を示す。図１８Ｂは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１８Ｃは、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで１時間にわたり処理した細胞、および３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり処理した細胞の、処理の１、６、および２４時間後の細胞表面におけるＣＸＣＲ４を発現する細胞の百分率を示す。 図１９は、表示される温度、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で表示される時間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞についての生存度解析および増殖解析を示す。次いで、処理した細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＦＵ−Ｓアッセイを用いて解析した。図１９Ａは、３７℃におけるインキュベーションにより、造血前駆細胞数が増大することを示す。図１９Ｂは、４℃、２５℃、および３７℃、多様な濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたヒト全臍帯血細胞についての細胞生存度データを示す。図１９Ｃは、４℃および３７℃、多様な濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたヒトＣＤ３４＋細胞についての細胞生存度データを示す。図１９Ｄは、３７℃、ｄｍＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞におけるＣＦＵ−Ｃコロニー形成の増大を、４℃、ＤＭＳＯまたはｄｍＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞と比較して示す。 図１９は、表示される温度、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で表示される時間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞についての生存度解析および増殖解析を示す。次いで、処理した細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＦＵ−Ｓアッセイを用いて解析した。図１９Ａは、３７℃におけるインキュベーションにより、造血前駆細胞数が増大することを示す。図１９Ｂは、４℃、２５℃、および３７℃、多様な濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたヒト全臍帯血細胞についての細胞生存度データを示す。図１９Ｃは、４℃および３７℃、多様な濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に１２０分間にわたりインキュベートしたヒトＣＤ３４＋細胞についての細胞生存度データを示す。図１９Ｄは、３７℃、ｄｍＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞におけるＣＦＵ−Ｃコロニー形成の増大を、４℃、ＤＭＳＯまたはｄｍＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞と比較して示す。 図２０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける走化性機能アッセイについての実験フローチャートを示す。ＣＤ３４＋細胞を、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯ対照で４時間にわたり処理し、次いで、４時間にわたり０〜５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ１αの存在下の遊走ウェルアッセイへと移した。 図２１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける走化性機能アッセイについての代表的なデータを示す。ＣＤ３４＋細胞を、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯ対照で４時間にわたり処理し、次いで、４時間にわたり０〜５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ１αの存在下の遊走ウェルアッセイへと移した。 図２２Ａは、４℃、２５℃、または３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比して示す。図２２Ｂは、細胞における、図２２Ａで例示される発現解析に由来するシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化（ａｖｅｒａｇｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を提示する。 図２２Ａは、４℃、２５℃、または３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比して示す。図２２Ｂは、細胞における、図２２Ａで例示される発現解析に由来するシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化（ａｖｅｒａｇｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を提示する。 図２３Ａは、３７℃、１０μＭのｄｍＰＧＥ２またはフォルスコリンで１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させて示す。図２３Ｂ（上パネル）は、ｄｍＰＧＥ２またはフォルスコリンで処理した細胞における、図２３Ａで例示されるシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化を示す。図２３Ｂ（下パネル）は、３７℃、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰで１２０分間にわたり処理するか、または３７℃、１ｍＭのｄｍＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞におけるシグネチャー遺伝子のサブセットについての、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ｑＰＣＲによる平均倍変化を示す。 図２３Ａは、３７℃、１０μＭのｄｍＰＧＥ２またはフォルスコリンで１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞（ｙ軸）についてのゲノム全体の発現解析を、ビヒクルで処理した細胞（ｘ軸）と対比させて示す。図２３Ｂ（上パネル）は、ｄｍＰＧＥ２またはフォルスコリンで処理した細胞における、図２３Ａで例示されるシグネチャー遺伝子のサブセットについての平均倍変化を示す。図２３Ｂ（下パネル）は、３７℃、１ｍＭのｄｂｃＡＭＰで１２０分間にわたり処理するか、または３７℃、１ｍＭのｄｍＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞におけるシグネチャー遺伝子のサブセットについての、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ｑＰＣＲによる平均倍変化を示す。 図２４は、本発明の治療用組成物を用いてマウスにおける造血細胞移植を実施するための実験戦略を示す。
Ａ．序説
本発明は、治療用組成物および造血幹細胞移植または前駆細胞移植の有効性を改善し、再生細胞療法の分野における医療従事者が直面する多面的な難題に取り組む方法を提供する。本発明者らは、幹細胞移植において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の有効性を増大させる方法を開発するために、プロスタグランジン経路を刺激し、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現および細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現を上方制御する薬剤を含めた、細胞の遺伝子発現を改変する薬剤で処理した造血幹細胞集団および前駆細胞集団についての複数の生物学的パラメータを解析した。移植時における被験体の造血系を再構築するときの細胞集団の有効性は、細胞集団が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨髄にホーミングおよび生着し、自己再生し、増殖する能力などの特性に依存する。本発明は、細胞集団を調節して、このような細胞特性を改善し、結果としてもたらされる、造血再構築における治療的改善をもたらす方法を提供する。
特に、本発明は、増強されたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む治療用組成物、および増強された治療用組成物を作製し、幹細胞移植においてこれを用いる方法を提供する。本発明の治療用組成物は、移植療法において細胞集団を用いる前に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて細胞集団の治療的特性を増強するように改変されたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む。治療用組成物の改変された細胞は、骨髄にホーミングおよび生着する能力の増大を実証し、加えて、改善された細胞生存度および自己再生能を保有する。
細胞の生着能およびホーミング能を含めた、治療用組成物の造血幹細胞および前駆細胞の治療的特性は、細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、細胞における、ＣＸＣＲ４を含めた、細胞のホーミングおよび生着と関連すると考えられる遺伝子の発現を改変する薬剤で処理した方法を介して増大させる。したがって、本発明の方法は、細胞移植時において最も有益な治療効果を達成するための、治療用組成物に含まれる細胞を予備刺激する（ｐｒｉｍｅ）。本発明の方法では、治療用組成物の造血幹細胞または前駆細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ホーミング、生着、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞集団の増殖など、細胞の有益な生物学的特性と関連する遺伝子の発現を結果として増大させる、生理学的に適切な温度で、薬剤により処理する。増強された造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物は、以下で記載される例において、ホーミング、生着、および増殖の利点を有することが実証される。
したがって、治療用組成物は、採取された血液細胞、および、明確のために述べると、臍帯血を含めた血液細胞の生着の潜在能を改善する方法、ならびに移植された造血細胞におけるホーミング、生存度、および自己再生を増大させる方法を提供する。加えて、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて造血幹細胞および前駆細胞を増殖させる方法も提供する。本発明で記載される治療用組成物および方法は、臍帯血移植における部分臍帯ユニットまたは単一の臍帯ユニットの使用を可能としうる。
移植の前に造血幹細胞を操作するための注意についての最新の基準では、移植時における細胞生存度および生着の成功を最大化するために、４℃における厳密な温度制御が必要とされている。本発明は、細胞生存度の低下および薬剤半減期の短縮と関連すると考えられている条件下で、造血幹細胞および前駆細胞におけるプロスタグランジンによる細胞シグナル伝達経路を刺激すること（３７℃で２時間の期間にわたる細胞の操作など）により、予測外にも、細胞生存度に負の影響を及ぼすことなく、細胞が骨髄にホーミングする能力の増大、自己再生の増大、および幹細胞／前駆細胞の生着の潜在能の増大が結果としてもたらされることを実証する。より具体的に述べると、本発明者らは、完全な生物学的効果を達成するには、体温など、生理学的に適切な温度においてＰＧＥ２活性を及ぼす処理薬剤での、造血幹細胞および前駆細胞の曝露の延長（少なくとも１時間にわたる）が必要とされることを発見した。とりわけ、短い持続時間にわたり、生理学的に適切な温度で造血幹細胞または前駆細胞を処理する結果、ｃＡＭＰの生成の増大はもたらされるが、細胞のホーミングおよび生着と関連すると考えられている遺伝子の発現の増大はもたらされないことは予測外である。遺伝子発現の増大を達成するには、生理学的に適切な温度でのより長い細胞の処理が必要とされ、これは、細胞のホーミングおよび生着を増大させる所望の生物学的効果を達成するのに必要であることが、本発明により実証される。任意の任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本明細書で記載される方法は、被験体への投与の際に造血幹細胞および前駆細胞の増殖および生着の潜在能の増大を結果としてもたらす。
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、多様な細胞型における多数の異なるプロスタグランジン受容体に作用し、限定なしに述べると、ＰＩ３−キナーゼ（ＰＩ３−ＫまたはＰＩ３Ｋ）経路を含めた、多様なシグナル伝達経路を活性化させることにより、その機能を果たす。これらのプロスタグランジン受容体は、Ｇタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）と称する細胞表面７回膜貫通型受容体のサブファミリーを代表する。４つのサブタイプのプロスタグランジンＥ２受容体、ＰＧＥ２Ｒ１、ＰＧＥ２Ｒ２、ＰＧＥ２Ｒ３、およびＰＧＥ２Ｒ４が存在する。プロスタグランジンまたはその類似体、例えば、ＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４アゴニストなど、適切なリガンドまたはアゴニストにより活性化されると、これらのプロスタグランジン受容体は、多様な下流の生物学的機能を開始する。例えば、造血幹細胞および前駆細胞におけるＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４による細胞シグナル伝達の刺激／活性化は、部分的に、Ｇタンパク質アルファ−ｓ（またはＧα−ｓ）の活性化およびアデニル酸シクラーゼの刺激と共役している。
アデニリルシクラーゼが活性化されると、ＡＴＰのｃＡＭＰへの転換が触媒される。第２メッセンジャーであるｃＡＭＰの濃度を増大させると、環状ヌクレオチド依存性イオンチャネルの活性化がもたらされ、ＲＡＰＧＥＦ３など、ｃＡＭＰにより活性化されるタンパク質に交換される可能性がある。ｃＡＭＰ依存性経路を介する、ＧＰＣＲとその最終的な分子標的との間のシグナル伝達の特異性は、ＧＰＣＲ、アデニリルシクラーゼ、およびエフェクタータンパク質を含めた、多重タンパク質複合体の形成を介して達成されうる。
上記で言及した通り、環状ＡＭＰは、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ、また、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼとしても公知である）を活性化させる。ＰＫＡは通常、２つの触媒性ユニットと２つの制御性ユニットとからなる四量体のホロ酵素（Ｃ２Ｒ２）として不活性であり、制御性ユニットにより触媒性ユニットの触媒性の中心部がブロックされる。環状ＡＭＰは、ＰＫＡの制御性ユニットにおける特異的な位置に結合し、制御性サブユニットと触媒性サブユニットとを解離させ、これにより、基質タンパク質をリン酸化することを可能とする触媒性ユニットを活性化させる。例えば、プロテインキナーゼＣを含めた、いくつかのタイプのプロテインキナーゼはｃＡＭＰ依存性ではないので、全てのプロテインキナーゼがｃＡＭＰに応答するわけではない。
ＰＫＡの活性サブユニットは、ＡＴＰからタンパク質基質の特定のセリン残基またはトレオニン残基へのリン酸イオンの移動を触媒しうる。リン酸化されたプロテインキナーゼは、細胞におけるイオンチャネルに直接作用する場合もあり、他の酵素を活性化させるかまたは阻害する場合もある。ＰＫＡはまた、ＤＮＡのプロモーター領域に結合する特定のタンパク質もリン酸化し、特異的遺伝子の発現の増大を引き起こす。さらなる下流の効果は、ＰＫＡの多様な役割に依存し、これらは、細胞型に基づき異なりうる。例えば、活性化されたＰＫＡは、例えば、グリコーゲンをグルコースへと転換するタンパク質、心臓における筋収縮を促進して、心拍数の増大をもたらすタンパク質、および遺伝子発現を制御する転写因子を含めた、他の多数のタンパク質をリン酸化しうる。
したがって、ＰＧＥ２Ｒ２およびＰＧＥ２Ｒ４による細胞シグナル伝達経路の刺激は、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）およびＣＲＥＢの標的遺伝子、例えば、ｃＡＭＰ応答エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）などの転写因子の活性化を増大させうる（図１を参照されたい）。ｃＡＭＰを増大させた造血幹細胞および前駆細胞を投与することにより、造血幹細胞／前駆細胞の生存度を維持し、ホーミングを増大させ、自己再生を増大させ、生着の増大および移植された細胞集団のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖の増大をもたらすことができる。
ＰＧＥ２Ｒ２およびＰＧＥ２Ｒ４による細胞シグナル伝達の刺激／活性化はまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）のリン酸化の増大およびＢ−カテニンのシグナル伝達の増大とも関連し（Ｈｕｌｌら、２００４年； Ｒｅｇａｎ、２００３年）、これらのいずれもがＷｎｔ経路の活性化を示す。ＰＧＥ２によるＷｎｔ経路の刺激は、造血幹細胞／前駆細胞の増殖、ならびに幹細胞ニッチからのシグナル伝達のほか、細胞自体の内部におけるシグナル伝達も介する自己再生を活発に増強しうる（Ｎｏｒｔｈら、４４７巻（７１４７号）、Ｎａｔｕｒｅ、１００７〜１１頁（２００７年））。造血幹細胞および前駆細胞におけるＷｎｔ経路の活性化はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞集団の増殖も増大させうる。
ＰＧＥ２Ｒ４による刺激はまた、ＰＩ３Ｋ経路も活性化させることが示されており、また、幹細胞のホーミング、増殖、生存、および生着の増大という所望の生物学的効果を達成するのにも重要でありうる。ＰＧＥ２Ｒ２およびＰＧＥ２Ｒ４による、ＰＩ３Ｋ経路などの細胞シグナル伝達経路の刺激／活性化はまた、幹細胞のホーミングおよび生着に重要な遺伝子、例えば、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）、セレクチン、インテグリンの発現も増大させうる。
本発見以前には、ＥＰ受容体を、細胞の生存度およびまた処理化合物の安定性を最大化する条件下において被験化合物で完全に飽和させうるであろうという考えのもとに、造血幹細胞および前駆細胞を化合物で処理した。造血幹細胞移植についての最新のケア基準によれば、４℃における処理により、処理した細胞の細胞生存度が改善されるほか、この温度における被験化合物の半減期について予測される延長も、より高い温度、例えば、２５℃または３７℃、およびより長いインキュベーション時間、例えば、２、３、４時間以上の場合と比較して改善されると考えられていた。
任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、部分的に、細胞を、ホーミングおよび生着と関連する遺伝子の発現を増大させる薬剤で、高温で長いインキュベーション期間にわたり処理することにより造血幹細胞および前駆細胞の生着、細胞が骨髄にホーミングする能力、および細胞の自己再生を増大させ、細胞生存度は維持しうることを意図する。
適切な薬剤には、例えば、プロスタグランジンＥ２ならびにｃＡＭＰ類似体およびｃＡＭＰエンハンサーおよび／またはＧα−ｓ活性化因子を含めたｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤の改善された組成物が含まれる。さらに、本発明は、生理学的に適切な温度（体温または３７℃など）のプロスタグランジンＥ２およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤を含めたこのような薬剤で長いインキュベーション期間（すなわち、少なくとも１時間）にわたり処理した細胞を投与することにより、細胞の生着が増大するだけでなく、造血幹細胞および前駆細胞集団のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖も結果としてもたらされることを実証する。
したがって、多様な実施形態では、本発明が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、約３７℃の温度で、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物を提供する。本発明はまた、造血再構築のための治療用組成物として用いられる造血幹細胞および前駆細胞を調製する方法であって、ヒト造血幹細胞集団および／または前駆細胞集団を、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤など、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、造血幹細胞集団または前駆細胞集団の生着および増殖を最適化する条件下で接触させるステップを含む方法も提供する。
本明細書では、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」という冠詞が、その冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つの）を指すのに用いられる。例として述べると、「ある要素」とは、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはこれらの任意の組合せを意味すると理解されたい。本明細書で用いられる「包含する」という用語と「含む」という用語とは、同義に用いられる。
本明細書で用いられる「約（ａｂｏｕｔ）」という用語または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さに照らして最大で１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％変化する、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さを指す。一実施形態では、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が、基準の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％となる、ある範囲の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さを指す。
本明細書を通して、文脈により別段に要求されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、言及されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含は示唆するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は示唆しないことが理解される。「〜からなる」とは、「〜からなる」という語句に後続するあらゆる語句を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを示す。「〜から本質的になる」とは、この語句の後に列挙された任意の要素を包含し、かつ、列挙された要素についての本開示で特定された活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
本明細書の全体における「一実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、この実施形態との関連において記載されている特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、構造、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）が、本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されていることを意味する。したがって、本明細書全体の多様な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、構造、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を、任意の適切な形で１または複数の実施形態において組み合わせることもできる。
Ｂ．本発明の治療用組成物
本発明は、患者への投与に適する無菌で治療的に許容される溶液中に懸濁させたヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、ヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団であって、造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である１または複数の薬剤と接触しており、細胞が、接触していない幹細胞または前駆細胞と比べたＣＸＣＲ４の発現の増大を含む遺伝子発現シグネチャーにより特徴づけられる、ヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団を含む。造血幹細胞または前駆細胞は、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現レベルおよび細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現レベルの増大に基づき特徴づけることができる。
本発明の治療用組成物では、造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも２、３、４、５、１０、１５、または２０倍増大している。
本発明の治療用組成物は、遺伝子発現シグネチャーであって、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない細胞と比べて増大する遺伝子発現シグネチャーによってもさらに特徴づけることができる。
本明細書で用いられる「接触していない」細胞とは、対照薬剤以外の薬剤で処理されていない（例えば、それと共に培養されていない、それと接触させない、またはそれと共にインキュベートされていない）細胞である。ＤＭＳＯ（対照薬剤）と接触させた細胞、または別のビヒクルと接触させた細胞が、接触していない細胞である。
本明細書で用いられる「シグネチャー遺伝子」とは、表３に示されるシグネチャー遺伝子のセット中の任意の遺伝子を意味する。例えば、シグネチャー遺伝子には、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、およびＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が含まれる。明確のために述べると、シグネチャー遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子を包含しない。
シグネチャー遺伝子の発現は、接触していない細胞と比較して２倍以上増大する可能性があり、具体的な実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、１０、１５、または２０倍増大している。一部の実施形態では、１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、本発明の治療用組成物を構成する細胞において増大する。具体的な実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ以上の発現が、接触していない細胞と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、１０、１５、または２０倍増大している。多様な実施形態では、シグネチャー遺伝子の発現が、接触していない細胞と比較して少なくとも６倍増大している可能性がある。
本発明の具体的な実施形態では、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、少なくとも約４倍増大し、ＣＲＥＭの遺伝子発現が、少なくとも約１０倍増大している。
治療用組成物を構成するヒト造血幹細胞または前駆細胞はまた、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化（ａｖｅｒａｇｅ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）が少なくとも約２、４、または６倍である遺伝子発現プロファイルにより特徴づけることもできる。一部の実施形態では、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化が、少なくとも約４である。一部の実施形態では、全てのシグネチャー遺伝子の平均倍数変化が、少なくとも約６である。一部の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の平均倍数変化が、少なくとも６倍である。一部の実施形態では、シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の平均倍数変化が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍である。具体的な実施形態では、治療用組成物を、図１４（Ｂ）、図１５（Ｂ）、または図１６（Ｂ）で示される、全てのシグネチャー遺伝子についての平均倍数変化を有する遺伝子発現プロファイルにより特徴づけることができる。
治療用組成物を構成するヒト造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現シグネチャーは解析することができる、すなわち、細胞を薬剤で処理した後で得ることもでき、または細胞を、処理後、ある期間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析することもできる。例えば、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて薬剤で処理し、洗浄して薬剤を除去し、さらなる細胞のインキュベーションを伴わずに遺伝子発現を解析することができる。あるいは、一部の実施形態では細胞を薬剤で処理し、洗浄して細胞集団から薬剤を除去し、次いで、細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ある時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。
一部の実施形態では、細胞を洗浄して薬剤を除去し、次いで、１〜６時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。一部の実施形態では、細胞を洗浄し、次いで、少なくとも約１時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。一部の実施形態では、細胞を洗浄し、次いで、約２時間にわたりインキュベートしてから、細胞の遺伝子発現シグネチャーを解析する。
本明細書で用いられる「遺伝子発現」とは、本発明の治療用組成物における造血幹細胞および前駆細胞、または造血幹細胞集団もしくは前駆細胞集団などの生物学的試料における遺伝子発現の相対的なレベルおよび／または遺伝子の発現パターンを指す。遺伝子の発現は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれらの組合せのレベルで測定することができる。「遺伝子発現プロファイル」または「遺伝子発現シグネチャー」とは、同じ試料、すなわち、細胞集団について測定される複数の異なる遺伝子の発現レベルを指す。
本明細書では、本発明の治療用組成物を構成する細胞を特徴づける遺伝子の発現を検出するのに当技術分野において利用可能な任意の方法が包含される。本明細書で用いられる「発現を検出する」という用語は、ＲＮＡ転写物またはその遺伝子の発現産物の量または存在を決定することを意味する。遺伝子の発現を検出する方法、すなわち、遺伝子発現プロファイリングには、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学法、およびプロテオミクスベースの方法が含まれる。方法は一般に、目的の遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。一部の実施形態では、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）など、ＰＣＲベースの方法（Ｗｅｉｓら、ＴＩＧ、８巻：２６３〜６４頁、１９９２年）、およびマイクロアレイなど、アレイベースの方法（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４６７〜７０頁、１９９５年）を用いる。「マイクロアレイ」とは、例えば、担体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上のポリヌクレオチドプローブなど、ハイブリダイズ可能なアレイエレメントの秩序のある配置を意図する。「プローブ」という用語は、特別に意図された標的の生体分子、例えば、内因性遺伝子によりコードされるかまたはこれに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することが可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成することもでき、適切な生物学的調製物から誘導することもできる。標識化するために、プローブを特別にデザインすることができる。プローブとして用いうる分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、タンパク質、抗体、および有機分子が含まれるがこれらに限定されない。
ＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当技術分野において周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７〜１９９９年を含めた分子生物学の標準的な教科書において開示されている。パラフィンで包埋された組織からＲＮＡを抽出するための方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ（Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、５６巻：Ａ６７頁、１９８７年）ならびにＤｅ Ａｎｄｒｅｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１８巻：４２〜４４頁、１９９５年）において開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、製造元の指示書に従い、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）など、商業上の製造者からの精製用キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて実施することができる。例えば、培養物中の細胞に由来する全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎｓを用いて単離することができる。他の市販されるＲＮＡ単離キットには、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）が含まれる。組織試料に由来する全ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘ．）を用いて単離することができる。加えて、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（米国特許第４，８４３，１５５号）による単一ステップのＲＮＡ単離工程など、当業者に周知の技法を用いて、容易に加工することもできる。
単離されたＲＮＡは、ＰＣＲ解析およびプローブアレイが含まれるがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用いることができる。ＲＮＡレベルを検出する１つの方法は、単離されたＲＮＡを、検出される遺伝子によりコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズしうる核酸分子（プローブ）と接触させるステップを伴う。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡの場合もあり、少なくとも７、１５、３０、６０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドの長さであり、とりわけ、ストリンジェントな条件下で、本発明の内因性遺伝子、または任意の誘導体ＤＮＡもしくは誘導体ＲＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチドなど、その一部の場合もある。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、問題の内因性遺伝子が発現していることを示す。
一実施形態では、ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、例えば、単離されたｍＲＮＡを、アガロースゲル上で泳動させ、このｍＲＮＡを、ゲルからニトロセルロースなどの膜へと転写することにより、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、プローブを固体表面に固定化し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ製の遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、本発明の内因性遺伝子の発現レベルを検出するのに用いるのに容易に適合させることができる。
試料における遺伝子発現レベルを決定する代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：１８９〜９３頁、１９９１年）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜７８頁、１９９０年）、転写による増幅システム（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻：１１７３〜７７頁、１９８９年）、Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ法（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：１１９７頁、１９８８年）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法を介する核酸増幅工程の後で、当業者に周知の技法を用いる、増幅された分子の検出を伴う。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合に核酸分子を検出するのにとりわけ有用である。
本発明の具体的な態様では、遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価する。当技術分野では、多くの異なるＰＣＲプロトコールまたはＱＰＣＲプロトコールが公知であり、これらは本明細書の以下でも例示され、先に記載した組成物を用いる、表３で列挙される遺伝子を検出および／または定量化するための使用に直接適用するかまたは適合させることができる。一般に、ＰＣＲでは、標的のポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマー対を伴う反応により増幅する。プライマー（複数可）は、標的核酸の相補性領域とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー（複数可）を伸長させて、標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件下では、１つのサイズの核酸断片が、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の大半を占める。増幅サイクルを繰り返して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増大させる。反応は、ＰＣＲに一般的に用いられる任意のサーマルサイクラーにより実施できる。しかし、リアルタイムの蛍光測定能力を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、ＩＣＹＣＬＥＲ（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＭＸ４０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）が好ましい。
一部の状況下では、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）（また、リアルタイムＰＣＲとも称する）が、定量的測定だけでなく、時間の短縮および汚染の低減をもたらすために好ましい。場合によっては、新鮮な凍結させた組織および専用の実験装置に対する要件のために、完全な遺伝子発現プロファイリング技術の利用可能性は限定されており、臨床状況下におけるこのような技法の日常的な使用は困難となっている。本明細書で用いられる「定量的ＰＣＲ」（または「リアルタイム ＱＰＣＲ」）とは、それが反応産物を繰り返してサンプリングする必要なしに行われるので、ＰＣＲ増幅の進行を直接的にモニタリングすることを指す。定量的ＰＣＲにおいて、反応産物が生成され、追跡されるのは、シグナルがバックグラウンドレベルを上回って上昇した後であるが、反応がプラトー状態に到達する前であるので、シグナル発生機構（例えば、蛍光）を介して反応産物をモニタリングすることができる。検出可能レベルまたは「閾値」レベルの蛍光を達成するのに必要とされるサイクル数は、ＰＣＲ工程の開始時における増幅可能な標的の濃度により直接変化し、シグナル強度の尺度により、試料中の標的核酸の量の尺度をリアルタイムでもたらすことを可能としている。
本発明の別の実施形態では、発現プロファイリングのためにマイクロアレイを用いる。マイクロアレイは、異なる実験間における再現性のために、特にこの目的に十分に適する。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定する１つの方法を提供する。各アレイは、固体の支持体に結合させた捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識化されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的なプローブとハイブリダイズし、次いで、レーザー走査により検出される。アレイ上の各プローブについてのハイブリダイゼーション強度を決定し、相対遺伝子発現レベルを表す定量的な値に変換する。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照されたい。高密度のオリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡについての遺伝子発現プロファイルを決定するのに特に有用である。
マイクロアレイ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ技術、またはＡｇｉｌｅｎｔインクジェットマイクロアレイ技術などを用いることにより、製造元のプロトコールに従う市販の装置を介して実施することができる。
「正規化」は、試料間の変動を取り除くのに用いることができる。マイクロアレイデータの場合、正規化の工程は、２つの標識化色素の蛍光強度を比較することにより、系統的誤差を除去することを目的とする。色素の偏りは、色素の標識化効率、熱感受性および光感受性のほか、２つのチャネルを走査するためのスキャナーの設定における差違を含めた多様な発生源から生じうる。正規化因子（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を計算するのに一般に用いられる一部の方法には、（ｉ）対数目盛による頑健な多重アレイ解析（ＲＭＡ）などにより、アレイ上の全ての遺伝子を用いる、包括的正規化（ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、（ｉｉ）一定に発現されるハウスキーピング遺伝子／不変遺伝子を用いる、ハウスキーピング遺伝子による正規化、および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション時に添加される既知量の外因性対照遺伝子を用いる、内部対照による正規化（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２年）、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、３２巻（増刊号）、４９６〜５０１頁）が含まれる。一実施形態では、本明細書で開示される遺伝子の発現を、対照のハウスキーピング遺伝子に対して、または対数目盛の頑健な多重アレイ解析（ＲＭＡ）を介して正規化することができる。
多様な例示的実施形態では、本発明が、部分的に、移植、例えば、骨髄移植において用いられる細胞集団を含む治療用組成物を提供する。本明細書で用いられる「細胞集団」とは、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む不均質な細胞集団または均質な細胞集団を指す。造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団は、骨髄細胞、臍帯血細胞、または動員末梢血細胞の場合もあり、とりわけ、骨髄、動員末梢血、および臍帯血を含めた、任意の適切な供給源から得られた細胞集団の場合もある。「細胞収集物」という用語はまた、細胞集団も指し、一部の実施形態では、「細胞集団」と同義である。しかし、細胞収集物が、任意の特定の細胞集団を指す必要はない。
造血幹細胞および／または前駆細胞は、臍帯血、骨髄、末梢血、または他の供給源のいずれから得られたものであれ、所望に応じて血清を伴うかまたは伴わない、任意の適切な市販の培地中またはカスタムで規定される培地中で成長させるか、処理するか、または増殖させることができる（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｔｓｈｏｒｎら、Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２２１〜２２４頁； Ｒ． Ｓｍｉｔｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、２００７年を参照されたい）。例えば、特定の実施形態では、無血清培地では、無血清培地におけるＣＤ３４＋細胞の成長および増殖に有用であることが示されている、アルブミンおよび／またはトランスフェリンを用いることができる。とりわけまた、Ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）などのサイトカインも包含されうる。ＨＳＣは、バイオリアクターなどの容器内で成長させることもできる（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２４巻：５９２〜６０１頁、２００６年を参照されたい）。ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＨＳＣの増殖に適する培地はまた、例えば、リンパ組織の解離から誘導することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＳＣのならびにそれらの後代の維持、成長、および分化を支持することが示されている、間質細胞（例えば、リンパ網内系間質細胞）などのＨＳＣ支持細胞も含みうる。
具体的な実施形態では、細胞集団を、被験体に投与する前に、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖させない。具体的な実施形態では、増殖させていない細胞集団を得、この細胞集団を、本明細書で示されるプロトコールに従い、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて処理し、洗浄して処理薬剤を除去し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて細胞集団を増殖させることなしに患者に投与することができる。一部の実施形態では、細胞を、臍帯血を含めたドナーから得、そして細胞の処理前もしくは処理後に、または患者に治療用組成物を投与する前の任意の時点において増殖させない。一実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける任意の実質的な細胞分裂の前に、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける任意の実質的な細胞分裂に必要とされる時間の前に患者に投与する。他の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける任意の実質的な有糸分裂の前に、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける任意の実質的な有糸分裂に必要とされる時間の前に患者に投与する。一部の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞の倍化時間の前に患者に投与する。一実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、集団内の細胞の倍化時間の前に患者に投与する。一部の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、細胞を処理して６、１２、または２４時間以内に患者に投与する。他の実施形態では、増殖させていない細胞集団を処理し、細胞を処理して２時間以内に患者に投与する。
多様な実施形態では、細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて薬剤で処理する前に、または患者に投与する前の任意の時点において培養しない。一部の実施形態では、細胞集団を、約２４時間未満にわたり培養する。他の実施形態では、細胞集団を、約１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、または２時間未満にわたり培養する。
多様な実施形態では、本明細書の別の個所で記載される薬剤で処理され、その後被験体に投与する細胞集団が、全骨髄、臍帯血、動員末梢血、造血幹細胞、造血前駆細胞、ならびに顆粒球（例えば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板を生成する巨核球、血小板）、および単球（例えば、単球、マクロファージ）を含めた、造血幹細胞および前駆細胞の後代を含めた、不均質な細胞集団である。
一実施形態では、治療用組成物が、約１００％の造血幹細胞および前駆細胞である細胞集団を含む。一部の実施形態では、治療用組成物における細胞集団が、約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％未満の造血幹細胞および前駆細胞である。一部の実施形態では、細胞集団が、約０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％未満のＣＤ３４＋細胞である。他の実施形態では、細胞集団が、約０．１％〜約１％、約１％〜約３％、約３％〜約５％、約１０％〜約１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約６０％〜７０％、約７０％〜８０％、約８０％〜９０％、約９０％〜９５％、または約９５％〜約１００％の造血幹細胞および前駆細胞である。具体的な実施形態では、細胞集団が、約０．１％〜約１％、約１％〜約３％、約３％〜約５％、約１０％〜約１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約６０％〜７０％、約７０％〜８０％、約８０％〜９０％、約９０％〜９５％、または約９５％〜約１００％のＣＤ３４＋細胞である。
本発明の治療用組成物における細胞は、自系／同体（「自己」）の場合もあり、非自系（「非自己」、例えば、同系異種、同系、または異種）の場合もある。本明細書で用いられる「自系」とは、同じ被験体に由来する細胞を指す。本明細書で用いられる「同系異種」とは、比較される細胞とは遺伝子的に異なる、同じ種の細胞を指す。本明細書で用いられる「同系」とは、比較される細胞と遺伝子的に同一である、異なる被験体の細胞を指す。本明細書で用いられる「異種」とは、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。具体的な実施形態では、本発明の細胞が同系異種である。
「幹細胞」とは、分化していない細胞であって、（１）長期にわたる自己再生、または元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成させる能力、（２）単一の細胞レベルにおける、複数の特化した細胞型への分化、および、場合によって、唯一の特化した細胞型への分化、ならびに（３）ｉｎ ｖｉｖｏにおける組織の機能的再生が可能な細胞を指す。幹細胞は、それらの発生上の能力により、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、および少能性／単能性と下位分類される。「前駆細胞」もまた、自己再生能およびより成熟した細胞へ分化する能力を有するが、系統（例えば、造血前駆細胞は、血液系統に拘束され、骨髄前駆細胞は、骨髄系統に拘束され、リンパ前駆細胞は、リンパ系統に拘束される）に拘束されるのに対し、幹細胞は、必ずしもそのようには限定されない。「自己再生」とは、変化していない娘細胞をもたらし、したがって、その集団数を補充および維持し、特化した細胞型を生成させる固有の能力（効力）を有する細胞を指す。自己再生は、２つの方法で達成されうる。非対称性の細胞分裂は、親細胞と同一である１つの娘細胞と、親細胞とは異なり、より拘束された前駆細胞またはより分化した細胞である今１つの娘細胞とをもたらす。対称性の細胞分裂は、２つの同一な娘細胞をもたらす。細胞の「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」または「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、対称的に分裂する細胞を指す。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生体の生存期間にわたり、成熟血液細胞のレパートリー全体を生成させることが可能な、拘束された造血前駆細胞（ＨＰＣ）をもたらす。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系統（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系統（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、ならびに当技術分野において公知である他の系統（Ｆｅｉ， Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号； ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号； Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号； Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号； Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号； ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号； Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）を含めた、生体の全ての血液細胞型をもたらす、多分化能幹細胞を指す。致死的に照射された動物またはヒトへと移植されると、造血幹細胞は、赤血球プール、好中球−マクロファージプール、巨核球プール、およびリンパ造血細胞プールを再配置させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）ことが可能である。
ＨＳＣは、特定の表現型マーカーまたは遺伝子型マーカーに従い同定することができる。例えば、ＨＳＣは、それらのサイズが小型であること、系統（ｌｉｎ）マーカーが欠如していること、ロダミン１２３（また、ｒｈｏｌｏとも呼ばれる、ロダミンＤＵＬＬ）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などの生体色素によってあまり染色されないこと（サイドポピュレーション（ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ））、およびそれらの表面における多様な抗原性マーカー（そのうちの多くが分化系列のクラスター（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、およびｃ−ｋｉｔ、幹細胞因子の受容体）に属する）が存在することにより同定することができる。ＨＳＣは、主に、系統への拘束を検出するのに用いられることが典型的であるマーカーについて陰性であり、したがって、Ｌｉｎ（−）細胞と称することが多い。大半のヒトＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）として特徴づけることができる。しかし、あるＨＳＣは、ＣＤ３４−／ＣＤ３８−であるので、全ての幹細胞がこれらの組合せにより網羅されるわけではない。また、一部の研究は、最初期の幹細胞が、細胞表面におけるｃ−ｋｉｔを欠く場合があることを示唆する。ヒトＨＳＣでは、ＣＤ３４＋ＨＳＣおよびＣＤ３４−ＨＳＣの両方がＣＤ１３３＋であることが示されているので、ＣＤ１３３が、初期マーカーを表しうる。当技術分野では、ＣＤ３４＋およびＬｉｎ（−）細胞がまた、造血前駆細胞も包含することが公知である。
本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の適切な供給源には、造血起源の細胞を含有する体内の臓器から単離されるかまたは得られる細胞が含まれるがこれらに限定されない。「単離される」とは、その元の環境から取り出される材料を意味する。例えば、細胞が、通常はその天然状態においてそれに随伴する一部または全ての構成要素から分離される場合に、その細胞は単離される。例えば、本明細書で用いられる「単離された細胞集団」、「単離された細胞の供給源」、または「単離された造血幹細胞および前駆細胞」などは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、１または複数の細胞を、それらの天然の細胞環境から、かつ、組織または臓器の他の構成要素との関連から分離すること、すなわち、それがｉｎ ｖｉｖｏにおける物質と著明に関連するわけではないことを指す。
本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞からは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球細胞などの成熟造血細胞、および骨髄吸引物、臍帯血、または動員末梢血（動員された白血球搬出産物）に由来するそれらの拘束された前駆細胞を枯渇させることができる。成熟した、系統に拘束された細胞は、免疫枯渇により、例えば、固体担体を、いわゆる「系統」抗原：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａのパネルに結合する抗体で標識化することにより枯渇させる。ＣＤ３４＋抗原に結合する抗体で標識した担体を用いて未分化の造血幹細胞および前駆細胞を単離する後続のステップを実施して、細胞集団をさらに精製することができる。造血幹細胞および前駆細胞を、多様な細胞供給源から精製するためのキットが市販されており、具体的な実施形態では、これらのキットが、本発明の方法と共に用いるのに適する。造血幹細胞および前駆細胞を精製するための例示的な市販のキットには、Ｌｉｎｅａｇｅ（Ｌｉｎ）Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ３４＋ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＲｏｓｅｔｔａＳｅｐ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の間葉系幹細胞を含む。具体的な実施形態では、細胞集団が、約１０％以下の間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とは、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞を含めた系統へと容易に分化しうる多分化能幹細胞である（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻、１４３頁（１９９９年）； Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈら、Ｂｏｎｅ、１３巻、６９頁（１９９２年）； Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻、７１頁（１９９７年））。
他の実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の内皮前駆細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団が、約１０％未満の内皮前駆細胞を含む。本明細書で用いられる「内皮前駆細胞」とは、血管内皮細胞へと分化する能力を有する多分化能細胞または単能性細胞を指す。
より具体的な実施形態では、細胞集団が、約１０％以下の間葉系幹細胞または内皮前駆細胞を含む。
ドナーから得られるかまたは別の形で提供される細胞集団は、間葉系幹細胞および／または内皮前駆細胞を実質的に含まない場合があり、具体的な実施形態では、約１０％未満の間葉系幹細胞および約１０％未満の内皮前駆細胞を含む場合がある。代替的に、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、免疫磁気選択技術（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、蛍光活性化細胞分取、またはこれらの組合せを用いて、間葉系幹細胞および／または内皮前駆細胞を枯渇させることもできる。枯渇法は、本明細書で記載される細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの抗体の使用をさらに含みうる。
一部の実施形態では、細胞集団から、ＣＤ１４細胞表面マーカーについて陽性であり、かつ、ＣＤ４５について陰性である（ＣＤ１４＋／ＣＤ４５−）細胞、および／またはＶＷＦ（フォンウィレブランド因子）について陽性である（ＶＷＦ＋）細胞を含めた、内皮前駆細胞を枯渇させる。他の実施形態では、細胞集団から、ＣＤ７３および／またはＣＤ１４０Ｂ細胞表面マーカーについて陽性である細胞を枯渇させる。本発明の具体的な実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性である細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満の、ＣＤ７３、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４、およびＶＷＦからなる群より選択される細胞表面マーカーについて陽性である細胞を含む。
具体的な実施形態では、本発明の治療用組成物を構成する細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞を含む。本発明の他の実施形態では、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＶＷＦ＋細胞を含む。本発明の他の実施形態では 、細胞集団が、ＣＤ３４＋細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含む。
より具体的な実施形態では、細胞集団が、ＣＤ３４＋造血幹細胞またはＣＤ３４＋前駆細胞を含み、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満のＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞、ＶＷＦ＋細胞、ＣＤ７３＋細胞、およびＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性であり、ＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３、およびＣＤ１４０Ｂからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーについて陰性である。他の実施形態では、細胞集団が、細胞表面マーカーのＣＤ３４について陽性であり、細胞表面マーカーであるＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３、およびＣＤ１４０Ｂについて陰性である。
造血幹細胞および前駆細胞は、成体の分画されていない骨髄または分画された骨髄から得ることもでき、これらから単離することもでき、これらには大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨、および他の骨が含まれる。造血幹細胞および前駆細胞は、注射針およびシリンジを用いて寛骨から取り出すことにより、直接得るかまたは単離することもでき、しばしば、細胞が骨髄コンパートメントから放出または動員されるように誘導する、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）などのサイトカインによる前処理の後で、血液から得るかまたは単離することもできる。造血幹細胞および前駆細胞の他の供給源には、臍帯血、胎盤血（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｂｌｏｏｄ）、および動員末梢血が含まれる。実験目的では、動物の胎仔肝臓、胎仔脾臓、腎臓髄質（ｋｉｄｎｅｙ ｍａｒｒｏｗ）、およびＡＧＭ（Ａｏｒｔａ−ｇｏｎａｄ−ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｓ）もまた、造血幹細胞および前駆細胞の有用な供給源である。
具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、造血源、例えば、骨髄細胞、臍帯血、または動員末梢血細胞から採取する。造血幹細胞および前駆細胞を「採取する」とは、マトリックスからの細胞の脱離または分離と定義される。これは、酵素的方法、非酵素的方法、遠心分離法、電気的方法、もしくはサイズベースの方法など、多数の方法を用いて達成することもでき、好ましくは、培地（例えば、細胞がインキュベートされる培地）を用いて細胞をフラッシングすることにより達成することもできる。具体的な実施形態では、移植に十分な量の細胞を採取することが、ドナーにおいて幹細胞および前駆細胞を動員するステップを必要としうる。
「造血幹細胞の動員」とは、幹細胞移植の前の白血球搬出を目的とする、幹細胞の骨髄から末梢血循環への放出を指す。動員を刺激するために、造血性増殖因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または化学療法剤を用いることが多い。幹細胞動員薬が市販されており、これをＧ−ＣＳＦと組み合わせて用いて、被験体への移植に十分な量の造血幹細胞および前駆細胞を動員することができる。例えば、移植に十分な数の造血細胞を採取するために、Ｇ−ＣＳＦおよびＭｏｚｏｂｉｌ（商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をドナーに投与することができる。
ドナーから採取される幹細胞数、被験体に戻して移植するのに利用可能な幹細胞数を増大させることにより、被験体の転帰を顕著に改善し、これにより、生着までの時間を短縮することを可能とし、その結果、被験体が有する好中球および血小板が不十分となる時間を短縮し、このために、感染、出血、または他の合併症を防止することができる。当業者には、造血幹細胞および前駆細胞を動員する他の方法が明らかであろう。
具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を、臍帯血から得る。臍帯血は、当技術分野において公知の技法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１４７，６２６号および同第７，１３１，９５８号を参照されたい）に従い採取することができる。
一実施形態では、治療用組成物および本発明の方法において用いられる造血幹細胞および前駆細胞を、多能性幹細胞の供給源、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）から得ることができる。本明細書で用いられる用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、多能性状態へと再プログラム化された非多能性細胞を指す。被験体の細胞を多能性状態へと再プログラム化したら、細胞を、造血幹細胞または前駆細胞など、所望の細胞型へとプログラム化することができる。本明細書で用いられる「再プログラム化する」という用語は、細胞がより分化していない状態を指向する能力を増大させる方法を指す。本明細書で用いられる「プログラム化する」とは、細胞のこの能力を減少させるか、または細胞をより分化した状態へと分化させる方法を指す。
多様な実施形態では、本発明が、治療用組成物の、ヒト患者、または療法を必要とする被験体への投与を意図する。治療用組成物に含有され、患者に投与される造血幹細胞または前駆細胞の量は、細胞の供給源、個体の疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）、年齢、性別、および体重、ならびに造血幹細胞および前駆細胞が個体において所望の応答を誘発する能力と共に変化する。
一実施形態では、被験体に投与する治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、Ｌｉｎ（−））の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１０×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０６個の細胞、少なくとも０．７５×１０６個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１．２５×１０６個の細胞、少なくとも１．５×１０６個の細胞、少なくとも１．７５×１０６個の細胞、少なくとも２×１０６個の細胞、少なくとも２．５×１０６個の細胞、少なくとも３×１０６個の細胞、少なくとも４×１０６個の細胞、少なくとも５×１０６個の細胞、少なくとも１０×１０６個の細胞、少なくとも１５×１０６個の細胞、少なくとも２０×１０６個の細胞、少なくとも２５×１０６個の細胞、もしくは少なくとも３０×１０６個の細胞である。
具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、Ｌｉｎ（−））の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約０．１×１０５個の細胞〜約１０×１０５個の細胞、約０．５×１０６個の細胞〜約５×１０６個の細胞、約１×１０６個の細胞〜約３×１０６個の細胞、約１．５×１０６個の細胞〜約２．５×１０６個の細胞、もしくは約２×１０６個の細胞〜約２．５×１０６個の細胞である。
具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約１×１０６個の細胞〜約３×１０６個の細胞、約１．０×１０６個の細胞〜約５×１０６個の細胞、約１．０×１０６個の細胞〜約１０×１０６個の細胞、約１０×１０６個の細胞〜約２０×１０６個の細胞、約１０×１０６個の細胞〜約３０×１０６個の細胞、もしくは約２０×１０６個の細胞〜約３０×１０６個の細胞である。
別の実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または約１×１０６個の細胞〜約３０×１０６個の細胞； 約１．０×１０６個の細胞〜約２０×１０６個の細胞、約１．０×１０６個の細胞〜約１０×１０６個の細胞、約２．０×１０６個の細胞〜約３０×１０６個の細胞、約２．０×１０６個の細胞〜約２０×１０６個の細胞、もしくは約２．０×１０６個の細胞〜約１０×１０６個の細胞である。
具体的な実施形態では、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、約１×１０６個の造血幹細胞または前駆細胞、約２×１０６個の細胞、約５×１０６個の細胞、約７×１０６個の細胞、約１０×１０６個の細胞、約１５×１０６個の細胞、約１７×１０６個の細胞、約２０×１０６個の細胞、約２５×１０６個の細胞、または約３０×１０６個の細胞である。
一実施形態では、被験体に投与する、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞の量が、部分的な臍帯血もしくは単一の臍帯血における造血幹細胞もしくは前駆細胞の量、または体重１ｋｇ当たり少なくとも０．１×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも５×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１０×１０５個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．７５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１．２５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１．５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１．７５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも２．５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも３×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも４×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１０×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも１５×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも２０×１０６個の細胞、体重１ｋｇ当たり少なくとも２５×１０６個の細胞、もしくは体重１ｋｇ当たり少なくとも３０×１０６個の細胞である。
任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、部分的に、本方法の利点のうちの１つが、本発明の治療用組成物における、増強された造血幹細胞および前駆細胞は、対照の処理した細胞、および、例えば、４℃において薬剤で処理した細胞と比較して、生着の潜在能を増大させ、ホーミングを改善し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖能を増大させているために、移植において用いる造血幹細胞および前駆細胞を少なくし得ることであることを意図する。
Ｃ．本発明の方法
本発明者らは、幹細胞移植において用いられる造血幹細胞および前駆細胞の有効性を増大させるために、プロスタグランジン経路を刺激し、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現および細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現を上方制御する薬剤を含めた、細胞の遺伝子発現を改変する薬剤で処理した造血幹細胞集団および前駆細胞集団についての複数の生物学的パラメータを解析した。移植時における被験体の造血系を再構築するときの細胞集団の有効性は、細胞集団が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨髄にホーミングおよび生着し、自己再生し、増殖する能力などの特性に依存する。本発明は、細胞集団を調節して、このような細胞特性を改善し、結果としてもたらされる、造血再構築における治療的改善をもたらす方法を提供する。
「生着の潜在能」とは、細胞が生着する能力を指す。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞、Ｌｉｎ（−）細胞など、造血幹細胞または前駆細胞の生着の潜在能を、例えば、ＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４細胞シグナル伝達経路の活性、細胞におけるホーミングまたは生着、細胞生存度、および細胞の自己再生能と関連する遺伝子の発現を測定することにより、決定することができる。当然ながら、当業者は、また、造血幹細胞または前駆細胞における生着の潜在能の増大も示す、他の適切なアッセイについても理解するであろう。本明細書で用いられる用語「生着する」とは、細胞が組織などの位置へと組み込まれ、ある時間にわたり、特定の位置に残存する能力、例えば、造血幹細胞または前駆細胞が骨髄に組み込まれ、残存する能力を指す。「ホーミング」とは、造血幹細胞または前駆細胞が局在化する能力、すなわち、移植された幹細胞の骨髄への局在化など、特定の領域または組織に移動する能力を指す。
多様な実施形態では、本発明が、プロスタグランジン経路、例えば、ＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である１または複数の薬剤と接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞を含む治療用組成物を提供する。処理した細胞の治療用組成物は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞集団のホーミング、生着、および増殖の増大など、幹細胞移植において既に用いられている細胞を凌駕する多くの利点をもたらす。本明細書で用いられる「薬剤」とは、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤を指す。このような薬剤には、例えば、しかし限定なしに述べると、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、限定なしに述べると、本明細書の別の個所で記載される、ＰＧＥ２類似体、ｃＡＭＰ類似体もしくはｃＡＭＰ活性化因子、および／またはＧα−ｓ活性化因子を含めた、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が含まれる。具体的な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、任意に組み合わされた１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の薬剤と、同時的または逐次的に接触させることができる。
ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤など、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、生着および／または生着の潜在能および／または増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させたヒト造血幹細胞または前駆細胞は、生化学的アッセイにより決定される、細胞内のｃＡＭＰのシグナル伝達レベル、例えば、ＣＲＥＢのリン酸化レベルの増大により、遺伝子発現アッセイ、例えば、マイクロアレイにより決定される、ＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４細胞シグナル伝達経路に関与する遺伝子（、例えば、ＣＲＥＭ）、および造血幹細胞および前駆細胞のホーミングおよび生着を増大させる遺伝子（例えば、ＣＸＣＲ４遺伝子）の上方制御を示す遺伝子発現シグネチャーにより、細胞生存度アッセイ、例えば、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色により決定される、造血幹細胞生存度および前駆細胞生存度において測定可能な減少がないこと、および／または、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｃ）アッセイにより決定される、造血幹細胞の自己再生能の増大など、複数で多様にわたる方法により特徴づけることができる。
一実施形態では、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤など、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と、生着および／または生着の潜在能および／または増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させた造血幹細胞または前駆細胞は、接触させた（処理した）細胞の遺伝子発現シグネチャーを、ビヒクルで処理した細胞、または４℃において薬剤で処理した細胞と比較して検討することにより同定することができる。
具体的な実施形態では、生着および／もしくは生着の潜在能を増大させ、かつ／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させた、処理した造血幹細胞または前駆細胞が、以下の遺伝子：ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｆｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）、およびＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全ての発現を、ビヒクルで処理した細胞、または４℃において薬剤で処理した細胞と比較して増大させている。本発明の特定の実施形態では、ＣＸＣＲ４が、治療用組成物における造血幹細胞または前駆細胞において、処理されていない細胞におけるＣＸＣＲ４の発現レベルと比較して、少なくとも４倍上方制御される。
前臨床研究に由来する観察とは対照的に、本発明者らは、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤と、本明細書で記載される特定の条件下で接触させた造血幹細胞および前駆細胞が、細胞の増殖および生着の潜在能を増大させることを発見した。これらの条件は、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤による処理の、幹細胞のホーミング、生存、増殖、および生着を含めた所望の生物学的応答を最適化する。
したがって、本発明者らは、造血幹細胞および前駆細胞の生存度を低下させ、ｄｍＰＧＥ２の半減期を短縮すると考えられている条件が、細胞生存度を保持する、骨髄へのホーミングおよび生着を増大させ（例えば、ＣＸＣＲ４発現の増大）、細胞の自己再生能を増大させるために、予測外にも、生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖の潜在能の増大を示す造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらすことを発見した。
したがって、本発明は、骨髄移植、末梢血移植、および臍帯血移植を、部分的には、造血幹細胞集団または前駆細胞集団を、ｄｍＰＧＥ２など、ＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を上方制御する、本明細書で記載される薬剤で、造血幹細胞および前駆細胞の生着、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける造血幹細胞および前駆細胞の増殖を増大させるのに好ましいとは予測されていない条件下において処理することにより実施するための新規の方法を意図する。
本明細書で用いられる「十分な条件」または「十分な条件下で」という用語は、移植材料、例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、もしくは臍帯血細胞、ならびに／または造血幹細胞および／もしくは前駆細胞を含む他の細胞集団、ならびに／または濃縮もしくは選択された造血幹細胞集団および前駆細胞集団の供給源を、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤で処理するためのインキュベーション条件を指す。一実施形態では、条件が、被験体に投与する造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させるのに十分な条件である。一実施形態では、この条件は、被験体に投与する造血幹細胞または前駆細胞の増殖を増大させるのに十分なものである。別の実施形態では、条件が、被験体に投与する造血幹細胞集団または前駆細胞集団の生着および増殖を増大させるのに十分である。インキュベーション条件には、細胞の供給源、薬剤の濃度、細胞と薬剤とのインキュベーションの持続時間、およびインキュベーションの温度が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、薬剤が、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤である。一実施形態では、薬剤が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
多様な実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞の生着および／または増殖を増大させるのに十分な条件には：約２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、および３９℃の温度が含まれるがこれらに限定されない、約３９℃の温度範囲（ほぼ室温〜ほぼ体温）など、生理学的に適切な温度；約１００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１１０μＭ、もしくは約１２０μＭ、または他の任意の中間の濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（例えば、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ）が含まれるがこれらに限定されない、約１０ｎＭ〜約１２０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の最終濃度において；ならびに約６０分間、約７０分間、約８０分間、約９０分間、約１００分間、約１１０分間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、もしくは約４時間の持続時間、またはインキュベーションの他の任意の中間の持続時間（例えば、１１１分間、１１２分間、１１３分間、１１４分間、１１５分間、１１６分間、１１７分間、１１８分間、１１９分間）にわたるインキュベーションが含まれるがこれらに限定されない、約６０分間〜約４時間にわたるインキュベーションが含まれる。
本明細書で用いられる「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、基準の濃度、温度、持続時間、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さに対して、最大で３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％変化する濃度、温度、持続時間、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さを意味する。例えば、好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±１０％を中心とする量の範囲を指す、例えば、約３７℃という温度が、３３℃〜４１℃の温度範囲を指す。別の好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±５％を中心とする量の範囲を指す。別の好ましい実施形態では、この用語が、ほぼ特定の量±１％を中心とする量の範囲を指す。
具体的な実施形態では、造血幹細胞および前駆細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件には、約３５℃〜約３９℃の温度範囲、約１０μＭ〜約２５μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の最終濃度におけるインキュベーション、および約１時間〜約４時間にわたる、約２時間〜約３時間にわたる、約２時間〜約４時間にわたる、または約３時間〜約４時間にわたるインキュベーションが含まれる。
別の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件には、約３７℃（ほぼ体温）の温度、約１０μＭ以上の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の最終濃度におけるインキュベーション、および約２時間にわたるインキュベーションが含まれる。
別の実施形態では、造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むヒト臍帯血、骨髄細胞、もしくは動員末梢血細胞、またはＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋、造血幹細胞もしくは前駆細胞の精製された集団を、１２０分間以上にわたり、３７℃の温度で、最終濃度を１０μＭとする１６，１６−ｄｍＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）と接触させることにより、造血幹細胞または前駆細胞の、被験体の骨髄における生着の潜在能を増大させる。接触させた細胞は、細胞生存度の統計学的に有意な低下を示さず、造血幹細胞または前駆細胞のホーミングおよび生着ならびに自己再生能と関連する遺伝子発現の統計学的に有意な増大を示す。
別の実施形態では、造血幹細胞もしくは前駆細胞を含むヒト臍帯血、骨髄細胞、もしくは動員末梢血細胞、またはＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋、造血幹細胞もしくは前駆細胞の精製された集団を、１２０分間以上にわたり、３７℃の温度で、最終濃度を１０μＭとする１６，１６−ｄｍＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）と接触させることにより、被験体に投与する造血幹細胞集団または前駆細胞集団のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させる。
多様な実施形態では、本発明が、部分的に、造血幹細胞移植および前駆細胞移植のための細胞集団を取得および調製するための方法であって、細胞集団を、細胞の生着の潜在能および／または生着を増大させるのに十分な条件下で、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる１または複数の薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞および前駆細胞の量を増大させるための細胞集団を取得および調製するための方法であって、細胞集団を、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞集団の増殖を増大させるのに十分な条件下で、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる１または複数の薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
他の多様な実施形態では、本発明が、部分的に、被験体における造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させる方法であって、ＣＤ３４は発現するがＬｉｎは発現しない造血細胞（例えば、Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞）を含む細胞集団を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。細胞は、本明細書の別の個所で記載される、被験体における接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を増大させるのに十分な条件下で薬剤と接触させる。
特定の実施形態では、本発明が、部分的に、ｉｎ ｖｉｖｏの被験体における造血幹細胞および前駆細胞集団を増殖させる方法であって、ＣＤ３４は発現するがＬｉｎは発現しない造血細胞（例えば、Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞）を含む細胞集団を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤からなる群より選択される１または複数の薬剤と接触させるステップと、細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。細胞は、本明細書の別の個所で記載される、被験体における、接触させた造血幹細胞集団および前駆細胞集団を増殖させるのに十分な条件下で薬剤と接触させる。
本発明は、部分的に、それを必要とする被験体（例えば、ヒト）における幹細胞の生着を増大させる方法であって、造血幹細胞および／または前駆細胞（例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、および／または臍帯血細胞）を含む細胞集団を、ＰＧＥ２またはその類似体、例えば、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させるステップと、細胞を被験体に投与するステップとを含む方法を意図する。一実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞の供給源を、ｄｍＰＧＥ２などのＰＧＥ２類似体と接触させる。多様な実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞の供給源を、ｄｍＰＧＥ２など、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、ｃＡＭＰ類似体もしくはｃＡＭＰエンハンサー、またはＧα−ｓ活性化因子と接触させる。
特定の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団を、ｄｍＰＧＥ２などのＰＧＥ２類似体およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、例えば、ｃＡＭＰ類似体もしくはｃＡＭＰエンハンサー、またはＧα−ｓ活性化因子と接触させる。別の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞の供給源を、１または複数のＰＧＥ２類似体、１もしくは複数のｃＡＭＰ類似体もしくはｃＡＭＰエンハンサー、および／または１もしくは複数のＧα−ｓ活性化因子と接触させる。
他の多様な実施形態では、本発明が、それを必要とする被験体を処置する方法であって、必要のある被験体を同定するステップと、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、例えば、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、およびＧα−ｓ活性化因子からなる群より選択される１または複数の薬剤と、被験体における、接触させた造血幹細胞または前駆細胞の生着またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させた造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞集団を、被験体に投与し、これにより、必要のある被験体を処置するステップとを含む方法を提供する。
「増強する」または「促進する」または「増大させる」または「活性化させる」とは、一般に、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、細胞において、ビヒクルまたは対照の分子／組成物のいずれかにより引き起こされる応答と比較して、より大きな生理学的応答（すなわち、下流における効果）、例えば、幹細胞および／または前駆細胞の生着／生着の潜在能の増大、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける幹細胞の増殖の増大をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的応答には、当技術分野における理解および本明細書における記載から明らかな応答の中でも、造血幹細胞および／または前駆細胞の生着、生存度、ホーミング、自己再生、および／または増殖の増大が含まれうる。一実施形態では、増大が、ＣＲＥＢリン酸化の増大、ＣＲＥＭ発現の増大、およびＣＸＣＲ４の増大が含まれるがこれらに限定されない、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を介するシグナル伝達の増大の結果としての遺伝子発現の増大でありうる。造血幹細胞および／または前駆細胞の生着、生存度、ホーミング、自己再生および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖の増大はまた、とりわけ、遺伝子発現、ＣＦＵ−Ｃアッセイ、ＣＦＵ−Ｓアッセイ、ＣＡＦＣアッセイ、および細胞表面タンパク質の発現など、当技術分野において公知の方法を用いて確認することもできる。「増大された」または「増強された」量とは、典型的には、「統計学的に有意な」量であり、ビヒクル（薬剤の非存在）または対照の組成物によりもたらされる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（全ての整数ならびにそれらの間および１を超える全ての小数、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含めた）である増大を包含しうる。例えば、具体的な実施形態では、本発明の方法が、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、約３７℃でｄｍＰＧＥ２と接触させるステップを含む。これらの細胞は、約４℃で接触させた細胞と比較して、生着の潜在能および増殖を増大させている。
「減少させる」または「低下させる」または「低める」または「低減する」または「減らす」とは、一般に、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、細胞において、ビヒクルまたは対照の分子／組成物のいずれかにより引き起こされる応答と比較して、より小さな生理学的応答（すなわち、下流における効果）、例えば、アポトーシスの減少をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。一実施形態では、減少が、通常は細胞生存度の低減と関連する、遺伝子発現の減少または細胞シグナル伝達の減少でありうる。「減少」または「低減された」量とは、典型的には、「統計学的に有意な」 量であり、ビヒクル（薬剤の非存在）または対照の組成物によりもたらされる応答の１／１．１、１／１．２、１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１５、１／２０、１／３０以下（例えば、１／５００、１／１０００）（全ての整数ならびにそれらの間および１を超える全ての小数、例えば、１／１．５、１／１．６、１／１．７．１／１．８などを含めた）である減少を包含しうる。例えば、具体的な実施形態では、本発明の方法が、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、約３７℃でｄｍＰＧＥ２と接触させるステップを含む。接触させた細胞は、約４℃でｄｍＰＧＥ２と接触させた細胞と比較して、統計学的に有意な細胞生存度の低下を示さない。
「維持する」または「保持する」または「維持」または「変化なし」または「実質的に変化なし」または「実質的に減少なし」とは、一般に、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、細胞において、ビヒクルまたは対照の分子／組成物のいずれかにより引き起こされる応答（基準の応答）と比較して、同等の生理学的応答（すなわち、下流における効果）をもたらすかまたは引き起こす能力を指す。同等の応答とは、基準の応答と有意に異なるかまたは測定可能に異なることがない応答である（図１３Ａを参照されたい）。一実施形態では、造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団を、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、例えば、ｄｍＰＧＥ２、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、およびＧα−ｓ活性化因子など、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤と、約３７℃で約２時間にわたり接触させる。処理した細胞は、約４℃で接触させた細胞と比較して、統計学的に有意な細胞生存度の低下を示さない。言い換えれば、本明細書で記載される方法は、約４℃で接触させた細胞と比較して、造血幹細胞および前駆細胞の生存度を維持し、実質的に減少させず、統計学的に有意な減少を結果としてもたらさず、喪失を引き起こさず、かつ／または、実質的に変化させない。
具体的な実施形態では、細胞を薬剤、例えば、ｄｍＰＧＥ２である期間にわたり処理する。関連する実施形態では、細胞を、それらが薬剤を実質的に含まないように、細胞培養培地における処理後に洗浄する。例えば、一実施形態では、ヒト造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄細胞、動員末梢血細胞、または臍帯血細胞を含む細胞集団を、約３７℃で１２０分間にわたり、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と接触させる。インキュベーション後であるが、注入または後続の処理または保存の前に、細胞を、５％のヒト血清アルブミン培地（ＬＭＤ／５％のＨＳＡ）またはＳｔｅｍ Ｓｐａｎ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を伴う低分子量のデキストランなどの細胞培養培地で洗浄する。
多様な例示的実施形態では、本発明が、部分的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける処理法であって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、幹細胞／前駆細胞の生存度を維持し、生着、ホーミング、自己再生、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させる、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させるステップを含む処理法を提供する。
「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は一般に、生体外の人工的な環境、好ましくは、天然条件の変化を最小とする環境における生組織内または生組織上でなされる実験または測定など、生体の外部で生じる活動を指す。具体的な実施形態では、「ｅｘ ｖｉｖｏ」における手順が、生体から採取され、通常は無菌条件下にある実験装置内で、典型的には、状況に応じて、数時間または最長で約２４時間であるが、最長で４８または７２時間を含めた時間にわたり培養された生細胞または生組織を伴う。特定の実施形態では、このような組織または細胞を回収して凍結させ、その後、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処理のために解凍することができる。生細胞または生組織を用いる、数日間より長くかかる組織培養の実験または手順は、典型的には、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語を、「ｅｘ ｖｉｖｏ」と互換的に用いることができる。
「ｅｘ ｖｉｖｏにおける投与」、「ｅｘ ｖｉｖｏにおける処理」、または「ｅｘ ｖｉｖｏにおける治療的な使用」という記載は一般に、１または複数の臓器、細胞、または組織を、生存しているかまたは死亡して間もない被験体から得、場合によって、精製／濃縮し、処理または手順（例えば、細胞を本発明の組成物または薬剤と共にインキュベートして、造血幹細胞または前駆細胞など、所望の細胞の増殖を増強することを伴う、ｅｘ ｖｉｖｏにおける投与ステップ）に曝露する医療手順に関する。ｅｘ ｖｉｖｏにおいて処理した細胞は、同じ生存する被験体に投与することもでき、異なる生存する被験体に投与することもできる。
このようなｅｘ ｖｉｖｏにおける治療的適用にはまた、本発明の接触させた細胞を、１回または複数回にわたり、生存する被験体に投与することなどを介する、任意選択のｉｎ ｖｉｖｏにおける処理または手順ステップも包含しうる。当技術分野において周知であり、本明細書の別の個所で記載される技法によるこれらの実施形態には、局所投与および全身投与の両方が意図される。被験体に投与する細胞の量は、健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性のほか、薬物および／または細胞移植に対する反応の程度、重症度、および種類など、その被験体の特徴に依存する。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は一般に、細胞の生着、細胞のホーミング、細胞の自己再生、および細胞の増殖など、生体内で生じる活動を指す。一実施形態では、「ｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖」という用語が、細胞集団がｉｎ ｖｉｖｏにおける数を増大させる能力を指す。具体的な実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖には、幹細胞の自己再生および／または増殖が含まれる。
一実施形態では、本発明が、部分的に、移植、例えば、骨髄移植のための細胞集団、例えば、骨髄細胞、動員末梢血細胞、臍帯血細胞を調製する方法であって、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞を、被験体に投与すると、接触させた細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な温度で、かつ十分な時間にわたり、ｄｍＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明が、造血再構築または造血系の再構築を必要とする被験体を処置する方法であって、造血再構築を必要とする被験体を同定するステップと、接触させた造血幹細胞および前駆細胞の生着を被験体において増大させるのに十分な条件下でｄｍＰＧＥ２など、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させることが可能である薬剤と接触させた、ある量の造血幹細胞および／または前駆細胞を被験体に投与し、これにより造血再構築を必要とする被験体を処置するステップとを含む方法を提供する。
別の具体的な実施形態では、本発明が、造血再構築、造血系の再構築、造血幹細胞もしくは前駆細胞の数の増大、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける造血幹細胞もしくは前駆細胞の増殖を必要とする被験体を処置する方法であって、造血再構築を必要とする被験体を同定するステップと、接触させた造血幹細胞または前駆細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を被験体において増大させるのに十分な条件下でｄｍＰＧＥ２など、ＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤と接触させた、ある量の造血幹細胞または前駆細胞を被験体に投与し、これにより造血再構築を必要とする被験体を処置するステップとを含む方法を提供する。
本明細書で用いられる「被験体」は、本発明の薬剤もしくは組成物もしくはデバイスにより処置しうるか、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、本発明の薬剤もしくは組成物で処理したＨＳＣもしくは臍帯血により処置しうる症状を呈示する任意の動物を包含する。造血再構築、造血系の再構築、造血幹細胞もしくは前駆細胞の数の増大、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける造血幹細胞もしくは前駆細胞の増殖を「必要とする被験体」には、本明細書の別の個所で論じられる、多様な種類の白血病、貧血、リンパ腫、骨髄腫、免疫不全障害、および充実性腫瘍を有する、またはそれらを伴うと診断された被験体が含まれるがこれらに限定されない。「被験体」にはまた、悪性疾患の処置の過程にある幹細胞移植もしくは骨髄移植または遺伝子治療の構成要素である幹細胞移植もしくは骨髄移植の候補であるヒトも含まれる。被験体にはまた、同種異系移植のために幹細胞または骨髄を提供する個体または動物も含まれうる。特定の実施形態では、被験体が、多様ながん処置などにおいて、放射線照射療法または化学療法を経ている可能性がある。適切な被験体（例えば、患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、農場動物、および家畜動物、またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が含まれる。非ヒト霊長動物、および、好ましくは、ヒト患者も含まれる。典型的な被験体には、薬剤または幹細胞移植もしくは骨髄移植により調節されうる、異常な量（「正常な」被験体または「健康な」被験体よりも低い量または高い量）の１または複数の生理学的活性を呈示する動物が含まれる。
本明細書で記載される方法において用いられている細胞集団を投与するのに適切な方法には、静脈内投与および動脈内投与などの血管内投与法が含まれるがこれらに限定されない非経口投与が含まれる。本発明の細胞を投与するさらに例示的な方法には、筋肉内注射および筋肉内注入、髄腔内注射および髄腔内注入、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）注射および嚢内注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心臓内注射および心臓内注入、皮内注射および皮内注入、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射および経気管注入、皮下注射および皮下注入、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射および関節内注入、嚢下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）注射および嚢下注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内注射および脊髄内注入、ならびに胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射および胸骨下注入も含まれる。
ある「量」の造血幹細胞および前駆細胞の、被験体への投与とは、限定なしに述べると、被験体の処置を含めた、所望の治療的結果または予防的結果を達成するのに「有効な量」の投与を指す。したがって、本明細書における目的のための造血幹細胞または前駆細胞の「治療有効量」とは、当技術分野において公知であるような検討事項により決定され、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに造血幹細胞および前駆細胞が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従い変化しうる。「治療有効量」には、被験体（例えば、患者）を「処置する」のに有効な量が含まれる。治療有効量とはまた、造血幹細胞または前駆細胞の任意の毒性作用または有害作用が、治療的に有益な効果により凌駕される量でもある。
「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに有効な造血幹細胞または前駆細胞の量を指す。予防用量は、疾患の前または早い病期にある被験体において用いられるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ないことが典型的ではあるが、必ずしもそうではない。
別の具体的な実施形態では、本発明が、幹細胞移植／前駆細胞移植を必要とする被験体を処置する方法であって、幹細胞移植／前駆細胞移植を必要とする被験体を選択するステップと、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ｄｍＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と、被験体における接触させた細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を、接触させていない細胞と比較して増大させるのに十分な温度で、かつ十分な時間にわたり接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を意図する。具体的な実施形態では、被験体が、造血再構築を必要とする。
本明細書で用いられる「処置」「処置すること」などの用語は、限定なしに述べると、疾患の症状の改善または消失を達成することを含めた、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止することとの関係で予防的な場合もあり、かつ／あるいは症状の改善もしくは消失を達成すること、または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒をもたらすこととの関係で治療的な場合もある。本明細書で用いられる「処置」とは、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、これには、（ａ）疾患の素因を示しうるが、いまだそれを有すると診断されたわけではない被験体において疾患が生じることを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること、（ｃ）疾患を緩和すること、例えば、疾患の後退を引き起こし、例えば、疾患の症状を完全にまたは部分的に消失させること、（ｄ）個体を疾患前の状態に回復させること、例えば、造血系を再構築することが含まれる。
本明細書で用いられる「処置」または「処置すること」は、疾患または病態の症状または病理に対する任意の所望の効果を包含し、これには、処置される疾患または状態についての１または複数の測定可能なマーカーが最小限であれ低減されることが含まれる。「処置」とは、必ずしも疾患もしくは状態または関連するその症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。本発明の具体的な方法では、処置または処置することが、被験体における細胞集団の生着の改善、被験体における造血再構築の改善、または被験体における生存の改善を提供する。
この種の処置を必要とする被験体には、非悪性血液障害、特に、免疫不全症（例えば、ＳＣＩＤ、ファンコニー貧血、重症再生不良性貧血、または先天性異常ヘモグロビン症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ））、または、とりわけ、ハーラー病、ハンター病、マンノシドーシスなどの代謝性蓄積症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、あるいはがん、特に、急性白血病、慢性白血病（骨髄性白血病またはリンパ性白血病）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの血液悪性疾患、または、乳がん、結腸がん、神経芽細胞種、もしくは腎細胞がんなどの非血液がんを患う（例えば、これらに罹患する）被験体が含まれる。
本発明の方法は、骨髄における造血幹細胞または前駆細胞の量を増大させるか、または造血幹細胞または前駆細胞を骨髄へと動員することが所望である任意の疾患または障害を処置するのに用いることができる。例えば、本発明の方法は、化学療法および／または放射線療法を受けるがん患者など、骨髄移植または造血幹細胞移植もしくは前駆細胞移植を必要とする患者を処置するのに用いることができる。本発明の方法は、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、および充実性腫瘍（乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、または膵臓がん）を患う患者を含め、がんのための化学療法または放射線療法を受ける患者を処置するのに特に有用である。本発明の方法はまた、再生不良性貧血、免疫性障害（重症複合型免疫不全症候群またはループス）、脊髄形成異常症、サラセミア、鎌状赤血球症、またはウィスコット−アルドリッチ症候群を患う患者を処置するのにも用いることができる。本発明の方法により処置される障害は、放射線療法、化学療法、またはジドブジン（ｚｉｄｏｖａｄｉｎｅ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ）、もしくはガングシクロビルなどの骨髄抑制薬による処置など、別の一次処置の望ましくない副作用または合併症の結果でありうる。このような障害には、好中球減少症、貧血、血小板減少症、および免疫機能不全（ｉｍｍｕｎｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）が含まれる。加えて、本発明の方法は、毒性作用物質または放射線への意図しない曝露により引き起こされる骨髄への損傷を処置するのにも用いることができる。
処置される障害はまた、骨髄の幹細胞または前駆細胞に損傷を引き起こす感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、または真菌感染）の結果でもありうる。
上記に加えて、本発明の方法を用いる処置から利益を受けうるさらなる状態には、リンパ球減少症、リンパ漏、リンパうっ滞、赤血球減少症（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、赤血球変性障害（ｅｒｔｈｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、赤芽球減少症、白赤芽球症；赤血球崩壊（ｅｒｙｔｈｒｏｃｌａｓｉｓ）、サラセミア、骨髄線維症、血小板減少症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫性（自己免疫性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＨＩＶ誘導性ＩＴＰ、脊髄形成異常症；血小板増多性疾患（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、血小板増多症、先天性好中球減少症（コストマン症候群およびシュバッハマン−ダイアモンド症候群など）、新生物関連性好中球減少症、小児性周期性好中球減少症および成人性周期性好中球減少症；感染後好中球減少症；骨髄異形成症候群；化学療法および放射線療法と関連する好中球減少症；慢性肉芽腫症；ムコ多糖症；ダイアモンドブラックファン貧血；鎌状赤血球症；またはベータサラセミアメジャーが含まれるがこれらに限定されない。
具体的な実施形態では、移植を必要とする患者が、骨髄を提供した骨髄ドナーであるか、いまだ骨髄を提供していない骨髄ドナーであるか、骨髄ドナーによる移植のレシピエントであるか、造血前駆細胞が環境ストレス下に置かれているか、貧血を有するか、正常な被験体と比較して免疫細胞機能のレベルが低下しているか、または免疫系不全症を有する。
特定の実施形態では、移植を必要とする患者が、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、慢性顆粒球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性リンパ芽球性白血病、急性非リンパ芽球性白血病、または前白血病を有する。
Ｄ．本発明の方法で用いられる薬剤
多様な実施形態では、本発明が、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤など、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる１または複数の薬剤と接触させた、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団の治療用組成物を意図する。
ｃＧＭＰの実践を用いて、本発明の治療用組成物を調製するのに有用な薬剤を、本発明の細胞を接触させるステップにおいて用いられ、内毒素を含まない容器により供給されうる、酢酸メチルなどの有機溶媒中で処方することができる。本発明により意図される薬剤は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、本明細書で記載される哺乳動物細胞に投与するのに適する。特定の実施形態では、溶媒が、典型的に、本明細書で記載される適切な有機溶媒（例えば、これらの組合せまたは混合物を含めたＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＥなど）である。１または複数の溶媒は、特定の比率で組み合わせることができる。例えば、２つの溶媒の混合物は、全ての整数および小数を含めた、９．５：０．５、９：１、８：２、７：３、６：４、５：５などの比率で組み合わせることができる。
記載「有機溶媒」または「適切な有機溶媒」は一般に、固体、液体、または気体の溶質を溶解させ、結果として溶液をもたらす炭素を含有する液体または気体に関する。「適切な」有機溶媒とは、選択された濃度の、ｅｘ ｖｉｖｏの条件下における（例えば、細胞培養物における）またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるインキュベーション時間または投与時間にわたり、毒性または他の阻害効果が最小であることなどにより、ｅｘ ｖｉｖｏにおける哺乳動物細胞への投与または哺乳動物細胞とのインキュベーションに適切であり、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおける被験体への投与にも適切でありうる有機溶媒である。適切な有機溶媒はまた、本明細書で記載される薬剤の保存安定性および取り扱いにも適切であるべきである。適切な有機溶媒の例には、これらの混合物または組合せを含めた、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、およびジメチルアセトアミドが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、組成物または有機溶媒が酢酸メチル「を実質的に含まない」とは、組成物または溶媒中に存在する酢酸メチルが痕跡量を超えず、好ましくは、検出不可能な量（例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などにより測定したときに）であるべきことを意味する。
本明細書で用いられる「内毒素を含まない」という用語は、含有する内毒素が多くとも痕跡量（すなわち、被験体に対して生理学的に有害な効果を及ぼさない量）であり、好ましくは含有する内毒素が検出不可能な量である容器および／または組成物を指す。「内毒素を実質的に含まない」とは、生物学的製剤について、細胞の１用量当たりに存在する内毒素が、ＦＤＡにより許容される内毒素より少ないことであり、１日当たり、体重１ｋｇ当たりの全内毒素が５ＥＵであり、平均的な７０ｋｇのヒトの場合、全細胞用量当たり３５０ＥＵであることを意味する。一実施形態では、「内毒素を含まない」という用語が、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％内毒素を含まない容器および／または組成物を指す。内毒素とは、特定の細菌、典型的に、グラム陰性菌と関連する毒素であるが、内毒素は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性菌においても見い出すことができる。最もよく見られる内毒素は、多様なグラム陰性菌の外膜において見い出されるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これらは、これらの細菌が疾患を引き起こす能力において中心的な病原性の特徴を表す。ヒトでは、少量の内毒素が、生理学的に有害な作用の中でも、発熱、血圧の低下、ならびに炎症および凝固の活性化をもたらしうる。したがって、少量であっても、ヒトにおいて有害な作用を引き起こしうるために、大半または全ての微量の内毒素を医薬品の容器から除去することが所望であることが多い。内毒素は、当技術分野において公知の方法を用いて、容器から除去することができる。例えば、容器は、ＨＥＰＡフィルターを備えた洗浄装置内で、内毒素を含まない水により洗浄し、２５０℃で発熱物質除去処理（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅ）をし、クラス１００／１０のクリーンルーム（例えば、１立方フィートの空気中に含有する０．５ミクロンより大きい粒子が１００個以下である、クラス１００のクリーンルーム）内に設置された、ＨＥＰＡフィルターを備えたワークステーション内で無菌パッケージングすることができる。
本明細書で用いられる「医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）」という用語は、食品、医薬品、および医療機器の製造および品質管理試験の制御および管理を指す。ＧＭＰは、必ずしもサンプリングに依拠せず、代わりに、薬物および医療機器の製造に関与する工程、活動、および操作の全ての側面についての文書化に依拠する。製品がどのように作製され、調べられたか（これによりトレーサビリティーが可能となり、将来問題が生じた場合は、市場からのリコールが可能となる）を示す文書化が適正でなく、秩序立てられていない場合、その製品は、要請される規格を満たさず、汚染されていると考えられる（すなわち、米国では、不良品と考えられる）。加えて、ＧＭＰは典型的に、全ての製造装置および試験装置が、使用に適するものとして適格性を保証されており、薬物製造工程において用いられる全ての操作法および操作手順（例えば、製造、洗浄、および分析試験）が、それらの意図される機能（複数可）を果たしうることを実証する所定の規格に従い検証されていることも要請する。米国では、「最新版医薬品の製造管理および品質管理に関する基準」が、１９３８年制定の食品医薬品化粧品法（２１ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３５１）の５０１（Ｂ）に記載されている。
本発明の治療用組成物を調製するのに用いられうる薬剤は、ヒト造血幹細胞集団または前駆細胞集団のホーミングおよび生着の潜在能を増強することが可能な薬剤である。このような薬剤には、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４による細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含めた、細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現を増大させる薬剤が含まれる。有用な薬剤には、ＰＧＥ２およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、例えば、ＰＧＥ２類似体、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサー、およびＧα−ｓ活性化因子が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ＰＧＥ２Ｒ４特異的類似体が、特に興味深く、一部の実施形態では、この薬剤は、ＰＧＥ２Ｅ４受容体に優先的に結合してそして活性化させる。
本明細書で用いられる「プロスタグランジンＥ２」または「ＰＧＥ２」という用語には、限定なしに述べると、任意の天然のＰＧＥ２分子または化学合成されるＰＧＥ２分子のほか、その「類似体」も含まれる。本明細書で用いられる「類似体」という用語は、構造および機能において、別の化学物質、例えば、ＰＧＥ２と類似する化学的分子であって、単一の元素または基により構造的に異なることが多いが、それが親化学物質と同じ機能を保持する場合は、複数の基（例えば、２つ、３つ、または４つの基）の修飾により異なる場合もある化学的分子に関する。当業者にはこのような修飾が日常的であり、これらには、例えば、酸、アルコールもしくはチオールに対するベンジル基およびアミンに対するｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル基などの保護基のエステルまたはアミドなど、付加的な化学的部分または置換された化学的部分が含まれる。また、アルキル置換（例えば、メチル置換、ジメチル置換、エチル置換など）など、アルキル側鎖基に対する修飾、側鎖の飽和レベルまたは不飽和レベルに対する修飾、および置換フェニルおよび置換フェノキシなど、修飾基の付加も含まれる。類似体にはまた、ビオチン部分またはアビジン部分などのコンジュゲート、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素も含まれる場合があり、放射能標識部分、生物発光部分、化学発光部分、または蛍光部分も含まれる。また、本明細書で記載される薬剤に部分を添加して、他の所望の特性の中でも、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するか、またはそれらの細胞の透過特性を増大させるなど、それらの薬物動態特性を変化させることもできる。また、医薬品の多くの所望の品質（例えば、可溶性、バイオアベイラビリティー、製造など）を増強することが公知であるプロドラッグ（例えば、このようなアゴニストのその開示について参照により組み込まれる、例示的なＥＰアゴニストであるプロドラッグについてのＷＯ／２００６／０４７４７６を参照されたい）も含まれる。
例示的なＰＧＥ２「類似体」およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤の例には、限定なしに述べると、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンザミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６、１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−ｔｒａｎｓ ＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノル（ｔｒｉｎｏｒ）ＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノール（ｓｅｒｉｎｏｌ）アミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノル（ｔｅｔｒａｎｏｒ）ＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥ１、ノクロプロスト（ｎｏｃｌｏｐｒｏｓｔ）、スルプロストン（ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ）、ブタプロスト（ｂｕｔａｐｒｏｓｔ）、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２が含まれる。また、９位においてハロゲンで置換された、ＰＧＥ２と類似の構造を有するＰＧ類似体または誘導体（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００１／１２５９６を参照されたい）のほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００６／０２４７２１４号において記載されている誘導体など、２−デカルボキシ−２−ホスフィニコプロスタグランジン誘導体も含まれる。
限定なしに述べると、アルプロスタジルが含まれるＰＧＥ１類似体はまた、ＰＧＥ２Ｒ２（ＥＰ２）およびＰＧＥ２Ｒ４（ＥＰ４）による細胞シグナル伝達経路を活性化させるのにも用いることができ、本発明の方法において有用な薬剤として意図される。
ＰＧＥ２Ｒ２（ＥＰ２）およびＰＧＥ２Ｒ４（ＥＰ４）による細胞シグナル伝達経路の刺激／活性化は、造血幹細胞および前駆細胞において生着を増大させ、細胞生存度を維持し、ホーミングおよび細胞の増殖を増大させる生理学的応答の根底をなすことが意図される。したがって、一実施形態では、ＰＧＥ２Ｒ２受容体およびＰＧＥ２Ｒ４受容体に結合してこれらを刺激する（すなわち、ＰＧＥ２Ｒ２／ＰＧＥ２Ｒ４アゴニストである）「非ＰＧＥ２ベースのリガンド」が、本発明の方法において用いられることを意図される。
非ＰＧＥ２ベースのＥＰ２受容体アゴニストの例示的な例には、ＷＯ２００７／０７１４５６において開示されている、ＣＡＹ１０３９９、ＯＮＯ＿８８１５Ｌｙ、ＯＮＯ−ＡＥ１〜２５９、ＣＰ−５３３、５３６、ならびにカルバゾールおよびフルオレンが含まれる。
非ＰＧＥ２ベースのＥＰ４アゴニストの例示的な例には、ＷＯ／２０００／０３８６６３、米国特許第６，７４７，０３７号、および米国特許第６，６１０，７１９号において開示されている、ＯＮＯ−４８１９、ＡＰＳ−９９９ Ｎａ、ＡＨ２３８４８、ＯＮＯ−ＡＥ１〜３２９、および他の非ＰＧＥ２ベースのＥＰ４アゴニストが含まれる。
ＰＧＥ２ＥＰ４受容体に選択的な薬剤は、ＰＧＥ２ＥＰ４受容体に優先的に結合する。このような薬剤のＥＰ４受容体に対するアフィニティーは、他の３つのＥＰ受容体、すなわち、ＥＰ１、ＥＰ２、およびＥＰ３のうちのいずれに対するアフィニティーより大きい。ＰＧＥＥＰ４受容体に選択的に結合する薬剤には、５−［（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニル−１−ブテン−１−イル］−１−［６−（２Ｈ−テトラゾール−５Ｒ−イル）ヘキシル］−２−ピロリジノン、２−［３−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（Ｅ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−［２−（メトキシメチル）フェニル］ペント−１−エニル］−５−オキソシクロペンチル］スルファニルプロピルスルファニル］酢酸、メチル４−［２−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（Ｅ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−［３−（メトキシメチル）フェニル］ブト−１−エニル］−５−オキソシクロペンチル］エチルスルファニル］ブタノエート、１６−（３−メトキシメチル）フェニル−ロ（ｒｏ）−テトラノル−５−チアＰＧＥ、５−｛３−［（２Ｓ）−２−｛（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−５−オキソピロリジン−１−イル］プロピル］チオフェン−２−カルボキシレート、［４’−［３−ブチル−５−オキソ−１−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−１，５−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾール−４−イルメチル］−ビフェニル−２−スルホン酸（３−メチル−チオフェン−２−カルボニル）−アミド］、および（（Ｚ）−７−｛（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｅ）−５−（３−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−３−ヒドロキシ−ペント−１−エニル］−４−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−２−オキソ−シクロペンチル｝−ヘプト−５−エノイン酸）、ならびにこれらの薬剤のうちのいずれかの薬学的に許容される塩からなる群より選択される薬剤が含まれるがこれらに限定されない。
「環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）エンハンサー」とは、薬剤なしまたは対照の分子／組成物と比較して、細胞におけるより多量のｃＡＭＰ、あるいは細胞におけるより大きなｃＡＭＰ活性、またはｃＡＭＰに関連するシグナル伝達経路の他の任意の関与する構成要素、またはｃＡＭＰシグナル伝達経路の下流における測定可能な生理学的応答もしくは効果の増大をもたらすかまたは引き起こす分子を指す。具体的な実施形態では、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、ｃＡＭＰ類似体またはｃＡＭＰエンハンサーである。
本発明のｃＡＭＰエンハンサーは、典型的に、ｃＡＭＰの細胞内レベルおよび／または活性を増大させるかまたは維持する。最も一般的には、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ、環状ＡＭＰ、または３’−５’−環状アデノシン一リン酸）が、多くの生物学的過程において重要な二次的メッセンジャーとして作用する。二次的メッセンジャー系とは、細胞シグナル伝達の方法であって、特定の活性化シグナルに応じて拡散性のシグナル伝達分子が迅速に産生／分泌され、次いで、これにより、細胞内のエフェクタータンパク質が活性化されて、細胞応答がなされうる方法に関する。例えば、他の応答の中でも、ｃＡＭＰのシグナル伝達は、これによらなければ細胞膜を通過することができないプロスタグランジンの効果を伝達する。ｃＡＭＰはまた、Ｃａ２＋のイオンチャネルを介する通過も制御する。
測定可能な下流の効果には、当技術分野における理解および本明細書における記載から明らかな効果の中でも、より程度の大きな幹細胞の生存度、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎまたはｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、ならびに自己再生および生着が含まれうる。ｃＡＭＰエンハンサーには、典型的に、細胞の受容体または他の分子に結合して細胞による応答を誘発する「アゴニスト」、および典型的に、ｃＡＭＰの分解を遮断する（例えば、ホスホジエステラーゼを遮断する）ことによるなど、ある作用に反対に作用する、作用を遮断／阻害する、「アンタゴニスト」が含まれうる。また、ｃＡＭＰ類似体も意図される。
ｃＡＭＰ活性はまた、多様な機構を介して負に制御される場合もある。例えば、Ｇα−ｓサブユニットにより、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解が緩徐に触媒され、これがＧｓタンパク質を不活性化させ、これにより、ｃＡＭＰ経路が遮断される。ｃＡＭＰ経路はまた、アデニリルシクラーゼを直接阻害することを介して、またはＰＫＡによりリン酸化されたタンパク質を脱リン酸化することを介して、下流で不活性化する場合もある。アデニリルシクラーゼの産生、および、したがって、ｃＡＭＰの産生は、アデニリルシクラーゼ阻害性Ｇ（Ｇｉ）タンパク質結合型受容体のアゴニストにより阻害される場合がある。ｃＡＭＰのＡＭＰへの分解は、ｃＡＭＰのシグナル伝達の負の制御因子としても作用しうる酵素であるホスホジエステラーゼにより触媒される。
ｃＡＭＰ経路を阻害する分子の例示的な例には、例えば、ｃＡＭＰをＡＭＰへと脱リン酸化し、ｃＡＭＰレベルを低減するｃＡＭＰホスホジエステラーゼ、アデニリルシクラーゼを阻害し、これにより、ｃＡＭＰレベルを低減するＧｉタンパク質、およびｃＡＭＰレベルを低下させる百日咳毒素が含まれる。
本発明のｃＡＭＰエンハンサーは、典型的に、ｃＡＭＰ経路を、この経路の任意の段階において活性化させることが可能であるか、またはｃＡＭＰの負の制御（例えば、分解）を阻止することが可能であり、これらには、このような機能的効果を有する化学物質、ポリペプチド、抗体、および他の分子が含まれる。ｃＡＭＰ経路を活性化させる例示的な分子または薬剤には、例えば、ｃＡＭＰレベルを上昇させるコレラ毒素、フォルスコリン、アデニリルシクラーゼを活性化させるジテルペン（ｄｉｔｅｒｐｉｎｅ）天然生成物、ならびにｃＡＭＰホスホジエステラーゼを阻害して、Ｇタンパク質を活性化させ、次いで、これにより、ｃＡＭＰ経路を活性化させるカフェインおよびテオフィリンが含まれうる。
ｃＡＭＰエンハンサーの例示的な例には、当技術分野において公知であるｃＡＭＰエンハンサーの中でも、フォルボールエステル、フォルスコリン、スクラレリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、コレラ毒素（ＣＴｘ）、アミノフィリン、２，４ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン、テオフィリン（ジメチルキサンチン）、ドパミン、ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）、イロプロスト（ｉｌｏｐｒｏｓｔ）、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、および血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）が含まれるがこれらに限定されない。上記で例示した通り、ｃＡＭＰエンハンサーの例にはまた、とりわけ、ｓｐ−５，６−ＤＣｌ−ＢＩＭＰＳ（ＢＩＭＰＳ）およびジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）などのｃＡＭＰおよびｃＡＭＰ類似体も含まれる。
ｃＡＭＰは、培養物中の造血幹細胞の成長および／または生存に関与する（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｎｅｇｒｏｔｔｏら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３４巻：１４２０〜１４２８頁、２００６年を参照されたい）。例えば、ジブチリルｃＡＭＰおよびＢＩＭＰＳなど、２つの異なるｃＡＭＰ類似体が、一酸化窒素（ＮＯ）または血清枯渇により誘導されるアポトーシスを抑制することにより、ヒト臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞の生存を促進することが観察された。ＰＫＡ経路およびＰＩ３Ｋ経路の関与は、それらの特異的阻害剤であるＲｐ−ｃＡＭＰおよびウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２のそれぞれが、ＢＩＭＰＳの抗アポトーシス効果を逆転させる能力により実証された。トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または幹細胞因子（ＳＣＦ）が、ｃＡＭＰレベルを増大させなかったのに対し、これらの増殖因子により及ぼされる抗アポトーシス活性は、アデニル酸シクラーゼの阻害により遮断され、ＢＩＭＰＳと協同した。したがって、環状ＡＭＰ類似体が、ＮＯまたは血清枯渇に曝露した細胞におけるコロニー形成の低下を抑制することから、ｃＡＭＰは、ＣＤ３４＋の生存を制御する重要な経路であるだけでなく、また、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、およびＳＣＦを介する細胞保護作用のメディエーターでもあると考えられることが示される。
同様に、骨髄細胞の移植後すぐに、イソプロテレノール（アデニリルシクラーゼを刺激する）またはジブチリル環状アデノシン３’，５’−一リン酸を注射することなどによりｃＡＭＰを活性化させると、ほとんど即時的に、ＤＮＡの合成を誘導することを介して、移植された幹細胞のＳ期への参入が誘発される（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｎｅｃａｓら、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、９巻：２２３〜２３０頁、２００８年を参照されたい）。
「Ｇα−ｓ活性化因子もしくはＧα−ｓ活性化剤」または「Ｇタンパク質アルファ−ｓ活性化因子もしくはＧタンパク質アルファ−ｓ活性化剤」には、刺激性Ｇ−タンパク質（「Ｇα−ｓ」）またはＧα−ｓの変異体のアルファサブユニットを活性化させることが可能である任意の分子が含まれる。Ｇα−ｓ活性化因子の例示的な例には、ＰＧＥ２ならびにそのアゴニストおよび誘導体、ならびにコレラ毒素が含まれる。具体的な実施形態では、ｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤が、Ｇα−ｓ活性化因子である。
したがって、ＰＧＥ２およびｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、例えば、ｄｍＰＧＥ類似体、ｃＡＭＰ類似体、もしくはｃＡＭＰエンハンサー、および／またはＧα−ｓ活性化因子を含む本発明の組成物を用いて、造血幹細胞の細胞生存度を保持または維持し、生着、ホーミング、自己再生、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させることができる。
したがって、具体的な実施形態では、細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、限定なしに述べると、任意の具体的な形で組み合わされた、ＰＧＥ２およびその類似体（例えば、ｄｍＰＧＥ２）ならびにｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させることにより、造血幹細胞／前駆細胞の生着／生着の潜在能／および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させる。
具体的な実施形態では、細胞集団を、各々の最終濃度を約１μＭ〜約１００μＭとする１または複数の薬剤で処理する（例えば、これらと接触させる）。特定の実施形態では、細胞集団を、各々の最終濃度を約１×１０−１４Ｍ〜約１×１０−３Ｍ、約１×１０−１３Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１２Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−５Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、約１×１０−６Ｍ〜約１×１０−４Ｍ、または任意の中間の範囲にある最終濃度とする１または複数の薬学的作用因子で処理する。
別の具体的な実施形態では、細胞集団を、各々の最終濃度を約１×１０−１４Ｍ、約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−９Ｍ、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−６Ｍ、約１×１０−５Ｍ、約１×１０−４Ｍ、約１×１０−３Ｍ、または任意の中間の最終濃度とする１または複数の薬剤で処理する。１または複数の薬剤を含む処理では、アゴニストが、互いと異なる濃度の場合もあり、同じ濃度の場合もある。
具体的な実施形態では、細胞集団を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上処理する（例えば、１または複数の薬剤と接触させる）。細胞集団は、１または複数の薬剤と、同じ容器内で間欠的に接触させることもでき、挿間的に接触させることもでき、逐次的に接触させることもできる（例えば、細胞集団を、１つの薬物とある時間にわたり接触させ、培養培地を交換し、かつ／または細胞集団を洗浄し、次いで、薬学的作用因子の同じ組合せまたは異なる組合せを使用するサイクルを、同じ所定の時間または異なる所定の時間にわたり繰り返す）。
好ましい実施形態では、細胞集団を、約３７℃、最終濃度を約１０μＭとするＰＧＥ２Ｒ２またはＰＧＥ２Ｒ４アゴニスト、例えば、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理する。
例示的な処理持続時間には、一般的に、約１時間、約２時間、または約３時間の処理時間が含まれる。
具体的な実施形態では、本発明において有用な薬剤を、第１の容器から第２の容器へと移すことができ、第２の容器が、内毒素を含まないテフロン製のキャップを伴う２ｍｌのバイアルであり、薬剤の保存またはｅｘ ｖｉｖｏにおける投与に適し、薬剤が酢酸メチルを実質的に含まないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に供給される、ストック濃度を約１０ｍＭとする１６，１６−ジメチルＰＧＥ２であり、バイアル内には空気のオーバーレイを置く。容器および溶媒を含めた組成物の全体は、無菌で内毒素を含まないことが好ましい。
特定の実施形態では、第２の容器または他の容器が、骨髄細胞、末梢血細胞、または臍帯血細胞などの造血幹細胞または前駆細胞を含めた細胞を含みうる。したがって、これらの実施形態および他の実施形態は、組成物を、第１の容器または最初の容器から、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処理条件に適し、造血幹細胞または前駆細胞を適切な培地中に含む第２の容器へと移すことを伴いうる。代替的に、ヒト細胞集団を、ＰＥバッグまたはチューブなど、既に組成物を含有し、既にｅｘ ｖｉｖｏにおける処理条件またはインキュベーション条件に適する第１の容器または第２の容器へと移すこともできる。
Ｅ．本発明の投与準備ができた組成物
本発明の治療用組成物は、無菌であり、投与に適切であり、かつ、ヒト患者への投与の準備ができている（すなわち、さらなる加工なしに投与しうる）。一部の実施形態では、治療用組成物は、患者への注入の準備ができている。本明細書で用いられる「投与準備ができている」、「投与の準備ができている」、または「注入の準備ができている」という用語は、被験体への移植または投与の前にさらなる処理または操作を必要としない、本発明の細胞ベースの組成物を指す。
患者への投与に適する無菌の治療的に許容される組成物は、１または複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／もしくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される培地、例えば、細胞培養培地）、または薬学的に許容される他の構成要素を含みうる。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、投与される具体的な組成物により部分的に決定されるほか、治療用組成物を投与するのに用いられる具体的な方法によっても決定される。したがって、本発明の治療用組成物には、適切な処方物が多種多様に存在する（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１７版、１９８５年を参照されたい）。
具体的な実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む治療的な細胞組成物が、薬学的に許容される細胞培養培地を含む。本発明の細胞ベースの組成物を含む治療用組成物は、経口投与法または非経口投与法を介して別個に投与することもでき、所望の処置目標を実現するのに適切な他の化合物と組み合わせて投与することもできる。
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、それを、処置されるヒト被験体への投与に適するために十分に純度が高く、十分に毒性が低くなければならない。それはさらに、治療用組成物の安定性を維持するかまたは増大させるものとする。薬学的に許容される担体は、液体の場合もあり、固体の場合もあり、本発明の治療用組成物の他の構成要素と組み合わせた場合に、所望のバルク、コンシステンシーなどをもたらすように、計画された投与方式で選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、限定なしに述べると、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）デンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状の二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化した植物油、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）デンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）でありうる。本発明の組成物に適する他の薬学的に許容される担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるがこれらに限定されない。
このような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤も含有しうる。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、その化学的組成により、ｐＨの著明な変化なしに酸または塩基が中和される溶液または液体を指す。本発明により想定される緩衝液の例には、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、リンゲル液、水中に５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常／生理食塩液（０．９％のＮａＣｌ）が含まれるがこれらに限定されない。
これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３〜約１０に維持するのに十分な量で存在しうる。それ自体、緩衝剤は、全組成の重量対重量ベースで最大約５％でありうる。また、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどであるがこれらに限定されない電解質も、治療用組成物に包含されうる。
一態様では、治療用組成物のｐＨが、約４〜約１０の範囲にある。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５〜約９、約６〜約９、または約６．５〜約８の範囲にある。別の実施形態では、治療用組成物が、前記ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物のｐＨが約７である。代替的に、治療用組成物のｐＨは約６．８〜約７．４の範囲にある。さらに別の実施形態では、治療用組成物のｐＨが約７．４である。
本発明の無菌組成物は、薬学的に許容される非毒性培地中の無菌溶液または無菌懸濁液でありうる。本明細書で用いられる「懸濁液」という用語は、細胞を固体の支持体に結合させない非付着状態を指しうる。例えば、懸濁液中で維持されている細胞は、撹拌することができ、培養ディッシュなどの支持体に付着していない。
懸濁液とは、微細に分割された種を別の種と組み合わせた分散液（混合物）であって、前者がすぐには沈殿しない程度まで微細に分割され、混合されている分散液（混合物）である。懸濁液は、溶液を含めた液体培地などのビヒクルを用いて調製することができる。具体的な実施形態では、本発明の治療用組成物が懸濁液であり、造血幹細胞および／または前駆細胞を、許容される液体培地または溶液、例えば、生理食塩液または無血清培地内に分散させており、固体の支持体には結合させていない。日常で最も一般的な懸濁液は、液体の水における固体の懸濁液である。用いられうる許容される希釈剤、例えば、ビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、等張性の塩化ナトリウム溶液（生理食塩液）、および無血清細胞培養培地がある。一部の実施形態では、懸濁液を作製するのに高張性の溶液を用いる。加えて、従来は、溶媒または懸濁培地として無菌の固定油が用いられている。非経口適用では、特に適切なビヒクルが、溶液、好ましくは油性溶液または水性溶液のほか、懸濁液、エマルジョン、またはインプラントからなる。水性の懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有する場合があり、これには、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが含まれる。一部の実施形態では、注入溶液が、対象組織に対して等張性である。一部の実施形態では、注入溶液が、対象組織に対して高張性である。
本発明の投与準備ができている治療用組成物を構成する、薬学的に許容される担体、希釈剤、および他の構成要素は、治療用組成物が臨床レジメンで用いられることを可能とする米国薬局方グレードの試薬に由来する。典型的に、任意の培地、溶液、または他の薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含めたこれらの完成試薬は、濾過滅菌するなど、当技術分野における従来の方式で滅菌し、使用の前に、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属汚染、内毒素汚染、またはウイルス汚染など、多様な望ましくない汚染物質について調べる。一実施形態では、薬学的に許容される担体が、ヒトまたは動物由来の天然のタンパク質を実質的に含まず、造血幹細胞および前駆細胞を含めた治療用組成物の細胞集団を保存するのに適する。治療用組成物は、ヒト患者へと投与されることを意図し、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
本発明はまた、部分的に、本発明の具体的な組成物および／または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用も意図する。このような組成物は、ヒト被験体への投与に適する。一般的に述べると、本発明の所望の再プログラム化された細胞および／またはプログラム化された細胞の維持、成長、および／または健康を支持する任意の培地が、医薬用細胞の培養培地として用いるのに適する。具体的な実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地が、無血清培地である。
治療用組成物は、組成物に含まれる細胞集団を保存するのに適する無血清培地を含みうる。無血清培地は、簡素化されかつより良好な規定された組成、低減された程度の汚染物質、感染性作用物質の潜在的な供給源の除去、および費用の低減を含め、血清を含有する培地を凌駕する複数の利点を有する。多様な実施形態では、無血清培地が非動物性であり、場合によって、タンパク質非含有でありうる。場合によって、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有しうる。「非動物性」培地とは、構成要素が動物以外の供給源に由来する培地を指す。非動物性培地では、組換えタンパク質により天然の動物タンパク質を置換し、栄養素は、合成供給源、植物供給源、または微生物供給源から得る。これに対し、タンパク質非含有培地、とは、タンパク質を実質的に含まない培地として定義される。
本発明において用いられる無血清培地は、ヒトのための治療プロトコールおよび治療用製品において用いるのに適する処方物である。１つの無血清培地は、米国特許第５，９４５，３３７号において記載されている、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）である。ＱＢＳＦ−６０は、米国薬局方グレードの構成要素で最適化されており、基礎培地であるＩＭＤＭに加えて、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ヒト注射用グレードの血清アルブミン（４ｍｇ／ｍｌ）（Ａｌｐｈａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、部分的に鉄飽和させたヒトトランスフェリン（３００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎまたはＢａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、およびヒト組換えインスリンナトリウム（０．４８Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）からなる。当技術分野において公知である他の無血清培地には、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のカタログ ＳｔｅｍＰｒｏ−３４無血清培養培地：Ｃａｐｍａｎａｙら、「Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ、ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ、ｓｔａｔｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＦＬＴ３−Ｌ ａｎｄ ＭＩＰ−１α ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ」、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、８４巻：６７５〜６８２頁（１９９９年）； Ｄａｌｅｙ， Ｊ Ｐら、「Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ−３４ Ｍｅｄｉｕｍ」、Ｆｏｃｕｓ、１８巻（３号）：６２〜６７頁；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のカタログ ＡＩＭ Ｖ無血清培養培地についての情報、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社のカタログ Ｘ−ＶＩＶＯ １０無血清培養培地についての情報、「Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｂａｓａｌ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ」と題された米国特許第５，３９７，７０６号； Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇら、１８巻：１５３〜４頁（２０００年）； Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２６巻（４号）：２８８〜９８頁（１９９８年４月）が含まれるがこれらに限定されない。
当業者は、上記の培地の例が例示的なものであり、本発明において用いるのに適する培地の処方を限定するものではなく、多くのこのような培地が当業者に公知であり利用可能であることを理解するであろう。
多様な実施形態では、本発明の治療用組成物が、５％のＨＳＡなど、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および低分子量（ＬＭＷ）デキストランの無菌溶液を含む。
治療用組成物は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属汚染、内毒素汚染、および微生物汚染を実質的に含まない。具体的な実施形態では、治療用組成物が、約１０、５、４、３、２、１、０．１、０．０５μｇ／ｍｌ未満のウシ血清アルブミンを含有する。
内毒素に関して「〜を実質的に含まない」とは、生物学的製剤について、細胞の１用量当たりに存在する内毒素が、ＦＤＡにより許容される内毒素より少ないことであり、１日当たり、体重１ｋｇ当たりの全内毒素が５ＥＵであり、平均的な７０ｋｇのヒトの場合、全細胞用量当たり３５０ＥＵであることを意味する。
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属汚染および微生物汚染に関して本明細書で用いられる「〜を実質的に含まない」とは、当業者に公知である、一般に受容されている検査についての陰性の読み取り値を意味する。例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属汚染は、治療用組成物の試料をブロス培地中で継代培養し、１、３、７、および１４日目に、適切な陽性対照および陰性対照と共に、３７℃で寒天プレート上に分配することにより、決定する。試料の外見を、１００倍の顕微鏡により陽性対照および陰性対照の外見と比較する。加えて、指標細胞培養物の接種物を３〜５日間にわたりインキュベートし、ＤＮＡに結合する蛍光色素を用いる落射蛍光顕微鏡法により、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属の存在について６００倍で検討する。寒天および／またはブロス培地による手順ならびに指標細胞の培養による手順がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ属汚染の証拠を示さなければ、試料を良好なものと考える。
本発明の治療用組成物を、ＨＬＡタイピングし、移植について特定の患者に適合する場合もあり、部分適合する場合もある。ＨＬＡタイプとは、ヒト白血球抗原と呼ばれるタンパク質の固有のセットを指す。これらのタンパク質は、各個体の細胞に存在し、免疫系が「異物」から「自己」を認識することを可能とする。異物として認識される細胞または組織を投与すると、免疫拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）など、適合性の問題がもたらされる可能性がある。したがって、臓器移植および組織移植では、ＨＬＡタイプおよび適合が特に重要である。
６つの主要なＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＱ）が存在する。ヒト集団では、各ＨＬＡ抗原が複数のアイソフォームを有し、各個体は、各ＨＬＡについて、ヒトゲノムの二倍体の性質のために、２つの異なるアイソフォームを有しうる。したがって、完全な適合であれば、１２のアイソフォーム中１２に適合するであろう。意図されるレシピエントと同じ個体、またはその一卵性双生児から提供された細胞または組織は完全なＨＬＡタイプを有し、これを同系または自系と称する。また、民族的背景および人種が含まれるがこれらに限定されない特定の因子が、特定のＨＬＡタイプと相関することも理解される。
多くの主要なＨＬＡアイソフォームおよび副次的なＨＬＡアイソフォームが存在し、適切な適合には、主要なＨＬＡのサブセット、全ての主要なＨＬＡ、一部もしくは全ての主要なＨＬＡおよび副次的なＨＬＡ、または当技術分野に公知である、免疫拒絶またはＧＶＤＨを軽減する任意の組合せの間における適合が含まれうることが理解される。また、何が良好なＨＬＡタイプの適合を構成するかについての特定の指針は、多くの因子に依存することも理解される。したがって、所与の細胞試料または組織試料の所与の個体への移植についての適性を評価するには、当業者による判断が不可欠である。
ＨＬＡタイプは、いわゆる低分解能法を用いて、例えば、血清型別により決定することもでき、抗体ベースの方法を用いて決定することもできる。血清型別は、抗体によるＨＬＡタイプの認識に基づく。血清型別では、２８の異なるＨＬＡ−Ａ遺伝子、５９のＨＬＡ−Ｂ遺伝子および２１のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を識別することができる。血清型別法による完全な適合であれば、各個体に存在する各ＨＬＡ（Ａ、Ｂ、およびＣ）について２つずつの対立遺伝子に言及するので、いわゆる６個中６個の適合となろう。特定の場合には、６個中５個以下の適合も、当業者により良好な適合として決定される場合がある。
ＨＬＡタイプを決定する他の低分解能法または中程度分解能法では、個体のＨＬＡアイソフォームは検討するが、個体のＨＬＡ対立遺伝子の実際の配列決定には依拠しない。ドナーが試料を受容する個体と血縁であることが多く、この場合は、血清型別単独でまたは他の低分解能法または中程度分解能法との組合せでも、試料が移植に適するかどうかを決定するのに十分でありうる。他の場合、６個中５個以下の適合は容易に見出されるが、完全な適合は見出されない。このような場合は、より良好なＨＬＡタイプの適合を見出すのに時間および労力を浪費するより、適合がより低い細胞または組織を用いる方が有利でありうる。
高分解能法は、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子発現産物（タンパク質またはＲＮＡ）の具体的な配列を調べることを伴う。高分解能法は、数千個の異なるアイソフォームを識別しうる。
少なくとも、治療用組成物のＨＬＡタイピングを、６つのＨＬＡ遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−ＤＲについて、例えば、低分解能／スプリット抗原レベルで実施する。
ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子タイピングには、ＤＮＡベースの試験法を用いることができる。ＤＮＡベースの試験は、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに用いることができる。患者、家族にタイピングを施し、潜在的な非血縁ドナーのＨＬＡタイプを確認するための移植センターのガイドラインは、主にＤＮＡベースの試験法を、ＤＲＢｌには対立遺伝子レベルの分解能で、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂには低分解能／スプリット抗原レベルで用いて、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座、およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座にタイピングを施すことを包含する。患者および選択されたドナーのタイピングは、同じ試薬、方法、および解釈基準のセットを新鮮な組織試料と共に用いて実施して、ＨＬＡの同一性を確実にすることができる。ＨＬＡ検査のための品質保証および品質管理を順守する。
多様な実施形態では、細胞集団が、ハプロタイピングされている造血幹細胞または前駆細胞を含む。一部の実施形態では、治療用組成物を構成する細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１に基づき、ＨＬＡタイピングされている。具体的な実施形態では、細胞集団が、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＤＰＢ１からなる群に基づきＨＬＡタイピングされている。一部の実施形態では、治療用組成物を構成する細胞集団が、特定のヒト患者と適合する。一部の実施形態では、ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する。ＨＬＡの適合は、対立遺伝子または抗原およびこれらの組合せに基づく。一部の実施形態では、ＨＬＡハプロタイピングされている細胞集団が、治療用組成物が投与される被験体など、特定のヒト被験体と部分的に不適合である。
本発明の治療用組成物は、ＦＤＡによる製品の免許下付（すなわち、ＦＤＡの承認）ならびに他の諸国および規制地域における他の保健当局による製品の免許下付のほか、製品の適応、製品の有効性、安全性、および純度に関する特徴づけの情報を伴う製品の表示を得ることが可能である。ＦＤＡによる免許下付は、細胞用量およびＨＬＡの不適合に基づく可能性が高い。一部の実施形態では、本発明の治療用組成物を、公認の基準に従い無菌で加工および低温保存し、例えば、ＲＨおよびＡＢＯ分類、ＨＬＡタイピング、ならびにＡ遺伝子座、Ｂ遺伝子座、およびＤＲ−ベータ−１遺伝子座、ならびに加工後のカウント、ＣＤ３４＋細胞カウント、ＣＦＵ−ＧＭカウント、感染性疾患についてのスクリーニング、家族歴、および母体による供出同意の証拠について表示する。移植に用いられる治療用組成物であれば、少なくとも４／６の抗原または３／６の対立遺伝子に適合する細胞、および本明細書で記載される細胞用量が含まれるであろう。
Ｆ．スマートバイオ容器
多様な実施形態では、本発明が、部分的に、細胞療法であって、細胞集団を、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件下で１または複数の薬学的作用因子と接触させるステップと、接触させた細胞を被験体に投与するステップとを含む細胞療法、例えば、幹細胞移植／前駆細胞移植を意図する。
本発明は、部分的に、被験体（例えば、ヒト）における幹細胞の生着を増大させる方法であって、造血幹細胞および／または前駆細胞（例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、および／または臍帯血細胞）を含む細胞集団を、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞の生着を増大させるのに十分な条件下でＰＧＥ２、ｄｍＰＧＥ２、またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤など、造血幹細胞および／または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を増大させる薬剤と接触させるステップと、接触させた細胞を被験体に投与するステップとを含む方法をさらに意図する。
本発明は、部分的に、被験体（例えば、ヒト）における造血幹細胞数または前駆細胞数を増大させる方法であって、造血幹細胞および／または前駆細胞（例えば、骨髄細胞、末梢血細胞、および／または臍帯血細胞）を含む細胞集団を、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件下でＰＧＥ２、またはその類似体、例えば１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤など、造血幹細胞および／または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を増大させる薬剤と接触させるステップと、接触させた細胞を被験体に投与するステップとを含む方法をさらに意図する。
多様な例示的実施形態では、本発明が、部分的に、造血幹細胞または前駆細胞を、ＰＧＥ２またはその類似体、例えば、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、幹細胞／前駆細胞の生存度を維持し、生着、ホーミング、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を増大させるのに十分な条件下で接触させる方法を提供する。
一実施形態では、本発明が、部分的に、移植、例えば、骨髄移植のための細胞集団、例えば、骨髄細胞、動員末梢血細胞、臍帯血細胞を調製する方法であって、細胞を、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を接触していない細胞と比較して増大させるのに十分な条件下でｄｍＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させるステップを含む方法を提供する。
具体的な実施形態では、本発明が、被験体における造血幹細胞または前駆細胞の生着を増大させる方法であって、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞の生着を、接触していない細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、ｄｍＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させた細胞供給源または細胞集団を被験体に投与するステップを含む方法を意図する。
別の具体的な実施形態では、本発明が、造血幹細胞移植／前駆細胞移植を必要とする被験体を処置する方法であって、造血幹細胞移植／前駆細胞移植を必要とする被験体を選択するステップと、本明細書で記載される内毒素を含まない容器において、被験体における接触させた細胞の生着および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖を、接触していない細胞と比較して増大させるのに十分な条件下で、ｄｍＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤と接触させた細胞集団を被験体に投与するステップとを含む方法を意図する。
本明細書で用いられる「容器」という用語は一般に、本明細書で提示され、意図される多様な目的で、造血幹細胞または前駆細胞およびこれらの副産物を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、または別の形で培養する目的、取り扱う目的、操作する目的、保存する目的、解析する目的、インキュベートする目的、投与する目的、および別の形で樹立する目的、支持する目的、採取する目的のために用いることが可能である任意の品目に関する。
容器（ｖｅｓｓｅｌ）の例示的な実施形態には、バッグ（例えば、静脈内（ＩＶ）バッグ；細胞培養バッグ、例えば、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）、ＫｒｙｏＳｕｒｅ（商標）、ＫｒｙｏＶｕｅ（商標）、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）、ＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）、Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）、ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標））、バイオリアクター、細胞培養デバイスまたは組織培養デバイス、パウチ、カプセル、培養バイアル、装置、細胞ファクトリー（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、培養チューブ（例えば、微量遠心用チューブ、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＴＵＢＥＳ（登録商標）、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）円錐形チューブなど）、培養ディッシュ（例えば、ペトリディッシュ）、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、マルチウェルプレート（例えば、２ウェルプレート、４ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、および３８４ウェルプレート）、マイクロインキュベーター、マイクロキャリア、マイクロプレート、マイクロスライド、およびチャンバースライド、および植え込み用デバイス（例えば、コラーゲンスポンジ）が含まれるがこれらに限定されない。容器は、複数回にわたり用いる場合もあり、単回使用容器の場合もある。
本発明の容器は、内毒素を含まないことが好ましく、本明細書の別の個所で論じたＧＭＰの実務に従い製造される。
具体的な実施形態では、容器を以下の特徴：ガス透過性（酸素、二酸化炭素、および窒素のガス移動速度が適切な材料）、水分喪失率が無視できる程度であること（水に対して事実上不透過性の材料）、化学的および生物学的に不活性であること（容器内容物と反応しない材料）、多様な条件下で可撓性および強度を保持すること（容器をマイクロウェーブ処理すること、ＵＶ照射で処理すること、遠心分離すること、または広範な温度範囲内、例えば、−１００℃〜＋１００℃で用いることを可能とする材料）のうちの１または複数を備える材料から作製することができる。
当業者は、所望の透過性、生物反応特性、および生物適合特性、温度耐性、可撓性、熱伝導性、および強度を伴う適切なポリマー材料を選択しうる。
本発明の容器を作製するのに適する例示的な材料には、ガラス、セラミックス、金属、熱硬化性のモノマーおよびならびにエラストマーのモノマーおよびポリマー、ならびにモノマーおよびポリマーの熱可塑性プラスチックが含まれるがこれらに限定されない。限定なしに述べると、本発明の容器を作製するのに適する例示的な熱可塑性材料には、アセタール樹脂、デルリン（ｄｅｌｒｉｎ）、フルオロカーボン、ポリエステル、ポリエステルによるエラストマー、メタロセン、ポリアミド、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリブタジエン、シリコーン樹脂、ＡＢＳ（「アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン」の頭字語）、ポリカーボネート（プラスチック業界ではまた、「ＰＣ」とも称する）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、液晶ポリマー、合金、ならびにこれらの組合せおよび混合物および複合材、ならびに強化合金、ならびにこれらの組合せおよび混合物および複合材が含まれる。
具体的な実施形態では、容器を、フタル酸ジエチルヘキシル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびフッ化エチレンプロピレンからなる群より選択される１または複数の材料から作製することができる。
多様な例示的実施形態では、壁断面厚が、選択された材料および意図される適用に基づき、その潜在的な関数となるように、容器を作製することができる。限定なしに述べると、例示的な壁断面厚には、約０．２５ｍｍ〜約２．０ｍｍの厚さ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍの厚さ、および約０．７５ｍｍ〜約１．２５ｍｍの厚さが含まれる。具体的な実施形態では容器の壁断面厚が、少なくとも０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、もしくは２．０ｍｍ、または任意の中間の厚さである。
具体的な例示的実施形態では、本発明の容器を、特定の容量を収容するようにデザインする。限定なしに述べると、本発明の容器の例示的な容量には、任意の中間の容量を含めた、約１０ｍＬ、約２５ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１５０ｍＬ、約２５０ｍＬ、約５００ｍＬ、約７５０ｍＬ、約１０００ｍＬ、約１２５０ｍＬ、約１５００ｍＬ、約１７５０ｍＬ、約２０００ｍＬ以上の容量が含まれる。例えば、１０ｍＬ〜２５ｍＬの中間の容量には、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬ、１５ｍＬ、１６ｍＬ、１７ｍＬ、１８ｍＬ、１９ｍＬ、２０ｍＬ、２１ｍＬ、２２ｍＬ、２３ｍＬ、および２４ｍＬが含まれる。
特定の実施形態では、本明細書で意図される容器が、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのコンパートメントを備える。コンパートメントは、同じサイズの場合もあり、異なるサイズの場合もあり、同じ多孔度の場合もあり、異なる多孔度の場合もある。一実施形態では、隣接するコンパートメントの多孔度が、小分子、栄養素、ポリペプチド、および／または増殖因子は、コンパートメント間で自由に交換されうるが、各コンパートメントの細胞は、それらの各々のコンパートメントに制約されるような多孔度である。
当業者は、容器の作製材料および意図される使用についての知識に基づき、所望の厚さ、容量、およびコンパートメント数を有する容器を作製することができる。
具体的な実施形態では、容器を、特定のコーティング、フィルム、もしくは他の薬剤、例えば、ＰＧＥ２またはｄｍＰＧＥ２活性を有する薬剤、またはこれらの適切な組合せを収容する材料から作製することができる。
容器の内面は、当業者に公知の方法を用いて、多様な疎水性の分子、親水性の分子、または両親媒性の分子によるコーティングを収容するようにデザインすることができる。例えば、熱硬化性材料、エラストマー、ゴム、ならびに、ポリスチレン、ポリカーボネート、ＡＢＳ、および本明細書で開示される他のポリマー材料などの熱可塑性プラスチックなど、例えば、一般に用いられる疎水性材料は、疎水性分子（例えば、１または複数の疎水性領域を有するタンパク質）に対する結合を有する。さらに、特定の実験的適用、産業的適用、または臨床的適用は、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物など、多様な種類の分子に対する結合を必要とする場合もあり、これを除外する場合もあり、これらに対して中立である場合もある。また、具体的な適用の目的に応じて、担体への分子の結合を阻止することが所望の場合もあり、これを最小化することが所望の場合もあり、かつ／またはこれを最大化することが所望の場合もある。
具体的な例示的実施形態では、本明細書で意図される容器が、化合物、細胞、細胞培養培地などを導入、交換、または除去するための、１または複数の入力ポートおよび／または出力ポートを含む。ポートは、適切な場合、針なしのアクセスをもたらす場合もあり、針のためのアクセスポイントを包含する場合もある。各ポートは、１または複数のアダプター（例えば、ルアーアダプター）、バルブ、および／またはフィルターを含有する場合もある。
本発明は、部分的に、例えば、容器内容物の温度、容器が任意の所与の温度にあった時間、および多様な環境条件（例えば、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度、グルコース濃度）を示す、任意の適切な組み合わせおよび構成での、１または複数のデバイスを備える容器を意図する。本発明は、カード、ストリップ、ディスク、スティッカー、ラベル、プローブ、センサー、および小型の電子デバイスなどの形態にあるデバイスを意図する。意図されるデバイスは、容器の材料へと統合することもでき、代替的に、容器とは別個に製造し、その後、容器の外面に恒久的にまたは非恒久的に固定または接着することもできる。
一実施形態では、容器が、温度表示デバイスを備える。好ましい実施形態では、容器が、温度表示デバイスおよび経過時間表示デバイスの両方を、個別のデバイスとして別個に備えるか、または単一のデバイスとして組み合わせて備える。さらなる実施形態では、容器が、温度表示デバイス、経過時間表示デバイス、および環境条件を示す１または複数のデバイスを備える。複数のデバイスを、個別のデバイスとして別個に作製することもでき、単一のデバイスとして作製することもできる。
本明細書で用いられる「温度表示デバイス」という用語とは、容器および／または容器内容物の温度を感知、測定、および／または表示し、１または複数の「温度計」を備えるデバイスを指す。本明細書で用いられる「温度計」という用語は、温度を示す信号をもたらすインジケーターを指す。温度計は、リアルタイムの温度、または任意の所定の長さの時間にわたる特定の温度への曝露に対応する信号をもたらしうる。具体的な実施形態では、温度計が、可逆的である。他の実施形態では、１または複数の温度計が、容器および／または容器内容物が所定温度に到達したか、または特定の長さの時間にわたり所定温度にあったことを不可逆的に示す。さらなる実施形態では、温度表示デバイスが、１または複数の可逆的温度計および不可逆的温度計を、任意の数または組合せで備える。
温度表示デバイスは、使用者が作動させる場合もあり、所定温度へと曝露されると作動する場合もある。本明細書で用いられる「所定温度」という用語は、使用者によりモニタリングのために選択された温度または温度範囲を指す。多様な実施形態では、所定温度が、容器が使用のために意図される所望の温度または温度範囲を示す「標的温度」である。多様な実施形態では、温度表示デバイスが、１または複数の所定温度、すなわち、標的温度にあるか、これを上回るか、もしくはこれを下回るか、または標的温度範囲を上回るか、これを下回るか、もしくはこの範囲内にある容器および／または容器内容物の温度を示す温度計を提供する。限定なしに述べると、本発明は、多様な標的温度および標的温度範囲を意図する。
各種の信号が、本発明の温度計において用いられることを意図されている。例えば、温度計は、視覚信号（例えば、デジタル表示、色の変化、グラフ）、聴覚信号、赤外線信号、ラジオ波信号、アナログ信号、デジタル信号、またはこれらの組合せを生成することにより、温度を示しうる。例えば、温度表示デバイスには、温度を示す液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、温度を示すかもしくはこの品目が所定の標的温度未満にあるかもしくはこれを超えることを特定する音声（ｖｏｉｃｅ）または発話（ｓｐｅｅｃｈ）合成装置、音波、超音波、もしくは他の波を介して温度を示す、アナログ信号、赤外線信号、またはラジオ波信号、および／または温度を電子的に示すデジタル信号のうちの１または複数が含まれうる。
温度の視覚的表示をもたらす温度計は、標的温度にあるか、これを上回るか、もしくはこれを下回るか、または標的温度範囲を上回るか、これを下回るか、もしくはこの範囲内にある容器および／または容器内容物の温度に対応する色を含む信号をもたらしうる。本発明は、限定なしに述べると、任意の色の組合せを、任意の温度計の数および組合せと共に用いうることを意図する。当業者であれば、特定の温度において特定の色を反映する任意の数の化学物質を用いうるであろうし、特定の温度に対応する所望の色を反映するこのような化学物質を選択しうるであろう。
さらなる例示的な実施形態では、温度表示デバイスが、各々が所定の温度または温度範囲を示す１または複数の温度計を含む１または複数の温度目盛を備えうる。温度目盛内の各温度計は、信号（例えば、視覚信号、デジタル信号）をもたらしうる。
例示的に述べると、温度目盛には、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃、１１０℃、１２５℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、または２００℃以上の範囲にわたり増分を１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃とする温度計が含まれる。
例示的な温度範囲には、限定なしに述べると、約４℃〜約６５℃、約４℃〜約５０℃、約４℃〜約４２℃、約４℃〜約３７℃の範囲、または任意の中間の温度範囲が含まれる。
本発明は、限定なしに述べると、温度表示デバイスが、１または複数の温度目盛を含むことが可能であり、各目盛が所定の温度または温度範囲を示す任意の温度範囲にわたる任意の増分において、任意の数および組合せの温度計を含むことを意図する。
一実施形態では、温度表示デバイスが、各々が特異的な温度範囲と関連する複数の可逆的温度計、および１または複数の所定温度に到達したか、または任意の所定の長さの時間にわたりこの温度にあったときを示す、１または複数の不可逆的温度計を備える。可逆的インジケーターは、温度の視覚的表示を、個別にリアルタイムで提示する。温度の視覚的表示は、標的温度にあるか、これを上回るか、もしくはこれを下回るか、または標的の温度範囲を上回るか、これを下回るか、もしくはこれ以内にある容器および／または容器の内容物の温度に対応する。不可逆的インジケーターは、一たび所定温度に到達すると、視覚的表示を維持する。
本発明は、１もしくは複数の温度表示デバイスおよび１もしくは複数の経過時間表示デバイス、または多様な環境条件を表示するデバイスを含む容器をさらに意図する。
本明細書で用いられる「経過時間表示デバイス」いう用語は、１または複数の「経過時間インジケーター」を含むデバイスを指す。本明細書で用いられる「経過時間インジケーター」という用語は、所定の長さの時間が経過したときを測定し、モニタリングし、これを示すインジケーターを指す。各経過時間インジケーターは、使用者が個別に作動させる場合もあり、具体的な所定の温度または温度範囲へと曝露されると作動する場合もある。
作動させると、経過時間インジケーターは、作動からの時間を示す。一実施形態では、所与の経過時間インジケーターが、所定量の時間を測定し、次いで、所定量の時間が経過したときを示す信号をもたらす。多様な例示的実施形態では、経過時間表示デバイスが、１、２、３、４、５つ以上の経過時間インジケーターを含み、各々の経過時間インジケーターを使用者が個別に作動させる場合もあり、同じであるかまたは異なる所定の温度または温度範囲への曝露によりこれが作動する場合もある。
多様な実施形態では、本発明が、部分的に、容器および／または内容物が、１または複数の所定の温度もしくは温度範囲に曝露されていたか、この温度もしくは温度範囲にあったか、またはこの温度もしくは温度範囲に維持されていた時間を示す経過時間インジケーターを備える容器を意図する。関連する実施形態では、経過時間インジケーターが、容器および／または内容物が、１または複数の所定の温度もしくは温度範囲に曝露されていたか、この温度もしくは温度範囲にあったか、またはこの温度もしくは温度範囲に維持されていた所定量の時間を示す。経過時間インジケーターは、持続的信号をもたらす場合もあり、総所定時間のうちの所定の百分率が経過した時点において１または複数の信号をもたらす場合もあり、例えば、一定間隔で、測定される総経過時間の信号をもたらす。
一実施形態では、経過時間インジケーターが、一定間隔で、測定される総経過時間の信号をもたらす。例えば、経過時間インジケーターを、１時間の総経過時間を測定し、示すようにデザインする場合、インジケーターは、１５分間、３０分間、４５分間、および１時間が経過した時点を示す信号をもたらしうる。例示的な一定間隔には、１分間の間隔、２分間の間隔、５分間の間隔、１０分間の間隔、１５分間の間隔、２０分間の間隔、３０分間の間隔、４５分間の間隔、６０分間の間隔、９０分間の間隔、１２０分間以上の間隔が含まれる。任意の総経過時間内における例示的な一定間隔の数には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の間隔が含まれる。
別の実施形態では、経過時間インジケーターが、経過した時間の量、またはいまだ経過していない時間（すなわち、残り時間）の量を示す持続的信号をもたらす。例えば、１時間の総経過時間を測定し、示すようにデザインされる経過時間インジケーターは、プログレスバー、円グラフ、または時計の形態であり、作動すると信号がもたらされ、これが経過した総経過時間の部分に照らして直線的に増大する。一実施形態では、全時間が経過すると、経過時間インジケーターは、信号をもたらすことを中断する場合もあり、全時間が経過したことを示す異なる信号をもたらす場合もある。
具体的な例示的実施形態では、経過時間表示デバイスが、経過時間インジケーターの１または複数の任意の組合せを備える。各経過時間インジケーターは、使用者が個別に作動させる場合もあり、異なる所定温度へと曝露されると作動する場合もある。加えて、各経過時間インジケーターは、異なる所定の長さの時間にわたり信号を測定し、発生させることも可能である。
例示だけを目的として述べると、単一の経過時間表示デバイスは、使用者が作動させ、１時間の経過時間を測定および表示する経過時間インジケーター、使用者が作動させ、２時間の経過時間を測定および表示する経過時間インジケーター、使用者が作動させ、１０分間の経過時間を測定および表示する経過時間インジケーター、４℃の所定温度へと曝露されると作動し、作動させてから１時間、２時間以上の経過時間を測定し、これを示す経過時間インジケーター、および／または３０℃〜４０℃の範囲にある、好ましくは３７℃である所定温度へと曝露されると作動し、作動させてから１時間、２時間以上の経過時間を測定し、これを示す経過時間インジケーターを備えうる。
経過時間インジケーターによりもたらされる例示的な種類の信号には、視覚信号、聴覚信号、赤外線信号、ラジオ波信号、デジタル信号、アナログ信号、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、部分的に、例えば、容器内容物のｐＨ、二酸化炭素濃度、酸素濃度、浸透圧、またはグルコース濃度を測定し、モニタリングし、表示する１または複数の環境インジケーターを備える表示デバイスを含む容器をさらに意図する。一実施形態では、環境インジケーターが、環境条件を示す信号を持続的にモニタリングし、発生させる。別の実施形態では、環境インジケーターが、１または複数の所定の時間および／または一定間隔で、信号をモニタリングし、発生させる。信号は、視覚信号であることが好ましく、ＬＥＤ、ＯＬＥＤ、またはＬＣＤ上で発生する英数字の信号であることがより好ましい。
多様な実施形態では、環境インジケーターが、容器内の環境条件を測定し、モニタリングし、表示するデジタルセンサーを備える。加えて、限定なしに述べると、センサーを、任意の範囲の環境条件を測定するように較正しうることも意図される。したがって、各環境条件のための通常の範囲を、各環境表示デバイスへとあらかじめプログラム化することができる。範囲には、最小閾値、最適条件、または最大閾値のうちの１または複数が含まれうる。具体的な実施形態では、測定またはモニタリングされる環境条件が最小閾値または最大閾値の外側にある場合、環境インジケーターが、環境条件が許容される範囲内にないことを示す聴覚信号をもたらす。
他の例示的な環境インジケーターには、Ｃａ＋＋濃度、カリウム濃度、ナトリウム濃度、マグネシウム濃度、マンガン濃度、硫酸濃度、リン酸濃度、および塩化物濃度が含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、部分的に、例えば、容器内容物の温度、容器を任意の所与の温度、および場合によって、１または複数の多様な環境条件（例えば、ｐＨ、酸素濃度、グルコース濃度）に置いた時間を示す表示デバイスの組合せを備える容器を意図する。好ましい実施形態では、組合せデバイスが、本明細書で開示される個別のデバイスおよびインジケーターの特徴を包含しうる。当業者ならば、環境表示デバイスが、容器の内容物と接触していることが好ましいことを理解するであろう。意図されるデバイスは、容器の透過性が、特定の環境感知デバイスを容器内腔または容器の内容物と接触させるような地点で容器の材料へと統合されうる。別の実施形態では、環境表示デバイスを、容器とは別個に製造し、その後、容器の外面に恒久的にまたは非恒久的に固定または接着することができる。関連する一実施形態では、固定または接着されたデバイスが、特定の環境感知デバイスを容器内腔または容器の内容物と接触させるように、容器を穿通する。関連する別の実施形態では、特定の環境感知デバイスを容器内腔または容器の内容物と接触させるように、固定または接着されたデバイスを、透過性となるデバイスの部分へと適用する。
好ましい実施形態では、容器が、温度表示デバイスおよび経過時間表示デバイスの組合せを、個別のデバイスとして、または単一のデバイスとして別個に備える。さらなる実施形態では、温度表示デバイス、経過時間表示デバイス、および１または複数の環境条件表示デバイスの組合せを、個別のデバイスとして、または単一のデバイスとして別個に備える。
組合せ表示デバイスは、容器と統合的に作製することもでき、容器外面に恒久的にまたは非恒久的に結合させることもでき、容器外面に積層化することもでき、容器により容器の内法内に包み込むこともできる。デバイスは、小型の電子デバイス、プローブ、センサー、またはこれらの組合せでありうる。
組合せ表示デバイスは、任意のサイズまたは形状でありうる。組合せ表示デバイスの例示的な形状には、カード、ストリップ、ディスク、スティッカー、ラベル、プローブ、またはこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。例えば、カードまたはストリップの形態にある温度表示デバイスが、１または複数の温度表示ディスクを含む場合もあり、この逆の場合もある。
当業者に明らかとなる通り、容器の経過時間および温度を視覚化するために、多様な直線、曲線、楕円、矩形、または点が含まれるがこれらに限定されない、多様な種類の図形デザインを用いることができる。同様にまた、異なるサイズの多様な矢印、曲線、直線、および点が含まれるがこれらに限定されない、液体移動前線の進行を示す標徴も用いることができる。例えば、特定の間隔の経過時間における特定の温度またはある範囲の温度についての視覚的な信号を、連続的なウィンドウにおける進行バー上の進行として、または複数のウィンドウにおいて視認することができる。さらに、各実施形態を、容器の時間インジケーターまたは温度の状態を示す多くのさらなる標徴を包含するように適合させることもできる。このような標徴には、総経過時間までの漸進的な進行を温度と対比させて示す図形記号が含まれる。
より好ましい実施形態では、容器が、温度表示デバイスと経過時間表示デバイスとの組合せを含む。
本明細書で用いられる単数形である「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」、および「その」は、別段に指示されることが文脈により明らかでない限り、複数に対する言及を包含する。
本明細書の全体では、文脈により別段に要請されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、言及されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含は示唆するが、他の任意のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外は示唆しないことが理解される。「〜からなる」とは、「〜からなる」という語句に後続するあらゆる語句を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要請されるかまたは必須であり、他の要素は存在しえないことを示す。「〜から本質的になる」とは、この語句の後に列挙された任意の要素を包含し、かつ、列挙された要素についての本開示で特定された活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要請されるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
本明細書の全体における「一実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、この実施形態との関連において記載されている特定の特徴、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されていることを意味する。したがって、本明細書全体の多様な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではない。さらに、特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅｓ）、構造、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を、任意の適切な形で１または複数の実施形態において組み合わせることもできる。
細胞の生着の潜在能および増殖を増大させる臨床的方法を開発するために、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤で処理した造血幹細胞集団および前駆細胞集団についての複数の生物学的パラメータの解析を実施した（図２を参照されたい）。これらの実験の結果および第１ｂ相臨床試験についての結果は、以下で記載される。
（実施例１）
競合的ｃＡＭＰアッセイ
製造元の指示書に従い、ＬＡＮＣＥ（登録商標）ｃＡＭＰ検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ＣＤ３４＋細胞についてのｃＡＭＰアッセイを実施した。略述すると、３，０００個のＣＤ３４＋細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を、推奨される刺激緩衝液中で３８４ウェル不透明白色プレートの各ウェル内に分注した。アッセイは、全ての条件について３連で実施した。
ＣＤ３４＋細胞は、４℃のＤＭＳＯまたは１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で刺激する前に、氷上に置いた。他の温度、例えば、２５℃または３７℃で実施するアッセイでは、ＤＭＳＯまたは１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を、ＣＤ３４＋細胞に室温で添加し、次いで、プレートを、ＤＭＳＯまたは１６，１６−ｄｍＰＧＥ２と共に、実験温度（２５℃または３７℃）でインキュベートした。
ＣＤ３４＋細胞は、５、１５、３０、６０、または１２０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション期間の後、検出緩衝液を刺激された細胞に添加し、刺激温度に関わらず、細胞を、室温の検出緩衝液中でさらに１時間にわたりインキュベートした。製造元の指示書に従い、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、アッセイプレートを解析した。
時間（１５、３０、６０、または１２０分間にわたるインキュベーション）、温度（４℃、２５℃、または３７℃におけるインキュベーション）、および１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の最終濃度（１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、または１００μＭ）の、細胞におけるｃＡＭＰの生成に対する効果を決定するために、ＣＤ３４＋細胞を用いる競合的ｃＡＭＰアッセイを実施した。
結果は、最大のｃＡＭＰ応答が、約３０〜６０分のインキュベーションで生じること、インキュベーション温度を高くすると、結果としてより頑健なｃＡＭＰ活性がもたらされること、ｃＡＭＰ応答が、１０μＭの閾値濃度を超えると、比較的用量に非感受性であることを示した（図３を参照されたい）。ｃＡＭＰ活性の、ＤＭＳＯ対照と比較して統計学的に有意な増大は、ＣＤ３４＋細胞を、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、３７℃および２５℃、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の全ての被験濃度（１、１０、５０、および１００μＭ）で、最短で５分間〜最長で２時間の持続時間にわたりインキュベートしたときに観察された（ｐ＜０．００１）。１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に４℃でインキュベートしたＣＤ３４＋細胞では、時間についての同様の条件下で、かつ、全ての被験濃度（１、１０、５０、および１００μＭ）にわたり、ｃＡＭＰ生成の、ＤＭＳＯ対照と比較して統計学的に有意な増大が観察されなかった（全ての試料についてｐ＞０．０５）。
より高い温度でより長い持続時間にわたるインキュベーション（これらの条件は、かつて、ＣＤ３４＋細胞生存度の低下および１６，１６−ジメチルＰＧＥ２半減期の短縮と関連すると考えられていた）は、細胞生存度に負の影響を及ぼすことなしに、ｃＡＭＰに対する優れた刺激を示した。さらに、本明細書で記載される通り、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による、４℃でより短い持続時間にわたる細胞の処理は、結果としてｃＡＭＰ生成の増大をもたらしたが、幹細胞のホーミング、生存、増殖、および生着を制御するのに重要であると考えられている遺伝子発現の増大は結果としてもたらさなかった。このような遺伝子の上方制御、およびしたがって、最も頑健な生物学的応答の達成は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による、３７℃など、生理学的に適切な温度で少なくとも約１時間の長い持続時間にわたる細胞の処理を必要とした。
（実施例２）
遺伝子発現
全ゲノム発現アレイ
ヒト臍帯血およびヒト臍帯血からあらかじめ単離されたＣＤ３４＋細胞を、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ｅｘ ｖｉｖｏにおける１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による処理のために、５％のヒト血清アルブミン培地（ＬＭＤ／５％のＨＳＡ）またはＳｔｅｍ Ｓｐａｎ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を伴う低分子量のデキストラン中で、細胞をインキュベートした。全ＲＮＡは、Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、インキュベートされた細胞から単離した。
ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ ａＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）および任意選択のＳｅｃｏｎｄ Ｒｏｕｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎのための標準的なプロトコールを用いて、ビオチン化した増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製した。製造元の指示書に従い、ＭｅｓｓａｇｅＡＭＰ ＩＩ Ｂｉｏｔｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、コピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を、ビオチンで標識化したａＲＮＡへと転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのプロトコールに従い、ビオチンで標識化したａＲＮＡを、精製し、断片化させた。断片化させたａＲＮＡ２０μｇを、４５℃で１６時間にわたり、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）とハイブリダイズさせた。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０においてＧｅｎｅＣｈｉｐを洗浄、および染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇを用いて走査した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアおよびデフォルトの解析設定を用いて、画像データを解析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐの発現データは、対数目盛による頑健な多重アレイ解析（ＲＭＡ）を介して正規化し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３．１（Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）により視覚化した。ＭｅｔａＣｏｒｅ（ＧｅｎｅＧｏ、Ｓｔ． Ｊｏｓｅｐｈ、ＭＩ）により、経路解析を実施した。
ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術を用いて、時間（５、１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１２０、１８０、または２４０分間にわたるインキュベーション）、温度（４℃、２５℃、または３７℃におけるインキュベーション）、および１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の最終濃度（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、または１００μＭ）の、細胞における遺伝子発現に対する効果を決定した。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームを用いるマイクロ流体ｑＰＣＲ
ＢｉｏＭａｒｋ Ｄｙａｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋細胞試料からのリアルタイムＰＣＲ転写物の定量を実施した。全ＲＮＡは、Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、処理した細胞から単離した。相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、単離された全ＲＮＡ ５０ｎｇから逆転写させた。
ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プロトコールを用い、６つの基準対照遺伝子を含めた９６の遺伝子特異的プライマー対の２００ｎＭの混合物（表１を参照されたい）を用いて、特異的標的遺伝子（９６）のｃＤＮＡをあらかじめ増幅した。製造元のプロトコールを用いる、標準的なサイクリング条件を伴う、１４サイクルの増幅を用いて、ｃＤＮＡからの特異的標的増幅（ＳＴＡ）を実施した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＥｖａＧｒｅｅｎプロトコールに従い、ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ． Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加して、増幅された産物を検出した。試料について、反応ミックスは、９６．９６ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）の試料入口へのローディングのために、３．０μＬのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．）、０．３μＬのＳａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）、０．３μＬの２０Ｘ ＥｖａＧｒｅｅｎ ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．）、１．５μＬの希釈した（無菌ｎＨ２Ｏで１：５に希釈した）ＳＴＡ ｃＤＮＡ、および０．９μＬの無菌ｄｉＨ２Ｏを含有した。
試料は、５〜９つのウェルにより多連で処理した。プライマー対について、反応ミックスは、９６．９６ Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）のアッセイ入口へのローディングのために、２．５μＬの遺伝子特異的プライマー対（２０μＭ）および２．５μＬのＡｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を含有した。９６．９６ Ｄｙｎａｍｉｃアレイには、ＮａｎｏＦｌｅｘ ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＨＸ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いてロードし、リアルタイム反応は、ＢｉｏＭａｒｋ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いて実施した。
ＢｉｏＭａｒｋ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、結果を解析した。平均Ｃｔは、試料の反復物により計算し、デルタ−デルタＣｔ（ΔΔＣｔ）は、６つの基準遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＱＡＲＳ、ＡＲＰＣ２、およびＬＲＩＧ２）の平均を用いて、ビヒクルだけの試料に対して計算した。２８を超えるＣｔ、または不適切な融解曲線特性を伴う増幅産物は、計算から除外した。結果は、ヒートマップフォーマットでのＳｐｏｔｆｉｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３．１（Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてか、またはＥｘｃｅｌによるグラフプロット（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）として表示する。

１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャー
ビヒクルで処理したＣＤ３４＋細胞と比較した、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞のベースラインにおける遺伝子発現シグネチャーを得た（図４を参照されたい）。これらの条件下で処理したＣＤ３４＋細胞では、合計６０８の遺伝子が、統計学的に有意なレベルで調節された（３６５が上方制御されるか、または２４３が下方制御された）。ＳＤＦ−１αとの相互作用を介する骨髄ニッチへのＨＳＣのホーミングの公知なメディエーターであるＣＸＣＲ４は、ＤＭＳＯで処理した対照と比べて１８倍に上方制御された。また、多くの公知のｃＡＭＰ応答性遺伝子のうちの１つであるＣＲＥＭも上方制御された。ＰＧＥ２シグナル伝達経路、細胞の接着、およびケモカインのシグナル伝達と関連する遺伝子発現の調節もまた観察された。しかし、アポトーシスまたは細胞死と関連する遺伝子発現には増大は観察されなかった。
ＤＭＳＯ対照と比較した、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子発現プロファイルにより、本発明の細胞が他の公知の細胞から区別される。本発明の方法は、処理されていない対照、または４℃で処理した細胞と比較して、生着の潜在能／生着の増強または増大、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける増殖の増大を示す細胞をもたらす。本発明の細胞の遺伝子発現シグネチャーにおいて高度な増幅の制御を示す遺伝子の表を以下に示す。

したがって、前臨床プロトコールとは対照的に、かつてはＣＤ３４＋細胞生存度の低下および１６，１６−ジメチルＰＧＥ２半減期の短縮と関連すると考えられていた３７℃におけるインキュベーションにより、予測外にも、ＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４細胞シグナル伝達経路と関連する遺伝子発現、細胞のホーミング、および増殖の増大が示された。さらに、細胞生存度の低下を示す遺伝子発現の変化は観察されなかった。
さらなる実験を実施して、細胞を全臍帯血の臨床処理プロトコールの背景で処理する場合に、ＣＤ３４＋細胞が１６，１６−ジメチルＰＧＥ２に応答するかどうかを決定した。ヒト臍帯血細胞を、３７℃で１２０分間にわたり、ビヒクルまたは１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共にインキュベートした（図１７を参照されたい）。インキュベーション後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気分取を用いて、Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞を単離した。ビオチンで標識化したａＲＮＡは、細胞から調製し、遺伝子発現プロファイルを解析した。ヒト臍帯血から単離されたＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞により１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーが再現されたことは、異なる濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共にインキュベートしたＣＤ３４＋臍帯血細胞についての結果と一致する。処理した全臍帯血に由来するａＲＮＡ、Ｌｉｎ（＋）ＣＤ３４＋細胞に由来するａＲＮＡ、Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞に由来するａＲＮＡ、およびＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋細胞に由来するａＲＮＡもまた調製した。図１７は、全臍帯血（９９％を超える系統＋細胞）が、全臍帯血またはＬｉｎ（＋）ＣＤ３４＋細胞から単離されたＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞と同じ形では１６，１６−ジメチルＰＧＥ２に応答しなかったことを示す。
時間パラメータ
１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、３７℃で５、１５、３０、６０、または１２０分間にわたりインキュベートしたＣＤ３４＋細胞について、遺伝子発現プロファイルを解析した。１２０分間未満のインキュベーション（例えば、処理）期間の場合は、細胞を培地で洗浄して１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を除去し、次いで、細胞を、残りの時間にわたり培地中でインキュベートして、遺伝子発現の変化が生じるための時間をもたらした（図５を参照されたい）。
結果は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２への曝露を長くすると、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の発現シグネチャーにおいて、より大きな遺伝子発現が得られることを示した（図６を参照されたい）。これに対し、インキュベーション時間を極めて短く（５〜１５分間と）すると、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の発現シグネチャーと関連する遺伝子における遺伝子発現の変化が結果として最小となった。遺伝子発現の変化は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２との３０分間のインキュベーション後に現れたが、全ての実験を全１２０分間の経過時間後において評価した事実に関わりなく、１２０分間のインキュベーションまで増大し続けた。
これは、下流の生物学的反応が生じると考えられていた短いインキュベーション時間で、移植の前に薬物でのＥＰ２／４受容体を負荷するのに十分であるべきことを示唆したかつての観察と対照的である。本発明による結果は、生物学的利益を達成するには、３７℃など生理学的に適切な温度における、より長いインキュベーション時間（３０分間より長い）が必要とされることを実証する。
また、異なるインキュベーション時間によるヒトＣＤ３４＋細胞における、表３で列挙される遺伝子の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーにおける発現変化を測定するのに、マイクロ流体ｑＰＣＲプラットフォームも用いた。遺伝子発現解析は、表３で列挙される遺伝子を検出するための９６ウェルフォーマットを包含する。

図１４Ａは、適切な遺伝子発現シグネチャーが、３７℃、少なくとも約６０分間にわたる、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２への持続的な曝露、および３７℃、最長で約４時間にわたる、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２への持続的な曝露の後において検出可能であったことを示す。しかし、最大の遺伝子発現応答は、３７℃、少なくとも約２時間にわたる、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２への持続的な曝露の後において観察された。図１４Ｂは、表３で列挙されるシグネチャー遺伝子についての平均遺伝子発現を示し、最大の遺伝子発現の変化が、３７℃で少なくとも約２時間後において観察されたことを示す。図１４Ｃは、骨髄ニッチへのホーミングの一因となるＣＸＣＲ４についての発現データを示す。興味深いことに、遺伝子発現応答の動力学は、３７℃、１５分間だけで最大レベルに到達したｃＡＭＰ応答と比較してはるかに緩徐であることが注目される。図１４に示されるデータでは、以下の遺伝子群：ＡＲＰＣ２、ＳＳＴＲ１、ＣＸＣＬ５、ＳＹＴ４、ＣＸＣＬ６、ＴＭＣＣ３、ＦＧＦ９、ＧＮＡＬ、ＧＵＬＰ１、ＬＲＩＧ２、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＬＡＴ（１）、およびＰＬＡＴ（２）についての遺伝子発現の検出反応が失敗し、この解析から除外した。図１４に示されるデータでは、以下の対照のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、およびＱＡＲＳを用いた。
さらに、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による短いパルス処理の後、薬物の非存在下における回復時間を施した細胞において、遺伝子発現シグネチャーを測定した。ヒトＣＤ３４＋細胞を、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の存在で異なる時間にわたりインキュベートした後、ｉｎ ｖｉｖｏにおける状況を反映するようにデザインした培地による洗浄および回復時間を施した。実験デザインは、細胞を処理し、洗浄して薬物を除去し、次いで、患者に投与する、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処理パラダイムに適合した。ＣＤ３４＋細胞を、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、３７℃で５、１５、３０、６０、または１２０分間にわたりインキュベートし、遺伝子発現シグネチャーを解析した。１２０分間未満のインキュベーション期間では、細胞を培地中で洗浄して１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を除去し、次いで、細胞を、遺伝子発現が生じることを可能とする残余の期間にわたり培地中でインキュベートした。
図１５は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による短いパルス処理（５〜１５分間）が、「完全な」遺伝子発現応答を生成させるのに十分ではないことを示す。遺伝子発現の変化および認識可能な遺伝子発現シグネチャーは、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２との約３０分間にわたるインキュベーション後においてのみ観察され、約２時間後において最大となったが、これは、迅速なｃＡＭＰ応答（図３を参照されたい）とは対照的である。したがって、具体的な臨床的実施形態では、生理学的条件下において（例えば、３７℃で）、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１２０分間にわたり処理した臍帯血が、「頑健な」遺伝子発現シグネチャーを達成することから、処理した細胞の臨床的有効性の改善が示される。
図１５に示されるデータでは、以下の遺伝子群：ＡＤＣＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＴＧＥＲ２、ＲＧＳ２およびＹＰＥＬ４についての遺伝子発現の検出反応が失敗し、これらを、この解析から除外した。図１５に示されるデータでは、以下の対照のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。
１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の濃度
異なる濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ビヒクル、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、または１００μＭ、図７を参照されたい）と共に、３７℃で１２０分間にわたりインキュベートしたＣＤ３４＋細胞について、遺伝子発現プロファイルを解析した。結果は、完全な１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーが１０μＭで再現されるが、１０μＭを上回る１６，１６−ジメチルＰＧＥ２により遺伝子発現シグネチャーにさらなる実質的な変化が生じるわけではないことを示したことから、１０μＭが最適の処理用量であることが示唆される。
ヒト全臍帯血細胞を用いてこれらの実験を繰り返し、ＣＤ３４＋細胞についての発現結果を臨床的状況へと翻訳しうるかどうかを決定した。全臍帯血を処理するときは、（１）全臍帯血中に存在する細胞の複雑性が増大すること、（２）タンパク質が薬物に結合するために薬物レベルが低減されること、および（３）傍分泌効果の可能性があることを考慮に入れる。ヒト臍帯血細胞を、ビヒクル、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ、または５０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、３７℃で１２０分間にわたりインキュベートした（図８を参照されたい）。インキュベーション後、Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞を単離し、標識化したａＲＮＡを細胞から調製し、遺伝子発現プロファイルを解析した。ヒト臍帯血から単離されたＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞により、１０μＭでの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーが再現され、１０μＭにより最大のシグネチャーがもたらされ、濃度を増大させても実質的な改善が観察されるわけではないことは、異なる濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共にインキュベートしたＣＤ３４＋細胞についての結果と一致する。
３７℃、異なる濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ビヒクル、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、または１００μＭ）で２時間にわたり処理したヒトＣＤ３４＋細胞における、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャー（遺伝子については表３を参照されたい）の発現変化を測定するにはまた、マイクロ流体ｑＰＣＲプラットフォームも用いた。図１６は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーは、１０μＭで最大となるが、１０μＭを上回る１６，１６−ジメチルＰＧＥ２により遺伝子発現シグネチャーにさらなる実質的な変化が生じることはないことを示す。
図１６に示されるデータでは、以下の遺伝子群：ＡＤＣＹ７、ＣＣＮＤ１、ＣＲＥＢ５、ＧＵＬＰ１、ＦＧＦＲ１、ＦＬＪ２７３５２、ＭＰＰＥ１、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＴＧＥＲ２、ＰＤＥ３Ｂ、およびＹＰＥＬ４についての遺伝子発現の検出反応が失敗し、これらを、この解析から除外した。図１６に示されるデータでは、以下の対照のハウスキーピング遺伝子：ＡＣＴＢ、ＡＲＰＣ２、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１、ＬＲＩＧ２、およびＱＡＲＳを用いた。
インキュベーション温度
４℃、２５℃、または３７℃で１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共にインキュベートしたＣＤ３４＋細胞について、遺伝子発現プロファイルを解析した（図９および２２を参照されたい）。これらの結果は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーと関連する遺伝子発現の変化が、３７℃で６０〜１２０分間にわたるインキュベーションにおいて生じ、遺伝子発現の変化が最も頑健となるのは１２０分間のときであることを示した。加えて、濃度および温度を共に変化させたところ、より低い温度およびより高い濃度の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を、より高い温度の効果を再現するのに用いることはできないことが決定された（データは示さない）。したがって、４℃および２５℃で１００μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２における処理では、得られる遺伝子発現の変化が、３７℃で１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による場合より小さくなる。
したがって、結果は、ヒト臍帯血中で単離されたＣＤ３４＋細胞またはＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞における遺伝子発現の結果として、ＨＳＣのホーミングおよび生着に関与する遺伝子、例えば、ＣＸＣＲ４、ｃＡＭＰ応答性遺伝子、例えば、ＣＲＥＭの上方制御、ならびにＰＧＥ２のシグナル伝達経路、細胞の接着、およびケモカインのシグナル伝達と関連する遺伝子発現の調節がもたらされることを示した。３７℃で１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２とのインキュベーション後には、２５℃または４℃におけるインキュベーションと比較して、有意により多くの遺伝子が、少なくとも２倍遺伝子発現を増大または減少させた（ｔ検定：各遺伝子／プローブについて、ｐ＜０．０５）。特に、３７℃では、２５℃または４℃におけるインキュベーションと比較して、造血幹細胞および前駆細胞のホーミングと関連する遺伝子、例えば、ＣＸＣＲ４における遺伝子発現の統計学的に有意な変化（ｐ＝０．０００１４）、ならびにＰＧＥ２Ｒ２／Ｒ４による細胞シグナル伝達経路の増大と関連する遺伝子、例えば、ＣＲＥＭにおける遺伝子発現の統計学的に有意な変化（ｐ＝０．００１２）が見られた。
さらに、前臨床的予測とは対照的に、かつてはＣＤ３４＋細胞生存度の低下および１６，１６−ジメチルＰＧＥ２半減期の短縮と関連すると考えられていた、３７℃でインキュベートした細胞において、アポトーシスまたは細胞死と関連する遺伝子の遺伝子発現の増大が観察さることはなかった。
（実施例３）
細胞生存度アッセイ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た全臍帯血細胞またはＣＤ３４＋細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにより均等に分注し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＬＭＤ／５％ＨＳＡ培地中、ある範囲の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度（１０μＭ〜１００μＭ）またはＤＭＳＯ対照、温度（４℃、２２℃、または３７℃）で、６０、または１２０分間にわたり処理した。処理後、インキュベートされた細胞のアリコートを、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色を細胞死の指標として用いてアッセイした。百万個の全臍帯血細胞を、５μＬの７ＡＡＤ染色溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で染色するか、または２００，０００個のＣＤ３４＋臍帯血細胞を、１μＬの７−ＡＡＤ溶液で染色した。細胞をＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上でＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）により解析した。また、ＣＦＵ−Ｃアッセイ（以下の実施例４で論じられる）を用いて増殖の潜在能を評価するために、同じ細胞の別個のアリコートも採取した。
結果は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、高温で比較的長いインキュベーション時間にわたりインキュベートした全臍帯血細胞またはＣＤ３４＋細胞が、かつての前臨床実験から予測されることとは対照的に、他の条件でインキュベートした細胞と比較して、細胞生存度を低下させないことを示した。したがって、４℃から３７℃で、７−ＡＡＤにより評価された生細胞において統計学的に有意な減少が見られることはなかった（図１０および１９Ｂ〜Ｃを参照されたい）。
（実施例４）
細胞増殖アッセイ
メチルセルロースアッセイキットであるＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）ＧＦ Ｈ４０３４（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）を用いて、コロニー形成単位の細胞アッセイ（ＣＦＵ−Ｃ）を実施した。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た全臍帯血細胞またはＣＤ３４＋細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにより均等に分注し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＬＭＤ／５％ＨＳＡ培地中、ある範囲の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２濃度（１０μＭ〜１００μＭ）またはＤＭＳＯ対照、温度（４℃、２２℃、または３７℃）で、１２０分間にわたり処理した。処理後、細胞をＬＭＤ／５％ＨＳＡ培地中で洗浄し、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するイスコフ培地中で再懸濁させた。次いで、製造元の指示書に従い、細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）アッセイチューブへと添加し、混合し、３５ｍｍの組織培養プレートにおいて平板培養した。別段に言及しない限り、ＷＣＢ細胞１０，０００個およびＣＤ３４＋細胞２５０個の同等物を各プレートへと添加した。
結果は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、高温で比較的長いインキュベーション時間にわたりインキュベートした全臍帯血細胞またはＣＤ３４＋細胞が、かつての前臨床実験から予測されることとは対照的に、他の条件でインキュベートした細胞より増殖の潜在能（例えば、自己再生能）が高いことを示した。したがって、４℃から３７℃で、統計学的に有意な細胞増殖の潜在能の増大が見られた（図１１を参照されたい）。
（実施例５）
１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した細胞におけるＣＸＣＲ４の細胞表面発現
フローサイトメトリー
ＣＤ３４＋臍帯血細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＡｌｌ Ｃｅｌｌｓ）を、３７℃、ＬＭＤ／５％ＨＳＡ中に１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２または対照としてのＤＭＳＯで２時間にわたり処理した。処理後、細胞をＬＭＤ／５％ＨＳＡで洗浄し、６５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。次いで、他所で公表されているプロトコール（Ｐａｒｋら、２００８年）に従い、細胞を分取して、長期前駆細胞、短期前駆細胞、および多分化能前駆細胞を単離した。次いで、細胞を染色用培地（上記で言及した）中で再懸濁させ、抗体色素を添加した。別段に言及しない限り、全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製とした。系統枯渇抗体パネルは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２３５を包含し、全ての抗体をＦＩＴＣに直接コンジュゲートした。用いた他の抗体は、ＣＤ３４（８Ｇ１２）−ＡＰＣ、ＣＤ３８−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ４５ＲＡ−Ｖ４５０、およびＣＤ９０−ＰＥであった。細胞は、氷上で２０分間にわたり推奨量の抗体で染色し、次いで、染色用培地で２回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、細胞２百万個／ｍｌで再懸濁させ、ＤｉＶａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ上で分取した。細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中で回収し、ＲＮＡの抽出を実施するまで４℃で保存した。
ＣＸＣＲ４の表面発現解析
ＣＤ３４＋臍帯血細胞を、３７℃、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯで２時間にわたり、または４℃で１時間にわたり処理した。処理後、細胞をＳｔｅｍＳｐａｎ培地中で洗浄し、３００×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、ＣＤ３４＋細胞の生存を促進するサイトカイン（例えば、ＣＣ１００）を含有するＳｔｅｍＳｐａｎ培地中で再懸濁させ、３７℃で１、６、および２４時間にわたりインキュベートした。１、６、または２４時間にわたるインキュベーション後において、細胞を遠心分離し、系統カクテル、１−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＡＰＣ、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）−ＰＥを含有する染色用培地中で再懸濁させ、氷上で１５分間にわたりインキュベートした。次いで、新鮮な染色用培地を細胞に添加し、細胞を３００ｇで１０分間ずつ２回にわたり遠心分離した。染色した細胞をＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ上に取り込み、ＦｌｏＪｏソフトウェアパッケージ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて解析を実施した。
３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたり処理した全臍帯血（ＷＣＢ）またはＣＤ３４＋細胞では、ＤＭＳＯで処理した細胞または４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１時間にわたり処理した細胞と比較して、ＣＸＣＲ４ ＲＮＡ発現の増大が観察された。細胞表面におけるＣＸＣＲ４の発現は、骨髄造血ニッチへの幹細胞のホーミングに重要である。図１８は、特定の条件下、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の存在下において、ＣＸＣＲ４タンパク質の表面発現が増大したことを示す。ＳｔｅｍＳｐａｎ培地中１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯ対照で３７℃、２時間にわたり、または４℃、１時間にわたり、細胞を処理した。ＣＸＣＲ４細胞表面タンパク質の発現は、処理が終了した１、６、および２４時間後においてフローサイトメトリーにより評価した。
処理の１時間後、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋臍帯血細胞では、ＤＭＳＯで処理した細胞のうちの３．５％と比較して、そのうちの４８％でＣＸＣＲ４発現が検出可能であった。処理の６時間後、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋臍帯血細胞では、ＤＭＳＯで処理した細胞の１．７％と比較して、そのうちの３４．７％が検出可能なレベルのＣＸＣＲ４を発現した。処理の２４時間後、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋臍帯血細胞に存在するＣＸＣＲ４のレベルは、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較して実質的に同じであった。
これに対し、４℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＣＤ３４＋臍帯血細胞は、ＣＸＣＲ４発現の増大を結果としてもたらさなかった。したがって、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した細胞におけるＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡの発現は、細胞におけるＣＸＣＲ４細胞表面タンパク質の発現を忠実に表す。したがって、具体的な臨床的実施形態では、ＨＳＣのホーミングおよび機能をもたらすＨＳＣの最大の活性化を得るために、細胞を３７℃の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理することが、４℃における処理と比較して好ましい。
（実施例６）
コロニー形成単位脾臓アッセイ
１２日目におけるコロニー形成単位脾臓（ＣＦＵ−Ｓ１２）アッセイは、Ｎｏｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ．、２００７年６月２１日；４４７巻（７１４７号）：１００７〜１１頁において記載されている通りに実施した。８週齢のＣ５７Ｂｌ／６ドナーマウスから全骨髄を単離し、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯとともに４℃、１時間または３７℃、２時間にわたり、あるいはＰＢＳ中で処理した。処理後、細胞を遠心分離により洗浄し、既に１０．５Ｇｙの致死的に照射したＣ５７Ｂｌ／６レシピエント（２×５／処置）への尾静脈注射のためにＰＢＳ中で再懸濁させた。レシピエント１匹当たりの細胞５０，０００個を注射した。
３７℃の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で２時間にわたる処理後に、４℃の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１時間にわたる処理と比較して観察される、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の遺伝子発現シグネチャーの増大を、ＣＦＵ−Ｓアッセイでさらに確証した。
マウスの骨髄を、４℃で１時間または３７℃で２時間にわたる１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯによる１０μＭの処理に曝露し、照射したマウスに投与した。１４日後、脾臓を切除し、コロニーをカウントした。結果は、４℃における処理により、ｃＡＭＰ応答または遺伝子発現シグナルの増大は誘発されなかったが、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較してＣＦＵ−Ｓ数のわずかな増大が結果としてもたらされることを示した。しかし、この増大は、細胞を３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共にインキュベートした場合より統計学的に有意に低い。
マウスの全骨髄（ＷＢＭ）細胞を、４℃または３７℃で１または２時間にわたり、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯに曝露した。細胞を１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した場合に、温度に関わらず、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較してＣＦＵ−Ｓ１２数の統計学的に有意な増大が観察された（図１９Ａ）。３７℃で２時間にわたる１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２への曝露により、結果として１１．５±１．４個のコロニーの形成がもたらされ、これは、４℃で１時間にわたる１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による１０μＭの処理に曝露したＷＢＭにおける８．５±１．３個のコロニー（ｐ＜０．００５）、または３７℃で２時間にわたるＤＭＳＯによる処理に曝露した場合の４．０±０．８個のコロニー（ｐ＜０．００１）より有意に高かった。さらに、３７℃、１０μＭの１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で１時間（１１．２±１．５）または２時間（１１．５±１．４）にわたり処理したＷＢＭからも、同様の結果が得られた。４℃の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２によるＷＢＭの処理でも同じ結果が観察され、１または２時間にわたる曝露により、それぞれ、８．５±１．３個および８．４±１．０個のコロニーという同様の結果が得られた。
（実施例７）
１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した細胞の走化性の増強
製造元の指示書に従い９６ウェル走化性チャンバー、小孔サイズを５μＭとするポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を用いて、走化性アッセイを実施した。略述すると、ヒトＣＤ３４＋臍帯血（ｈＣＤ３４＋ＣＢ）細胞をＡｌｌ Ｃｅｌｌｓから得、製造元の指示書に従い解凍した。次いで、細胞を、３７℃、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中の濃度を１０μＭとする１６，１６−ジメチルＰＧＥ２またはＤＭＳＯ対照で４時間にわたり処理した。次いで、細胞を遠心分離（３００ｇで１０分間にわたる）により洗浄し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ緩衝液（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ Ｆｒｅｅ ＲＰＭＩ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、０．５％の脂質非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、７５ｕｌ当たりの濃度を細胞４０，０００〜６０，０００個として再懸濁させた。７５μｌの細胞懸濁液をプレートの上部チャンバーに添加する一方、０または５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ１α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する２３５μｌのＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ培地を下部ウェルに添加した。３７℃、５％のＣＯ２における４時間のインキュベーションの後に７ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて死細胞を除外するフローサイトメトリーにより、下部ウェルにおける全細胞数を得た。図２０は、これらの実験において用いられるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける走化性機能アッセイのフローチャートを示す。遊走のパーセントは、下部ウェルにおける細胞数を、投入された全細胞数で除し、１００を乗じることにより計算した。試料は３連で解析し、次いで、統計学的な解析のためにデータを平均した。
図２１は、５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ１αに曝露した場合、１６，１６−ジメチルＰＧＥと共にインキュベートした、遊走するＣＤ３４＋細胞の数が、ＤＭＳＯまたは陰性対照（ＳＤＦ１αを０ｎｇ／ｍｌとする）と共にインキュベートした、遊走するＣＤ３４＋細胞の数と比較して著明に増大することを示す。したがって、１６，１６−ジメチルＰＧＥで処理したＣＤ３４＋細胞は、幹細胞のホーミング特性を、ＤＭＳＯまたは処理されていない対照細胞と比較して増大させた。
（実施例８）
第１ｂ相臨床研究
概要
本発明者らが作成した前臨床データは、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２のＨＳＣのホーミング、増殖、生存、および分化のプロモーターとしての使用を支持した。前臨床データに基づき、強度を低減する条件づけレジメンの後に二倍の（ｄｏｕｂｌｅ）（臍帯血）ＣＢ移植を受ける、血液悪性疾患を伴う成人において、第Ｉｂ相臨床試験を開始した。研究の１つの主要目的は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢの安全性を、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢユニットのキメラ現象を＞５％とする４２日目までの生着に基づき決定することであった。第２の目的は、生着までの時間、非血液学的な毒性の比率、移植の失敗、急性および慢性のＧＶＨＤ、再発、処置関連死亡率（ＴＲＭ）、キメラ現象率、ならびに無再発生存（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）および全生存（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を包含した。二倍のＵＣＢ移植についての競合的生着動態により、ｄｍＰＧＥ２により改変されたＨＳＣが、調節されていないＨＳＣを凌駕しうるかどうかの決定が可能となる。
方法
臍帯血の選択基準は、各臍帯血ユニットの、被験体ならびに他の臍帯血ユニットに対する少なくとも４／６のＨＬＡ適合からなった。同胞ドナーも適合した非血縁ドナーもいない患者は、フルダラビン（−８〜−３日目における静脈内の３０ｍｇ／ｍ２／日）、メルファラン（−２日目における静脈内の１００ｍｇ／ｍ２／日）、およびウサギＡＴＧ（−７、−５、−３、および−１日目における１ｍｇ／ｋｇ／日）により条件づけた。免疫抑制レジメンは、シロリムス（標的：３〜１２ｎｇ／ｍＬ）およびタクロリムス（標的：５〜１０ｎｇ／ｍＬ）を包含した。０日目には、２つの臍帯血（ＵＣＢ）ユニットを患者に施した：第１のＵＣＢユニット（１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢ）を温水浴中で解凍し、５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および低分子量（ＬＭＷ）デキストランの溶液を用いて洗浄した。細胞を１６，１６−ジメチルＰＧＥ２と共に、３７℃で２時間にわたりインキュベートした。残留１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を除去するための最終洗浄後において、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢを、さらなる細胞操作を伴わずに注入することにより、患者に投与した。第２の処理されていないＵＣＢユニットを解凍し、洗浄し、２〜６時間後に、細胞を調節または操作することなしに注入した。
結果
全１２例の被験体を登録し、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢユニットを施したところ、このうち１１例の被験体が、評価可能であった。年齢の中央値は、５７．５歳（範囲：１９〜６６歳）であり、６７％が男性であった。診断には、ＡＭＬ（５例）、ＭＤＳ（４例）、およびＮＨＬ／ＣＬＬ（３例）が含まれた。０日目に、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理される全てのＵＣＢユニットを処理し、注入した。前低温保存時のＵＣＢサイズの中央値は、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢユニット：１ｋｇ当たりのＴＮＣ細胞２．７×１０７個（範囲：２．０〜５．１）および１ｋｇ当たりのＣＤ３４細胞１．３×１０５個（範囲：０．３〜６．３）、処理されていないＵＣＢ：１ｋｇ当たりのＴＮＣ細胞２．０×１０７個（範囲：１．８〜５）および１ｋｇ当たりのＣＤ３４細胞１．１×１０５個（範囲：０．５〜３．４）であり、組み合わせた細胞用量の中央値は、１ｋｇ当たりのＴＮＣ細胞４．７×１０７個（範囲：３．９〜１０．１）および１ｋｇ当たりのＣＤ３４細胞２．１×１０５個（範囲：１．４〜９．７）であった。
１６，１６−ジメチルＰＧＥ２によるＵＣＢの処理は、著明な細胞喪失を結果としてもたらさず、ＣＤ３４＋生細胞の平均回収率は９０％であった。１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢに起因する有害事象には、悪寒、潮紅、腹痛、または咳からなる、４例の被験体におけるグレード１の注入関連事象５件が含まれた。公知の冠動脈疾患を伴うさらに１例の被験体では、注入によるグレード４の一過性ＳＴ上昇、および心筋トロポニンアッセイによる心筋虚血の証拠が認められた。
好中球回復（１μＬ当たりの細胞＞５００個）までの時間の中央値は、１７日間（範囲：１５〜２７日間）であり、好ましくも同じ施設で同様に処置した患者の過去の対照群についての中央値である２１日間と同等である（ｎ＝５３、ｐ＝０．０２５）。これらのデータはまた好ましくも、ここでもまた、代替的なインキュベーションレジメン：１６，１６−ジメチルＰＧＥ２による、氷上で（温度を４℃とする）６０分間にわたる処理を用いて調製した、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢと組み合わせた、処理されていないＵＣＢユニットを施した、かつての患者９例のコホートとも同等である。これらの患者は、好中球回復までの時間の中央値が２２日間であった。
支持されていない血小板カウントがμＬ当たり２０，０００個となるまでの時間の中央値は、４２日間（ｎ＝９（評価可能））であった。一次移植または二次移植の失敗例はなかった。評価可能な被験体１１例中９例において、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢは、主要な造血供給源であり、１４日目における１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢの全キメラ現象の中央値は９０％であり、ここでもまた、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢユニットによる長期にわたる優越性が見られた。比較において、処理されていないＵＣＢと、４℃／６０分間のインキュベーションレジメンを用いて調製した、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢとを施された患者９例についてのかつての試験では、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理したＵＣＢが主要な造血供給源となったのは、９例中２例に過ぎなかった。
現在のところ、グレード２の急性ＧｖＨＤが観察されているのは２例だけであり、慢性ＧｖＨＤの症例は観察されていない。加えて、ＥＢＶによるリンパ増殖性疾患の症例も認められなかった。追跡期間の中央値５．０カ月間（範囲：１．６〜９．４カ月間）で、ＴＲＭは９％（１例の被験体）であり、１例の患者が再発し、９例の被験体が再発なしに生存する。
結論
これらのデータは、ＵＣＢ移植を受ける患者における生着を改善するためのｅｘ ｖｉｖｏにおける新規の調節法の利益を支持する。さらに、これらの実験からの結果は、インキュベーション温度を４℃から３７℃へと高め、インキュベーション時間を６０分間から１２０分間へと延長する結果として、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２で処理した細胞の生物学的活性が大幅に増大することを明らかに実証した。この一連の研究は、分子プロファイリングがいかにして臨床医学に直接的な影響を及ぼすかということの重要な例を示し、ｅｘ ｖｉｖｏにおける小分子による短時間にわたる処理により、細胞療法が増強されうることを実証する。
（実施例９）
ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＤＭＰＧＥ２で処理したマウス骨髄細胞の再配置活性についての４℃対３７℃の直接対比（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）解析
本発明では、３７℃で細胞をパルスしたときの、赤血球カウント、血小板カウント、および好中球カウントの回復の増強を含めたＷＢＣ回復に対するｄｍＰＧＥ２の効果を、対照と比較して実証する。本研究は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてｄｍＰＧＥ２で処理した細胞の生着についての４℃対３７℃の直接比較である。類遺伝子性のＣＤ４５．１マウスおよびＣＤ４５．２マウスに由来する骨髄細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、１０ｕＭの１６，１６−ｄｍＰＧＥ２で２時間にわたり処理し、致死的に照射したＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２ハイブリッドレシピエントマウスへと共移植した。１０匹のハイブリッドマウス群に、４℃の１６，１６−ｄｍＰＧＥ２で処理した１００，０００個のＣＤ４５．１骨髄細胞、および３７℃の１６，１６−ｄｍＰＧＥ２で処理した１００，０００個のＣＤ４５．２骨髄細胞を施す。１０匹のマウスの第２のコホートに、４℃の１６，１６−ｄｍＰＧＥ２で処理した１００，０００個のＣＤ４５．２骨髄細胞、および３７℃の１６，１６−ｄｍＰＧＥ２で処理した１００，０００個のＣＤ４５．１骨髄細胞を施して、系統の偏りを補償する。移植の１、２、３、および４カ月間後にマウスから採血し、ＣＤ４５．１陽性末梢血細胞およびＣＤ４５．２陽性末梢血細胞を決定する。４カ月間後に、三系統（ｔｒｉ−ｌｉｎｅａｇｅ）の再構築を評価して、任意の系統の再構築における偏りまたは差違を決定する。マウスを安楽死させ、移植の４カ月間後に骨髄キメラ現象の評価を実施する。５０％／５０％のキメラ現象からの逸脱は、処置プロトコールから結果として生じる生着能の変化を反映する。この研究についての図解による概要を、図２４に示す。
（実施例１０）
方法
処理された全臍帯血からのＬｉｎ（−）ＣＤ３４＋細胞の単離
ヒト全臍帯血単核細胞は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た。解凍したら、細胞を、ＬＭＤ／５％ＨＳＡ培地中の１６，１６−ジメチルＰＧＥ２または適切な対照、例えば、ＤＭＳＯで処理した。
処理後、細胞をＬＭＤ／５％ＨＳＡ培地で洗浄し、室温、６５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、低温の選択緩衝液（Ｃａ＋もＭｇ＋も含まないリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（２ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５％のＨＳＡを含む））中で再懸濁させた。Ｌｉｎｅａｇｅ（Ｌｉｎ）Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ａｂｒｕｎ、ＣＡ）の後で、ＣＤ３４＋ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて磁気選択を実施した。系統の枯渇およびＣＤ３４＋細胞の濃縮は、製造元の指示書に従い、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）分離器を用いて実施した。この工程の間、細胞を４℃に保った。処理された全臍帯血からＬｉｎ−ＣＤ３４＋細胞を単離したら、フローサイトメトリーによりアリコートを解析して、純度を評価した。細胞の純度は、９０％を超えた。細胞の大半は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ解析のためのＰｉｃｏ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いるＲＮＡの抽出に用いた。
上記で記載した多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照され、かつ／または出願データシートで列挙される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。多様な特許、出願、および刊行物の概念を用いてなおさらなる実施形態を提供することが必要である場合は、実施形態の態様を改変することができる。
上記の詳細な説明に照らして、これらの変化および他の変化を実施形態に施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語を、特許請求の範囲を本明細書において開示される特定の実施形態に限定するように解釈すべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される全範囲と共に、可能な全ての実施形態を包含するように解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。

Claims (16)

  1. 非悪性血液障害またはがんの処置のための細胞集団を含む治療用組成物であって、少なくとも百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含み、
    ａ）前記造血幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、３３℃〜４１℃の温度で、ＰＧＥ２またはＰＧＥ２類似体を含む薬剤と接触しており、
    ｂ）前記造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の遺伝子発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞におけるＣＸＣＲ４の発現と比較して少なくとも５倍増大しており、
    ｃ）前記治療用組成物が、無菌の、患者への投与の準備ができた造血幹細胞または前駆細胞の治療有効量を含む、
    治療用組成物。
  2. 前記造血幹細胞または前駆細胞が、少なくとも１時間にわたり前記薬剤と接触している、請求項１に記載の治療用組成物。
  3. 請求項１に記載の治療用組成物であって、
    ａ）前記造血幹細胞または前駆細胞における１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍増大しており、前記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される；
    ｂ）前記造血幹細胞または前駆細胞における、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される少なくとも２つのシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５倍増大している；あるいは
    ｃ）前記造血幹細胞または前駆細胞における、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される各シグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍増大している、
    治療用組成物。
  4. 請求項１に記載の治療用組成物であって、
    ａ）前記細胞集団が、３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む；
    ｂ）前記細胞集団が、少なくとも０．０１％かつ５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む；
    ｃ）前記細胞集団を、前記患者への投与前にｅｘ ｖｉｖｏで増殖させない；
    ｄ）前記細胞集団が、３０％未満の間葉系幹細胞を含む；
    ｅ）前記細胞集団が、３０％未満の内皮前駆細胞を含む；
    ｆ）前記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる；
    ｇ）前記細胞集団が、ＨＬＡハプロタイピングされている；
    ｈ）前記細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきＨＬＡハプロタイピングされている；
    ｉ）前記細胞集団が、ＨＬＡハプロタイピングされており、特定のヒト被験体と適合する；または
    ｊ）前記細胞集団が、ＨＬＡハプロタイピングされており、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する、
    治療用組成物。
  5. 前記薬剤を含まない、請求項１に記載の治療用組成物。
  6. 前記細胞集団内の細胞のうちの少なくとも１５％が、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する、請求項１に記載の治療用組成物。
  7. 前記細胞集団が、少なくとも百万個のヒト造血幹細胞または前駆細胞を含むハプロタイピングされた細胞の集団であり、
    ａ）前記ハプロタイピングされた細胞集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている；
    ｂ）前記ハプロタイピングされた細胞集団が、ＨＬＡ−ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、およびＤＰＢ１からなる群に基づきハプロタイピングされている；
    ｃ）前記ハプロタイピングされた細胞集団が、特定のヒト被験体と適合する；または
    ｄ）ＨＬＡハプロタイピングされた細胞集団が、６つのＨＬＡのうちの４つで特定のヒト被験体と適合する、
    請求項１に記載の治療用組成物。
  8. 請求項７に記載の治療用組成物であって、前記造血幹細胞または前駆細胞が遺伝子発現シグネチャーを含み、
    ａ）１または複数のシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記１または複数のシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍増大しており、前記シグネチャー遺伝子が、ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される；
    ｂ）ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される少なくとも２つのシグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記２つのシグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも５倍増大している；あるいは
    ｃ）ヒアルロナンシンターゼ１（ＨＡＳ１）、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）、二重特異性プロテインホスファターゼ４（ＤＵＳＰ４）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、核内受容体関連１タンパク質（ＮＲ４Ａ２）、レニン（ＲＥＮ）、ｃＡＭＰ応答性エレメントモジュレーター（ＣＲＥＭ）、Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）、およびＦｏｓ関連抗原２（ＦＯＳＬ２）からなる群より選択される各シグネチャー遺伝子の発現が、接触していない造血幹細胞または前駆細胞における前記シグネチャー遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍増大している、
    治療用組成物。
  9. 前記薬剤が、プロスタグランジンＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ ｐ−（ｐ−アセトアミドベンザミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−ｔｒａｎｓ ＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノル（ｔｒｉｎｏｒ）ＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノール（ｓｅｒｉｎｏｌ）アミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノル（ｔｅｔｒａｎｏｒ）ＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥ１、ノクロプロスト（ｎｏｃｌｏｐｒｏｓｔ）、スルプロストン（ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ）、ブタプロスト（ｂｕｔａｐｒｏｓｔ）、１５−ケトＰＧＥ２、または１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２を含む、請求項１または７に記載の治療用組成物。
  10. 請求項７に記載の治療用組成物であって、
    ａ）前記細胞集団が、３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む；
    ｂ）前記細胞集団が、少なくとも０．０１％かつ５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む；
    ｃ）前記細胞集団を、前記患者への投与前にｅｘ ｖｉｖｏで増殖させない；または
    ｄ）前記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、
    治療用組成物。
  11. 治療用組成物を調製する方法であって、
    造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、前記造血幹細胞または前駆細胞の遺伝子発現を改変するのに十分な条件下で、少なくとも１時間にわたり、３３℃〜４１℃の温度で、１または複数の薬剤と接触させ、接触していない造血幹細胞または前駆細胞と比較してＣＸＣＲ４の発現が少なくとも５倍増大した造血幹細胞または前駆細胞を結果としてもたらすステップ、および
    前記１または複数の薬剤を実質的に除去するステップ
    を包含し、前記１または複数の薬剤のうちの少なくとも１つが、ＰＧＥ２またはＰＧＥ２類似体からなる群より選択される、
    方法。
  12. 前記薬剤がプロスタグランジンＥ２または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１に記載の治療用組成物であって、
    ａ）前記患者が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、重症再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、赤芽球ろう、無巨核球症／先天性血小板減少症、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、ベータサラセミアメジャー、鎌状赤血球症、ハーラー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質萎縮症、脊髄形成異常症、不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病、原因不明骨髄様化生、家族性血球貪食性リンパ組織球症、または充実性腫瘍を有するか、または
    ｂ）前記患者が、乳がん、卵巣がん、脳のがん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、膵臓がん、または肉腫を有するか、または
    ｃ）前記患者が、骨髄除去的化学療法もしくは骨髄除去的放射線療法、または非骨髄破壊的化学療法もしくは非骨髄破壊的放射線療法を受けたか、あるいは
    ｄ）前記患者が骨髄ドナーである、
    治療用組成物。
  14. 請求項１１に記載の方法であって、
    ａ）前記細胞集団が、３０％未満のＣＤ３４＋細胞を含む；
    ｂ）前記細胞集団が、少なくとも０．０１％かつ５０％以下のＣＤ３４＋細胞を含む；または
    ｃ）前記細胞集団が、骨髄、臍帯血、または動員末梢血から得られる、
    方法。
  15. 前記治療用組成物が前記薬剤の除去後には前記薬剤を含まない、請求項１１に記載の方法。
  16. 得られた前記造血幹細胞または前駆細胞内の細胞のうちの少なくとも１５％が、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する、請求項１１に記載の方法。
JP2018031941A 2010-08-12 2018-02-26 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法 Expired - Fee Related JP6574279B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37321210P 2010-08-12 2010-08-12
US61/373,212 2010-08-12

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016124416A Division JP6346917B2 (ja) 2010-08-12 2016-06-23 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018139536A Division JP2018184448A (ja) 2010-08-12 2018-07-25 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018104457A JP2018104457A (ja) 2018-07-05
JP2018104457A5 JP2018104457A5 (ja) 2018-09-06
JP6574279B2 true JP6574279B2 (ja) 2019-09-11

Family

ID=45568224

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013524254A Active JP6047489B2 (ja) 2010-08-12 2011-08-12 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2016124416A Active JP6346917B2 (ja) 2010-08-12 2016-06-23 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2018031941A Expired - Fee Related JP6574279B2 (ja) 2010-08-12 2018-02-26 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2018139536A Withdrawn JP2018184448A (ja) 2010-08-12 2018-07-25 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2019197587A Withdrawn JP2020029458A (ja) 2010-08-12 2019-10-30 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2021172986A Withdrawn JP2022009404A (ja) 2010-08-12 2021-10-22 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2023071598A Pending JP2023109761A (ja) 2010-08-12 2023-04-25 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013524254A Active JP6047489B2 (ja) 2010-08-12 2011-08-12 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2016124416A Active JP6346917B2 (ja) 2010-08-12 2016-06-23 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018139536A Withdrawn JP2018184448A (ja) 2010-08-12 2018-07-25 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2019197587A Withdrawn JP2020029458A (ja) 2010-08-12 2019-10-30 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2021172986A Withdrawn JP2022009404A (ja) 2010-08-12 2021-10-22 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
JP2023071598A Pending JP2023109761A (ja) 2010-08-12 2023-04-25 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20140030232A1 (ja)
EP (2) EP2603227B1 (ja)
JP (7) JP6047489B2 (ja)
CN (5) CN106214701B (ja)
AU (1) AU2011289245B2 (ja)
BR (1) BR112013003366A2 (ja)
CA (1) CA2807944C (ja)
ES (1) ES2654994T3 (ja)
WO (1) WO2012021845A2 (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011289245B2 (en) * 2010-08-12 2015-01-22 Fate Therapeutics, Inc. Improved hematopoietic stem and progenitor cell therapy
EP3785767A1 (en) 2011-12-02 2021-03-03 Fate Therapeutics, Inc. Enhanced stem cell composition
EP2785350B1 (en) 2011-12-02 2018-05-02 Fate Therapeutics, Inc. Improved methods of treating ischemia
US20150329643A1 (en) 2012-11-16 2015-11-19 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Identification and use of new tumor-promoting gene in hematological malignancies
JP2016513974A (ja) * 2013-03-14 2016-05-19 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 造血幹細胞系列を初期化するための組成物および方法
US9943545B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
WO2014150602A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Fate Therapeutics, Inc. Cell potency assay for therapeutic potential
KR20160048029A (ko) 2013-03-15 2016-05-03 마르쿠스 카레 토를레이프 라르손 제대혈 수집 및 세포의 분리를 위한 세포, 방법 및 장치
RU2525143C1 (ru) * 2013-03-22 2014-08-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации-Институт медико-биологических проблем Российской академии наук СПОСОБ ЭКСПАНСИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ (пкМНК) ex vivo В ПРИСУТСТВИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ММСК)
US20160299148A1 (en) * 2013-11-22 2016-10-13 Washington University Biomarkers for multiple myeloma
US11278572B2 (en) 2014-07-18 2022-03-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reducing CXCR4 expression and/or function to enhance engraftment of hematopoietic stem cells
US10626372B1 (en) 2015-01-26 2020-04-21 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
JP2018504122A (ja) * 2015-01-26 2018-02-15 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫調節特性が増加した細胞ならびにその使用および製造のための方法
CA2982115A1 (en) * 2015-04-06 2016-10-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for non-myeloablative conditioning
US20180214488A1 (en) * 2015-07-20 2018-08-02 Angiocrine Bioscience, Inc. Methods and compositions for stem cell transplantation
JP2018520688A (ja) 2015-07-21 2018-08-02 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション Ｐｄ−ｌ１発現造血幹細胞およびその使用
CA3003152A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Fate Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
CN108368520B (zh) * 2015-11-04 2023-01-17 菲特治疗公司 多能细胞的基因组工程改造
RU2628092C1 (ru) * 2016-02-10 2017-08-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) Способ получения МСК-ассоциированных недифференцированных гемопоэтических клеток-предшественников с фенотипов CD34+/CD133+
CN105779386B (zh) * 2016-04-06 2019-09-20 南京大学 一种间充质干细胞在制备治疗m5型白血病药物中的应用
CN105886457A (zh) * 2016-05-16 2016-08-24 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 诱导干细胞分化成外胚层祖细胞的方法
US11542473B2 (en) 2016-10-21 2023-01-03 Amniotics Ab Methods and compositions for generating hematopoietic cells
CN106754726A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 溯源生命科技股份有限公司 一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法
US11879137B2 (en) 2017-09-22 2024-01-23 The Children's Medical Center Corporation Treatment of type 1 diabetes and autoimmune diseases or disorders
EP3647413A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-06 Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas O.A., M.P. (CIEMAT) Improvements for performing and facilitating the recovery after hematopoietic stem cell transplantation
EP3969018A4 (en) * 2019-05-17 2023-07-12 Deverra Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING THE TREATMENT OUTCOMES OF PATIENTS WITH HEMATOLOGICAL MALIGNANTS USING AN AMPLIFIED STEM CELL PRODUCT
WO2020247341A1 (en) * 2019-06-06 2020-12-10 Medeor Therapeutics, Inc. Methods of making cellular products by post-mortem mobilization and harvesting of hematopoietic cells
CN110585432B (zh) * 2019-08-27 2021-10-15 中国人民解放军第二军医大学 成纤维细胞生长因子受体1在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用
EP4234019A3 (en) 2019-10-18 2023-09-13 Amniotics AB Processes and apparatuses for obtaining amniotic mesenchymal stem cells from amniotic fluid and cells derived thereof
WO2022089606A1 (en) * 2020-10-30 2022-05-05 Westlake Therapeutics (Hangzhou) Co. Limited Methods for preparing mature red blood cells in vitro

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4843155A (en) 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US5709472A (en) * 1995-10-23 1998-01-20 Lifelines Technology, Inc. Time-temperature indicator device and method of manufacture
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
DE69829402T2 (de) 1997-10-31 2006-04-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corp.), Santa Clara Expressionsprofile in adulten und fötalen organen
US6020135A (en) 1998-03-27 2000-02-01 Affymetrix, Inc. P53-regulated genes
AU2183900A (en) 1998-12-24 2000-07-31 Alcon Laboratories, Inc. Ep4 receptor agonists for treatment of dry eye
AU770867B2 (en) 1999-08-13 2004-03-04 Fumie Sato Prostaglandin derivatives
DK1132086T3 (da) 2000-01-31 2006-08-28 Pfizer Prod Inc Anvendelse af prostaglandin (PGE2) selektive receptor 4 (EP4) agonister til behandling af akut og kronisk nyresvigt
US20020013294A1 (en) 2000-03-31 2002-01-31 Delong Mitchell Anthony Cosmetic and pharmaceutical compositions and methods using 2-decarboxy-2-phosphinico derivatives
FR2825261B1 (fr) 2001-06-01 2003-09-12 Maco Pharma Sa Ligne de prelevement du sang placentaire comprenant une poche de rincage
US7439332B2 (en) * 2002-04-26 2008-10-21 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Polypeptide having an activity to support proliferation or survival of hematopoietic stem or progenitor cells
US6747037B1 (en) 2003-06-06 2004-06-08 Allergan, Inc. Piperidinyl prostaglandin E analogs
US20050176140A1 (en) * 2004-02-10 2005-08-11 Benedict Daniel J. Method and apparatus for cell culture using a two liquid phase bioreactor
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
AU2005299473B2 (en) 2004-10-26 2012-06-28 Allergan, Inc. Therapeutic and delivery methods of prostaglandin EP4 agonists
DE102005062741A1 (de) 2005-12-22 2007-06-28 Bayer Schering Pharma Ag Fluorene und Carbazole als Liganden des EP2 Rezeptors
RU2493252C2 (ru) * 2006-03-24 2013-09-20 Чилдрен'З Медикал Сентер Корпорейшн Способ стимулирования экспансии гематопоэтических стволовых клеток
CN101517070A (zh) * 2006-05-31 2009-08-26 Styx有限责任公司 选择干细胞的方法及其用途
CN101506353A (zh) * 2006-06-15 2009-08-12 尼奥斯泰姆公司 外周造血干细胞的处理方法
US20110165128A1 (en) * 2008-03-07 2011-07-07 Columbia University In The City Of New York Homing in mesenchymal stem cells
JP5846915B2 (ja) * 2008-11-06 2016-01-20 インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション 造血幹細胞の生着手順を強化するための材料および方法
RU2497532C2 (ru) * 2008-12-03 2013-11-10 Эморсайт, Инк. Композиции, улучшающие перфузию в области инфаркта и способы восстановления сосудистого повреждения
JP2010193879A (ja) * 2009-01-27 2010-09-09 Jms Co Ltd 臍帯血造血幹細胞の増殖制御方法およびその用途
AU2011289245B2 (en) * 2010-08-12 2015-01-22 Fate Therapeutics, Inc. Improved hematopoietic stem and progenitor cell therapy

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013003366A2 (pt) 2020-08-04
JP2013540105A (ja) 2013-10-31
CN106244547A (zh) 2016-12-21
CN112516167A (zh) 2021-03-19
JP2018104457A (ja) 2018-07-05
JP2023109761A (ja) 2023-08-08
CN106244547B (zh) 2021-01-01
JP2018184448A (ja) 2018-11-22
EP2603227A2 (en) 2013-06-19
CN103167876B (zh) 2016-08-31
EP2603227A4 (en) 2014-01-15
EP3278808A1 (en) 2018-02-07
US20200339953A1 (en) 2020-10-29
CN103167876A (zh) 2013-06-19
JP2016185976A (ja) 2016-10-27
JP6346917B2 (ja) 2018-06-20
AU2011289245B2 (en) 2015-01-22
CA2807944C (en) 2020-02-18
JP6047489B2 (ja) 2016-12-21
CN112501118A (zh) 2021-03-16
CA2807944A1 (en) 2012-02-16
US20140030232A1 (en) 2014-01-30
ES2654994T3 (es) 2018-02-15
EP2603227B1 (en) 2017-10-04
AU2011289245A1 (en) 2013-03-21
CN106214701B (zh) 2020-09-25
JP2022009404A (ja) 2022-01-14
CN106214701A (zh) 2016-12-14
WO2012021845A2 (en) 2012-02-16
JP2020029458A (ja) 2020-02-27
WO2012021845A3 (en) 2012-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6574279B2 (ja) 改善された造血幹細胞および前駆細胞療法
Ratajczak et al. Adult murine bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells differentiate into the hematopoietic lineage after coculture over OP9 stromal cells
US8383404B2 (en) Hematopoietic stem cell identification and isolation
Goedhart et al. Interferon-gamma impairs maintenance and alters hematopoietic support of bone marrow mesenchymal stromal cells
AU2017203597B2 (en) Impoved hematopoietic stem and progenitor cell therapy
US20140154219A1 (en) Methods and compositions for large-scale isolation of very small embryonic-like (vsel) stem cells
Mizokami et al. Preferential expansion of human umbilical cord blood-derived CD34-positive cells on major histocompatibility complex-matched amnion-derived mesenchymal stem cells
Ayabe et al. Characterisation of canine CD34+/CD45 diminished cells by colony-forming unit assay and transcriptome analysis

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180327

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180725

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190201

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190425

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190625

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190726

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190815

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6574279

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees