CN104586832B

CN104586832B - 用于癌症治疗的组合物和方法

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Publication number: CN104586832B
Application number: CN201410583457.XA
Authority: CN
Inventors: C·J·李; K·米库尔; Y·李
Original assignee: 1Globe Biomedical Co Ltd
Current assignee: 1Globe Biomedical Co Ltd
Priority date: 2007-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: PL2200431T3; PT2194987T; HRP20160949T1; HK1148906A1; EP2194987B1; US20180030021A1; US20210024482A1; DK2200431T3; CA2736532C; EP3050566A3; DK2190429T3; US20120252763A1; HUE029111T2; EP2200431A4; SI2190429T1; PT2200431T; US20190263768A1; CN101854802B; CN104586832A; JP5938072B2

Abstract

本发明涉及应用Stat3通路抑制剂或癌干细胞抑制剂组合治疗癌症的组合物和方法。

Description

用于癌症治疗的组合物和方法

本申请为2008年9月10日提交的、发明名称为“用于癌症治疗的新组合物和方法”的PCT申请PCT/US2008/075906的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年5月7日，申请号为200880115249.X。

对相关申请的引用

本申请要求分别于2007年9月10日和2007年12月13日递交的美国临时专利申请No.60/971,144和61/013,372的优先权和权益，所述申请的全部内容并入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及应用Stat3通路抑制剂和癌干细胞抑制剂组合治疗癌症及其他紊乱的组合物和方法。

发明背景

癌干细胞(CSC)

近年来，一种新的肿瘤发生模型得到了广泛认可，其中提出假说，在全部肿瘤物质中仅一小部分负责肿瘤内的致瘤活性，而老的模型或者说克隆遗传模型却假定所有突变的肿瘤细胞均等同地贡献于此致瘤活性。根据新模型，这小部分肿瘤发生细胞是具有干细胞样性能的转化细胞，并称为“癌干细胞”(CSC)。在20世纪90年代，Bonnet和Dick首先在体内证明了急性髓性白血病(AML)中CSC的存在。他们的数据表明，仅小亚群的人AML细胞在移植到免疫缺陷小鼠中时具有转移AML的能力，而其他AML细胞不能够诱发白血病。后来，证明这些CSC具有与原始造血干细胞相同的细胞标志CD34⁺/CD38^-[1]。从那以后，研究人员已经确凿地在多种类型的肿瘤(包括脑、乳腺、皮肤、前列腺等的肿瘤)中发现CSC。

肿瘤发生的CSC模型能够解释为什么为了确立肿瘤移植物，需要将几万或几十万的肿瘤细胞注射到试验动物体内。在人AML中，这些CSC细胞的频率低于万分之一[2]。尽管CSC在一个给定的肿瘤细胞群体中是稀少的，但有增加的证据表明此类细胞存在于几乎所有肿瘤类型中。然而，由于癌细胞系是从特异地适应于在组织培养中生长的癌细胞亚群中选择的，所以癌细胞系的生物学及功能特性可能经历显著的变化。因此，并非所有的癌细胞系都含有CSC。

癌干细胞与正常干细胞享有许多相似的性状。例如，CSC具有自我更新能力，即产生其他的肿瘤发生癌干细胞的能力，一般速率比其他分裂肿瘤细胞低，但非有限次数的分裂。CSC还具有分化成多种细胞类型的能力，这就解释了如下组织学现象——许多肿瘤不仅含有多种对宿主器官而言天然的细胞类型，而且肿瘤转移中常常保持异质性。已经证明CSC根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发。CSC也称为肿瘤起始细胞、癌干细胞样细胞、干细胞样癌细胞、高致瘤性细胞、肿瘤干细胞、实体瘤干细胞或超级恶性细胞。

癌干细胞的存在对于未来的癌症治疗和疗法具有根本性的意义。目前癌症治疗的功效在检验的初始阶段往往以肿瘤大小的缩减来衡量，即去掉的肿瘤物质的量。由于CSC构成肿瘤的一个极小部分，且具有与其更为分化的子代显著不同的生物学特征，所以对肿瘤质量的测量可能不一定能够选择出特异地作用于此干细胞的药物。事实上，癌干细胞呈现出抵抗放疗(XRT)，并且对化疗剂和靶向药物也表现出顽固性[3-5]。正常的体干细胞天然地对化疗剂具有耐药性——他们具有将药物泵出的多种泵(例如MDR)以及有效的DNA修复机制。而且，他们还具有缓慢的细胞更新速率，而化疗剂靶向快速复制的细胞。癌干细胞为正常干细胞的突变对应物，可能也具有类似的机制使之幸免于药物治疗和放射治疗。换言之，传统的化疗法和放疗法杀死不能再生肿瘤的分化了的或分化中的细胞，这些细胞构成肿瘤的大部分。另一方面，产生所述分化了的或分化中的细胞的癌干细胞群可能保持原样并引起疾病复发。传统抗癌疗法的另一危险在于所述治疗(例如化疗) 可能导致仅仅留下耐受化疗的癌干细胞，由此使得继发的复发肿瘤很可能也是化疗耐受的。

由于存活的癌干细胞能够使肿瘤重新建殖故而造成复发，所以在抗癌疗法中纳入抗CSC策略是绝对必要的(见图1)。这就类似于斩草需除根[6]。通过选择性地靶向癌干细胞，可以治疗患有侵袭性不可切除肿瘤和顽固性或复发性癌症的患者，以及防止肿瘤转移和复发。因此，开发靶向癌干细胞的特异性疗法为癌症患者、尤其是转移性癌症患者的存活和改善生活质量提供了希望。开启这股未被利用的潜力的关键在于鉴定和验证对于癌干细胞自我更新和存活具有选择的重要性的通路。虽然在过去已阐述过位于胚胎干细胞或成体干细胞的自我更新或癌症的肿瘤发生背后的多个通路，但是尚未鉴定和验证用于癌干细胞自我更新和存活的通路。

也有许多鉴定和分离癌干细胞的研究。所用的方法主要是利用CSC外排药物的能力，或是基于癌干细胞相关表面标志的表达。

例如，由于CSC对许多化疗剂具有耐药性，那么CSC几乎普遍地过表达药物外排泵如ABCG2 (BCRP-1) [7-11]及其他ATP结合盒(ABC)超家族成员[12, 13]，就不足为奇。从而，也采用最初用来富集造血和白血病干细胞的侧群(side population, SP)技术来鉴定和分离CSC [14]。这种技术首先由Goodell等人描述，利用荧光染料如Hoechst 33342的差异性ABC转运蛋白依赖性外排来确定和分离富含CSC的细胞群[10, 15]。具体而言，通过用戊脉安(verapamil)阻断药物外排来揭示该SP，此时染料不再能够泵出该SP。

研究人员还集中于寻找使癌干细胞区别于大部分肿瘤的特异性标志。最常表达的CSC表面标志包括CD44、CD133和CD166 [16-24]。通过主要基于这些表面标志的差异表达来分选肿瘤细胞，已经导致了迄今描述的高致瘤性CSC的大多数。因此，对于从癌细胞系和大块肿瘤组织中鉴定和分离癌干细胞而言，这些表面标志是被充分验证了的。

Stat3通路

哺乳动物或人癌细胞中有许多不同的遗传缺陷，且有许多已被研究以寻求治愈癌症。例如，已经发现p53肿瘤阻遏蛋白在半数以上的人类癌症中是缺陷型的或者全然无存。STAT (信号转导及转录活化因子)蛋白家族是潜伏的转录因子，响应细胞因子/生长因子而被激活以促进增殖、存活及其他生物过程。其中，Stat3通过由生长因子受体酪氨酸激酶、Janus激酶或Src家族激酶等介导的关键酪氨酸残基磷酸化而激活。这些激酶包括但不限于EGFR、JAK、Abl、KDR、c-Met、Src和Her2 [25]。一旦酪氨酸磷酸化，Stat3形成同源二聚体，转位至细胞核，结合靶基因启动子区中的特异性DNA效应元件，诱导基因表达[26] (见图2)。

在正常细胞中，Stat3激活是瞬时的，受到严密的调控，持续30分钟至数小时。然而，发现Stat3在广泛种类的人类癌症(包括所有主要的癌症以及一些血液肿瘤)中异常激活。Stat3在癌症进展中起多种作用。作为一种有力的转录调控因子，它靶向参与许多重要细胞功能的基因，例如Bcl-xl、c-Myc、细胞周期蛋白D1、Vegf、MMP-2和生存素[27-32]。它也是肿瘤免疫监视和免疫细胞募集的关键负调控因子[33-35]。

通过反义、siRNA、显性失活形式的Stat3和/或阻断酪氨酸激酶，消除Stat3信号传递，在体外和/或体内可以抑制某些癌细胞系或肿瘤[26, 28, 36, 37]。但是尚未经验性地提供Stat3和癌干细胞功能之间的清楚关联。研究人员也尚未发现有效的Stat3通路抑制剂以开发针对已经发现含有癌干细胞的癌症的潜在治疗应用。如早先所说明的那样，最近已经证明癌干细胞(CSC)根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发，故而在设计靶向已知具有这些细胞的肿瘤的任何治愈性疗法时，不论CSC可能占该肿瘤物质的多小比例，都应将其考虑在内。

在除癌症以外的疾病中，已经在许多自身免疫疾病和炎性疾病中证明了多种细胞因子如白介素6 (IL6)对Stat3的过度激活[38]。最近已经揭示，Stat3通路还通过其在产生TH17 T细胞应答中的基本作用而促进病理性免疫反应[39]。另外，已经发现IL6-Stat3通路介导的炎症是动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、高血压、骨质疏松症、2型糖尿病和痴呆的共同病因。

发明概述

本发明部分地基于本文提供的经验性证据，即， Stat3在广谱癌症中对癌干细胞(CSC)的存活和自我更新能力均起着关键作用。本发明还提供数据确认了某些化合物可以起Stat3通路抑制剂作用，并且它们在体外和体内均有效地抑制CSC。

从而，本发明的第一方面提供了治疗患有异常Stat3通路活性相关紊乱的受试者的方法，该方法包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一药剂，以抑制至少一些异常Stat3通路活性；和(b)向受试者施用第二量的、包含信号转导抑制剂的第二药剂。

第一药剂可以通过至少一种如下的作用抑制Stat3通路活性：基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核转位(translocation)、基本上抑制Stat3蛋白的DNA结合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的转录活性。

在一个实施方案中，第一药剂选自： 2-(1-羟乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、盐或溶剂化物(下文称作“本发明的化合物”)。

能够通过本发明第一方面的方法治疗的非癌症紊乱包括但不限于：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎性肠病、关节炎、哮喘、和系统性红斑狼疮、自身免疫性脱髓鞘疾病、阿尔茨海默病、中风、缺血再灌注损伤和多发性硬化症。能够通过该方法治疗的癌症包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。已知这些非癌和癌的紊乱与异常的Stat3通路活性相关。

在一个特征中，第二药剂是靶向剂，其可为生长因子受体靶向剂、激酶靶向剂或血管生成抑制剂。

第二方面，本发明提供了治疗患有异常Stat3通路活性相关癌症的受试者的方法，所述方法包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一药剂，以抑制至少一些异常Stat3通路活性；和(b)向受试者施用第二量的第二抗癌药剂。

有关第一药剂的特征可类似于就本发明第一方面描述的那些特征，而第二抗癌药剂可为细胞毒性剂或化疗剂。在一个实施方案中，第二药剂是用于至少一种癌症的标准一线治疗。

在一个特征中，该抗癌药剂是DNA损伤剂、抗有丝分裂剂和/或抗代谢物。例如，DNA损伤剂可为烷化剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂。在一个实施方案中，第二药剂是卡铂、多柔比星、吉西他滨、多烯紫衫醇(docetaxel)或依托泊苷之一。

能够通过本发明第二方面的方法治疗的癌症包括已知与异常Stat3通路活性相关的那些，在上文已经列出，不在此重复。

由于癌干细胞一般抵抗放疗和传统化疗，因此靶向癌干细胞的药物在与其他抗癌疗法组合应用时应具有协同效应。因此，根据本发明的第三方面，治疗受试者癌症的方法包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一抗癌药剂，以抑制癌干细胞(CSC)群；和(b)向受试者施用第二量的第二抗癌药剂，以抑制多数的普通癌细胞。

在多个实施方案中，该方法的步骤(a)抑制至少一种CSC自我更新，和/或杀死至少一种CSC。在一实施方案中，第一量的第一抗癌药剂也杀死多数的普通癌细胞。在一实施方案中，步骤(a)抑制癌干细胞中的至少一些Stat3通路活性。第一抗癌药剂可以与根据本发明第一方面的方法中的第一药剂享有相同的特征和特点，因为本发明已经提供了Stat3通路抑制剂能够有效抑制CSC的证据。共享的特征可以包括，例如，本文所述的第一抗癌药剂能够靶向的多个Stat3通路步骤。在多个实施方案中，第一抗癌药剂可为小分子Stat3抑制剂、针对Stat3的RNAi药剂、针对Stat3的反义药剂、肽模拟物Stat3抑制剂、或G四联体寡脱氧核苷酸Stat3抑制剂。

能够通过该方法治疗的癌症优选是已知或确认含有CSC的那些，包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、结直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、肝癌、胃癌、成神经管细胞瘤、脑瘤和白血病。

根据本发明第三方面的方法中的“第二抗癌药剂”可与根据本发明第二方面的方法中的“第二抗癌药剂” 相同，故所有共享的特征不在此重复。

在一个实施方案中，第二药剂是用于至少一种癌症的标准一线治疗。第二药剂可为细胞毒性剂。在一个特征中，该抗癌药剂为DNA损伤剂、抗有丝分裂剂和/或抗代谢物。例如，DNA损伤剂可为烷化剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂。在一个实施方案中，第二药剂是卡铂、多柔比星、吉西他滨、多烯紫衫醇或依托泊苷之一。

根据本发明的第四方面，提供了治疗受试者癌症的方法，包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一癌干细胞抑制剂，以抑制Stat3通路活性；和(b)向受试者施用第二量的第二癌干细胞抑制剂，以抑制不同通路的活性。

在一实施方案中，第二癌干细胞抑制剂是拉帕替尼(lapatinib)。在一些实施方案中，第二量的第二抗癌药剂本身对癌干细胞群不是治疗有效的。能够通过此方法治疗的癌症优选是已知或确认含有CSC的那些，上文列出了一些实例。在多个实施方案中，癌症是转移性的、标准一线癌症治疗顽固性的或复发性的。

根据本发明的第五方面，提供了治疗受试者癌症的方法，包括步骤：(a)向受试者施用治疗有效量的第一抗癌药剂，其选自下组化合物： 2-(1-羟乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、其可药用盐或溶剂化物；和(b)施用并非选自该相同组的第二抗癌药剂。

第二抗癌药剂可为在本发明其他方面描述的任何药剂，包括任何细胞毒性剂或化疗剂及任何靶向剂。

第六方面，本发明提供了药物组合物，包含治疗有效量的第一抗癌药剂，其选自下组化合物：2-(1-羟乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、其可药用盐或溶剂化物；和第二抗癌治疗，其选自：细胞毒性剂、靶向剂、放疗剂、生物药(biologic agent)、激素药、HDAC抑制剂、视黄醇类药(retinoid agent)、检查点激活物(checkpoint activator)、蛋白酶体抑制剂、辅剂(adjuvant agent)或辅助药(adjunctive agent)。

在一实施方案中，组合物还包含可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明的其他方面(包括与本文所述方法相关的所有组合物和试剂盒)和实施方案在如下发明详述中阐释，或将会因其变得显而易见。

附图的简短说明

图1图示了癌干细胞特异性癌症疗法和传统癌症疗法之间的差异。

图2显示了癌中的Stat3通路。

图3A显示了Stat3在Hoechst侧群细胞中组成型地激活。

图3B显示了Stat3在CD133⁺细胞中组成型地激活。

图4A和4B显示了癌干细胞中的Stat3敲低(knockdown)诱导凋亡。

图5显示了癌干细胞中的Stat3敲低抑制癌干细胞球体形成。

图6显示了化合物401抑制Stat3的转录激活活性。

图7A显示了化合物401抑制核提取物中Stat3的 DNA结合活性。

图7B显示了化合物401、416和418抑制核提取物中Stat3 的DNA结合活性。

图8A显示了化合物401抑制异种移植肿瘤组织中Stat3 的DNA结合活性。

图8B显示了化合物401抑制异种移植肿瘤组织中Stat3的下游效应子的表达水平。

图9A显示了Hoechst侧群的分选和分析。

图9B显示了Hoechst侧群对化合物401与非侧群一样敏感。

图10A显示了化合物401使Hoechst侧群细胞凋亡。

图10B显示了化合物401使CD133⁺细胞凋亡。

图11显示了化合物401阻断CD44^high球体形成。

图12显示了体内化合物401处理降低异种移植肿瘤细胞的球体形成。

图13显示了化合物401在ISMS模型中抑制转移。

图14显示了化合物401在A549人肺癌细胞中与索拉非尼(sorafenib)具有协同效应。

图15显示了化合物401在A549人肺癌细胞中与厄洛替尼(erlotinib)具有协同效应。

图16显示了化合物401在A549人肺癌细胞中与拉帕替尼具有协同效应。

图17显示了化合物401在A549人肺癌细胞中与索坦(sutent)具有协同效应。

图18显示了化合物401在Paca-2人胰腺异种移植模型中与吉西他滨具有协同效应。

发明详述

如本文所用，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数引述，除非上下文另有清楚说明。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用的术语“分离的”或“纯化的”是指物质实质上或基本上不含在其天然状态下与其正常相伴的成分。纯度和均质性一般可以利用分析化学技术来确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。

如本文所用，术语“癌干细胞”和“CSC”可互换。CSC是哺乳动物的，并且在优选的实施方案中，这些CSC是人类来源的，但它们并非旨在限于此。癌干细胞定义为、并在功能上表征为：源于实体瘤的细胞群，其：(1)具有广泛的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂，生成一种或多种类型具有减小的增殖或发育潜力的分化子代；和(3)能够进行对称细胞分裂用于自我更新或自我维持。其他表征CSC的常见方法包括形态学和检查细胞表面标志、转录谱、和药物反应。CSC在研究文献中也称作肿瘤/癌症起始细胞、癌干细胞样细胞、干细胞样癌细胞、高致瘤细胞、肿瘤干细胞、实体瘤干细胞、药物存活细胞(DSC)、耐药性细胞(DRC)或超级恶性细胞。

如本文所用，术语“自我更新”是指癌干细胞产生新的致瘤性癌干细胞以补充或增加其数量的能力。

如本文所用，术语"癌症"和"癌变的"是指或者描述的是，哺乳动物中一群细胞以失控的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用的“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指源于肿瘤的总细胞群，既包括构成肿瘤细胞群体的大部分的非肿瘤发生性细胞，又包括肿瘤发生性干细胞(癌干细胞)。癌症的实例包括但不限于：癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌。

如本文所用的“肿瘤”是指由于过度细胞生长或增值而产生的任何组织块，或良性(非癌变)或恶性的(癌变)，包括癌前病变。

如本文所用的“转移”(metastasis)是指癌症由起源位点扩散或转移到身体其他区域、在新位置上形成类似的癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞是丧失与邻近细胞的粘附接触、并借助血流或淋巴由疾病的原发部位迁移而浸润邻近身体结构的细胞。

如本文所用，术语“受试者”是指任何将作为特定治疗的接受者的动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。一般，术语“受试者”和“患者”就人类受试者而言在本文可互换使用。

如本文所用的诸如“治疗”或“缓解”等术语既指1)治愈、减缓、减轻所诊断病情(condition)或紊乱的症状，和/或中断其进展的治疗性措施，又指2)防止或减缓所靶向病情或紊乱的发展的防范性或预防性措施。因而，需要治疗的包括已经患有紊乱的那些；易于患有紊乱的那些；以及欲预防紊乱的那些。如果患者显示出如下一种或多种状况，则该受试者被本发明的方法成功地“治疗”：癌细胞数量的减小或完全不存在癌细胞；肿瘤大小的减小；癌细胞向周围器官的浸润、包括癌向软组织和骨的扩散，的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；与具体癌症相关的一种或多种症状的减轻；减小的发病率和死亡率；和生活质量的提高。

如本文所用，当用在生物活性的语境中时，术语“抑制”及其语法等同体是指生物活性的下调，这可以减小或消除所靶向的功能，例如蛋白质的生产或分子的磷酸化。在特别的实施方案中，抑制可以指所靶向活性的约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的减小。当用于紊乱或疾病的语境中时，该术语是指成功地防止症状发作、缓解症状或消除疾病、病情或紊乱。

如本文所用的单数或复数形式的“普通癌细胞”是指非癌干细胞的癌细胞。

如本文所用的“组合”疗法或治疗表示施用至少两种不同的治疗，以处理紊乱、病情或症状，例如癌症病情。此类组合疗法可以包括在施用一种治疗之前、期间和/或之后施用另一种治疗。这些治疗的施用可以在时间上分开长达数周，但最常见的是48小时之内，且最常见的是24小时之内。

如本文所用的术语"可药用的赋形剂、载体或稀释剂"表示可药用的材料、组合物或媒介物，例如参与将主题药物活性剂由一种器官或身体部分携带或运输至另一器官或身体部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。就与制剂中的其他成分相容且对患者无害这一意义上，各载体必须是"可接受的" 。能够作为可药用载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；甘醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及其他在药学制剂中采用的无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物)、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香料剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

本发明的化合物可以形成盐，这也落在本发明的范围内。本文述及本发明的化合物应理解为包括述及其盐，除非另有说明。如本文所采用的术语“盐”，表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸加成盐和/或碱加成盐。另外，当本发明的化合物既含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)、又含有酸性部分(例如但不限于羧酸)时，可以形成两性离子(“内盐”)，并包括在如本文所用的术语“盐”中。优选可药用的(即，无毒、生理上可接受的)盐，不过其他盐也是有用的，例如用于制备期间可能采用的分离或纯化步骤中。本发明化合物的盐可以，例如，通过使化合物I、II或III与一定量(例如等量)的酸或碱在介质(例如盐在其中沉淀的介质或在水性介质)中反应并之后冻干而形成。

本文也考虑本发明化合物的溶剂化物。本发明化合物的溶剂化物包括例如水合物。

靶向Stat3通路

本发明提供了为Stat3通路活性有效抑制剂的化合物(实施例2)。由于Stat3通路是经激活可以促进增殖、存活和许多其他生物学过程的潜伏转录因子，其牵涉到广泛种类的人类癌症以及非癌症紊乱，包括许多自身免疫病和炎性疾病(表1)。从而，本发明第一方面提供了与异常(例如过表达的) Stat3通路活性相关的紊乱的组合治疗。特别地，向患者受试者施用第一量的第一药剂以抑制至少一些异常的Stat3通路活性，以及还施用第二量、包括信号转导抑制剂的第二药剂。在多个实施方案中，抑制一些(例如20%、30%、40%)、大多数(约50%以上)、或基本上所有(例如60%、70%、80%、90%、95%或100%)的异常Stat3通路活性。第一量和第二量之一或两者可为组合应用前(即自身针对紊乱应用时)相应药剂的治疗有效量，或者由于组合的突出协同效应而低于该量。第一药剂可以靶向Stat3通路中的一个或多个步骤。在一个实施方案中，第一药剂是本发明的化合物。

表1. 人类疾病中STAT3通路的激活

第二药剂，即信号转导抑制剂，可用来靶向与第一药剂所抑制的通路不相同的通路、相关的通路或者相同Stat3通路中不同的步骤。通常，当组合疗法中的两类药剂靶向相同的通路 (即使是不同的步骤) 时，预期的协同作用量是有限的。然而，下文实施例5提供的数据显示出在本发明化合物与推测靶向相同通路中的其他步骤的第二药剂(例如酪氨酸激酶和GFR靶向剂)之间令人惊讶地高的协同作用量，提示意料不到的抑制机制在起作用。

具体地，Stat3通过由生长因子受体酪氨酸激酶、Janus激酶或Src家族激酶等介导的关键酪氨酸残基磷酸化而激活；一旦酪氨酸磷酸化，Stat3形成同源二聚体，转位至细胞核，结合靶基因启动子区中的特定DNA效应元件，诱导基因表达。本发明的实施例2显示了在Stat3通路中，通过该DNA结合步骤，本发明化合物的抑制效应是明显的。而且，由于此类效应见于组成型激活的Stat3，故很可能本发明的化合物抑制Stat3蛋白的二聚化和/或核转位。因此，当其与也靶向相同Stat3通路的酪氨酸激酶(TKI)和GFR靶向剂组合时，观察到的协同作用量令人惊讶地高。例如，当化合物401与TKI索拉非尼组合时，实现了来自胰腺癌细胞系的细胞100%的抑制，而当化合物401和索拉非尼单独施用时，两者均仅能分别实现相同细胞系66%的抑制——已知胰腺癌牵涉到Stat3的过表达[44]。事实上，所有四种与化合物401组合检验的TKI均显示出显著的协同作用。在本发明优选的实施方案中，组合治疗实现癌细胞超过约50%、或70%、或90%的抑制。

根据本发明第一方面的方法可应用于治疗癌症或非癌症紊乱，优选已知与异常Stat3通路活性相关的那些。与异常Stat3通路活性相关的非癌症紊乱的实例包括但不限于：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎性肠病、关节炎、哮喘、和系统性红斑狼疮、自身免疫性脱髓鞘病、阿尔茨海默病、中风、缺血再灌注损伤和多发性硬化症。与异常Stat3通路活性相关的癌症的实例包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。

根据本发明第一方面的第二药剂可为靶向剂，例如生长因子受体靶向剂(见实施例5中厄洛替尼(特罗凯)的数据)、激酶靶向剂(见实施例5中拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼替尼和索拉非尼的数据)或血管生成抑制剂(见实施例5中舒尼替尼和索拉非尼的数据)。

在一个实施方案中，第二药剂是生长因子受体靶向剂，例如靶向与激酶相关的生长因子受体[例如，表皮生长因子受体(EGFR)或血管内皮生长因子受体(VEGFR)]的抗体。例如，靶向剂可为吉非替尼(艾瑞沙) 厄洛替尼(特罗凯)、PD153035、西妥昔单抗(爱必妥)、阿瓦斯丁、帕尼单抗、曲妥珠单抗和抗c-Met抗体。

在一个实施方案中，第二药剂是激酶靶向剂，其可为激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。例如，TKI可为厄洛替尼(erlotinib)(特罗凯(Tarceva))、索坦(Sutent)(舒尼替尼(sunitinib))、拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)(多吉美(nexavar))、凡德他尼(vandetanib)、阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cedivanib)、达沙替尼(dasatinib) (扑瑞赛(sprycel))、吉非替尼(gefitinib)(艾瑞沙(irressa))、伊马替尼(imatinib) (格列卫(gleevac))、来他替尼(lestaurtinib)、和/或ARQ197。

在多个实施方案中，激酶靶向剂为如下之一：吉非替尼(艾瑞沙)、ZD6474(AZD6474)、EMD-72000 (马妥珠单抗(matuzumab))、帕尼单抗(panitumab) (ABX-EGF)、ICR-62、CI-1033 (PD183805)、拉帕替尼(lapatinib) (泰克泊(tykerb))、AEE788 (吡咯并嘧啶)、EKB-569、EXEL 7647/EXEL 0999 、厄洛替尼(特罗凯)、伊马替尼(格列卫)、索拉非尼(多吉美)、舒尼替尼(索坦)、达沙替尼(扑瑞赛)、凡德他尼(ZACTIMA)、temsirolimus (驮瑞塞尔(torisel))、PTK787 (瓦他拉尼(vatalanib))、帕唑帕尼(pazopanib)、AZD2171、依维莫司(everolimus)、seliciclib、AMG 706、阿西替尼、PD0325901、PKC-412、CEP701、XL880、伯舒替尼、BIBF1120、BIBF1120、尼罗替尼(nilotinib)、AZD6244、HKI-272、MS-275、BI2536、GX15-070、AZD0530、enzastaurin、MLN-518和ARQ197。

在一个实施方案中，第二药剂是血管生成抑制剂，其可为如下之一：CM101、IFN-α、IL-12、血小板因子-4、苏拉明(suramin)、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、血管生成抑制性甾醇(angiostatic steroids)+肝素、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、巴马司他(batimastat)、马立马司他(marimastat)、制管张素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、2-甲氧基雌二醇、替可加兰(tecogalan)、血小板反应蛋白、αVβ3抑制剂、利诺胺(linomide)和ADH-1。

在相关的第二方面，本发明提供了治疗异常Stat3通路活性相关癌症受试者的方法，所述方法包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一药剂，以抑制至少一些异常Stat3通路活性；和(b)向受试者施用第二量的第二抗癌药剂。可用此方法治疗的癌症包括已知与异常通路活性相关(例如至少部分地由之引起)的那些，在上文就本发明第一方面提供了其列表。

有关第一药剂的特征可类似于就本发明第一方面所描述的那些，而第二抗癌药剂可为细胞毒性剂或化疗剂。在一个实施方案中，第二药剂是用于至少一种癌症的标准一线治疗。在该方法中使用的第一药剂和第二药剂的量可为组合应用前相应药剂的治疗有效量或者低于该量。

在一个特征中，抗癌药剂是DNA损伤剂、抗有丝分裂剂、和/或抗代谢物。DNA损伤剂可为烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、和/或DNA嵌入剂。如实施例5所示，将本发明的化合物401分别与如下每一种一起添加到Paca2胰腺癌细胞中：卡铂(DNA烷化剂)、依托泊苷(拓扑异构酶II抑制剂)、多柔比星(DNA嵌入剂)、多烯紫杉醇(抗有丝分裂剂)和健择(Gemzar)/吉西他滨(抗代谢物)。每种组合中都发现了显著的协同作用量。例如，当化合物401与健择/吉西他滨组合时，实现了胰腺癌细胞96%的抑制，而当单独施用时，化合物401和健择仅能分别实现相同细胞系66%和36%的抑制。

烷化剂可为如下之一：苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、塞替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链佐星(streptozocin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、沙铂(satraplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、六甲蜜胺(altretamine)、ET-743、XL119 (becatecarin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氮芥(chlormethine)、苯达莫司汀(bendamustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uramustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、司莫司汀(semustine)、奈达铂(nedaplatin)、triplatin tetranitrate、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)、替莫唑胺(temozolomide)、卡波醌(carboquone)、三亚胺醌(triaziquone)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、和丙卡巴肼(and procarbazin)。

拓扑异构酶抑制剂可为如下之一：多柔比星(doxorubicin, doxil)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依达比星(idarubicin)、二羟蒽二酮(anthracenedione,诺肖林(novantrone))、米托蒽醌(mitoxantrone)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素D (dactinomycin)、plicatomycin、伊立替康(irinotecan)(开普拓(camptosar))、喜树碱(camptothecin)、鲁比替康(rubitecan)、贝洛替康(belotecan)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和拓扑替康(topotecan)(和美新(hycamptin))。

DNA嵌入剂可为原黄素(proflavine)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、柔红霉素、放线菌素D和沙立度胺(thalidomide)。

抗有丝分裂剂可为如下之一：紫杉醇(paclitaxel, abraxane)/泰素(taxol)、多烯紫杉醇(docetaxel)(泰索帝(taxotere))、BMS-275183、聚谷氨酸紫杉醇(xyotax)、tocosal、异长春碱(vinorlebine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春利定(vinzolidine)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)、伊沙匹隆(ixabepilone)、larotaxel、ortataxel、tesetaxel和伊斯平斯(ispinesib)。

抗代谢物可为如下之一：氟脲嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、希罗达(xeloda)、阿仑恩(arranon)、亚叶酸(leucovorin)、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、喷司他丁(pentostatin)、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(cladribine)(2-CDA)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他滨、培美曲塞(pemetrexed)、硼替佐米(bortezomib)、氨基喋呤(aminopterin)、雷替曲塞(raltitrexed)、氯法拉滨(clofarabine)、依诺他滨(enocitabine)、sapacitabine和阿扎胞苷(azacitidine)。

在一个实施方案中，第二抗癌药剂是如下之一：卡铂、多柔比星、吉西他滨、多烯紫衫醇和依托泊苷。由于此方法抑制Stat3通路，本文证明该通路对于CSC的自我更新和存活均至关重要(见实施例1中的数据)，且已经发现CSC根本性地负责药物耐药性、肿瘤复发和转移，所以在优选的实施方案中，此方法用来治疗或预防顽固性癌症、复发性癌症、和/或转移性癌症。

抗癌化疗和生物疗法的更多讨论以及适宜治疗方案的实例可见于诸如Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice, 第三版 (2001), Chabner和Longo编辑, 以及Handbook of Cancer Chemotherapy, 第六版 (2003), Skeet编辑(两者均来自Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., U.S.A.)的书籍；而且抗癌治疗，尤其是化疗的方案可见于诸如美国癌症研究所(National Cancer Institute,www.cancer.gov)、美国临床肿瘤学会(American Society for Clinical Oncology,www.asco.org)和美国综合癌症网(National Comprehensive Cancer Network,www.nccn.org)维护的那些网站。

靶向癌干细胞

本发明还提供了本发明的化合物抑制CSC的自我更新并使CSC凋亡的体外和体内数据(实施例3)。此外，本发明经验性地确认了本发明化合物对转移性癌症的功效(实施例4)。

癌症疗法(抗癌疗法)的目的在于防止癌细胞增殖、浸润、转移及最终杀死其宿主生物体，例如人或其他哺乳动物。由于细胞增殖是许多正常细胞以及癌细胞的特征，大多数既有的抗癌疗法对正常细胞也具有毒性作用，特别是对具有快速周转率的那些正常细胞，例如骨髓和粘膜细胞。因此，有效的癌症疗法需要对癌细胞具有显著的生长抑制或控制作用，同时对宿主的正常细胞施加最小的毒性作用。

自从20世纪40年代第一代有效的抗癌化合物进入临床试验以来，癌症复发和药物耐药性依然是癌症治疗中一些最大的问题。往往是能够获得症状的消退，但反应屡屡为部分性的，且仅有很短的持续时间，而且复发的癌症倾向于对原来的药物具有耐药性。现在这可通过癌干细胞(CSC)的存在来解释。如上文所述，全部肿瘤物质中的这一小群细胞能够躲避对其余癌细胞有效的药物和放疗，这是因为CSC大概与正常体干细胞享有相同类型的生物机制，这些细胞对大多数(如果不是所有的话)化疗剂具有天然的耐药性。作为癌物质中肿瘤发生活性的真正根源，CSC能够重新支持癌症的再生，或者如果不予治疗的话导致转移。由于初始治疗仅留下药物耐药性癌干细胞，整个再生的或转移的肿瘤变得对初始“有效”疗法具有耐受性的几率显著增加。

目前，抗癌疗法由于若干原因而组合应用。其一，用两种或更多种无交叉抵抗性的疗法治疗可以防止肿瘤中抗性克隆的形成。对一种抗癌药物(例如铂抗癌化合物，如顺铂)的耐药性往往伴随着对同类其他药物(例如其他铂化合物)的交叉耐药性。而且，还存在着多药耐药性，也称为多效耐药性，即用一种药物治疗不仅赋予对该药物及对其类别的其他药物的耐药性，而且还赋予对无关药剂的耐药性。其二，对处于不同生长期的细胞具有活性的两种或更多种疗法的组合可以杀死缓慢分裂的细胞以及活跃分裂的细胞，和/或募集细胞进入更为活跃的分裂状态，使它们对多种抗癌疗法更加敏感。其三，组合治疗可以通过影响不同的通路或单一生化通路中的不同步骤来创建生化增强效应。

这些组合抗癌治疗的基本理论没有考虑到近来在确认和表征癌干细胞方面获得的进展。未能在组合疗法中并入CSC特异性疗法能够解释为何目前的组合疗法不能治愈常见癌症如转移性结肠癌和前列腺癌。鉴于本文提供的数据确认了本发明化合物针对CSC的功效(实施例3)，本发明能够设计组合CSC靶向剂和靶向普通癌细胞的其他药剂的癌症治疗方法。而且，虽然不希望束缚于特定的理论，本发明提供了药物方案取代如下情形，在该情形中当原始的CSC由于仅靶向CSC的单一药物疗法而被耗竭时，一些未被治疗或未充分治疗的普通癌细胞会回复成或产生CSC(目前这得到一些初步数据的支持)。

由于癌干细胞一般抵抗放疗和传统化疗，因此靶向癌干细胞的药物在与其他抗癌疗法组合应用时应具有协同效应。因此，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，其包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一抗癌药剂，以抑制癌干细胞群；和(b)向受试者施用第二量的第二抗癌药剂，以抑制多数的普通癌细胞。

在多个实施方案中，抑制一些(例如20%、30%、40%)、大多数(约50%以上)、或基本上所有(例如60%、70%、80%、90%、95%或100%)的CSC。，第一量和第二量之一或两者可为相应药剂在组合应用前(即自身针对癌症应用时)的治疗有效量，或者由于组合的突出协同效应而低于该量。在一个实施方案中，第一药剂是本发明的化合物，即，2-(1-羟乙基)-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、及其可药用盐或溶剂化物。

此处的“第二抗癌药剂”可为上述方法中相同的“第二抗癌药剂”，故所有共享的特征不在此重复。在一个特征中，第二抗癌药剂为DNA损伤剂、抗有丝分裂剂和/或抗代谢物。例如，DNA损伤剂可为烷化剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂。适宜的烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、抗有丝分裂剂和抗代谢物在上文列出，故不在此重复。在癌抑制实验中在本发明化合物与每一种上述类别的化疗剂组合应用的情况下观察到显著的协同作用(见实施例5)。在一个实施方案中，第二药剂是卡铂、多柔比星、吉西他滨、多烯紫衫醇和依托泊苷之一。

在另一特征中，第二抗癌药剂是靶向剂，例如生长因子受体靶向剂(见实施例5中厄洛替尼(特罗凯)的数据)、激酶靶向剂(见实施例5中拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼替尼和索拉非尼的数据)或血管生成抑制剂(见实施例5中舒尼替尼和索拉非尼的数据)。在癌抑制实验中在本发明化合物与每一种上述类别的靶向剂组合应用的情况下观察到显著的协同作用。适宜的生长因子受体靶向剂、激酶靶向剂(尤其是TKI)、以及血管生成抑制剂在上文列出，故不在此重复。

由于此方法采用特异性地靶向肿瘤中的CSC细胞(其根本性地负责药物耐药性、肿瘤复发和转移)的治疗剂，所以在优选的实施方案中，此方法用来治疗或预防顽固性癌症、复发性癌症、和/或转移性癌症。

在以组合治疗靶向CSC方面，一个策略应当旨在靶向牵涉CSC关键生物学功能(如自我更新和存活)的一个以上通路。为此，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，包括步骤：(a)向受试者施用第一量的第一癌干细胞抑制剂，以抑制Stat3通路活性；和(b)向受试者施用第二量的第二癌干细胞抑制剂，以抑制不同通路的活性。在一实施方案中，此方法中第一和/或第二抗癌药剂的量就其自身对癌干细胞群并非治疗有效的——但是由于通过该组合实现的显著协同作用，较低的量能够在此方法中应用以引发患者的反应。

在一个实施方案中，第二抗癌干细胞剂是拉帕替尼(INN)或二甲苯磺酸拉帕替尼(USAN)——其被FDA于2007年批准用于患有晚期转移性乳腺癌的患者。拉帕替尼是ATP竞争性表皮生长因子受体(EGFR)和HER2/neu (ErbB-2)双重酪氨酸激酶抑制剂。其通过与EGFR/HER2蛋白激酶结构域的ATP结合口袋结合而抑制受体的自磷酸化和激活。下文实施例5呈现的数据显示，针对Paca2胰腺癌细胞实现了显著的协同作用：组合前，化合物401和拉帕替尼的抑制率分别为32%和27%，而组合后的抑制率暴涨至74%，高于两抑制率之和。由于此方法额外关注CSC (其根本性地负责药物耐药性、肿瘤复发和转移)，所以在优选的实施方案中，此方法用来治疗或预防顽固性癌症、复发性癌症、和/或转移性癌症。

本发明的制剂包括适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。制剂可以便利地以单位剂型的形式提供，并且可以通过任何药学领域公知的方法制备。可与载体材料混合以生产单剂型的活性成分量将根据待治疗的哺乳动物和具体的施用方式而变。可与载体材料混合以生产单剂型的活性成分量一般是产生治疗效果的化合物量。一般而言，在100%中，该量的范围是例如约1%至约99%活性成分、约5%至约70%、约10%至约30%。

材料和方法

生物学测定法

本发明的化合物可根据上文所述的方案进行检查。表2显示了在该方案中描述的化合物的列表。

表2

细胞培养：HeLa、DU145、H1299、DLD1、SW480、A549、MCF7、LN18、HCT116、HepG2、Paca2、Panc1、LNcap、FaDu、HT29和PC3细胞(ATCC, Manassas, VA)在补充有10%胎牛血清(FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)和5%青霉素/链霉素/两性霉素B(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中维持。

Hoechst侧群：为鉴定和分离侧群(SP)和非SP级分，用胰蛋白酶和EDTA自培养皿中取出SW480细胞，离心沉淀，以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并重悬于37℃含2% FBS和1 mMHEPES的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。然后用Hoechst 33342 (Invitrogen)以5 µg/mL的浓度标记细胞。标记的细胞单独或与50 µM戊脉安(verapamil, Sigma-Aldrich,St. Louis)一起于37℃孵育120分钟。染色后，使细胞悬浮于含2% FBS和1 mMHEPES的Hanks平衡盐溶液(HBSS; Invitrogen)中，流经40 µm滤网，并维持在4℃直至进行流式细胞术分析。Hoechst染料在350 nm激发，并利用450 DF10 (450/20 nm带通滤光片)和675LP (675nm长波通截止滤光片)光学滤光片在两个波长测量其荧光。正向和侧向散射光设门并不严格，仅排除碎片[15]。

以表面标志进行CSC分离：通过主要基于表面标志(例如CD44或CD133)的差异表达来分选肿瘤细胞，已经产生了大多数迄今描述的高致瘤性CSC。CD133基于稍加修改的Ricci-Vitiani等人的方法[21] 分离。CD133⁺细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)或基于磁纳米颗粒的分离法进行分离。简言之，对于基于FACS的细胞分选，以CD133/1 (AC133)-PE标记10⁷细胞/mL；或对于基于磁场的分离，利用EasySep®生物素选择试剂盒(MiltenyiBiotec)按照生产商的建议以CD133/1 (AC133)-生物素(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)标记10⁷细胞/mL。非特异性标记用提供的FcR阻断试剂来阻断，而抗体孵育(1:11)在冰上于具有2% FBS和1 mM EDTA的PBS中进行15分钟。对于EasySep®分离进行5次洗涤，而在FACS分选前细胞在400×g沉淀5分钟，并重悬至2×10⁷/mL。

CD44^high细胞根据稍加修改的Ponti等人所述的方法[81]通过FACS分离。简言之，经胰蛋白酶消化和37℃生长培养基中30分钟的细胞恢复之后，细胞在400×g沉淀，并于具有2% FBS和1 mM EDTA的PBS中重悬至1×10⁶细胞/mL。细胞随之在冰上与1:100稀释的CD44-FITC (BD Biosicences, San Diego, CA)孵育15分钟。或者，利用CD24-PE (BDBioscences, San Diego, CA) (1:100)进行负选择。洗涤3次之后，细胞重悬至2×10⁶/mL，并流经40 µm滤网，之后进行分选。

球体测定试验：一种测量细胞群自我更新能力的可靠方法是在不存在血清或贴壁的情况下被培养为球体的能力。CD44^high FaDu或Hoechst侧群癌干细胞在超低附着板中于癌干细胞培养基(DMEM/F12, B27 Neurobasal增补物, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 4µg/ml胰岛素和0.4% BSA)中培养以允许球体形成。一般，10-14天培养后通过显微镜检评估球体形成，并记录具有>50个细胞的球体。

萤光素酶报告试验：HeLa细胞用Stat3-萤光素酶(Stat3-Luc)报告载体(Panomics, Fremont, CA)和海肾萤光素酶(Promega, Madison, WI)通过Lipofectamine2000如生产商(Invitrogen)所述进行共转染。转染之后，细胞在含0.5% FBS的培养基中维持24小时。细胞随之用所示的化合物处理30分钟，之后向培养基中添加25 ng/ml制瘤素M(OSM) (R&D Systems, Minneapolis, MN)。继OSM添加后6小时，收获细胞，并利用Dual-Glo萤光素酶测定系统如生产商(Promega)所述测量萤火虫和海肾萤光素酶的水平。

凋亡分析：用或未用化合物处理的细胞在处理后5小时收获，进行膜联蛋白-V染色。收集的细胞以PBS洗涤，重悬于含膜联蛋白-V-FITC的缓冲液中，并按照生产商(Roche)的说明染色。膜联蛋白-V阳性细胞通过流式细胞术确定。

STAT3 DNA结合测定试验：如生产商(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)所述进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。简言之，利用NucBuster蛋白质提取试剂盒如生产商(EMDBiosciences, San Diego, CA)所述由HeLa细胞制备核提取物。5 μg核提取物与所示剂量的所示化合物一起预孵育30分钟，之后再与IR700标记的共有Stat3寡核苷酸一起孵育15分钟。样品随之在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并应用Odyssey红外成像系统(Li-CorBiosciences)直接扫描。对于酶联免疫吸附试验(ELISA)，5 μg核提取物与所示浓度的所示化合物预孵育30分钟，之后添加生物素化的寡聚体(5’-生物素-GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC-3’ SEQ ID NO. 1)。Stat3-DNA复合物随之被捕获到链亲和素包被的96孔板(Pierce,Rockford, IL)上。结合的复合物随之与Stat3多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA)、接着是抗兔HRP缀合的二抗(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)进行孵育。结合的抗体随之通过添加TMB底物(Pierce)并在450 nm测量吸光值而观察。

细胞生存力确定：对于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)分析，细胞以10,000细胞/孔接种在96孔板中。种板后24小时，以所示剂量向细胞中添加化合物。化合物添加后22小时，向各孔添加MTT (0.5 mg/ml终浓度)，并使板在37℃再孵育2小时。然后吸出培养基，并使甲臜产物溶解在100 µl异丙醇中。各孔的吸光值利用微板读数器在570 nm测量。

免疫荧光：用所示化合物处理所示时间的细胞在4%甲醛或冷甲醇中固定，分别用于检测膜联蛋白V、裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)或stat3。盖片风干，在PBS中室温重新水合10分钟。样品之后在封闭缓冲液(PBS, 5% FBS)中在潮湿箱中室温孵育10分钟。细胞与一抗在4℃孵育过夜。洗涤后，细胞与1:500稀释的FITC缀合的抗兔抗体室温孵育1小时。用配备有落射荧光和SPOT镶嵌CCD相机的Nikon TE200显微镜捕获图像。多克隆抗裂解的胱天蛋白酶3抗体(1:100)获自Cell Signaling Technology, Danvers, MA.公司。膜联蛋白-V-FITC获自德国Penzberg的罗氏(Roche)公司。多克隆抗Stat3抗体获自SantaCruz公司。

通过TPIV^®技术敲低基因：TPIV^® (治疗通路鉴定和验证)技术(BostonBiomedical Inc., Norwood, MA, USA)提供了能够用来首先转染细菌、进而被哺乳动物受试者摄取的质粒。在细菌裂解后，由TPIV^®质粒编码并由细菌加工的dsRNA被释放到哺乳动物细胞的细胞质中，实现所靶向基因的敲低。TPIV^®技术在共同拥有的于2008年6月30日递交的PCT专利申请PCT/US08/68866中描述，其全部内容并入本文作为参考。具体而言，编码针对Stat3的有效siRNA序列的TPIV^®质粒利用如下引物通过PCR克隆购自OrigeneTechnologies (Rockville, MD, USA)的Stat3质粒来构建：

TPIV-Stat3 (300 bp插入物)引物：

Stat3 TPIV For 5’-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC (SEQ ID NO. 2)

Stat3 TPIV Rev 5’-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG (SEQ ID NO. 3)

对照质粒应用购自Promega (Madison, WI, USA)的pGL2质粒来构建。

TPIV-GL2 (300 bp插入物)

引物：

GL2 TPIV For 5’- CCCTCTAGATGGTTCCTGGAAC (SEQ ID NO. 4)

GL2 TPIV Rev 5’-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG (SEQ ID NO. 5)

化学感受态大肠杆菌(E. coli) BL21 (DE3) pLYSe细菌(50~100 μl)用对照或100 ng 靶向Stat3的TPIV^®质粒按照生产商(Stratagene)的说明进行转化。然后将单菌落接种到含100 μg/ml氨苄青霉素的BHI培养基中，并于37℃生长过夜。第二天，将5 ml各过夜培养物1:40稀释至含100 μg/ml氨苄青霉素的新鲜BHI培养基中，并再生长2-4小时(直至OD₆₀₀= 0.5)。各培养物随之用IPTG (1 mM终浓度)处理2-4小时，以诱导长双链RNA转录，其会被细菌加工为混合siRNA。在IPTG诱导之后，通过测量OD₆₀₀值来计算各培养物中的细菌总数(8×10⁸细菌/ml培养物具有OD₆₀₀ = 1)。然后根据细胞汇合度和在适当反应体积中所需的感染复数(MOI；尝试20:1至2000:1的细菌比细胞范围)，计算用于细胞处理的细菌数目。根据经验，应选择反应体积以导致对于1000:1 MOI为3×10⁸/ml。所需体积的细菌培养物随之在2500g 4℃离心10分钟，沉淀用无血清培养基(用于细菌感染的细胞，加上100 μg/ml氨苄青霉素和1 mM IPTG)洗涤一次，并以细菌感染(bactofection)所需的密度重悬于相同的培养基中。

同时分离癌细胞或癌干细胞，在细菌感染前30分钟，将细胞培养基替换为2 ml含100 μg/ml氨苄青霉素和1 mM IPTG的新鲜无血清培养基。上文制备的细菌随之以期望的MOI添加到细胞中，37℃感染2小时。

感染期过后，细胞用无血清细胞培养基洗涤3次。细胞随之与2 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素和150 μg/ml庆大霉素的新鲜完全细胞培养基孵育2小时，以杀死任何残留的胞外细菌。在氨苄青霉素和庆大霉素处理后，细胞与3 ml含10 μg/ml氧氟沙星的新鲜完全RPMI 1640培养基孵育，以杀死任何胞内细菌。随之收获细胞或在各时间点进行分析，以评估靶基因沉默的程度和产生的表型。

活体评价(in life evaluations)：还对每只动物的健康状态进行了每日检查。每三天检查体重。按照机构的动物管理方法每日供应食物和水。引起>20%致死率和/或>20%净体重损失的处理视为有毒性。结果表达为平均肿瘤体积(mm³) ± SE。P值<0.05视为统计学相关。

动物管理：4-5周龄的雄性或雌性无胸腺裸鼠(Charles River Laboratories,Wilmington, MA.)在研究开始前适应动物畜舍设施至少一周。所利用的所有实验方法与美国生理学会(American Physiology Society)所给出的指南以及实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)相符，并且也得到了波士顿生物医学公司(Boston Biomedical Inc.)研究所动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)的批准。动物4只一组关进木屑铺底的笼中，置于具有控制的温度(68°F-72°F)、光照(12小时光-暗周期)和湿度(45–55%)的房间。实验期间动物自由饮水摄食。

脾内裸鼠模型系统(ISMS模型)：雌性裸鼠麻醉并置于无菌条件，在左侧腹切割以露出脾脏。利用27号针在脾被膜下注射0.1 ml PBS中的100万人结肠癌HT29细胞。将脾重置于腹膜腔内，并闭合切口。移植后第二天开始处理直至检查当天。处理策略为每周5天一天一次(5 qd/wk)的腹膜内注射。小鼠在垂死时或注射后30天处死。取出脾和肝进行检查，并记录肿瘤病变数。

实施例1

鉴定Stat3作为抗癌干细胞靶标

在CSC中Stat3的敲低可以诱导凋亡。为确定癌干细胞是否表达Stat3，以及Stat3是否组成型激活，我们进行了免疫荧光显微镜检，这不仅允许分析罕见细胞群，而且还提供了有关蛋白质定位的额外信息，以及能够将染色与表型(即凋亡)相关联。在通过FACS自SW480结肠癌细胞分离的NSP和SP细胞中对p-Stat3和Stat3进行了免疫荧光检测后，我们确定了Stat3确实存在于SP细胞中，且在细胞核中适度富集(图3A)。另外，我们还在SP细胞中观察到比NSP细胞增加的p-Stat3染色，提示SP细胞的存活可能更大比重地依赖于Stat3。

还评价了自FaDu人头颈部癌细胞和LN18人成胶质细胞瘤细胞分离的CD133⁺细胞中的Stat3状态。如图3B所示，Stat3在这些细胞中也具有组成型活性。综上所述，这些数据提示Stat3是对于癌干细胞特别重要的靶标。

我们接下来利用TPIV^®检验了在CSC中Stat3敲低的效应。免疫荧光分析揭示，在新鲜分离的CSC (SP)上感染24小时之内(图4A)能够实现Stat3的显著耗竭，并发现用靶向Stat3的TPIV^®质粒处理的大多数细胞在感染24小时之内经历凋亡，而对照TPIV^®质粒并不诱导高于对照未感染细胞的凋亡水平 (图4B)。这些数据证明癌干细胞依赖于Stat3用于存活。

在CSC中敲低Stat3抑制CSC球体形成。通过FACS分离CD44^high/CD24^low FaDu或Hoeschst侧群癌干细胞，并在超低附着板中于癌干细胞培养基(DMEM/F12, B27Neurobasal增补物, 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF, 4 μg/mL胰岛素和0.4% BSA)中培养以允许球体形成。收集初级球体(primary spheres)，用胰蛋白酶解聚，并在TPIV^®处理之前分配至96孔超低附着板中。以1000的MOI施加细菌两小时，之后添加抗生素混合物(青-链霉素混合物(penstrep)、庆大霉素、氧氟沙星)。10-14天培养后评估球体形成。在添加台盼蓝鉴定死细胞之前(图5，左上图)或之后(图5，左下图)获取代表性的球体图像。相对球体形成示于图5的右图。数据清楚地表明，在癌干细胞中Stat3敲低抑制球体形成，证明Stat3是癌干细胞的关键自我更新因子。

实施例2

鉴定抑制Stat3通路活性的化合物

Stat3转录活性的抑制。利用Stat3-萤光素酶(Stat3-luc)报告分子构建体检验了化合物在细胞中抑制Stat3转录激活活性的能力。转染了Stat3-luc的细胞在减少血清的培养基中培养，之后再添加所示的化合物孵育30分钟。细胞随之用25 ng/ml制瘤素M (OSM)刺激6小时，之后检测Stat3-luc报告分子活性。细胞与化合物401孵育抑制了OSM刺激的Stat3报告分子活性(图6, 左图)。纳入AG490 (一种已知的Jak-Stat通路抑制剂)作为Stat3抑制的阳性对照。依托泊苷纳入作为遗传毒性活性对照，其显示出很小或无Stat3抑制作用。化合物1001为萘而非作为本发明化合物的萘醌，其即便是在高得多的浓度也不抑制OSM刺激的Stat3报告分子活性(图6, 右图)。

在Stat3萤光素酶报告分子测定中检验了其他化合物，且结果总结于表3。

表3

化合物#	Stat3-Luc测定中的IC₅₀
		401	~0.25 μM
416	~0.75 μM
		418	~0.75 μM
301	~2 μM

Stat3 DNA结合活性的抑制。应用来自HeLa细胞的核提取物(如通过酪氨酸705残基磷酸化所检测的那样，其含有组成型激活的Stat3)进行Stat3 EMSA以监测Stat3 DNA结合活性。核提取物与所示化合物孵育，之后再与IR700标记的Stat3共有寡核苷酸孵育。Stat3与寡核苷酸的结合通过凝胶电泳监测，并利用LiCor Odyssey红外扫描仪检测。鉴定到Stat3滞后条带，并通过抗Stat3抗体的超级迁移(图7A, 左图)和Stat3肽的剂量依赖性抑制进行了确认(图7A, 中图)。在孵育标记的探针和化合物401之后观察到Stat3 DNA结合的剂量依赖性抑制(图7A, 右图)。

在EMSA测定中检验了其他化合物。如图7B所示，化合物401、416和418能够抑制Stat3的DNA结合活性。

异种移植肿瘤组织中Stat3下游效应子的抑制。从在收获前4小时用化合物401或载体对照处理过的异种移植Paca2肿瘤中制备提取物。样品通过western印迹和EMSA分析，以评价Stat3下游效应子表达水平和Stat3 DNA结合活性。化合物401处理的样品(T)与对照(V)相比显示出Stat3 DNA结合活性下降(图8A)。另外，化合物401处理导致Stat3下游效应子细胞周期蛋白D1和生存素的表达水平下降(图8B)。

实施例3

鉴定靶向癌干细胞的化合物

鉴定使癌干细胞凋亡的化合物。由于已经证明癌干细胞活跃地外排Hoechst，故用Hoechst染色SW480细胞，分选侧群(如图9A所示，左图围起来的区域)以富集癌干细胞。为确认此侧群富集癌干细胞，对照组的SW480细胞首先用戊脉安(verapamil, ABC转运蛋白抑制剂)处理，之后用Hoechst染色。如图9A右图所示，戊脉安处理导致侧群丧失。

在MTT测定中评估了化合物401对Hoechst侧群的IC₅₀，并与对非侧群的IC₅₀进行了比较。结果显示，侧群对化合物401与非侧群一样敏感(图9B, 右图)。然而，侧群对多柔比星比非侧群耐药性大得多(图9B, 左图)，这与之前的公开一致[7, 82]。这些数据提示化合物401杀死癌干细胞。

Hoechst侧群细胞用化合物401处理，并通过膜联蛋白V (凋亡的早期标志)染色来评估细胞死亡模式。结果显示，垂死细胞为膜联蛋白V阳性(图10A)，证明化合物401使癌干细胞凋亡。

可选地，我们进行了CD133 (常见的癌干细胞表面标志之一)抗体磁珠沉降以富集癌干细胞。CD133⁺细胞随之用化合物401处理，接着用抗裂解的胱天蛋白酶3 (凋亡标志)的抗体染色。如图10B所示，许多CD133⁺细胞在化合物401处理后变成裂解型胱天蛋白酶3阳性的，证实化合物401使癌干细胞凋亡。

鉴定在体外抑制CSC球体形成的化合物。癌干细胞的标志之一是其自我更新的能力。一种测量细胞群自我更新能力的可靠方法是其在不存在血清或附着的情况下培养为球体的能力。为比较化合物401与其他靶向及化疗剂的该能力，FACS分离的CD44^high CSC作为球体培养72小时，之后用一组治疗剂进行攻击。所检验的药剂中，只有化合物401有效防止球体增殖(图11)。注意，尽管施加的多柔比星和多烯紫杉醇的量大约十倍于其在类似测定中导致细胞死亡的IC₅₀浓度，但球体还是具有耐药性。添加的特罗凯(Tarceva)、索坦(Sutent)和格列卫(Gleevec)大约三倍于其报告的治疗浓度。这证明虽然癌干细胞对传统化疗剂和靶向剂具有耐药性，但化合物401高度有效地抑制其生长。

鉴定在体内抑制CSC球体形成的化合物。六周龄雌性无胸腺nu/nu小鼠获自Charles River Labs (Wilmington, MA)。小鼠在腰窝处皮下注射处于0.2 mL无血清DMEM中的6×10⁶ FaDu或Paca2癌细胞。在异种移植物大小达到~200 mm³后，携带Paca2异种移植肿瘤的动物通过腹膜内施用载体、吉西他滨(120 mg/kg, 一周两次)或化合物401 (20 mg/kg)一周，而携带FaDu异种移植肿瘤的动物通过腹膜内每日施用载体、卡铂(30 mg/kg)或化合物401 (20 mg/kg)两周，之后处死。然后分别针对Paca2和FaDu细胞，收集肿瘤。在动物处死并无菌取出肿瘤后制备单细胞悬液。简言之，用无菌解剖刀将肿瘤切成0.1 mm³的碎块，之后在1 mg/mL胶原酶/HBSS中持续震荡消化15-30分钟。在流经40 µm滤网后，将细胞悬液层放在1 mL Histopaque上，并在1440×g离心30分钟后收集界面层，而除去RBC、死细胞和细胞碎片。然后计数活细胞，并用来测量其形成球体的能力。细胞以100细胞/孔的密度分配到超低附着96孔板的癌干细胞培养基中(DMEM/F12, B27 Neurobasal增补物, 20 ng/mLEGF, 10 ng/mL FGF, 4 μg/mL胰岛素和0.4% BSA)。每三天添加新鲜培养基，并在10-14天培养后测定球体形成。记录具有>50个细胞的球体。实验结束时，添加台盼蓝以鉴定死细胞。如图12所示，如增加的球体形成所证明的，标准化疗吉西他滨(上图)和卡铂(下图)富集了癌干细胞。相反地，如减少的球体形成所证明的那样，化合物401处理减少了癌干细胞。

实施例4

抗转移功效

还检验了化合物401在ISMS模型中抑制转移的能力。脾内裸鼠模型系统(ISMS模型)适于研究结直肠癌的恶性行为，因为此技术能够在肝中产生实验性转移。在此模型中，在裸鼠脾被膜下注射处于0.1 ml PBS中的100万HT29细胞。将脾重置于腹膜腔内，并闭合切口。小鼠在垂死时或注射后30天处死。取出脾和肝进行检查，并记录肿瘤病变数(number oftumor lesions)。小鼠分成2组，对照组给予载体(n=4)，而另一组接受20 mg/kg化合物401(n=4)。在i.s.注射后第2天起至第30天，5天/周腹膜内施用药物。显微镜检估算原发性肿瘤和转移性肝肿瘤的数目。代表性照片示于图13。在载体对照组中，脾脏处有重负荷的原发性肿瘤(图13, 上左图)。还观察到大量的自发肝转移(图13, 上右图)。化合物401处理显著降低了原发性肿瘤病灶数和自发肝转移数(图13, 下图)。

实施例5

组合活性

Paca2人胰腺癌细胞、A549人肺癌细胞和HepG2人肝癌细胞(美国典型培养物保藏中心)在含有10%胎牛血清、100 单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。化合物401和索坦由Boston Biomedical, Inc.有限公司合成。卡铂、多柔比星、多烯紫杉醇、依托泊苷获自Sigma (St. Louis, MO)，并以10 mM溶于水或DMSO中。厄洛替尼来自American Custom Chemicals (San Diego, CA)。吉西他滨来自Eli Lilly (Indianapolis, IN)，为水性20 mM贮液的形式。索拉非尼购自LKT (St.Paul, MN)。拉帕替尼来自LC Laboratories (Woburn, MA)。除非另行指出，所有化合物以10 mM溶于DMSO中，并等份贮存于-20℃_。呈指数生长的Paca2胰腺癌细胞以1,000细胞/孔接种在6孔板中，并允许其贴壁24小时。然后向培养基中添加渐增浓度的个体药物及组合药物，再过24小时。24小时接触后，除去药物，并在接下来的10-14天添加新鲜培养基，允许集落形成。固定细胞，并用GIEMSA (Gibco BRL)染色。大于50个细胞的集落记录为存活者，并针对未处理的对照就细胞存活百分数进行标准化。结果为一式两份实验的平均值。可选地，在A549和HepG2细胞中在处理后72小时进行MTT测定。

我们的数据证明，化合物401与所有检验的化合物组合时均具有有益效果。其中，与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)组合显示出最出色的结果。例如，如图14所示，化合物401与索拉非尼组合时在人肺A549细胞中72小时具有协同效应。与此类似，图15至17表明化合物401分别与厄洛替尼、拉帕替尼和舒尼替尼(索坦^®)组合时在人肺A549细胞中72小时也具有协同效应。其余数据总结于表4，证明化合物401与所有检验药物组合时均表现出有益效果。

表4

而且，我们还检验了化合物401与吉西他滨在人胰腺癌异种移植模型中的组合效应。简言之，无胸腺雌性裸鼠(Ncr)皮下接种8×10⁶ MIA PaCa-2人胰腺癌细胞，并使肿瘤生长至约150 mm³的大小。将动物随机分成4组，每组6只动物，并用载体对照处理、每日口服100 mg/kg临床制剂(20% Gelucire)形式的化合物401、每三天腹膜内注射120 mg/kg (溶于PBS中)吉西他滨(健择^®)、或施用后两者。小鼠接受总计两周的处理，并分析肿瘤的平均体积。

如图18所示，用化合物401 (100 mg/kg)或是吉西他滨(120 mg/kg)单独处理在处理期间以类似的程度延迟肿瘤生长。用化合物401 (100 mg/kg)组合吉西他滨(120 mg/kg)处理的动物显示出对肿瘤生长的协同效应。对于任何处理策略，未观察到明显的毒性。我们的数据提示，化合物401组合吉西他滨在治疗胰腺癌方面具有临床益处。

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可对本发明进行修饰和改变而不偏离其精神和范围，这对本领域技术人员是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅仅是作为举例提供，而不意味着以任何方式加以限制。意思是说明书和实施例应视为仅仅是例示性的，而本发明的真正范围和精神由如下权利要求表明。

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Claims

1.组合物在制备用于癌症治疗的药物中的用途，其中所述组合物包含

a)第一药剂，所述第一药剂向患者施用，以体内治疗有效量的2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮抑制癌干细胞；和

b)第二药剂，所述第二药剂向患者施用，以体内治疗有效量的选自生长因子受体靶向剂、激酶靶向剂、血管生成抑制剂、DNA损伤剂、抗有丝分裂剂和/或抗代谢物的抗癌药剂抑制多数的癌细胞。

2.权利要求1的用途，其中第一药剂抑制至少一种癌干细胞自我更新。

3.权利要求1的用途，其中第一药剂杀死至少一种癌干细胞。

4.权利要求1的用途，其中第一药剂也杀死多数的癌细胞。

5.权利要求1的用途，其中第二药剂分别选自卡铂、顺铂、奥沙利铂、多柔比星、吉西他滨、紫杉醇、氟尿嘧啶、亚叶酸、卡培他滨、替莫唑胺、培美曲塞、硼替佐米、依托泊苷、西妥昔单抗、阿瓦斯丁、帕尼单抗、索拉非尼、伊马替尼、伊立替康、厄洛替尼、舒尼替尼和/或拉帕替尼。

6.权利要求1-5任一项的用途，其中第二药剂是至少一种癌症的标准一线治疗剂。

7.权利要求1-5任一项的用途，其中第二药剂是一种激酶抑制剂。

8.权利要求1-5任一项的用途，其中所述癌症是转移性的、标准一线癌症治疗顽固性的、或复发性的。

9.权利要求1-5任一项的用途，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃肠癌、食管癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。

10.权利要求1-5任一项的用途，其中所述癌症是结直肠癌。

11.权利要求1-5任一项的用途，其中所述癌症是胃癌。

12.组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述组合物包含

a)第一药剂，所述第一药剂是2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮及其可药用盐；和

b)第二药剂，第二药剂分别选自卡铂、顺铂、奥沙利铂、多柔比星、吉西他滨、紫杉醇、氟尿嘧啶、亚叶酸、卡培他滨、替莫唑胺、培美曲塞、硼替佐米、依托泊苷、西妥昔单抗、阿瓦斯丁、帕尼单抗、索拉非尼、伊马替尼、伊立替康、厄洛替尼、舒尼替尼和/或拉帕替尼；

其中所述癌症与异常Stat3通路活性相关。

13.权利要求12的用途，其中第二药剂是至少一种癌症的标准一线治疗剂。

14.权利要求12的用途，其中第二药剂是一种激酶抑制剂。

15.权利要求12的用途，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃肠癌、食管癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。

16.权利要求12的用途，其中所述癌症是结直肠癌。

17.权利要求12的用途，其中所述癌症是胃癌。

18.权利要求12的用途，所述第一药剂还包括2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮可药用的赋形剂或载体。

19.权利要求18用途，其中所述可药用的赋形剂是稀释剂。

20.权利要求18的用途，其中所述可药用的赋形剂包含

21.权利要求12的用途，其中所述第一药剂的制剂配置成适于口服施用的制剂。