CN104364232A - 用于癌症治疗的激酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于癌症治疗的激酶抑制剂。具体地，本发明涉及氨基乙腈衍生物(AAD)在癌症治疗中的用途。

Description

用于癌症治疗的激酶抑制剂
发明领域
本发明通常涉及用于癌症治疗的激酶抑制剂。具体地，本发明涉及氨基乙腈衍生物(AAD)在癌症治疗中的用途。
发明背景
氨基乙腈衍生物(AAD)为一类有效针对耐药性线虫的肠驱虫剂。线虫、或蛔虫，包括大量人和家畜的病原体。胃肠道线虫，诸如捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为反刍动物的主要寄生虫，引起全世界牲畜生产大量的经济损失。
莫奈太尔(Monepantel，MPL)(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺)为此类AAD的实例，并且已被认可为用于羊胃肠道寄生虫治疗的杀线虫剂。
MPL已显示有效的抗各种种类的牲畜病原性线虫。
作为杀线虫剂，MPL影响配体门控性离子通道，导致神经肌肉突触处的信号传导干扰。然后，受影响的寄生虫将经受肌肉收缩失调，麻痹，坏死和蜕皮缺陷。已鉴定出三个烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)相关的基因为MPL的主要靶标，并且所有这三个基因编码只存在于线虫中的代表nAChR亚基的DEG-3亚族的蛋白。DEG-3基因编码nAChR α-亚基，其与第二跨膜结构域中的α7-亚基相似。
目前令人惊奇地发现AAD在癌症治疗中也有效。过去50年期间医学中最大的挑战之一为鉴定有效地杀死肿瘤细胞而不伤害正常组织的药物。几乎所有已知种类的抗癌药物的副作用谱实质性限制了医师治疗癌症患者的能力，特别是在经常发展到药物耐药时的晚期。尽管已知其他肠驱虫的药物诸如苯并咪唑在控制癌症细胞的生长和发展中有效的，但是通式(I)的化合物，诸如MPL，令人惊奇的抗癌活性和低毒性允许更为灵活的用于伴有有限副作用的癌症治疗剂量方案。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了用于治疗一种或多种癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的通式(I)的化合物：
或其代谢物，药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2CF3、-SOCF3或-S-CF3；
X为杂原子，N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
优选地，R1为-CN、H或卤素。更优选地，R1为-CN。优选地，R2为H或卤素。更优选地，R2为H。优选地，R3为-CF3或卤素。更优选地，R3为-CF3。优选地，R4为-S-CF3、-SOCF3、-SO2CF3、-OCF3或-CF3。更优选地，R4为-S-CF3或-SO2CF3。优选地，R5为H。优选地，X为O。优选地，n为1-15、1-10、1-5、1-2或1。更优选地，n为1。优选地，R4被安排在酰胺部分的对位。
通式(I)的化合物可为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体。优选地，通式(I)的化合物为(S)-对映体。
优选地，通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
其中以上化合物的每一个为(R)-对映体或(S)-对映体，或外消旋体，或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
优选地，通式(I)的化合物为MPL(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
优选地，通式(I)的化合物为莫奈太尔砜(monepantel sulphone，MPL-SO2)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
还优选地，通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
优选地，癌症与激酶有关。
优选地，激酶为周期蛋白依赖性激酶，并且更优选地，cdk2或cdk4。
优选地，与激酶有关的癌症选自以下：恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状细胞癌的皮肤癌；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯克特氏淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；间叶细胞源的肿瘤，包括脂肪肉瘤、GIST、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、成骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
优选地，待被治疗的癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤，并且最优选地，待被治疗的癌症为卵巢癌。
在本发明的第二方面，提供了通式(I)的化合物或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗一种或多种与激酶有关的癌症的药物中的用途：
其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3或-S-CF3；
X为杂原子、N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
在本发明的第三方面，提供了用于治疗一种或多种与激酶有关的癌症的通式(I)的化合物或其代谢物，药学上可接受的盐、溶剂化物或前药：
其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3或-S-CF3；
X为杂原子、N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
附图说明
图1显示了通过MPL抑制细胞增殖。在MPL(0、1、5、10、25、50和100μmol/L)存在的情况下，培养卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和SKOV-3以及正常的HUVEC(对照)72小时。使用SRB测定评估MPL对细胞增殖的影响。对照(媒介处理的)细胞呈现100％增殖而MPL处理组表示成对照的百分比。每一药物浓度都以一式四份地测试并且每一试验重复至少两次。数据(均数±SEM)表示为对照的百分比。为了统计学比较，使用学生的t检验将每一药物处理组与对照组进行比较。
图2显示了MPL对OVCAR-3细胞的集落形成活性的影响。用MPL(0、5、10和25μmol/L)孵育细胞72小时之后，洗涤细胞，转移到琼脂平板，与它们的常规生长介质一起培养并且在标准的条件下孵育2周。然后用100％甲醇固定细胞并且用1％结晶紫染色。显微镜下(放大率5倍)计数集落(大于50个的细胞簇)。不同试验组计数的集落数表示为对照的百分比。
图3显示了MPL如何干扰卵巢癌细胞系的细胞周期分布。用MPL(0、5、10和25μmol/L)处理OVCAR-3(图3a)或A2780(图3b)细胞48小时。使用流式细胞术分析碘化丙啶染色的细胞的DNA含量。结果(见表)显示为G1、S和G2/M期细胞的百分比。每一数值代表2个独立的试验的均数±SEM。
图4显示了MPL如何干扰细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4以及细胞周期蛋白E和A的表达。用MPL(0、5、10和25μmol/L)处理细胞48小时。获取全蛋白提取物并且通过电泳分离和用指示的抗体探测免疫印迹。使用相关的抗体分析显示了在每一提取物中这些蛋白的水平的蛋白质印迹。图像代表扫描的暴露的放射线照片。管家基因(GAPDH)用于确认相似的蛋白上样和印迹转移。
图5显示了MPL处理的细胞中PARP和裂解的PARP的免疫印迹分析。用不同浓度的MPL[0、5、10、25μM]孵育在细胞培养状态下生长的OVCAR-3与A2780细胞24、48或72小时。然后制备细胞裂解物并且通过蛋白质印迹分析用于测定PARP和裂解的PARP。
图6显示了用MPL处理A2780卵巢癌细胞或用MPL-SO2处理U87胶质瘤导致空泡的形成，这提示MPL和MPL-SO2在这些细胞中诱导自体吞噬。
图7，与图6中所示的一致，显示了MPL处理降低了ADP/ATP的细胞比率，这是细胞自体吞噬的另一指示。
图8显示了MPL干扰细胞活力。A)暴露于MPL(0、5、10、25μM)72小时的OVCAR-3细胞的显微镜图像。在MPL(0、5、10、25μmol/L)存在的情况下培养人卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780、SKOV-3、IGROV-172小时。使用标准的台盼蓝测定评估MPL对细胞活力的影响。对照(媒介处理的)细胞呈现100％活力而MPL处理组表示成对照的百分比。以一式四份地测试每一药物浓度并且每一试验重复至少两次。数据(均数±SEM)表示为对照的％。为了统计学比较，使用学生的t检验将每一药物处理组与对照组进行比较并且0.5或更小的p值被认为是呈现了显著的变化(p<0.5)，*＝<0.05，**<0.01，***＝p<0.001。
图9显示了MPL对正常细胞活力的影响并且显示了MPL的抗增殖效应为癌细胞指向的。在MPL(0、5、10、25μmol/L)存在的情况下培养正常细胞HOSE、CHO、HEK和HUVEC 72小时。使用标准的台盼蓝测定评估MPL对细胞活力的影响。结果显示为与对照(100％)比较的均数±SEM。
图10显示了MPL如何抑制细胞增殖。在MP L(0、5、10、25、50和100μmol/L)存在的情况下培养人卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和SKOV-3和IGROV-172小时。使用SRB测定评估MPL对细胞增殖的影响。对照(媒介处理的)细胞呈现100％增殖而MPL处理组表示成对照的百分比。以一式四份地测试每一药物浓度并且每一试验重复至少两次。数据(均数±SEM)表示为对照的％。为了统计学比较，使用学生的t检验将每一药物处理组与对照组进行比较。(A)：阿托品：毒蕈碱Ach受体拮抗剂，筒箭毒碱：烟碱Ach受体拮抗剂，梅坎米胺：非选择的、非竞争性的烟碱受体拮抗剂；(B)：卡巴胆碱：毒蕈碱烟碱ach受体激动剂，尼古丁：烟碱ach受体激动剂，α-银环蛇毒素：选择性的α7，烟碱ach受体激动剂。
图11显示了MPL抗增殖效应不依赖于烟碱受体。用浓度逐渐增加的尼古丁、卡巴烟碱或受体拮抗剂阿托品、梅坎米胺、筒箭毒碱和α-银环蛇毒素预处理细胞(30分钟)。添加MPL(5μM)并且留在细胞培养孵育器中72小时。以一式四份地测试每一药物浓度并且每一试验重复至少两次。组合值(均数±SEM)表示为对照的％。
图12显示了MPL如何抑制胶质瘤增殖。使用SRB增殖测定比较MPL处理(0、5、10、25、50μM；72h)对U87-MG、U251胶质瘤细胞系的影响与对在正常的细胞培养条件下正常的星形胶质细胞的影响。数据表示为对照的％。
图13显示了MPL如何诱导自体吞噬。MPL处理耐药性U87胶质瘤细胞导致自体吞噬，通过LC3-II以浓度依赖性方式表达增加而确认。MPL处理的U87-MG和U251胶质瘤细胞展示了自体吞噬的浓度依赖性形成(显示为空泡)。LC3-I到LC3-II浓度依赖性转换确认了在这些细胞中自体吞噬增加的现象。
图14显示了MPL对OVCAR-3和A2780细胞的集落形成活性的影响。细胞与MPL(0、5、10、25μM)孵育72小时后，洗涤细胞然后将其转移至琼脂平板，与它们的常规生长介质一起培养，在标准条件下孵育2周。然后用100％甲醇固体细胞并且用1％结晶紫染色。显微镜下(放大率5倍)计数集落(大于50个的细胞簇)。不同试验组计数的集落数表示为对照的％。
图15显示了MPL如何干扰卵巢癌细胞系的细胞周期进展。用MPL(0、5、10、25μM)处理OVCAR-3或A2780细胞48小时并且在PI染色细胞后通过流式细胞术(FACS)检验。图片和数据显示了MPL诱导的细胞周期的各个期中细胞分布的变化，此处显示为G1、S和G2/M期中细胞的百分比。每一数值代表2个独立的检测的均数±SEM。
图16显示了MPL如何干扰细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4以及细胞周期蛋白E和A的表达。用MPL(0、5、10和25μM)处理细胞24、48或72小时。获取全蛋白提取物并且通过电泳分离和用指示的抗体探测免疫印迹。使用相关的抗体分析显示了在每一提取物中这些蛋白的水平的蛋白质印迹。图像代表扫描的暴露的放射线照片。管家基因(GAPDH)用于确认相似的蛋白上样和印迹转移。
图17显示了MPL如何裂解PARP。OVCAR-3或A2780细胞暴露于MPL(0、5、10、25μM)24、48或72小时引起PARP的裂解，这导致了细胞分解并且作为染色细胞的标记。
图18A和18B显示了MPL如何降低ATP水平。OVCAR-3或A2780细胞暴露于MPL(0、5、10、25μM)24、48或72小时引起PARP的裂解，这导致了细胞分解并且作为染色细胞的标记。
图19显示了裸鼠内腹腔注射(腹膜内的)给药的莫奈太尔对皮下(皮下的)肿瘤生长的影响。将2.5百万对数相生长的OVCAR-3细胞皮下注射到每一小鼠的左侧腹。通过卡尺测量监测肿瘤生长并且通过测量正交直径检测肿瘤体积。基于公式1/2(长×宽2)计算估计的肿瘤体积，其中宽为两个正交测量的较短者。肿瘤细胞注射后7天开始处理，在此之前，使小鼠随机化并且分配到处理或对照组(每组6只)。每周3次以2.5或25mg/kg腹腔注射给药悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔。对照组只用媒介处理。
图20显示了裸鼠内腹腔注射给药的莫奈太尔对皮下肿瘤生长的影响。将对数相生长的OVCAR-3细胞皮下注射到每一小鼠的左侧腹。通过卡尺测量监测肿瘤生长并且通过测量正交直径检测肿瘤体积。基于公式1/2(长×宽2)计算估计的肿瘤体积，其中宽为两个正交测量的较短者。肿瘤细胞注射后7天开始处理，在此之前，使小鼠随机化并且分配到处理或对照组(每组6只)。每周3次以25或50mg/kg腹腔注射给药悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔。对照组只用媒介处理。
图21显示了裸鼠口服莫奈太尔对肿瘤生长的影响。将OVCAR-3细胞皮下注射到每一小鼠的左侧腹。通过卡尺测量监测肿瘤生长并且通过测量正交直径检测肿瘤体积。基于公式1/2(长×宽2)计算估计的肿瘤体积，其中宽为两个正交测量的较短者。肿瘤细胞注射后7天开始处理，在此之前，使小鼠随机化并且分配到处理或对照组(每组6只)。每周3次以50或100mg/kg口服给药(100μL)悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔。对照组只用媒介处理。
总之，图19-21显示了雌性裸鼠内MPL对皮下异种移植物的影响。将2.5百万对数相生长的OVCAR-3细胞接种于小鼠的左侧腹。通过卡尺测量监测肿瘤生长并且通过测量正交直径检测肿瘤体积。基于公式1/2(长×宽2)计算估计的肿瘤体积，其中宽为两个正交测量的较短者。肿瘤细胞注射后7天开始处理，在此之前，使小鼠随机化并且分配到处理或对照组(每组5-6只)。每周3次以2.5或25mg/kg腹腔注射(图19)，25和50mg/kg腹腔注射(图20)，或以50或100mg/kg口服给药悬浮在0.5％HPMC中的莫奈太尔。对照组小鼠以完全相似的方式和时间接受相似体积的0.5％HPMC。
图22显示了MPL如何诱导肿瘤组织的坏死。裸鼠中以50或100mg/kg/day每隔一天口服给药MPL处理来源于皮下异种移植物的肿瘤组织。肿瘤的组织学图像以苏木精和伊红染色显示(H&E；顶行)，这预示了深刻的药物诱导的坏死(黑色箭头；放大率10倍)。从MPL处理的小鼠切除的肿瘤来源的肿瘤组织学的代表图像在较高剂量的100mg/kg(皮下肿瘤，口服处理，每周3次，持续2周)处展示了广泛的坏死。
定义
“卤素”意指氟、氯、溴或碘，优选地氟或氯。
“烷基”意指可为直链或分支的并且链中包含约1个-约20个碳原子的脂肪族烃基。优选的烷基链中包含约1个-约12个碳原子。更优选的烷基链中包含约1个-约6个碳原子。分支的意指一个或多个诸如甲基、乙基或丙基的低级烷基附着于直链的烷基链。“低级烷基”意指链中具有约1个-约6个碳原子的可为直链或分支的基团。“烷基”可为未取代的或任选地被一个或多个相同的或不同的取代基所取代，每一取代基独立地选自卤素、烷基、芳基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)、-N(烷基)2、羧基和-C(O)O-烷基。合适的烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。
“杂原子”意指选自N、O、P和S的原子。如有需要，任何未指定的化合价都独立地选自H、OH、羰基、正烷基、或烷氧基。
“n”为1-20，优选地1-10，更优选1-6，并且最优选1-4。
“烷氧基”意指其中烷基如以上所述的烷基-O-。合适的烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基。与亲代部分的结合通过醚氧。
“药学上可接受的盐”指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留了通式(I)的化合物的生物学有效性和特性并且由合适的无毒的有机的或无机的酸或有机的或无机的碱构成。实例酸加成盐包括衍生于诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的无机酸的那些和衍生于诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的有机酸的那些。实例碱加成盐包括衍生于铵、钾、钠和诸如例如氢氧化四甲铵的季铵氢氧化物的那些。将药物化合物(即药物)化学修饰成盐是药物化学家为获得改进的物理的和化学的稳定性、吸水性、流动性和化合物的溶解性的熟知技术。例如见H.Ansel等、药物剂型和药物递送系统(第6版1995)196页和1456-1457页。
“药学上可接受的”，诸如药学上可接受的载体、辅料等，意指药学上可接受的并且实质上对将特定化合物给药于个体无毒。
“取代的”，如在取代的烷基中，意指取代基可以发生在一个或多个位置，并且除非另有指明，每一取代位点处的取代基都独立地选自特定的选择，意指各不同位点处可同时存在超过一个取代基。
本文也涉及本发明的化合物的“前药”或“溶剂化物”。前药的讨论提供于T.Higuchi和V.Stella,前药作为新的递送系统(1987)A.C.S.的14讨论会丛刊，和药物设计中生物可逆的载体(1987)Edward B.Roche,ed.,美国制药协会和盖蒙出版社。术语“前药”意指体内转化的化合物(例如药物前体)从而产生通式(I)的化合物或代谢物，化合物药学上可接受的盐或溶剂化物。通过各种机制(例如通过代谢或化学过程)转化可发生。T.Higuchi和W.Stella,“前药作为新的递送系统”A.C.S.学术丛刊的第14卷,和药物设计中生物可逆的载体(1987)Edward B.Roche,ed.,美国制药协会和盖蒙出版社中提供了前药的使用的讨论。
本发明的化合物的“代谢物”指新陈代谢的中间产物和产物。
通式(I)的化合物可包含不对称的或手性中心，因此以不同的立体异构的形式存在。预期的是通式(I)的化合物及其混合物因此包括外消旋混合物的所有立体异构形式组成了本发明的部分。另外，本发明包括所有几何学的和位置异构体。基于它们的物理化学差异通过本领域中技术人员熟知的方法，诸如例如通过色谱分析和/或分离结晶，可以分离非对映混合物为它们各自的非对映体。分离对映体可以通过以下进行：通过与适当的光学活性化合物(例如手性助剂，诸如手性乙醇或莫舍酰基氯)反应将对映体混合物转化为非对映体混合物，分离非对映体并且将个体的非对映体转化(例如水解)为对应的纯的对映体。也可以通过使用手性的HPLC柱来分离对映体。本发明的手性中心可以具有如IUPAC 1974所定义的S或R构型。
术语“盐”、“溶剂化物”或“前药”等的使用，意欲平等地应用于对映体、异构对应体、旋转异构体、互变异构体、位置异构体、外消旋物的盐、溶剂化物和前药或本发明化合物的前药。
如本发明中所用的，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数的指称物，除非上下文另有清楚地指明。
如本发明中所用的，术语“包含”意指“包括”。词语“包含”的各种变化，诸如“包含”和“包含着”，具有相应变化的意义。因此，例如，药物组合物“包含”通式(I)的化合物可仅有这种化合物组成或可包括一种或多种额外的组分(例如药学上可接受的载体、辅料和/或稀释剂)。
如本发明中所用的，术语“复数”意指超过一个。在某些特定的方面或实施方案中，复数可意指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多的，以及本文可推论的任何整数，和本文可推论的任何范围。
“药学上有效的量”意指通式(I)的化合物或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药中的至少一个显著抑制包括人肿瘤细胞系的人肿瘤细胞增殖和/或预防其分化的量。如本文所用的“药学上有效的量”包括它的意义之内本发明制剂或组合物无毒的但是足以用于提供理想的治疗效果的量。所需的精确量将随个体的变化而异，取决于诸如被治疗的物种、年龄、个体的一般状态、被治疗状况的严重性、给药的特定制剂、给药模式等因素。因此，不可能制定可应用于所有实施方案的精确的“有效量”。然而，对任何给定的实例而言，可通过本领域中普通技术人员仅使用常规实验检测适当的“有效量”。
发明详述
AAD(例如通式(I))为一类使用有机合成方法学的普通的知识合成的化合物。例如，可通过酚类与氯丙酮的衍生化作用、施特莱克反应和合成胺与芳酰氯的酰化作用(如方案I中所示)合成AAD。如有需要，然后可获得特殊的对映体，例如，通过手性拆分(如方案2中所示)。
方案1：
方案2：
AAD为一类以前用于治疗耐药性线虫的化学药品。化合物MPL为此类AAD的实例，其靶向于线虫中烟碱样乙酰胆碱受体并且已广泛地用于反刍动物中寄生虫的治疗。
令人惊奇地，本发明者发现通式(I)的化合物，诸如MPL和MPL-SO2，具有抗癌活性。更具体地，通式(I)的化合物，包括MPL和MPL-SO2，已显示了抑制细胞增殖和癌细胞系集落形成。例如，卵巢癌细胞系已显示出对通式(I)化合物非常敏感，显而易见的是其他细胞系也是高度敏感的。这些包括乳腺癌、间皮瘤、前列腺癌和成胶质细胞瘤细胞系。MPL对耐药性雄激素不敏感的PC-3和DU145前列腺癌细胞非常有效。相似地，对化疗高度抵抗的PET和YOU细胞(间皮瘤)和U87细胞(成胶质细胞瘤)被MPL强烈抑制。
不希望受理论所限，惊奇的是，不同于线虫中所见的作用方式，通式(I)的化合物可通过靶向于癌细胞系中细胞周期蛋白依赖性激酶而发挥作用。更具体地，通式(I)的化合物好像干扰了细胞周期调节激酶，诸如细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cdk2)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cdk4)。
通式(I)的化合物，诸如MPL和MPL-SO2对癌细胞系的治疗好像导致了细胞周期阻滞。再次不希望受理论所限，但是看起来治疗可包括G1细胞周期阻滞，如细胞在细胞周期的G1期积聚所证明的。而且，提示的是通式(I)的化合物，诸如MPL和MPL-SO2对癌细胞系的治疗可诱导不可逆的G0细胞周期阻滞，如细胞存在于细胞周期并且经历自体吞噬和/或凋亡所证明的。这一新种类的驱虫剂呈现了与苯并咪唑不同的机制谱，提供了新的改进的癌症治疗方法。
组合物、药物和试剂盒
本发明提供了药物组合物，药物和试剂盒，所述试剂盒包含通式(I)的化合物或代谢物，药学上可接受的盐、溶剂化物或所述化合物的前药中至少一种和至少一种药学上可接受的载体。为从本发明所述的化合物制备药物组合物，惰性的、药学上可接受的载体可以为固体的或液体的。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、可分散的颗粒、胶囊、扁囊和栓剂。粉剂和片剂可由约5％-约95％活性成分组成。合适的固体载体为本领域中已知的，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或乳糖。片剂、粉剂、扁囊和胶囊可以用作固体剂型以用于口服给药。药学上可接受的载体的实例和各种组合物的生产方法可见于A.Gennaro(ed.)，雷明顿药物科学，第18版，(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania。
液体型制剂包括溶液、悬浮液和乳剂、例如用于胃肠外注射的水或水-丙烯乙二醇或添加甜味剂，用于口服溶液、悬浮液和乳剂的乳浊剂。液体型制剂也可包括用于鼻腔给药的溶液。
用于吸入的气雾剂可包括溶液和粉剂形式的固体，其可与药学上可接受的载体组合，诸如惰性压缩气体，例如氮气。还包括打算在使用前不久转换为液体型制剂的用于口服或胃肠外给药的固体型制剂。此类液体型包括溶液、悬浮液和乳剂。
本发明的化合物也可为经皮给药传送的。经皮给药的组合物可表现为乳脂、乳液、气溶胶和/或乳剂并且可以包括在经皮给药的基质片中或出于这一目的如本领域中常规的油藏类型。
本发明化合物也可经皮下给药递送。
优选地，通式(I)的化合物经口服给药。
本发明的组合物和药物可包含药学上可接受的载体、佐剂、辅料和/或稀释剂。载体、稀释剂、辅料和佐剂在与组合物或药物的其他成分相容方面必须为“可接受的”，并且通常对其接受者无害。药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例为去除矿物质的或蒸馏水；盐溶液；诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油的植物油；芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，诸如聚甲基硅氧烷，聚苯基硅氧烷和聚甲苯基硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油诸如液态石蜡，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物诸如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯，肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡喀烷酮；琼脂；黄耆胶或阿拉伯树胶，和凡士林。典型地，载体可形成于按重量计的约10％-约99.9％的组合物或药物。
本发明的组合物和药物可以适用于注射给药(例如胃肠外给药，包括皮下的，肌肉内的或静脉内的注射)，口服给药(诸如胶囊，片剂，囊片和酏剂，例如)，局部给药(例如以药膏、乳脂或乳液的形式，或适用于递送的形式如滴眼剂)或鼻内吸入(例如，气溶胶的形式)的形式呈现。
为了以可注射的溶液或悬浮液给药，无毒的胃肠道外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏液，等渗盐水，磷酸盐缓冲盐水，乙醇和1,2丙二醇。用于制备胃肠道外可给药的组合物和药物的方法对本领域中普通技术人员是明显的，并且例如在雷明顿药物科学，第15版，Mack PublishingCompany,Easton,Pa中更为详细地描述。
为口服给药，合适的载体、稀释剂、辅料和佐剂的一些实例包括花生油、液态石蜡、羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，海藻酸钠，阿拉伯树胶，黄耆胶，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，白明胶和卵磷脂。另外这些口服制剂可包含合适的香料和着色剂。当以胶囊形式使用时，可用诸如单硬脂酸甘油酯或甘油硬脂酸酯的延缓分解化合物包被胶囊。佐剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、灭菌剂和缓冲剂。
用于口服给药的固体形式可包含人体和兽医制药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、分解剂、稀释剂、香料、涂层剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶，白明胶，玉米淀粉，黄耆胶，海藻酸钠，羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖，乳糖，葡萄糖，阿斯巴甜或糖精。合适的分解剂包括玉米淀粉，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶，黄原胶，皂土，海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖，山梨醇，甘露醇，右旋糖，高岭土，纤维素，碳酸钙，硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油，樱桃、橙或覆盆子香料。合适的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物，蜡类，脂肪醇，玉米蛋白，虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠，维生素E，α-生育酚，抗坏血酸，甲基尼泊金，丙基尼泊金或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括丙三基单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
用于口服给药的液体形式可包含，除了以上试剂之外，液体载体。合适的液体载体包括水，诸如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、落花生油、椰子油的油类，液状石蜡，乙烯乙二醇，丙烯乙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，三酸甘油酯或其混合物。
用于口服给药的悬浮液还可包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰乙醇。合适的分散剂包括卵磷脂，诸如硬脂酸的脂肪酸的聚乙二醇酯、聚乙二醇山梨醇单或双油酸盐、硬脂酸盐或月硅酸盐，聚乙二醇山梨聚糖单或双油酸盐、硬脂酸盐或月硅酸盐等。
用于口服给药的制剂可包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如以上示例的分散剂或诸如瓜尔豆胶、阿拉伯树胶或黄耆胶的天然树胶。
本发明的局部制剂可包含与一种或多种可接受的载体在一起的活性成分，和任选地任何其他的治疗成分。适用于局部给药的制剂包括适用于渗透穿过皮肤到所需治疗的位点的液体或半液体制剂，诸如搽剂、乳液、乳脂、药膏或糊剂，和适用于给药于眼睛、耳朵或鼻子的滴剂。
本发明的滴剂可包含无菌的水或油性溶液或悬浮液。可通过将活性成分溶解在灭菌的和/或杀真菌制剂的水溶液中制备这些，和/或其他合适的防腐剂和任选地包括表面活性剂。然后通过过滤澄清所得的溶液，将其转移到合适的容器中并且灭菌。通过高压灭菌法或维持在90℃-100℃下半小时，或通过过滤，随后通过无菌技术将其转移到容器实现灭菌。适用于滴剂中内含的灭菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或硝酸盐苯汞(0.002％)，苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于油性溶液制备的合适的溶剂包括甘油，稀释的乙醇和丙烯乙二醇。
本发明的乳液包括适用于应用于皮肤或眼睛的那些。眼部乳液可包含无菌的水溶液，任选地包含灭菌剂并且可通过与以上所述的与滴剂制备有关的那些相似的方法制备。应用于皮肤的乳液或搽剂也可包括加速干燥和冷却皮肤的制剂，诸如酒精或丙酮，和/或保湿乳液，诸如甘油，或诸如蓖麻油或花生油的油。
本发明的乳脂、软膏或糊剂为外用的活性成分的半固体制剂。可通过单独或在溶液中或悬浮在水或非水流体，与油腻的或不油腻的基质一起，混合细分的或粉末状活性成分制备它们。基质可包含烃类，诸如硬的、软的或液态石蜡，甘油，蜂蜡，金属皂；粘液；天然来源的油，诸如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油，羊毛脂或它的衍生物，或脂肪酸，诸如与诸如丙二醇或聚乙二醇的乙醇在一起的硬脂酸或油酸。
本发明的组合物和药物可掺入任何合适的表面活性剂，诸如阴离子的、阳离子的或诸如脱水山梨醇酯或其聚乙二醇衍生物的非离子的表面活性剂。也可包括悬浮剂，诸如天然树胶、纤维素衍生物或诸如硅质二氧化硅的无机材料和诸如羊毛脂的其他成分。
本发明的组合物和药物可以脂质体的形式给药。本领域中已知合适的形成脂质体的方法，与此有关的具体参考文献是Prescott,(Ed),(1976),“Methods in Cell Biology”,14卷,Academic Press,New York,N.Y.p.33 etseq.。
补充的活性成分，诸如佐剂或生物反应改性剂也可以掺入到本发明的组合物和药物中。
本发明的组合物和药物中可包括任何合适的佐剂。例如，可利用基于铝的佐剂。合适的基于铝的佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝和其组合。可利用的基于铝的佐剂的其他具体实例描述于欧洲专利第1216053号和美国专利第6,372,223号中。其他合适的佐剂包括弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；默克佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝的铝盐；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶的悬浮液；酰化糖；阳离子地或阴离子地衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；单磷酰脂质A和植物皂苷；水乳胶中的油，包括欧洲专利第0399843号，美国专利第7,029,678号和PCT公开WO2007/006939中所述的那些；和/或额外的细胞因子，诸如GM-CSF或白细胞介素-2、-7、或-12，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，单磷酰脂质A(MPL)，霍乱毒素(CT)或它的构成亚基，不耐热肠毒素(LT)或它的构成亚基，toll样受体配体佐剂，诸如脂多糖(LPS)和其衍生物(例如，单磷酰脂质A和3-脱酰基的单磷酰脂质A)，胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白。
本发明的另一方面为包含治疗有效量的通式(I)的化合物或所述化合物的代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药中的至少一种，和药学上可接受的载体、媒介或稀释剂的试剂盒。
本发明的另一方面为包含一定量的通式(I)的化合物或所述化合物的代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药中的至少一种和/或一定量的以上所列举的抗癌治疗和/或抗癌制剂中的至少一种的试剂盒，其中两种或更多种成分的量产生所需治疗效果。
本发明的试剂盒可包含辅助进行本发明的方法的组分，诸如例如，给药装置，缓冲液，和/或稀释剂。试剂盒包括容留各种组分的容器和本发明的方法中试剂盒组分的使用说明。
在某些实施方案中，试剂盒可为组合式试剂盒(combined kit)。
在其他实施方案中，试剂盒可为分部式试剂盒(fragmented kit)。
给药剂量和途径
可通过标准的途径将制剂、组合物和药物给药于接受者，包括但不限于胃肠道外(静脉内的、椎管内的、皮下的或肌肉内的)，口服的，局部的，或粘膜的途径(例如鼻内的)。在一些实施方案中，它们可以孤立地或与其他额外的治疗剂组合的方式给药于接受者。在此类实施方案中，给药可为同时的或依次的。
通常，制剂、组合物和药物可以与给药途径和接受者的物理特征(包括健康状态)相容的方式，以产生所需效果的方式(即治疗有效，免疫原的和/或保护的)给药。例如，适当的剂量可取决于各种因素，包括但不限于个体的物理特征(例如年龄、体重、性别)，制剂、组合物或药物是否用作单一的制剂或辅助治疗，被治疗癌症的进展(即病理学状态)，和对于本领域中普通技术人员显而易见的那些其他因素。
当确定制剂、组合物和药物的适当剂量时，例如在Gennaro等.(Eds),(1990),“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USA；和Gilman等,(Eds),(1990),“Goodman AndGilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics”,Pergamon Press中描述了各种概述。
本发明令人惊奇的优势为通式(I)的化合物通常显示低毒。例如，MPL具有超过2000mg/kg体重的单一剂量毒性。因此，本发明中使用的制剂、组合物和药物可以高达并包括2000mg活性组分/kg体重的单一剂量给药于患者。而且，使用本发明用于癌症治疗的另一令人惊奇的优势为通式(I)的化合物的普遍高的临床耐受性。例如，1000mgMPL/kg体重/24小时的剂量在哺乳动物中有很好的耐受。因此，本发明中所用的制剂、组合物或药物可以高达并包括1000mg的活性组分/kg体重/24小时的量给药于患者。
通常，期望的有效剂量范围在约0.0001mg-约1000mg活性组分/kg体重/24小时；通常约0.001mg-约750mg活性组分/kg体重/24小时；约0.01mg-约500mg活性组分/kg体重/24小时；约0.1mg-约500mg活性组分/kg体重/24小时；约0.1mg-约250mg活性组分/kg体重/24小时；或约1.0mg-约250mg活性组分/kg体重/24小时。更通常地，期望的有效剂量范围在约1.0mg-约200mg/kg体重/24小时；约1.0mg-约100mg/kg体重/24小时；约1.0mg-约50mg kg体重/24小时；约1.0mg-约25mg/kg体重/24小时；约5.0mg-约50mg/kg体重/24小时；约5.0mg-约20mg/kg体重/24小时；或约5.0mg-约15mg/kg体重/24小时。
例如，优选的剂量可为约10mg-约100mg通式(I)的化合物/kg体重/24小时。而且，优选的剂量可为约50mg通式(I)的化合物/kg体重/24小时。
通常，在治疗应用中，治疗可用于癌症的持续期间。另外，对本领域中普通技术人员显而易见的是可以通过疾病状态的性质和程度或被治疗的条件、给药剂型、途径和位点，以及被治疗的特定个体的性质确定个体剂量的优选量和间隔。使用常规的技术确定优选剂量。
在许多情况下(例如预防性应用)，理想的是具有本发明的制剂、组合物或药物的几个或许多给药，例如其可给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10,或更多次。给药可来自于约1周-约12周间隔，并且在某些实施方案中来自于约1周-约4周间隔。也涉及周期性再给药。
还对本领域中普通技术人员显而易见的是使用疗程测定试验确定最佳的给药期。
两个或更多实体(例如制剂或药物)“联合”给药于个体之处，它们同时可以单一的组合给药，或同时以单独的组合给药，或以单独的组合在分开的时间给药。
本发明的某些实施方案涉及制剂、组合物或药物以多重单独剂量给药。因此，本文所述的用于预防性和治疗性治疗的方法包括多重单独剂量的给药于个体，例如，在确定的时间段内。因此，在一些实施方案中，方法包括初次剂量给药，随后进行激发剂剂量给药。激发剂可用于疫苗接种的目的。在各种实施方案中，制剂、组合或药物给药至少一次，两次，三次或更多次。
通常制剂、组合物和药物以获得预期目的的有效量给药。更具体地，它们可以治疗有效量给药，有效量意指预防靶疾病或状态的发展或缓解靶疾病或状态的既有的症状。有效量的确定在本领域中普通技术人员的个人能力之内。例如，最初可从细胞培养测定中估算制剂、组合物和药物的治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量来获得循环的浓度范围，其包括如细胞培养中所测定的IC50。此类信息可用于在人和其他哺乳动物个体中更精确地测定有用的剂量。
治疗有效剂量指制剂、组合物或药物用以预防症状发展，减轻症状和/或治疗下延长个体存活的量。通过细胞培养标准的药物测定和/或实验动物中(例如，通过LD50的检测)(使50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体中治疗有效的剂量))可以确定制剂、组合物和药物的毒性和治疗效能。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，其可以表达为LD50与ED50之间的比率。优选展示高治疗指数的制剂、组合物和药物。从此类细胞培养测定和/或动物研究获得的数据可用于配制用于人或其他哺乳动物的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于循环浓度的范围内，其包括很少或无毒的ED50。剂量可在这一范围内变化，这取决于应用的剂型和利用的给药途径。各自的内科医师可视个体的状态毫不费力地选择精确的制剂，给药途径和剂量(例如，见Fingl等,(1975),in“The PharmacologicalBasis of Therapeutics”,Ch.1 p.1)。可单独地调整剂量量和间隔从而提供足以获得和维持理想的治疗效果和/或最小的有效浓度(MEC)的活性剂的血浆水平。获取MEC所必需的剂量取决于给药途径和其他各自的特征。生物测定和/或HPLC测定可用于检测血浆浓度。
也可使用MEC值确定剂量间隔。通常，使用在约10％-90％时间之间，优选在约30％-90％时间之间，更优选约50％-90％时间之间维持血浆水平在MEC之上的方案给药制剂、组合物和药物。在实施方案中，利用局部给药或选择性摄取之处，药物的有效局部浓度可与血浆浓度无关。
本发明的化合物也可与一种或多种诸如放射治疗的抗癌治疗，和/或一种或多种选自以下的抗癌剂联合使用：细胞生长抑制剂、细胞毒剂(诸如例如，但不限于DNA相互作用制剂(诸如顺铂或阿霉素))；紫杉烷(例如泰素帝，紫杉醇)；拓扑异构酶II抑制剂(诸如依托泊苷)；拓扑异构酶I抑制剂(诸如伊立替康(或CPT-11)，肯托斯塔(camptostar)或拓扑替康)；微管蛋白相互作用剂(诸如紫杉醇，多西他赛或埃博霉素)；激素类制剂(诸如三苯氧胺)；胸苷酸合成酶抑制剂(诸如5-氟尿嘧啶)；代谢拮抗剂(诸如甲氨蝶呤)；烷化剂(诸如替莫唑胺(来自于Schering-Plough Corporation,肯尼尔沃斯，美国新泽西州TEMODAR(TM))，环磷酰胺)；法尼基蛋白转移酶抑制剂(诸如SARASAR(TM)(4～[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]环庚酮[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧乙基]-1-哌啶甲酰胺，或来自于Schering-Plough Corporation,肯尼尔沃斯，美国新泽西州的SCH 66336)，tipifamib(或来自于Janssen PharmaceuticalsR115777)，L778.123(来自于Merck & Company,怀特豪斯站,美国新泽西州的法尼基蛋白转移酶抑制剂)，BMS 214662(来自于Bristol-Myers SquibbPharmaceuticals,普林斯顿,美国新泽西州法的尼基蛋白转移酶抑制剂)；信号转导抑制剂(诸如lressa(来自于Astra Zeneca Pharmaceuticals，英格兰)，特罗凯(EGFR激酶抑制剂)，EGFR抗体(例如C225)，GLEEVEC(TM)(来自Novartis Pharmaceuticals,东汉诺威,美国新泽西州的C-abl激酶抑制剂)；干扰素，诸如例如内含子(来自于Schering-Plough Corporation)，Peg-lntron(来自于Schering-Plough Corporation)；激素治疗组合物；芳香酶组合物；阿糖胞苷，阿霉素，环磷酰胺和吉西他滨。
个体
本发明的预防性和治疗方法可应用于任何合适的个体。在一些实施方案中，个体为哺乳动物个体。例如，个体可为社会的、经济的或研究重要性的鼠、大鼠、狗、猫、牛、羊、马或其他哺乳动物。因此，个体可为哺乳动物，诸如例如人类或非人类的哺乳动物。
本领域中技术人员应理解的是可以制造如具体实施方案中所公开的许多本发明的变化和/或修改而没有背离如广泛所述的本发明的精神或范围。因此，本发明实施方案被认为在所有方面为示例性的而非限制性的。
现在将参考具体的实施例描述本发明，这不应该以任何方式解释为限制。
实施例
材料和方法
细胞系
人卵巢癌细胞系OVCAR-3、SKOV-3和A2780为原始的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且所有其他细胞系都获取自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并且根据它们的说明书保存。星形胶质细胞和胶质瘤细胞系为来自洛伊癌症研究中心，新南威尔士，澳大利亚的Kerry McDonald博士友好捐赠的。
细胞增殖测定
使用磺酰罗丹明B(SRB)测定评估细胞增殖。用MPL(0、1、5、10、25、50和100μmol/L)处理接种于96孔平板(2,000-3,000个细胞/孔)的细胞72小时。然后固定细胞，洗涤并且用100μl溶解于1％乙酸中的0.4％(w/v)SRB染色。在空气干燥之前用1％乙酸洗涤五次去除未结合的染料。用10mM Tris碱(pH 10.5)100μl溶解结合的SRB并且在570nm处读取吸光度。使用完全相同的程序评估MPL-SO2。两种制剂都溶解在乙醇中并且用培养基稀释从而产生用于细胞培养测定所需的最终的浓度。
细胞活力测定
为进行活力试验，将接种于6孔平板的细胞暴露于0、1、10、50和100μM浓度的莫奈太尔(MPL)24、48和72小时。莫奈太尔(Novartis,巴塞尔,瑞士捐赠)溶解于100％乙醇然后用细胞培养基稀释。处理期末，用PBS洗涤细胞，使胰蛋白酶化并且使用台盼蓝和血细胞计数器计数。一式四份地开始所有试验点并且每一试验都至少进行两次。
集落形成测定
为进行集落形成测定，将5×106个细胞，诸如OVCAR-3或A2780细胞平板接种在皮氏培养皿并且允许附壁过夜。抽取培养基并且用各种浓度的MPL孵育指数性生长的细胞72小时。此时，抽出培养基，用PBS洗涤培养皿，将没有药物的培养基添加到每一平板。每周改变培养基两次，持续3周。随后，用PBS温和地洗涤平板，用100％乙醇固定细胞并且用0.5％过滤的结晶紫溶液染色。在倒置显微镜下计数由超过50个细胞组成的集落。
细胞周期分析
使用标准的流式细胞术分析方案和程序测定MPL对细胞周期的影响。简单地说，MPL处理接种在25cm3烧瓶并且允许粘附过夜的0.7×1013个细胞24或48小时。用胰蛋白酶化收集细胞并且汇集漂浮在培养基中的细胞。用离心机分离细胞悬浮液，PBS洗涤，甲醇固定。然后洗涤细胞，并且在室温下再悬浮在碘化丙啶中和核糖核酸酶A在PBS中30分钟，通过流式细胞术分析(Becton Dickinson FACSort)。
蛋白质印迹
使用蛋白质印迹分析检测细胞中的蛋白表达。用指示浓度的MPL处理后，制备细胞裂解物并且用针对cdk2、cdk4、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、PARP-1(1:1000稀释；Cell Signalling Technology)和p53(1:200稀释；Santa Cruz Biotechnology)的抗体探针探测。通过GAPDH抗体多次再杂交印迹(1:30000稀释；Sigma-Aldrich)复核凝胶上可比较的的蛋白上样。
体内试验
雌性裸鼠(6周龄)购买于Biological Resources(新南威尔士大学)。机构的动物伦理学批准覆盖程序在小鼠上进行。简单地说，将2.5×106对数相生长的OVCAR-3细胞皮下注射到每一小鼠的左侧腹。每周称重动物一次同时每周两次检测它们的肿瘤体积。通过卡尺测量监测肿瘤生长并且通过测量正交直径检测肿瘤体积。基于公式1/2(长×宽2)计算估计的肿瘤体积，其中宽为两个正交测量的较短者。基于机构伦理学批准，在肿瘤体积达到500mm3之前对小鼠实施安乐死。在肿瘤细胞接种后第8天开始处理，这时随机化小鼠并且指定MPL或媒介处理组(5-6只小鼠/组)。MPL悬浮在过氧氢甲基纤维素(0.5％w/v HPMC)中，超声波仪灭菌并且每隔一天腹腔内(腹腔内)或灌胃(100μL)口服地给药。
在第一前导性试验中，以2.5或25mg/kg体重的药物腹腔注射给药，每周3次，持续2周。
基于此结果，在下一个动物组中，将剂量增加到25和50mg/kg，每周3次。
在最后的(第三)前导性研究中，口服地处理小鼠。以50和100mg/kg的剂量每周3次给药。在所有三次试验中，对照组中的小鼠接受相同容量的媒介(0.5％HPMC)。根据标准的程序在福尔马林固定的肿瘤切片上进行肿瘤组织学/免疫组织化学。
统计学分析
所有数据都报道为来自于至少两个独立的试验的均数±标准误(S.E.M.)。使用单因素方差分析和事后邓尼特检验分析MPL处理的与对照组之间肿瘤体积的差异。使用学生t检验比较定量变量。有意义的统计学差异定义为P<0.05。
结果
MPL抑制细胞增殖
检测MPL对卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和SKOV-3生长的影响。通过应用SRB测定，检测MPL对细胞增殖的影响。MPL以浓度依赖的方式抑制OVCAR-3、A2780和SKOV-3细胞的增殖，按照表1，分别为IC50值6.3、10.0和29.3。从这些结果中显而易见的是卵巢癌细胞系对MPL的抗增殖效应敏感。SKOV-3细胞是敏感性最小的。使用SRB增殖测定以相似的方式也检测MPL-SO2。发现MPL-SO2如MPL一样强有力的。MPL-SO2减少了生长在培养基中的癌细胞系的活力并且抑制细胞增殖。MPL-SO2的IC50显示在表1中。
也在一系列的细胞，诸如乳腺细胞、前列腺细胞和间皮瘤细胞上检测MPL对细胞增殖的抑制效应。获得的结果显示于表1中。进一步的结果显示于表2中。
表1：MPL和MPL-SO2的IC50值(体外处理72小时，SRB测定)
表2：MPL和MPL-SO2在抑制各种癌细胞系的增殖中的IC50值
没有星＝1次测定，**＝两次重复，***＝三次重复
表3
OVCAR-3，A2780为人上皮卵巢癌；CHO＝中国仓鼠卵巢细胞；HUVEC＝人脐静脉内皮细胞
表4：根据表3，氨基乙腈衍生物(AAD)
AAD R1 R2 R3 R4
1566(MPL) CN H CF3 SCF3
2105(MPL-SO) CN H CF3 SOCF3
4670(MPL-SO2) CN H CF3 SO2CF3
450 H H Cl CF3
907 H H CF3 CF3
970 H H CF3 OCF3
1154 Cl H Cl OCF3
004 F H Cl OCF3
2009 H F Cl OCF3
1336 F F Br OCF3
1470 F F CF3 OCF3
根据表3，“MPL-(R)”指N-[(1R)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺，并且“MPL-(S)”指N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺。
根据表3中所示的结果，AAD 907、1336、1470和2224(MPL-(R))的IC50值的比率(正常细胞/癌细胞)显示了特别高的活性。另外，发现AAD 2224(MPL-(R))与AAD 1566(MPL-(S))是均等的。值得注意的是以前已显示了(R)-对映体MPL-(R)没有驱虫活性。
简单地说，体外检测MPL与MPL-SO2抗具有广泛不同的疾病特征的一系列的癌细胞系。为进一步详细的研究，选择人卵巢癌细胞系OVCAR-3和A2780。额外地，在MPL(0、5、10、25、50和100μM)存在的情况下培养正常的人卵巢表面内皮细胞(HOSE)。使用台盼蓝测定评估细胞活力(图8)。相似地，研究MPL对正常的内皮的、上皮的、胚胎的和胎儿的细胞(图9)，同时使用SRB测定评估细胞增殖(图10)。选取呈现100％增殖的对照(媒介处理的)细胞并且MPL处理组表达为对照±SEM的百分比。一式四份地检测每一药物浓度并且每一试验重复至少两次。为了统计学比较，使用学生t检验比较每一药物处理组与对照组。为检验浓度依赖性药物效应，使用方差分析(ANOVA)。P值为*＝<0.05；**<0.01和***＝<0.001，****p<0.0001。表2中呈现的结果揭示MPL在癌细胞系中表现出高的抗增殖活性，然而正常细胞远未受到影响。为了发现是否是通过烟碱乙酰胆碱受体并且特别是nACHR7亚型介导MPL效应，用拮抗剂预处理细胞然后将其暴露于MPL(图11)。
也呈现了用MPL-SO2获得的结果。可以看到的是MPL-SO2以与母体药物MPL相似的量级发挥作用。IC50值的范围非常接近并且显示MPL-SO2在抑制癌细胞增殖方面如MPL一样有效(表2)。
MPL抑制集落形成
为研究MPL是否也阻碍生殖完整性和细胞系建立集落的能力，研究暴露于MPL的细胞的克隆源活性。暴露于各种浓度的MPL72小时后，洗涤细胞然后在无药物的培养基中孵育2周。发现MPL显著妨碍了这些细胞的集落形成。较高的MPL浓度导致克隆源性能力几乎完全丧失(图2)。
为检测MPL对细胞完整性的影响和在药物暴露和撤回后将它自己从药物效应摆脱的能力，用MPL(0、5、10、25μM)孵育细胞72小时，PBS洗涤，将其转移到琼脂平板，与生长培养基一起培养并且在标准的条件下孵育2周。然后用100％甲醇固定细胞并且用1％结晶紫染色。显微镜(放大率5倍)下计数集落(超过50个的细胞簇)。不同试验组计数的集落数量表达为对照的百分比(图14)。这些结果证明了MPL对集落形成的浓度依赖的抑制。
MPL通过下调细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的表达阻滞细胞周期
为研究MPL通过何种机制抑制细胞增殖和集落形成，借助于流式细胞术检测MPL对细胞周期的影响。发现MPL干扰细胞周期进展(图3)。暴露于MPL的细胞进展以浓度和时间依赖性方式被阻滞在G1期。细胞在G1期的积累伴随着S和G2-M期细胞百分比的急剧下降。为研究涉及MPL诱导的细胞周期阻滞的分子机制，检测细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4、细胞周期蛋白A和E的表达。MPL处理的细胞表达低水平的cdk2、cdk4、细胞周期蛋白A和E(图4)。
MPL通过下调细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的表达导致PARP-1裂解的诱导来阻滞细胞周期
为发现MPL通过何种机制抑制细胞增殖和集落形成，借助于流式细胞术(FACS)检测MPL对细胞周期的影响。发现MPL干扰细胞周期进展(图22)。暴露于MPL的细胞中，细胞被以浓度和时间依赖性方式阻滞在G1期。细胞在G1期的积累伴随着S和G2-M期细胞百分比的急剧下降。为研究涉及MPL诱导的细胞周期阻滞的分子机制，检测细胞周期调节蛋白cdk2、cdk4、细胞周期蛋白A和E的表达。MPL处理的细胞表达更低水平的cdk2、cdk4、细胞周期蛋白A和E(图4和16)。
MPL诱导PARP-1裂解
为研究MPL诱导的细胞死亡是否涉及PARP的裂解，对MPL处理的细胞的裂解产物进行PARP-1和裂解的PARP-1的蛋白质印迹分析。PARP-1的裂解通过阻止DNA修复诱导的存活促进了细胞凋亡。PARP帮助细胞维持它们的活力并且因此PARP的裂解促进细胞分解并且作为经受细胞凋亡的细胞标识。图5显示了PARP在MPL处理的细胞中被裂解。
MPL诱导PARP裂解
从MPL处理的OVCAR-3和A2780细胞制备的细胞裂解产物的蛋白质印迹分析显示了代表细胞死亡的高度诱导的PARP裂解(图17)。
MPL降低细胞的ATP水平
如图18A和18B中所述，用MPL处理OVCAR-3或A2780引起细胞中所发现的ATP水平的降低。
MPL诱导自体吞噬
图6显示了MPL对细胞的处理导致空泡的形成，这提示MPL可在这些细胞中诱导自体吞噬。图7显示MPL处理降低了ADP/ATP的细胞比率，这一比率是细胞自体吞噬的另一指标。
MPL抑制裸鼠中皮下异种移植生长率
图19-21显示了MPL在裸鼠中的体内测试。首先腹腔注射处理荷OVCAR-3肿瘤小鼠，或如根据最后的试验，口服地处理。获得的结果揭示给药剂量的活性并且特别是50mg/kg剂量(腹腔注射和口服的)显著延迟了这些动物中的肿瘤生长。肿瘤组织学揭示了大面积的肿瘤细胞死亡(图22)。
细胞增殖的抑制加上集落形成的抑制，以及体内结果显示了MPL的生长调控效应。通过减少细胞周期调控蛋白A和E2连同它们的激酶cdk2和cdk4的表达，显示了MPL干扰细胞周期进展。在正常的细胞中，从一期到另一期的转换以有序的方式发生，被各种蛋白很好地调控。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)为关键的调控蛋白，其在细胞周期的特定点处被激活并因此在细胞周期进展中发挥决定性的作用。这些在细胞周期的不同期需要不同的细胞周期蛋白。细胞周期蛋白A、D和E为细胞周期的G1和G1转换到S期所必需的。在迄今所鉴定的各种CDK中，CDK2和CDK4似乎是进入G1和G1-S转换必不可少的。细胞周期蛋白A和E与CDK2结合而细胞周期蛋白D与CDK4和CDK6结合。癌症为被认为与细胞周期有关的现象的几种疾病的其中之一。
图19-21中呈现的结果证明了MPL在抑制雌性裸鼠中皮下肿瘤生长的活性。最初的试验揭示了腹腔注射MPL给药的剂量依赖性活性。25mg/kg剂量是特别有效的。在此基础上，在相同的条件下如以前的使用25和50mg/kg剂量进行下一试验。50mg/kg剂量在延迟这些动物中的肿瘤生长方面更有效。作为抗寄生虫制剂，在许多动物模型中MPL已显示了口服地有效。检测MPL的50和100mg/kg剂量的口服治疗活性。在所有三个前导性试验中，MPL均制备于0.5％HPMC并且作为悬浮液给药。来自于这些的体内试验中肿瘤组织的检测揭示了MPL处理的肿瘤中广泛坏死区(图22)。
所观察的效应不限制于卵巢癌，如图1和2中所示，并且MPL有效地抑制了代表各种癌症的各种细胞系的体外细胞增殖，包括胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、间皮瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤(见表1和2)。
另一重要的发现为MPL对耐药性细胞系的活性。卵巢耐药性细胞、胶质瘤替莫唑胺耐药细胞和乳腺癌三苯氧胺耐药细胞都对MPL抗增殖作用敏感。
总之，结果证明了在癌症细胞系中，MPL及潜在地其代谢物和类似物(AAD)：
1-抑制细胞增殖；
2-通过烟碱激动剂或拮抗剂预处理，MPL-诱导的抑制既不积极地也不消极地受影响，这提示作用模式非烟碱受体介导的；
2-抑制集落形成；
3-阻滞细胞周期[G1期]；
4-下调细胞周期调控蛋白(CdK2、CdK4、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E)；
5-限制胸苷掺入到细胞而因此抑制DNA合成；
6-降低细胞ATP水平；
7-引起渐进式自体吞噬，如通过LC3B-I到LC3B-II的转换所确认的；
8-在显微镜下卵巢癌和胶质瘤细胞系中自体吞噬是清晰的；
9-MPL也诱导PARP-1的裂解从而细胞死亡；
10-通过体内数据所确定的显示了剂量依赖的荷皮下肿瘤裸鼠中肿瘤抑制；
11-腹腔注射和口服给药途径为有效的；
而且，MPL抑制对一些标准的化学疗法抵抗的细胞增殖。
讨论
如表1中所示，也在HUVEC上检测MPL。发现IC50值比OVCAR-3中IC50值高约10倍，这反映了MPL对癌细胞比对非癌细胞高的细胞毒性。
在集落形成测定中，MPL以浓度依赖性方式抑制生长在琼脂平板上的卵巢癌细胞系的集落形成，因此进一步地证明了MPL抑制癌细胞生长的功效。
而且，显示了无论[OVCAR-3(突变的)、SKOV-3(无效的)和A2780(野生型)]细胞的p53状态如何，MPL都发挥它的抗癌效果(即使处于不同的效能)。这提示了MPL对上皮性卵巢癌有效，无论它们的肿瘤p53状态如何。这一发现具有重要意义，因为p53突变在各种各样的癌症中是非常常见的。
应理解的是MPL所显示的效应可扩展至除了卵巢癌之外其他类型的癌症。
哺乳动物的细胞周期取决于Cdk的依次激活。Cdk2与细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E复合调控通过G1期的进展和S期的进入。因此，抑制这些调控蛋白的表达打乱了细胞周期进展。
MPL对细胞增殖和集落形成的抑制是浓度依赖的。MPL借此打乱细胞周期进展的可能的机制为下调细胞周期调控蛋白E和A，细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk4与Cdk2，导致G1阻滞。作为G1阻滞的结果，细胞没有进展到细胞周期的下一阶段，如通过S期和G2-M期中细胞随着时间急剧的减少所示。媒介处理组的G2-M期中细胞的百分比高于25μMMPL处理组中的那些细胞的百分比3倍多。
而且，MPL处理的癌细胞系中自体吞噬的证据强有力地提示经由G0期细胞周期阻滞，细胞不可逆地退出细胞周期。

Claims (63)

1.用于治疗一种或多种癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的通式(I)的化合物：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3或-S-CF3；
X为杂原子、N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
2.如权利要求1所述的方法，其中R1为-CN、H或卤素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中R2为H或卤素。
4.如上述任一权利要求所述的方法，其中R3为-CF3或卤素。
5.如上述任一权利要求所述的方法，其中R4为-S-CF3、-SOCF3、-SO2CF3、-OCF3或-CF3。
6.如上述任一权利要求所述的方法，其中R5为H。
7.如上述任一权利要求所述的方法，其中X为O。
8.如上述任一权利要求所述的方法，其中n为1。
9.如上述任一权利要求所述的方法，其中R4在酰胺部分的对位。
10.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述通式(I)的化合物为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体。
11.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述通式(I)的化合物为(S)-对映体。
12.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
其中以上化合物中的每一个为(R)-对映体或(S)-对映体，或外消旋体、或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
13.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述通式(I)的化合物为MPL(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述通式(I)的化合物为莫奈太尔砜(MPL-SO2)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
16.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述癌症与激酶有关。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述激酶为细胞周期蛋白依赖性激酶。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述细胞周期蛋白依赖性激酶为cdk2或cdk4。
19.如上述任一权利要求所述的方法，其中所述癌症选自以下：恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状细胞癌的皮肤癌；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯克特氏淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；间叶细胞源的肿瘤，包括脂肪肉瘤、GIST、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、成骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述疾病为卵巢癌。
22.通式(I)的化合物或其代谢物，药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗一种或多种与激酶有关的癌症的药物中的用途：
其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3或-S-CF3；
X为杂原子、N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
23.如权利要求22所述的用途，其中R1为-CN、H或卤素。
24.如权利要求22或23所述的用途，其中R2为H或卤素。
25.如权利要求22-24中任一项所述的用途，其中R3为-CF3或卤素。
26.如权利要求22-25中任一项所述的用途，其中R4为-S-CF3、-SOCF3、-SO2CF3、-OCF3或-CF3。
27.如权利要求22-26中任一项所述的用途，其中R5为H。
28.如权利要求22-27中任一项所述的用途，其中X为O。
29.如权利要求22-28中任一项所述的用途，其中n为1。
30.如权利要求22-29中任一项所述的用途，其中R4在酰胺部分的对位。
31.如权利要求22-30中任一项所述的用途，其中所述通式(I)的化合物为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体。
32.如权利要求22-31中任一项所述的用途，其中所述通式(I)的化合物为(S)-对映体。
33.如权利要求22-32中任一项所述的用途，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
其中以上化合物中的每一个为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体，或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
34.如权利要求22-33中任一项所述的用途，其中所述通式(I)的化合物为MPL(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
35.如权利要求22-33中任一项所述的用途，其中所述通式(I)的化合物为莫奈太尔砜(MPL-SO2)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
36.如权利要求22所述的用途，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
37.如权利要求22-36中任一项所述的用途，其中所述癌症与激酶有关。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述激酶为细胞周期蛋白依赖性激酶。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述细胞周期蛋白依赖性激酶为cdk2或cdk4。
40.如权利要求22-39中任一项所述的用途，其中所述癌症选自以下：恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状细胞癌的皮肤癌；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯克特氏淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；间叶细胞源的肿瘤，包括脂肪肉瘤、GIST、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、成骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
41.如权利要求40所述的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤。
42.如权利要求40或41所述的用途，其中所述疾病为卵巢癌。
43.用于治疗一种或多种与激酶有关的癌症的通式(I)的化合物或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药：
其中
R1、R2、R3和R5各自独立地选自H、烷基、卤素、-CF3或-CN；
R4和R6各自独立地选自H、烷基、卤素、烷氧基、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3或-S-CF3；
X为杂原子、N(烷基)或NH；以及
n为1-20。
44.如权利要求43所述的化合物，其中R1为-CN、H或卤素。
45.如权利要求43或44所述的化合物，其中R2为H或卤素。
46.如权利要求43-45中任一项所述的化合物，其中R3为-CF3或卤素。
47.如权利要求43-46中任一项所述的化合物，其中R4为-S-CF3、-SOCF3、-SO2CF3、-OCF3或-CF3。
48.如权利要求43-47中任一项所述的化合物，其中R5为H。
49.如权利要求43-48中任一项所述的化合物，其中X为O。
50.如权利要求43-49中任一项所述的化合物，其中n为1。
51.如权利要求43-50中任一项所述的化合物，其中R4在酰胺部分的对位。
52.如权利要求43-51中任一项所述的化合物，其为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体。
53.如权利要求43-52中任一项所述的化合物，其为(S)-对映体。
54.如权利要求43-53中任一项所述的化合物，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
其中以上化合物中的每一个为(R)-对映体或(S)-对映体或外消旋体，或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
55.如权利要求43-54中任一项所述的化合物，其中所述通式(I)的化合物为MPL(N-[(1S)-1-氰基-2-(5-氰基-2-三氟甲基-苯氧基)-1-甲基-乙基]-4-三氟甲基硫烷基-苯甲酰胺)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
56.如权利要求43-54中任一项所述的化合物，其中所述通式(I)的化合物为莫奈太尔砜(MPL-SO2)：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
57.如权利要求43所述的化合物，其中所述通式(I)的化合物选自下列化合物中的任何一个：
或其代谢物、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
58.如权利要求43-57中任一项所述的化合物，其中所述癌症与激酶有关。
59.如权利要求58所述的化合物，其中所述激酶为细胞周期蛋白依赖性激酶。
60.如权利要求59所述的化合物，其中所述细胞周期蛋白依赖性激酶为cdk2或cdk4。
61.如权利要求43-60中任一项所述的化合物，其中所述癌症选自以下：恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状细胞癌的皮肤癌；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯克特氏淋巴瘤；骨髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合征和前髓细胞白血病；间叶细胞源的肿瘤，包括脂肪肉瘤、GIST、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、成骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌和卡波济氏肉瘤。
62.如权利要求61所述的化合物，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌或间皮瘤。
63.如权利要求61或62所述的化合物，其中所述疾病为卵巢癌。
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