CN114026098A - 苯并吡喃基化合物、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于药物的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N‑氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其包含以下化学式(I)：其中R1、R2和R3独立于彼此选择；R1选自芳基或杂环；R2选自H、烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基、胺、羰基或杂环；R3选自H或(II)。
Description
技术领域
本发明涉及新类型的苯并吡喃基抗癌化合物。本发明描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的抗癌性质。本发明还描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的合成和分离方法。
背景技术
2018年，癌症导致全世界接近1000万人死亡，并且同年检测出1810万的新癌症病例。1预计5年后这种疾病的发病率将超过4300万例。这证明了发现新的且更好的治疗的紧急性。由于病例数目和相关死亡率的整体增加，该问题必须在全球范围解决。2018年，乳腺癌占癌症死亡的6.6％。乳腺癌是第五致死癌症类型；在2018年，检测到了11.6％的新病例(大于200万例)。2就发病率而言，这是第二最常见的癌症类型。治疗类型始终基于癌症阶段，但是主要包括手术、放射、常规化疗、免疫疗法或如果检测分子标志物，如ER、PR和HER-2的情况下的分子疗法。然而，就三阴乳腺癌(TNBC)(它是占全部乳腺癌的约15％-20％的非常侵袭性的乳腺癌亚型)而言，常规疗法具有有限的效力并且尚未发展出分子或个性化疗法。由于这种预后不良，高死亡率与这种乳腺癌亚型有关。3
苯并吡喃基骨架已启发了药物化学家，因为这些化合物广泛存在于自然界中并且具有多种生物学性质。4最近几年，有关这种天然存在的骨架及其合成衍生物的合成和生物重要性的研究已获得了关注。
Costa等人的文献“Tetrahedron”描述了一锅法级联反应，该反应涉及水杨醛和亚芳基氨基乙腈，用于制备2-芳基-1,9-二氢苯并吡喃并[3,2-d]咪唑。该文献进一步描述了作为具有改善的药理学性质的替代药物候选的组合了苯并吡喃和咪唑的新型稠合三环系统。然而，所描述的系统不允许产生其中芳族单元结合有不同取代基的分子。
公开了这些事实以显示通过本发明所解决的技术问题。
发明内容
本发明涉及新类型的苯并吡喃基抗癌化合物。本发明描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的抗癌性质。本发明还描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的合成和分离方法。
具体地，本发明描述了通过结合至少两种不同的分子，从而产生具有所关心的相关生物学特性的化合物的合成新型苯并吡喃基化合物的方法。
现有技术中描述的苯并吡喃基化合物合成方法不允许分离这些新型化合物。本发明中所描述的方法允许合成和分离新型苯并吡喃基化合物，当作为抗癌化合物在几种癌症亚型，如乳腺癌、肾细胞癌、急性白血病和神经胶质瘤中使用时，所述苯并吡喃基化合物是意外地有效的。所述化合物对于乳腺癌和肾细胞癌是特别有效的。
在一个实施方式中，使用适当细胞系，通过体外筛选，对所合成的化合物测试了它们的抗癌潜力。在不同水平研究了化合物的活性，包括对细胞存活力、增殖、迁移、侵袭、细胞死亡和代谢的影响。
在一个实施方式中，还在非赘生性细胞系中测试了苯并吡喃基化合物的毒性作用。
在一个实施方式中，将秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(秀丽隐杆线虫(C.elegans nematode))模型用于苯并吡喃基化合物的早期体内毒性筛选。还使用小鼠作为模型评价了体内毒性。
在一个实施方式中，还使用体内CAM(鸡绒毛尿囊膜)测定鉴定了苯并吡喃基化合物的抗癌性质，所述测定评价了新型苯并吡喃的效力和血管生成性。还使用小鼠作为模型进一步评价了体内效力。
本发明的主题的化合物显示出独特且有希望的抗癌特性。
本发明的一个方面涉及包含以下化学式的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物：
其中
R1、R2和R3独立于彼此选择；
R1选自H、烷基、芳基、烷氧基、酰基、卤素、硝基、羟基、胺、酰胺、酮、酯、杂环；
R2选自：H、烷基、芳基、烷氧基、酰基、卤素、硝基、羟基、胺、酰胺、羰基、酮、酯、杂环；
R3选自H、烷基、芳基、烷氧基、酰基、卤素、硝基、羟基、胺、酰胺、酮、酯、杂环或
本发明的另一个方面涉及包含以下化学式的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物：
R1选自芳基或杂环；
R2选自：H、烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基、胺、羰基或杂环；
R3选自H或
优选地条件是不包括
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中：R1选择为芳基；并且R2选择为H、烷基、烷氧基、卤素、羟基或胺。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中所述二聚体优选地为同型二聚体。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1是取代的芳基。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1选自以下列表：羟苯基、羟基-甲氧基苯基、羟基-溴苯基、羟基-氯苯基、氟苯基、溴苯基、24-氯苯基、苯基、甲氧基苯基、二氟-羟苯基、乙氧苯基或溴-羟基-甲氧基苯基。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1为2-羟苯基、2-羟基-3-甲氧基苯基、2-羟基-5-甲氧基苯基、2-羟基-5-溴苯基、2-羟基-5-氯苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氯苯基、苯基、3-羟苯基、2-羟苯基、2-甲氧基苯基、3,5-二氟-2-羟苯基、4-乙氧苯基或者2-溴-3-羟基-4-甲氧基苯基。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R2是取代的或未取代的芳基。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R2选自以下列表：H、5-甲氧基、7-甲氧基、7-溴代、7-氯代或7-氟代。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R3是苯并吡喃单元或H。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R3选自以下列表：H、2-(4-氟苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元、2-(4-溴苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元或者2-(2-氟苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元。
在一个实施方式中，所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中所述化合物选自以下列表：
在本发明的一个方面，所公开的化合物在医学或兽医学中使用。
在本发明的一个方面，所述化合物可以在以良性或恶性细胞增生或者以新血管形成或过度血管形成区域或者癌症为特征的疾病的治疗、疗法或诊断中使用。
在本发明的一个方面，所述化合物可以在过度增殖组织或瘤形成的治疗、疗法或诊断中使用。
在本发明的一个方面，所述化合物可以在乳腺癌、肾细胞癌、白血病、神经胶质瘤或成胶质细胞瘤的治疗、疗法或诊断中使用。
在本发明的一个方面，所述化合物可以在肾细胞癌、白血病、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌的治疗、疗法或诊断中使用。
在本发明的一个方面，所述化合物可以在三阴性乳腺癌、急性肾细胞癌、管腔乳腺癌、基底细胞样乳腺癌、急性白血病的治疗、疗法或诊断中使用。
本发明的另一个方面涉及包含所公开的化合物中的至少一种的药物组合物。
在一个实施方式中，所公开的药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，所公开的药物组合物还包含抗病毒剂、止痛剂、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、抗生素、抗真菌剂、驱寄生虫剂或利尿剂或其混合物。
在一个实施方式中，所公开的药物组合物还包含填充剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂或其混合物。
在一个实施方式中，所公开的药物组合物用于皮内或透皮疗法、或者局部或全身、或静脉内疗法或它们的组合。
本发明的另一个方面涉及获得所公开的化合物的方法，其包括以下步骤：
将浓HCl(1.1当量)添加至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(0.150mg；0.79mmol)在1mL CH3CN中的橙色溶液中；
在室温下(20℃)搅拌所述混合物10-15分钟(观察到直接的沉淀)；
过滤固体，优选地通过简单过滤，以获得3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵；
将醛(1.1-1.7当量)添加至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(0.25-0.35mmol)在CH3CN(1-2mL)中的混悬液中；
将所述混悬液在60℃搅拌24-48小时，
过滤所得固体以分离纯的产物，优选地用CH3CN清洗；
任选地当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物2-(5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑。
在一个实施方式中，对于5,5'-二甲氧-2,2'-二苯基-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑的制备，将醛(1-1.2当量)添加至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺在CH3CN(1-2mL)中的溶液中并将所述溶液在80℃搅拌7-24小时。固体产物开始缓慢沉淀，过滤，用CH3CN清洗，并鉴定为纯产物5,5'-二甲氧-2,2'-二苯基-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑。
本发明的另一个方面涉及包含所公开的化合物和/或所公开的药物组合物的纳米颗粒。
在一个实施方式中，通过纳米颗粒包封包含所公开的化合物和/或药物组合物的纳米颗粒。
本发明的另一个方面涉及包含所述化合物和/或所公开的药物组合物的试剂盒。
本发明的另一个方面涉及所述化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物用于医学或兽医的用途。具体地，用于以良性或恶性细胞增生或者以新血管形成区域或者癌症为特征的疾病的治疗或疗法中的用途。具体地，用于过度增殖组织，如与癌症有关的过度增殖组织的治疗、疗法或诊断中的用途。另外，用于乳腺癌、肾细胞癌、急性白血病和神经胶质瘤的治疗、疗法或诊断中的用途。此外，用于成胶质细胞瘤和三阴性乳腺癌的治疗、疗法或诊断的用途。
基于国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，将烷基定义为通过从任何碳原子除去氢原子衍生自烷烃的一价基团——CnH2n+1。通过从非支链烷烃的末端碳原子除去氢原子所衍生的基团形成了正烷基(n-烷基)亚类H(CH2)n。基团RCH2、R2CH(R≠H)和R3C(R≠H)分别是伯、仲和叔烷基。通过从环碳原子除去氢原子，芳基衍生自芳烃(单环和多环芳烃)。
“烷基”包括“低级烷基”并且延伸以覆盖具有多达30个碳原子的碳片段。烷基的实例包括辛基、壬基、降冰片基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、二十基、3,7-二乙基-2,2-二甲基-4-丙基壬基、2-(环十二基)乙基、金刚烷基等。
“低级烷基”表示具有1至7个碳原子的烷基。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲和叔丁基、戊基、己基、庚基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、2-甲基环丙基、环丙基甲基等。
在本发明中，卤素是指选自以下列表的元素：氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)、砹(At)。
在本发明中，术语“杂环”表示其中形成环主链的原子中的至少一种不是碳。除非另外说明，否则杂环可以是饱和、部分不饱和或完全不饱和的环。“饱和杂环”是指仅在环成员之间含有单键的杂环。“部分饱和杂环”是指含有至少一个双键的非芳族杂环。术语“杂芳环”表示其中形成环主链的至少一个原子不是碳的完全不饱和芳环。通常，杂芳环包含不超过4个氮、不超过1个氧且不超过1个硫。除非另外说明，否则杂芳环可以通过替换所述碳或氮上的氢原子，通过任何可用的碳或氮连接。术语“杂芳族双环系统”表示由两个稠环组成的环系统，其中所述两个环中的至少一个是如上定义的杂芳环。
术语“碳环”表示其中形成环主链的原子仅选自碳的环。除非另外说明，否则碳环可以是饱和、部分不饱和或完全不饱和的环。当完全不饱和的碳环满足休克尔规则(huckel's rule)时，则所述环也称为“芳环”。“饱和碳环”是指具有由通过单键彼此连接的碳原子组成的主链的环；除非另作说明，氢原子占据了剩余的碳原子价。
附图说明
以下附图提供了用于说明本发明的优选实施方式并且不应视为对本发明范围的限制。
图1显示了通过创伤-愈合测定评价的苯并吡喃基化合物对MCF-7细胞迁移的影响(对于每种化合物，用各自的1/2IC50和IC50值处理12、24、48、72小时)。
图2显示了通过创伤-愈合测定评价的苯并吡喃基化合物对Caki-2细胞系迁移的影响(对于每种化合物，用各自的IC50值处理12、24、36、48小时)。
图3显示了处理48小时后苯并吡喃基化合物对786-O细胞增殖的影响。
图4显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的MCF-7细胞存活力的流式细胞术分析。图4A是用0.5％DMSO(对照)处理或以化合物的IC50浓度处理12小时和24小时的MCF-7细胞的代表性点状图。图4B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。
图5显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的Hs578t细胞存活力的流式细胞术分析。图5A是用0.5％DMSO(对照)处理或以试剂的IC50浓度处理12小时和24小时的Hs578t细胞的代表性点状图。图5B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。
图6显示了使用相应IC50浓度，用化合物MC409、MC408、MC406和MC421处理MCF-7细胞(A)24小时和(B)48小时后的总PARP、半胱天冬氨酸酶3和9、BIM和Bcl-xL的免疫印迹分析。使用12％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平。
图7显示了使用相应IC50浓度，用化合物MC409、MC408、MC406和MC421处理Hs578t细胞(A)24小时和(B)48小时后的总PARP、半胱天冬氨酸酶3和9、BIM、Bcl-xL和Bax的免疫印迹分析。使用12％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平。
图8显示了MCF-7细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图8A是用0.5％DMSO(对照)处理或者以试剂的IC50浓度处理12和24小时的MCF-7细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图8B显示了在细胞周期的不同期中的细胞定量。
图9显示了Hs578t细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图9A是用0.5％DMSO(对照)处理或者以试剂的IC50浓度处理12小时和24小时的Hs578t细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图9B显示了在细胞周期的不同期中的细胞定量。
图10显示了化合物MC408和MC421对Hs578t(A、B)和MCF-7(C、D)细胞的微管网络的影响。
图11显示了在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的毒性影响确定中使用的策略。使用热失活的细菌(大肠杆菌(E.coli)OP50)作为食物来源并且在存在几种浓度的化合物MC421、MC406、MC369和MC408、MC409、MC407的情况下，将虫在液体培养基中培养7天。将第3-5天之间的食物消耗速率用作虫发育、健康以及生育力的指示，因为在第3天后，虫的子代也将促进食物量的更快速的减少。对于假想化合物X显示了实例。将DMSO 1％和5％用作毒性的阴性和阳性对照。
图12显示化合物在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中缺少体内毒性。
图13显示了化合物MC408对C57Bl/6小鼠的影响。
图14显示了对用化合物MC408处理的C57BI/6小鼠实施的一系列福利测试的结果。
图15显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的酶促肝功能的影响。
图16显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的影响——第2试验。图16A是实验时间线的示意图。图16B显示了小鼠体重。
图17显示了MC408和MC421对乳腺癌Hs578t细胞系的体内治疗效果。图17A显示了CAM测定的代表性照片并且图17B显示了肿瘤生长百分比。
图18显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的786-O细胞存活力的流式细胞术分析。图18A是用0.5％DMSO(对照)处理或以试剂的IC50浓度处理24和48小时的786-O细胞的代表性点状图。图18B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。
图19显示了使用相应IC50浓度，用化合物MC408和MC421处理786-O细胞(A)24小时和(B)48小时后的KDM4C、总PARP、Hsp90、总JNK、总p53、Bid和p21的免疫印迹分析。使用12％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平。
图20显示了在2小时的饥饿期和用西地尼布、化合物MC350、MC415、MC412、MC408和MC421，使用2μM的唯一浓度处理786-O细胞6小时后，总mTOR和mTOR的磷酸化形式、ERK、VEGFR2、EGFR、AKT、PTEN和AMPK、PDK1的磷酸化形式、NF-kB和p18和c-Myc、Hsp90和PRAS40蛋白的免疫印迹分析。使用10％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平。
图21显示了MC408和MC421对肾癌786-O细胞系的体内治疗效果。图21A显示了CAM测定的代表性照片并且图21B显示了肿瘤生长百分比。
图22显示了786-O细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图22A是用0.5％DMSO(对照)处理或者以试剂的IC50浓度处理24和48小时的786-O细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图22B显示了在细胞周期的不同期中的细胞定量。
图23显示了在用所选化合物的1/2IC50或IC50处理24和48小时后，苯并吡喃基化合物对A498耐受性和亲代细胞系的细胞增殖的影响。
图24显示了在用所选化合物的1/2IC50或IC50处理24和48小时后，苯并吡喃基化合物对Caki-2耐受性和亲代细胞系的细胞增殖的影响。
图25显示了以雷帕霉素和西地尼布、化合物MC350、MC413、MC408和MC421的IC50对A498亲代(P)和耐受性(R)细胞处理48小时的一段时间后，总ERK和GAPDH以及它们的磷酸化形式、HK2、LDHA、Hif2α、MCT1、PKM、PFKL、Hsp90和c-Myc蛋白的免疫印迹分析。使用10％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平。
图26显示了化合物MC408和MC421对血管生成的体内影响。在第13和17天，卵内和卵外CAM测定的代表性图像(20×放大)。
图27显示了正位乳腺癌NSG小鼠异种移植模型中的肿瘤体积和体重。
具体实施方式
本发明涉及新类型的苯并吡喃基抗癌化合物。本发明描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的抗癌性质。本发明还描述了新类型的苯并吡喃基抗癌化合物的合成和分离方法。
具体地，本发明描述了通过组合至少两个不同的分子，因此产生具有所关心的相关生物谱的化合物的合成新型苯并吡喃基化合物的方法。
在一个实施方式中，分离了19种不同的苯并吡喃-咪唑基化合物。表1显示了苯并吡喃基骨架结构以及19种合成和分离的苯并吡喃-咪唑基化合物。
表1：苯并吡喃基化合物的结构
在一个实施方式中，作为分离试剂的抗增殖活性评价的一部分，确定了合成和分离的苯并吡喃基化合物的细胞生长抑制和IC50值。对所有合成的化合物实施了构效关系的完整研究。分析了对MCF-7乳腺癌细胞系的抗增殖活性。表2显示了化合物对乳腺癌细胞系MCF-7和非赘生性细胞系MCF-10A的IC50值(μM)和选择性指数(SI)。非赘生性细胞系MCF-10A也用于确定化合物对肿瘤细胞的选择性。对于IC50值(细胞存活力降低50％所需的浓度)高于20μM的化合物，未确定IC50值。为了评价测试化合物的细胞毒性，计算了选择性指数(SI)。
表2：化合物对乳腺癌细胞系MCF-7和非赘生性细胞系MCF-10A的IC50值(μM)和选择性指数(SI)
二聚化合物为MCF-7细胞系提供了优良的IC50值，其值小于各自的单体。在芳环中具有连接至咪唑部分的卤素原子或不具有取代基的单体化合物提供了较小的IC50值(<1μM)。具有OH或OCH3/OCH2CH3的咪唑并-苯并吡喃导致了显著更高的IC50值，甚至当卤素原子存在于相同芳族部分时。
对于非赘生性细胞系MCF-10A，对一些苯并吡喃也获得了有希望的IC50值并且计算了高SI值。对于二聚化合物，对非赘生性细胞的毒性要低得多，从而导致产生了优良的SI值(高于60)。SI值通常是非常有前景。
在一个实施方式中，对于比较研究，选择单体和各自二聚体并在Hs578t和MDA-MB-468乳腺细胞系中进一步评价。表3显示了所选的苯并吡喃基化合物对于乳腺癌细胞系Hs578t和MDA-MB-468的IC50值(μM)和选择性指数(SI)。这些细胞系对应于乳腺癌的基底细胞-样亚型，其包括在已知的三阴性亚型中，因为它们对于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)分子标志物是阴性的。这些乳腺癌亚型的临床表现是非常侵袭性的并且仍没有特异性分子疗法。
表3：所选的苯并吡喃基化合物对于TNBC细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231和Hs578t的IC50值(μM)和选择性指数(SI)
苯并吡喃基化合物对Hs578t表现出从0.035至0.27μM的极低的IC50值。溴取代的苯并吡喃基化合物MC408和二聚化合物MC421对Hs578t细胞系和对MDA-MB 468细胞系表现出极低的IC50值。化合物MC408是活性特别高的(IC50＝0.027μM)。通常，化合物对这些侵袭性乳腺癌亚型显示出甚至更关心的抗增殖潜力并且SI值也是优良的。
在一个实施方式中，进一步对于神经胶质瘤细胞系(U87、GAMG和GL18)和急性白血病细胞系(HL-60、KG-1和Jurkat)确定了化合物MC408、MC409、MC421和MC406的抗增殖活性。实施了该研究以评价化合物是否在其它癌细胞模型中表现出同样关心的抗癌谱。在使细胞对各个化合物在适当的浓度范围暴露72小时以确定各自的IC50值之后，使用MTS测定确定了细胞存活力。表4显示了化合物MC408、MC409、MC421和MC406对神经胶质瘤和白血病癌细胞模型的IC50值(μM)。
表4：化合物MC408、MC409、MC421和MC406对神经胶质瘤和白血病癌细胞模型的IC50值(μM)
化合物显示了优良的抗增殖能力，因为对于所有细胞系所确定的IC50值处于纳-摩尔或低微-摩尔范围。化合物MC421对神经胶质瘤细胞系显示出非常高的细胞生长抑制，特别是对于U87和GAMG。当与其它化合物相比时，化合物MC408显示出较低的抗增殖能力，但是IC50值仍处于低μM范围。在白血病模型中，所有化合物似乎对Jurkat细胞系更具有选择性，但是还通过用所有化合物对其它白血病细胞系的治疗实现了优良的生长抑制。这些结果表明这些化合物在几种癌细胞模型中是有希望的，并且可以认为是癌症治疗的候选。
在一个实施方式中，进一步对肾癌细胞系和非肿瘤肾细胞系确定了化合物的抗增殖活性。表5显示了肾癌细胞系(786-O、Caki-2、A498)和非赘生性细胞系(HK2)的IC50值(μM)和选择性指数(SI)。化合物M955、M1220、M1143和M1221未在第一次筛选中显示出任何生物活性，并且未继续IC50确定。一些化合物对肾细胞癌(RCC)细胞系显示出高效力和优良的选择性指数。
表5：肾癌细胞系(786-O、Caki-2、A498)和非赘生性细胞系(HK2)的IC50值(μM)和选择性指数(SI)
在一个实施方式中，进一步确定了化合物MC421、MC409、MC408、MC350、MC416、MC410、MC411、MC415和MC413对耐药性肾癌细胞系的抗增殖活性。表6显示了雷帕霉素-耐受性A498和西地尼布-耐受性Caki-2细胞系和非赘生性细胞系(HK2)的IC50值(μM)和选择性指数(SI)。
表6：雷帕霉素-耐受性A498和西地尼布-耐受性Caki-2细胞系和非赘生性细胞系(HK2)的IC50值(μM)和选择性指数(SI)。
在一个实施方式中，进一步评价了4种所选化合物(MC408、MC409、MC406和MC421)对细胞迁移的影响(图1)。用各自的IC50和IC50值的一半处理MCF-7细胞72小时并且实施创伤-愈合测定。对于每种化合物，使用IC50浓度的一半来评价浓度-依赖性影响。图1显示了通过创伤-愈合测定评价的苯并吡喃基化合物对MCF-7细胞迁移的影响(对于每种化合物，用各自的1/2IC50和IC50值处理12、24、48、72小时)。将结果表示为至少3个独立实验的平均值±SD，与对照相比(DMSO，0.5％)，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
仅在培育12小时后，在显微镜下，对所有化合物观察到了彻底的细胞死亡。在72小时，在采集照片前从每个孔中除去培养基，因为大量死亡的漂浮细胞防碍细胞迁移的准确测量。化合物MC409显示出对细胞迁移的早期影响；在12小时后，对于IC50和1/2IC50值，该化合物能够将细胞迁移百分比(相对于0.5％DMSO的对照)降低约40％。然而，如通过细胞迁移的缓慢恢复所观察到的，细胞似乎从化合物的影响中恢复。处理72小时后，通过使用IC50浓度，细胞迁移抑制比对照小约12％。对于另外3种化合物，在处理24小时或48小时后还观察到了更低的影响。对于化合物MC408和MC406处理，使用IC50和1/2IC50浓度对细胞迁移导致了类似的影响，并且在72小时后，细胞迁移比对照小20％。化合物MC421显示出以浓度依赖性方式的影响。对于IC50和1/2IC50浓度两者，注意到随时间对细胞迁移的轻微影响。仅在处理后72小时观察到细胞迁移的减少(比对照小13％)。
在一个实施方式中，还在4个不同的时间点，在肾细胞癌细胞系Caki-2中，评价了化合物MC408、MC421、MC412和MC415对细胞迁移的影响(图2)。将西地尼布用作参考药物并且使用它们各自的IC50浓度值测试所有化合物。图2显示了通过创伤-愈合测定评价的苯并吡喃基化合物对Caki-2细胞系迁移的影响(对于每种化合物，用各自的IC50值处理12、24、36、48小时)。将结果对于对照归一化(短划线)并表示为平均值±SEM。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.002，****p<0.0001。通过学生t检验确定不同组之间的差异显著性。
在一个实施方式中，评价了优选的苯并吡喃基化合物对细胞增殖的影响。用IC50和1/2IC50值处理786-O细胞48小时。测量了DNA合成期间BrdU掺入的能力并且结果示于图3中。图3显示了处理48小时后苯并吡喃基化合物对786-O细胞增殖的影响。结果表示为至少3个独立实验的平均值±SD。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0005，****p<0.0001。通过学生t检验确定不同组之间的差异显著性。通常，对于786-O细胞，苯并吡喃以浓度依赖性方式诱导细胞增殖显著减少。对于化合物MC409、MC410和MC368观察到例外。
在一个实施方式中，所述化合物对于细胞生长和细胞死亡显示出清楚的影响，特别是化合物MC406、MC409和MC408。这通过形态变化(在显微镜下观察的细胞)是明显的并且通过圆形漂浮细胞的存在是明显的。
在一个实施方式中，为了理解导致细胞死亡的机制，通过流式细胞术对细胞研究了细胞凋亡的诱导。将MCF-7和Hs578t细胞与化合物的各自IC50浓度培育12小时和24小时，并且将786-O细胞培育24小时和48小时，然后用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)双染色以检测磷脂酰丝氨酸的外化。磷脂酰丝氨酸的外化发生在早期凋亡事件期间。尽管膜联蛋白V结合至磷脂酰丝氨酸，但是PI仅对已失去它们的膜完整性的细胞染色，它是允许区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞或者坏死细胞的实验程序。化合物MC408和MC421通过在24h，在3种细胞系中通过细胞凋亡诱导细胞死亡来显示相关抗癌作用，如图9和10所示。在Hs578t细胞系中，化合物MC406和MC409还通过细胞凋亡诱导细胞死亡。
图4显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的MCF-7细胞存活力的流式细胞术分析。图4A显示了用0.5％DMSO(对照)处理或用化合物MC408、MC409、MC406和MC421的IC50浓度处理12小时和24小时的MCF-7细胞的代表性点状图。图4B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。使用以DMSO作为对照(100％)处理的细胞获得结果并且将结果表示为3个独立实验的平均值±SEM。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析膜联蛋白V/PI数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。图5显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的Hs578t细胞存活力的流式细胞术分析。图5A显示了用0.5％DMSO(对照)处理或用化合物MC408、MC409、MC406和MC421的IC50浓度处理12小时和24小时的Hs578t细胞的代表性点状图。图5B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。使用以DMSO作为对照(100％)处理的细胞获得结果并且将结果表示为3个独立实验的平均值±SEM。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析膜联蛋白V/PI数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。图18显示了通过膜联蛋白V/PI测定评价的786-O细胞存活力的流式细胞术分析。图18A显示了用0.5％DMSO(对照)处理或用化合物MC408和MC421的IC50浓度处理24小时和48小时的786-O细胞的代表性点状图。图18B显示了点状图的每个象限中的细胞百分比的定量。使用以0.5％DMSO作为对照(100％)处理的细胞获得结果并且将结果表示为3个独立实验的平均值±SEM。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析膜联蛋白V/PI数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
在一个实施方式中，通过关键细胞凋亡标志物的免疫印迹分析检查凋亡通路，进一步研究了细胞死亡的诱导。在使用IC50，用化合物处理细胞24和48小时后，将聚(ADP-核糖)聚合酶1(Parp)、半胱天冬氨酸酶3和9作为标志物对诱导的细胞凋亡进行评价(图6)。
用化合物对细胞的处理导致PARP裂解(图6和7)，它是半胱天冬氨酸酶激活的最后一步并且认为是细胞凋亡的标志。还在两个时间点观察到裂解的半胱天冬氨酸酶3。如通过这些标志物的存在所观察到的，通过所有化合物诱导细胞凋亡。
还使用Bim蛋白，并且对于测试化合物注意到升高的水平，但是仅对于Hs578t细胞系观察到。作为Bim的BH3-域蛋白与微管蛋白相互作用，并且在初始阶段，将维管描述为通过结合至动力蛋白轻链来多价螯合Bim，从而以这种方式防止凋亡信号转导通路的起始。在从微管释放后，Bim迁移至线粒体，与一些蛋白(例如，Bax、Bcl-2和Bc-xL)相互作用，并最终促进细胞凋亡。这表明从用测试化合物处理的细胞释放早期细胞凋亡信号，因此影响参与线粒体-诱导的细胞凋亡的促凋亡和抗凋亡蛋白的水平。
在一个实施方式中，实施细胞周期分析以确定化合物MC408、MC409、MC406和MC421抑制细胞增殖的能力。在各自IC50浓度，用化合物处理MCF-7和Hs578t细胞12小时和24小时。在各自IC50，用化合物MC408和MC421处理786-O细胞24小时和48小时。使用流式细胞术通过DNA含量评价细胞周期分析(图8、9和22)。图8显示了MCF-7细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图8A显示了用0.5％DMSO(对照)处理的或者用MC408、MC409、MC406和MC421的IC50浓度处理12和24小时的MCF-7细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图8B显示了除化合物MC409外，在细胞周期的不同期中的细胞定量。结果表示为3个独立实验的平均值±SD。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图9显示了Hs578t细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图9A显示了用0.5％DMSO(对照)处理的或者用MC408、MC409、MC406和MC421的IC50浓度处理12和24小时的Hs578t细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图9B显示了除化合物MC409外，在细胞周期的不同期中的细胞定量。结果表示为3个独立实验的平均值±SD。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图22显示了786-O细胞的DNA含量的流式细胞术分析。图22A显示了用0.5％DMSO(对照)处理的或者用MC408和MC421的IC50浓度处理24和48小时的786-O细胞的细胞周期谱的代表性柱状图。图22B显示了在细胞周期的不同期中的细胞定量。结果表示为3个独立实验的平均值±SD。通过双向方差分析和Bonferroni事后检验分析数据。与对照(0.5％DMSO)相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
在一个实施方式中，分析了苯并吡喃基化合物对微管动态的影响。图10显示了化合物MC408和MC421对Hs578t(A、B)和MCF-7(C、D)细胞的微管网络的影响。未处理的(对照)、紫杉醇(Hs578t 12h：0.25μM，24h：0.01μM；MCF-7 12/24h：1μM)和以IC50用化合物MC408和MC421处理12(A、C)或24h(B、D)，用β-微管蛋白染色并用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染的细胞。以绿色显示微管和未组装的微管蛋白。以蓝色显示用DAPI染色的DNA。
在一个实施方式中，使用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(秀丽隐杆线虫(C.elegans))作为模型进行化合物体内毒性评价。实施了基于食物清除的测定，其中随时间的细菌消耗是虫发育、健康和生育力的代表(图11)。图11显示了在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的毒性影响确定中使用的策略。使用热失活的细菌(大肠杆菌(E.coli)OP50)作为食物来源并且在存在几种浓度的化合物MC421、MC406、MC369和MC408、MC409、MC407的情况下，将虫在液体培养基中培养7天。将第3-5天之间的食物消耗速率用作虫发育、健康以及生育力的指示，因为在第3天后，虫的子代将促进食物量的更快速的减少。对于假想化合物X显示了实例。分别将DMSO 1％和5％用作毒性的阴性和阳性对照。对于该实验，将化合物溶解在DMSO 1％(媒介物)中。
在几种浓度(高至可能的最高可溶浓度——150μM(MC369，75μM))下测试化合物(图12)。图12显示了MC421、MC406、MC369和MC408、MC409、MC407在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的体内毒性分析。将第3-5天之间的食物消耗速率用作虫发育、健康以及生育力的指示并与1％DMSO(媒介物，无毒)相比较。对于MC421、MC406、MC369和MC408、MC409、MC407未观察到统计学差异(ANOVA，随后进行Games-Howell事后检验)。对于任何化合物/化合物浓度，未检测到第3-5天的食物消耗速率的统计学差异。即使在比用于体外测试的那些显著更高的浓度，化合物似乎良好耐受的事实可以是哺乳动物模型中毒性的良好预测因子。
在一个实施方式中，在啮齿类动物中评价了化合物的安全性谱。图13显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的影响——第1试验。图13A是实验时间线的示意图。使用了5-个月大的雌性和雄性动物(n＝3/组/性别)并用MC408 3mg/Kg或者媒介物(盐水、Tween80和甲基纤维素)(i.p.)每天注射，共注射7天。每天实施一系列福利测试(welfare tests)。图13B显示了在第1次注射后立即发生的情况；对于该分析，将动物录象10min并且通过实验员对不活动时间和垂直移动(REARS)计数。在媒介物和MC408小鼠之间不存在差异。图13B显示了整个实验期间监测的小鼠体重，并且处理组之间不存在差异。图13D显示了小鼠的垂直探索活动。在观察罐(viewing jar)中测量活动，并且对垂直移动数计数5分钟。图13E显示了小鼠的水平活动。在用正方形标记的开放场地中记录活动，并且对正方形数目计数，同时让动物自由探索1分钟。探索活动中不存在差异。图13F显示了小鼠中焦虑的间接测量。为了间接测量焦虑，对在行为程序期间产生的动物粪便丸数目计数，并且组间未观察到差异。在图13G和H中，分别分析了水和食物摄入。每天，将0.300g的食物和200mL水置于每个笼中。在试验结束(第7天)时，对食物称重并测量水，并且两个参数中不存在差异。将数据表示为平均值±SE。
图14显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的影响。实施一系列福利测试以评价与媒介物动物相比时，用MC408处理的毒性迹象。将所评价的所有参数打分为正常或异常，存在或不存在，并且对所有动物同样打分(MC408和媒介物)，表明化合物对小鼠福利无影响。
在一个实施方式中，分析处理对C57Bl/6小鼠肝功能的影响。图15显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的酶促肝功能的影响。使用标准技术，在(图15A)雌性和(图15B)雄性动物的血清中测量了天冬氨酸转氨酶(AST/TGO)和丙氨酸转氨酶(ALT/TGP)。在实验结束时收集血液(第7天)。在每种性别内，未发现化合物-和媒介物-处理动物之间的统计学差异。值得注意地，与同组另外两只动物相比，MC408处理组中的一只雄性动物显示出AST和ALT两者的更高水平。将数据表示为平均值±SE。
在一个实施方式中，分析化合物处理对C57Bl/6小鼠的影响——第2试验。图16显示了MC408处理对C57Bl/6小鼠的影响——第2试验。图16A是实验时间线的示意图。使用了3-个月大的雌性和雄性动物(n＝6/组/性别)并用MC408 3mg/Kg或者媒介物(盐水、Tween80和甲基纤维素)(i.p.)每天注射，共注射7天。在该试验中，提高每组动物数目并且构思实验以在处理前后收集血液。图16B显示了小鼠体重。在整个实验期间监测体重，并且每种性别内的组间无差异。将数据表示为平均值±SE。
在一个实施方式中，使用CAM模型分析化合物的体内治疗效力研究。图17显示了MC408和MC421对乳腺癌Hs578t细胞系的体内治疗效果。图17A显示了卵内和卵外CAM测定的代表性照片(×10放大)(在第13和17天)。图14B显示了肿瘤生长百分比。将结果表示为从发展第13天至第17天的肿瘤生长平均百分比±SD****p<0.0001。通过单因素方差分析检验分析数据。用对照(DMSO 0.5％)、MC408(2×IC50＝0.094μM)或者MC421(2×IC50＝0.070μM)处理卵。
在一个实施方式中，通过关键细胞凋亡标志物的免疫印迹分析检查凋亡通路，进一步研究了细胞死亡的诱导。在使用IC50，用化合物处理786-O细胞24和48小时后，将聚(ADP-核糖)聚合酶1(Parp)、热休克蛋白90(Hsp90)、c-Jun N末端激酶(JNK)、p53、BH3相互作用-域死亡激动剂(Bid)和p21作为标志物评价诱导的细胞凋亡(图19)。
在一个实施方式中，通过评价雷帕霉素(mTOR)、胞外-信号-调控激酶(ERK)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、内皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、5'一磷酸腺苷-激活的蛋白激酶(AMPK)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、核因子κB(NF-kB)、p18、c-Myc、Hsp90和40kDa的富含脯氨酸的Akt底物(PRAS40)蛋白的哺乳动物靶标，进一步研究了与RTK受体和mTOR/PI3K/AKT通路的相互作用。在用西地尼布(肾细胞癌治疗中使用的血管内皮生长因子的有效抑制剂)和使用2μM的唯一剂量用化合物MC350、MC412、MC415、MC408和MC421处理6小时后，评价了这些标志物(图20)。
用几种化合物对786-O细胞的治疗导致磷酸化-mTOR水平和AKT蛋白水平降低。此外，在一些情况下，当与对照和西地尼布相比时，EGFR和VEGFR2两者表现出降低的水平。一些测试化合物影响mTOR/PI3K/AKT通路，从而干扰不同的蛋白标志物。
VEGF和EGFR是对血管内皮(VEGF)和内皮(EGF)生长因子家族特异的酪氨酸激酶(RTK)受体，其在肿瘤生长和转移中具有重要作用。通过与磷酸化酪氨酸有关的多种其它蛋白，它们的自磷酸化刺激下游激活和信号转导。这些下游信号蛋白起始一些信号转导级联，包括Akt通路，从而导致基因表达、细胞增殖和迁移、血管发生和血管生成。此外，mTOR调节细胞生长、增殖和代谢。通过两种多蛋白复合物mTORC1(对雷帕霉素敏感)和mTORC2控制其活性，认为其是耐受性的或者仅当以高剂量提供持续的一段时间时抑制。已开发了第二代双重mTOR抑制剂，并且那些新药的最重要的优势是对于mTORC2阻断的AKT磷酸化的显著减少和对mTORC1的更好抑制。考虑结果，RTK、mTOR和AKT表达的减少表明对于上述所有功能的关键调节因子的减少。
在一个实施方式中，使用CAM模型分析化合物的体内治疗效力。图21显示了MC408和MC421对肾癌786-O细胞系的体内治疗效果。图21A显示了卵内和卵外CAM测定的代表性照片(×10放大)(在第13和17天)。图21B显示了肿瘤生长百分比。将结果表示为发展第13天至第17天的肿瘤生长平均百分比±SD，与对照相比，p<0.0001(使用单因素方差分析检验进行统计分析)。用对照(DMSO 0.5％)、MC408(2×IC50＝0.128μM)或者MC421(2×IC50＝0.154μM)处理卵。
在一个实施方式中，评价了西地尼布、雷帕霉素和苯并吡喃基化合物对细胞增殖的影响。用IC50和1/2IC50值处理A498(亲代和雷帕霉素-耐受性)和Caki-2(亲代和西地尼布-耐受性)细胞24和48小时。测量了DNA合成期间BrdU掺入的能力并且图23和24中显示了结果。图23显示了在处理24和48小时后，苯并吡喃基化合物对A498(亲代和雷帕霉素-耐受性)细胞增殖的影响。图24显示了在处理24和48小时后，苯并吡喃基化合物对Caki-2(亲代和西地尼布-耐受性)细胞增殖的影响。结果表示为至少3个独立实验的平均值±SD。
通常，对于亲代或耐受性A498细胞，苯并吡喃以浓度和时间依赖性方式诱导细胞增殖的显著减少，特别是化合物MC408、MC421和MC413(图23)。
对于亲代和耐药性Caki-2细胞(图24)，苯并吡喃MC421、MC350和MC413能够以浓度和时间依赖性方式减少细胞增殖。
在一个实施方式中，通过评价总胞外-信号-调控激酶(ERK)及其磷酸化形式、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、己糖激酶2(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、低氧诱导因子2α(Hif2α)、单羧酸转运体1(MCT1)、丙酮酸激酶同工酶(PKM)、6-磷酸果糖激酶(PFKL)、热休克蛋白90(Hsp90)和c-Myc蛋白，进一步研究了与代谢特征有关的相互作用。在用雷帕霉素和西地尼布、化合物MC350、MC413、MC408和MC421的IC50对A498亲代(P)和耐受性(R)细胞处理48小时的一段时间后，评价了这些标志物。使用10％聚丙烯酰胺凝胶，通过免疫印迹检测裂解液中的蛋白水平(图25)。
用不同化合物处理A498细胞导致一些蛋白水平降低。事实上，与对照并且甚至与亲代细胞相比，雷帕霉素-耐受性细胞显示出GAPDH、Hif2α、c-Myc和Hsp90蛋白表达水平的显著降低。考虑到本发明的结果，苯并吡喃改变了癌细胞的代谢反应，甚至当对当前可用的RCC疗法耐受时。
在一个实施方式中，使用CAM模型分析化合物体内抑制血管生成的能力。为了评价对血管生成的影响，将灭菌的5-mm直径过滤盘浸渍在具有固定浓度(2×IC50值)的苯并吡喃MC408和MC421或者0.5％DMSO(对照组)的培养基中并置于CAM的血管区上。图26显示了卵内和卵外CAM测定的代表性照片(×10放大)(在第13和17天)。
在用新型苯并吡喃处理4天后，新血管的形成随着苯并吡喃MC408和MC421而减少。另外，观察到了预存在血管的破裂(图26中的黑色箭头)，从而表明化合物在CAM模型中抑制血管生成。
在一个实施方式中，使用小鼠模型分析化合物MC408的体内治疗效力。图27显示了使用TNBC细胞系MDA-MB-231，MC408在正位乳腺癌小鼠异种移植模型中的体内治疗效果。将MDA-MB-231细胞注入NSG小鼠的乳房脂肪垫中(n＝6或7只每组)。植入后3天施用治疗一周。NT＝媒介物；剂量1＝3mg/kg；剂量2＝10mg/kg；剂量3＝50mg/kg。*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001(与NT组相比；双向方差分析事后Tukey检验或者具有Welch修正的非配对t检验)。
在正位乳腺癌异种移植小鼠模型中，苯并吡喃MC408以剂量-依赖性方式显著减小肿瘤体积(图27A)和重量(图27B)。以50mg/kg的剂量，与媒介物组相比，肿瘤体积和重量两者减少大于40％。重要地，在整个实验期间，对于所测试的治疗方案，动物未显示出体重减轻，并且也未显示出其它副作用。
在一个实施方式中，3种人乳腺癌细胞系Hs578T、MDA-MB-468和MCF-7和正常乳腺细胞系MCF-10A得自ATCC(美国模式培养物保藏所)。将癌细胞系在补充有10％热失活的胎牛血清(FBS,Gibco)和1％抗生素溶液(青霉素-链霉素，Gibco)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基，4.5g/l葡萄糖(DMEM,Gibco)中培养。将正常细胞系在达尔伯克改良伊格尔培养基中培养：补充有5％热失活的FBS(Gibco)、1％抗生素溶液(青霉素-链霉素，Gibco)、1％甾醇类激素(氢化可的松，Sigma-Aldrich)、0.1％肽类激素(胰岛素，Sigma-Aldrich)和0.01％蛋白质复合物(霍乱毒素(Cholera Toxin)，Gibco)的营养混合物(Nutrient Mixture)F-12(DMEM/F12,Gibco)。还使用了两种不同的人急性髓细胞性白血病(AML)细胞系HL-60(FABM2)和KG-1(红白血病-FAB M6)和一种人淋巴细胞性白血病(ALL)细胞系Jurkat(T细胞型)。这3种细胞系得自德国微生物和细胞培养物保藏所(
德语为Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen)。将细胞在补充有10％热失活的FBS(
-Merck Millipore)和1％抗生素/抗有丝分裂剂混合物(
)的RPMI 1640培养基(
-Merck Millipore)中培养。还使用了3种人成胶质细胞瘤(GBM)细胞系模型，两个建立且可商购的细胞系(U87MG和GAMG，由Rui M.Reis友好赠送)和一个原代GBM培养物(GL18)。将GBM细胞在DMEM(Biochrom-Merck Millipore)中培养，全部补充有10％FBS。肾细胞癌细胞系A498、786-O、Caki-2和HK2得自ATCC。将癌细胞系A498在MEM培养基(
-Merck Millipore)中培养，将786-O在RPMI 1640培养基(
-Merck Millipore)中培养，将Caki-2在Mc Coys培养基(
-MerckMillipore)中培养并且将HK2在RPMI1640培养基(
-Merck Millipore)中培养。所有培养基补充有10％热失活的FBS(
-Merck Millipore)和1％抗生素/抗有丝分裂剂混合物(
)。将所有细胞在37℃和5％CO2下在加湿培育箱中生长。对于所有测定，使用DMSO(二甲基亚砜，Sigma-Aldrich)对照。
在一个实施方式中，实施细胞存活力测定。将MCF-7、Hs578t和MCF-10A细胞在96-多孔培养平板中以3000个细胞每mL或者对于MDA-MB-468，5000个细胞每mL(100μL/孔)铺板，重复三次。然后，使细胞在完全培养基中在18-20小时的一段时间内贴壁。随后，用新鲜培养基中的7种不同浓度(0.1至40μM或者5至60μM)的化合物或对照处理细胞。将HL-60、KG-1和Jurkat细胞系以50.000个细胞/100μL每孔在96-多孔培养平板中铺板并用不同浓度(0.001至2μM)的所描述的化合物(或对照)处理所述细胞系。将细胞以2000个细胞/孔(对于GAMG)、4000个细胞/孔(对于GL18)和6000个细胞/孔(对于U87MG)的初始密度在96-孔板中铺板，重复三次，并且使其贴壁18-20小时。用不同浓度的化合物(0.005至100μM)或用对照处理细胞。在96-多孔培养平板(100μL/孔)中，将A498和786-O细胞以2000个细胞每mL铺板，将Caki-2细胞以3000个细胞每mL铺板并且将HK2细胞以2000个细胞每mL铺板，重复三次，并且使其在完全培养基中在18-20小时的一段时间内贴壁。然后，用新鲜培养基中的7种不同浓度(0.1至40μM或者5至60μM)的化合物或对照处理细胞。培育72h后，根据生产商的说明实施MTS(Promega)还原测定以通过代谢细胞存活力间接评价活细胞的百分比。在37℃和5％CO2，在加湿气氛中与MTS培育1-2小时之后，测量490nm的吸光度。对于RCC细胞系，根据生产商的说明使用磺基罗丹明B测定。将数据log-转化，并且使用GraphPad Prism 6软件计算相对于对照将活细胞数减少至50％的每种化合物的浓度(IC50)。
在一个实施方式中，使用以下数学公式，使用所有化合物对于MCF-7和MCF10A细胞系的IC50值，计算选择性指数(SI)值：
SI＝(IC50正常细胞系-IC50癌细胞系)/IC50癌细胞系
对于SI值>1，对癌细胞系的细胞毒性高于对非赘生性细胞系。
在一个实施方式中，通过模拟体内创伤-愈合期间细胞迁移过程的创伤-愈合测定来评价细胞迁移。该方法基于以下过程：制备抓痕，模拟细胞单层中的创伤，在细胞迁移以使创伤闭合的过程期间在开始时并以规则间隔记录图象并将图像进行比较以定量细胞迁移速率。将MCF-7和Caki-2细胞分别以9.0×105和3.0×105每2mL的密度在6-孔板中铺板，并在37℃，在5％CO2加湿气氛中生长过夜。将200μL移液管尖头用于在汇合细胞层中制备两道抓痕。用500μL PBS轻轻清洗细胞一次。以各自的IC50、1/2IC50用化合物或者用0.5％DMSO(对照)处理MCF-7细胞72小时。在0、12、24、48和72小时，对特异性创伤位点(每个创伤4个位置)拍照。对于Caki-2细胞，使用每种化合物各自的IC50，包括西地尼布或0.5％DMSO(对照)进行48h处理，并在0、12、24、36和48小时拍照。使用配备有Olympus DP20数字照相机系统的Olympus IX51倒置显微镜，以100×放大倍数采集图像。使用BeWound 1.7.1进行5次迁移距离的评价，并且使用GraphPad Prism 6软件对相对于对照进行归一化的细胞迁移百分比作图。对每个化合物实施3次独立实验。通过学生t检验确定不同组之间的差异显著性。
在一个实施方式中，实施增殖测定。将786-O细胞以7000个细胞/10μL的密度在96-孔板中铺板，并使其在37℃，在5％CO2加湿气氛中培育过夜。此后，以IC50或1/2IC50浓度用化合物MC350、MC408、MC412、MC415、MC409、MC410、MC413和MC369或者用0.5％DMSO(对照)处理贴壁细胞48h。在培育后，通过添加10μl/孔BrdU标记溶液(最终浓度：40μMBrdU)标记细胞。然后，将细胞重新培育16h以允许将BrdU引入增殖细胞DNA，从而替换胸腺嘧啶核苷。在标记后，除去培养基，固定细胞并通过在室温下与200μl FixDenat溶液培育使DNA变性。DNA的变性对于结合至掺入的BrdU的抗体缀合物是必需的。在除去FixDenat之后，并且将100μl抗-BrdU-POD抗体在室温下培育90min。将抗-BrdU-POD抗体在新合成的细胞DNA中结合至掺入的BrdU。除去抗体缀合物，并用洗涤液清洗孔三次。通过添加基材溶液(100μl/孔)检测免疫复合物，并在室温下培育板直至显色对于光度学检测满意(5-10min)。通过向每个孔中添加25μl 1M H2SO4并温和混合使底物反应终止。通过在酶标仪(Tecan Infinite M200)中测量450nm的吸光度(参考波长：690nm)来定量反应产物。在没有细胞的情况下，实施所有上述步骤，在每个实验时间点使用空白测试。使用GraphPad Prism 5软件评价至少3个独立实验的结果(重复四次)。
在一个实施方式中，实施蛋白质提取和免疫印迹分析。使MCF-7和Hs578t细胞在T25烧瓶中生长并且使786-O细胞在6-孔板中生长，当细胞达到70-80％汇合时，在各自IC50值用化合物处理或者用0.5％DMSO(对照)处理细胞。将细胞处理24小时和48小时。具体地，就RTK和mTOR通路分析来说，使786-O细胞饥饿2小时，然后用唯一剂量的2μM西地尼布或化合物处理或者用0.5％DMSO(对照)处理。处理后，通过刮除收集贴壁和漂浮细胞并以2000rpm，4℃离心10min。将颗粒在PBS中再混悬并再次离心(1200rpm；5min，4℃)。弃去上清液并将小粒在裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.6-8、150mM NaCl、5mM EDTA、1mM Na3VO4、10mMNaF、1％NP-40、1％Triton-X100和1/7蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Sciences))中混悬并在冰上培育20分钟。将裂解液以14000rpm在4℃离心15分钟；然后，收集上清液以使用DC蛋白质测定试剂盒(BioRad)进行蛋白浓度测定。
简要地，将每个样品的30μg总蛋白在10％、12％或15％聚丙烯酰胺凝胶(100V)中分离，然后转移至硝化纤维素膜上(100V，30分钟)。用5％牛奶在1×TBS中的溶液使膜封闭60分钟，然后使其在4℃与特异性第一抗体培育过夜(兔抗-PARP抗体(Cell Signaling,#9542)，1:1000 5％牛奶；小鼠抗-半胱天冬氨酸酶-9抗体(Cell Signaling,#9508)，1:5005％牛奶；兔抗-半胱天冬氨酸酶-3抗体(Cell Signaling,#9665)，1:500 5％牛奶；小鼠抗-Bax抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-7480)，1:500 5％牛奶；小鼠抗-Bax抗体(SantaCruz Biotechnology,sc-8392)，1:500 5％牛奶；兔抗-Bim抗体(Cell Signaling,#2933)，1:1000 5％BSA；兔抗-Bid抗体(Cell Signaling,#2002)，1:1000 5％BSA；兔抗-KDM4C抗体(Abcam,ab27532)，1:2000 5％BSA；大鼠抗-Hsp90抗体(Calbiochem,cat#386041)，1:5005％BSA；兔抗-c-Myc抗体(Cell Signaling,#5605)，1:1000 5％BSA；兔抗-p53抗体(CellSignaling,#2527)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-p53抗体(Cell Signaling,#2521)，1:500 5％BSA；兔抗-p21抗体(Cell Signaling,#2947)，1:1000 5％BSA；兔抗-JNK抗体(CellSignaling,#92525)，1:500 5％BSA；兔抗-磷酸化-JNK抗体(Cell Signaling,#46685)，1:500 5％BSA；兔抗-mTOR抗体(Cell Signaling,#2983)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-mTOR抗体(Cell Signaling,#5536)，1:500 5％BSA；兔抗-PRAS40抗体(Cell Signaling,#2691)，1:1000 5％BSA；兔抗-VEGFR2抗体(Cell Signaling,#2479)，1:500 5％BSA；兔抗-磷酸化-VEGFR2(Tyr1175)抗体(Cell Signaling,#2478)，1:500 5％BSA；兔抗-EGFR抗体(Cell Signaling,#4267)，1:1500 5％BSA；兔抗-磷酸化-EGFR(Tyr1068)抗体(CellSignaling,#2234)，1:1500 5％BSA；小鼠抗-磷酸化-NF-kB p65(Ser536)抗体(CellSignaling,#3036)，1:1000 5％BSA；兔抗-AMPKα抗体(Cell Signaling,#2532)，1:10005％BSA；兔抗-磷酸化-AMPKα抗体(Thr172)(Cell Signaling，#2535)，1:1000 5％BSA；兔抗-AKT抗体(Cell Signaling,#4691)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-AKT(Thr308)抗体(Cell Signaling,#13038)，1:1000 5％BSA；兔抗-PTEN抗体(Cell Signaling,#9559)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-PTEN(Ser380)抗体(Cell Signaling,#9551)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-PDK1(Ser241)抗体(Cell Signaling,#3438)，1:1000 5％BSA；兔抗-磷酸化-p38(Thr180/Tyr182)抗体(Cell Signaling,#4511)，1:1000 5％BSA；兔抗-p44/42MAPK(Erk1/2)抗体(Cell Signaling,#4695)，1:10005％BSA；兔抗-磷酸化-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)(磷酸化-Erk1/2)抗体(Cell Signaling,#4370)，1:1000 5％BSA；兔抗-β-微管蛋白抗体(Abcam,ab6046)，1:10000 5％BSA；小鼠抗-GAPDH抗体(Santa CruzBiotechnology,sc-32233)，1:1000 5％BSA；小鼠抗-HK2(Abcam,ab104836)，1:1000 5％BSA；小鼠抗-LDHA抗体(Santa Cruz Biotechnology,sc-137243)，1:1000 5％BSA；兔抗-Hif2α抗体(Cell Signaling,#36169)，1:1000 5％BSA；兔抗-MCT1抗体(Santa CruzBiotechnology,sc-365501)，1:1000 5％BSA；兔抗-PKM(Abcam,ab38237)，1:1000 5％BSA；兔抗-PFKL(Abcam,ab37583)，1:1000 5％BSA和小鼠抗-β-肌动蛋白抗体(Santa CruzBiotechnology,#E1314)，1:500 5％牛奶)。在用0.1％吐温20清洗5分钟(两次)和另外15分钟(一次)后，将印迹与各自第二抗体在室温下培育1小时(细胞凋亡抗体采样试剂盒(Apoptosis Antibody Sampler Kit)-Cell Signaling(#9915)：山羊-抗-兔IgG-HRP(7074)和马-抗-小鼠IgG-HRP(7076)第二抗体，1:2000 5％牛奶，Cell Signaling；和兔-抗-大鼠IgG-HRP第二抗体(Abcam,ab6734)，1:30000，5％BSA)。在用TBS/0.1％吐温20清洗5分钟(两次)和另外15分钟(一次)后，通过化学发光WesternBrightTM Sirius试剂盒(Advansta)在ChemiDoc XRS+系统(BioRad)上检测免疫活性条带。通过Quantity One4.6.9进行免疫印迹定量。
在一个实施方式中，实施了通过流式细胞术的细胞周期分布。将MCF-7、Hs578t和786-O细胞接种到6-孔培养平板中。使细胞在18-20小时的一段时间内在完全DMEM(对于MCF-7和Hs578t细胞)和完全RPMI(对于786-O细胞)培养基中贴壁并用IC50浓度的测试化合物或者0.5％DMSO(对照)处理12小时和24小时。每个实验重复三次。收集漂浮和贴壁细胞并通过离心合并，并用冷乙醇(70％)固定。将细胞在PBS中再混悬；在离心和除去上清液后，在含有PBS、PI(50μg/mL,P1304MP,Invitrogen)、RNA酶A(20mg/mL,12091-021,Invitrogen)和Triton X 100的溶液中再混悬。在50℃避光最终培育1小时后，使用FACS LSRII流式细胞仪(BD
)以488nm激发激光器测量PI信号，记录并使用FACS Diva作为采集软件。使用FlowJo 7.6(Tree
)软件分析每个期中的细胞百分比。实施3个独立生物学重复。
在一个实施方式中，将MCF-7、Hs578t和786-O细胞在6-孔培养平板中接种，并使其在18-20小时内在完全DMEM(对于MCF-7和Hs578t细胞)和完全RPMI(对于786-O细胞)培养基中贴壁以通过流式细胞术分析检测细胞凋亡。用IC50浓度的测试化合物或者0.5％DMSO(对照)处理细胞12小时和24小时。每个实验重复三次。收集漂浮和贴壁细胞并通过离心合并。除去上清液，然后添加1mL结合缓冲液。将8μL FITC膜联蛋白V(556419,BD Pharmingen)和30μL PI(50μg/mL,P1304MP,Invitrogen)加入至细胞小粒中。将样品在室温下避光培育15min。将另外200μL结合缓冲液加入至每个样品。使用FACS LSRII流式细胞仪(BD
)以488nm激发激光器测量PI信号。通过488nm闭塞滤波器、具有525nm带通的550nm长通二向色镜(long-pass dichroic)收集膜联蛋白V信号。记录信号并将FACS Diva用作采集软件。使用FlowJo 7.6(Tree
)软件分析每个期中的细胞百分比。实施3个独立生物学重复。
在一个实施方式中，基于使用秀丽隐杆线虫(C.elegans)的食物清除测定，使用Bristol株N2(CGC提供，由NIH Office of Research Infrastructure项目-P40 OD010440资助)测试每个化合物的毒性。在96-孔板上的液体培养中实施测定(Voisine等人2007；Teixeira-Castro等人2015)。每个孔包括下列(最终体积60μL)：约20只处于卵期的虫，OP50细菌至最终OD为0.6-0.8(595nm)，并且每种化合物处于适合的浓度。使虫在180rpm/20℃下，在连续振荡下(Shel lab Si系列培育箱)生长7天，并且每天在酶标仪(Tecan InfiniteM200)上测量吸光度(OD595)。通过大肠杆菌(E.coli)食物混悬液消耗速率监测化合物对秀丽隐杆线虫(C.elegans)生理学的影响(图14)。如下所示，通过“卵制备(egg prep)”获得了年龄-同步的虫卵：将成虫用碱性次氯酸盐溶液(20％漂白剂，25％1M NaOH)处理6分钟，然后离心并在M9缓冲液中清洗2次。然后，将卵小粒在S-培养基中再混悬以获得适合的卵浓度，然后转移至96-孔板。通过4次冻融循环，使培养物失活过夜(37℃，180rpm，Luria肉汤培养基)来制备OP50细菌。在使用前，将OP50在补充的S-培养基(胆固醇、链霉素、青霉素和制霉菌素)中再混悬。将化合物在100％DMSO(Sigma)中制备并稀释直至1％DMSO的测试浓度以防止溶剂毒性。对于每个化合物，除由于溶解度问题的MC369(75-10μM)外，测试了几个浓度(150-10μM)。
对于每种化合物，使用了几个浓度并且计算了第3-5天的相应的OD595消耗速率(斜率)。在两个独立实验中，在96孔板中生长的虫中测试了化合物(PlateLayout.xls,Supporting Information)。对于统计分析，将来自两个实验的数据混合在一起并且使用IBM SPSS来应用ANOVA(平均值的齐次性的Brown-Forsythe稳健检验)，然后进行Games-Howell事后检验，从而将用于每个化合物的不同浓度和5％DMSO(wt/v)与对照(1％DMSO(wt/v))相比较。
在一个实施方式中，每天对C57/Bl6雌性和雄性小鼠(n＝3/组/性别)腹膜内注射MC408(3mg/Kg)或者媒介物(盐水、Tween80和甲基纤维素)，注射7天，以确定小鼠模型中化合物的毒性。每天实施一系列评价小鼠福利的测试。在第一药物施用后立即，对动物录象并记录MC408的即刻效果。记录垂直移动次数和不活动时间。通过在第一天在动物的饲养笼中添加固定量的食物和水，并且在第7天测量剩余的量来评价7天实验期间的水和食物摄入。每天在动态小鼠量表中评价体重。分析水平和垂直活动以评价动物的固有探索行为；分别对这些在具有标记的正方形的开放场地中测量1分钟，并且在观察罐中测量5分钟。此外，作为焦虑的量度，在动物实施每天行为评价规程的同时，还对粪便丸数目计数。实验员应用了与动物福利更相关的一系列测试，包括下列的测量：(i)身体姿势和弯曲；(ii)自发性活动；(iii)呼吸率；(iv)眼睑打开和反射；(v)抠抓皮肤以分析脱水；(vi)打扮；(vii)毛皮直立；(viii)震颤；(ix)四肢抱紧和(x)对转移的反应。在第7天，将动物安乐死。将所有动物深度麻醉(氯胺酮盐酸盐(150mg/kg)和美托咪定(0.3mg/kg))并用盐溶液(NaCl0.9％(wt/v))心脏灌注。从腔静脉收集血液，以13.000rpm离心10分钟并将血浆转移至新管中，并在-80℃储存直至使用标准技术进一步处理用于酶促肝功能测量。收获器官(肾、肠、胃、脑、肝、卵巢/睾丸)并置于含有4％多聚甲醛的管中，并进一步处理用于石蜡包埋和病理学分析。
在一个实施方式中，实施CAM测定。将鸡的受精卵在37℃培育，并在发育第3天，在刺穿空气室后，对蛋壳开窗。用BTK胶带密封所述窗并返回培育箱。在发育第9天，将Hs578t细胞(2×106个细胞)或者786-O细胞(3.5×106个细胞)以及Matrigel(10μL)置于CAM上，从而允许肿瘤形成并轻敲卵并使卵返回培育箱。在发育第14天，对肿瘤拍照。处理组接受20μL2×IC50浓度的处于完全DMEM(对于Hs578t细胞)或完全RPMI(对于786-O细胞)培养基中的MC408或MC421并且对照接受20μL在完全DMEM或RPMI中的0.5％DMSO；将这些添加到所形成的肿瘤上方。在处理72小时(发育第17天)后，再次对肿瘤卵内拍照。在-80℃对鸡胚胎处死10分钟，并且在再次卵外拍照前，用4％的多聚甲醛固定单独的CAM。
在一个实施方式中，用0.6×106个MDA-MB-231乳腺癌细胞和matrigel(比值1:1)的混合物在乳房脂肪垫中对NSG(NOD Scid Gamma)雌性小鼠(3-6个月)进行注射。将小鼠随机分配至处理组(至少6只小鼠/组)，其在使用3个独立剂量的化合物MC408(剂量1＝3mg/kg，剂量2＝10mg/kg和剂量3＝50mg/kg)或媒介物(PBS 1×和Matrigel，比值1:1)植入后3天开始，并且每天施用，共计7天。将小鼠维持在标准实验室条件下。测量动物肿瘤尺寸(通过测量两个最大侧边并应用公式：v＝3.14×L1×L1×L2/6计算；L1是最大侧边，并且L2是另一个)并定期记录。在植入后第47天，将动物处死并切下肿瘤。根据实验室动物保护和使用指南(欧洲指令2010/63/EU)实施所有动物程序。
在一个实施方式中，使用硅胶60板(Macherey-Nagel)，以0.2mm和荧光指示剂，通过薄层色谱法(TLC)监测所有化合物的反应。将具有254nm灯的UV室(CN-6Vilber Lourmat)用于它们的显示。使用来自MN Kieselgel60(230ASTM)的硅胶(粒径<0.063mm)进行干法快速色谱法。对于使用温度的反应，根据具体程序，使用适合的磁力搅拌并在不同温度下使用电炉搅拌器IKAMAG RCT。将溶剂在具有真空度和不同的浴温度的Buchi RE 11旋转蒸发器中蒸发。在25℃并且使用氘化二甲亚砜(DMSO-d6)作为溶剂，在Bruker Avance III(对于1HNMR以400MHz并且对于13C NMR以100MHz)获得NMR光谱。使用残余溶剂峰作为内标，以百万分之一(ppm)记录化学位移。使用石蜡糊和NaCl池(NaCl cell)，在FT-IR Bomem MB 104中记录IR光谱。在Stuart SMP3设备中确定熔点并且不进行修正。
在LECO CHNS-932仪上实施元素分析。
可以通过上述方法合成2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)和苯并吡喃衍生物M1159、M955、M1220、M1221和M1143。
在一个实施方式中，实施了3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)的合成。将浓HCl(1.1当量)加入至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)(0.150mg；0.79mmol)在1mL CH3CN中的橙色溶液中。观察到直接的沉淀，并且将反应混合物在室温下搅拌10-15分钟。通过简单过滤分离橙色固体并鉴定为3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)。橙色固体；得率91％；mp＞300℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)
3.93(s,3H),7.12-7.15(m,2H),7.18(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.32(t,J＝8.0Hz,1H),11.48(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)56.02,110.13,113.52,117.42,122.21,126.39,130.57,135.33,146.55,161.15；IR(石蜡糊)
3322,3192,1678,1654,1600,1576,1552,1460cm-1；C10H11N2O2Cl.0.2H2O的理论值：C,52.16；H,4.96；N,12.17。实验值：C,52.06；H,4.77；N,12.40。
在一个实施方式中，合成了苯并吡喃并[2,3-d]咪唑。将醛(1)(1.1-1.7当量)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.25-0.35mmol)在CH3CN(1-2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌24-48小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。
在一个实施方式中，合成了2-(4-氟苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC409)。将4-氟苯甲醛(1)(0.0375mg；0.30mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.047mg；0.21mmol)在CH3CN(1.6mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌32小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率98％；mp191-192℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.12(s,2H),6.94(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),6.86(dd,J＝7.4,1.8Hz,1H),7.00(t,J＝7.8Hz,1H),7.25-7.32(m,2H),7.86-7.92(m,2H),12.44(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.64,55.75,103.64,110.48,115.77(J＝21.7Hz),119.31,121.82,122.59,126.29(J＝8.3Hz),127.19(J＝3.2Hz),138.88,141.25,148.19,148.38,161.78(J＝243.4Hz)；IR(石蜡糊)3348,1700,1650,1608,1578,1538,1500,1461cm-1；C17H13N2O2F的理论值：C,68.91；H,4.42；N,9.45。实验值：C,68.89；H,4.65；N,9.56。
在一个实施方式中，合成了2-(4-溴苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC408)。将4-溴苯甲醛(0.0737mg；0.40mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0758mg；0.34mmol)在CH3CN(2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌24小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M；2mL)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。黄色固体；得率99％；mp 215-217℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.11(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.94(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.01(t,J＝8.0Hz,1H),7.63(dd,J＝6.8,2.0Hz,2H),7.80(dd,J＝6.8,2.0Hz,2H),12.62(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.61,55.77,104.40,110.54,119.25,120.87,121.81,122.70,126.15(2C),129.53,131.76(3C),138.51,141.16,148.36；IR(石蜡糊)
3435,1717,1639,1603,1576,1536,1463cm-1；C17H13N2O2Br.1.9H2O的理论值：C,52.12；H,4.29；N,7.15。实验值：C,52.12；H,3.93；N,7.37。
在一个实施方式中，合成了2-(2-氟苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC407)。将2-氟苯甲醛(0.0389mg；0.31mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0571mg；0.25mmol)在CH3CN(2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌24小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率82％；mp102-103℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.10(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,2.4Hz,1H),6.94(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),7.00(t,J＝8.0Hz,1H),7.26-7.40(m,3H),7.95(td,J＝8.0,1.6Hz,1H),12.09(s,1H)；13CNMR(75MHz,DMSO-d6)23.93,55.79,104.61,110.54,116.22(J＝16.1Hz),118.22(J＝8.6Hz),119.44,121.85,122.67,124.94(J＝2.3Hz),128.20(J＝2.2Hz),129.61(J＝6.2Hz),134.50,141.24,148.15,148.38,158.53(J＝184.5Hz)；IR(石蜡糊)3426,1710,1631,1603,1576,1536,1463cm-1；C17H13N2O2F1.1H2O的理论值：C,64.60；H,4.46；N,8.87。实验值：C,64.36；H,4.46；N,8.91。
在一个实施方式中，合成了2-(3-氟苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC349)。将3-氟苯甲醛(0.0482mg；0.39mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0712mg；0.31mmol)在CH3CN(1mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌33小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率100％；mp198-200℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.12(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.94(dd,J＝8.0,1.2Hz,1H),7.00(t,J＝8.6Hz,1H),7.13(td,J＝8.6,2.8Hz,1H),7.44-7.51(m,1H),7.73(dt,J＝10.4,2.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.6Hz,1H),12.58(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.60,55.79,104.46,110.56,110.68(J＝18.4Hz),114.43(J＝15.8Hz),119.24,120.23(J＝1.8Hz),121.81,122.68,130.95(J＝6.4Hz),132.78(J＝6.4Hz),138.39(J＝2.3Hz),141.21,148.31,148.38,162.52(J＝180.8Hz)；IR(石蜡糊)3356,1707,1652,1628,1522,1508,1461cm-1；C17H13N2O2F的理论值：C,68.91；H,4.42；N,9.45。实验值：C,68.98；H,4.58；N,9.66。
在一个实施方式中，合成了2-(4-氯苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC412)。将4-氯苯甲醛(0.0291mg；0.21mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0417mg；0.18mmol)在CH3CN(1mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌24小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率100％；mp212-214℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.12(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.94(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),7.00(t,J＝8.0Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,2H),7.86(d,J＝8.4Hz,2H),12.53(s,1H)；13CNMR(75MHz,DMSO-d6)23.62,55.76,104.18,110.52,119.25,121.80,122.62,125.84(2C),128.84(2C),129.36,132.18,138.55,141.22,148.31,148.36；IR(石蜡糊)3352,1700,1656,1601,1532,1489,1462cm-1；C17H13N2O2Cl的理论值：C,65.29；H,4.19；N,8.96。实验值：C,65.47；H,4.23；N,8.74。
在一个实施方式中，合成了5-甲氧基-2-苯基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC350)。将苯甲醛(0.0520mg；0.49mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0653mg；0.29mmol)在CH3CN(1mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌33小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。米色固体；得率99％；mp 162-162℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.83(s,3H),4.12(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.94(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.00(t,J＝8.0Hz,1H),7.31(t,J＝7.6Hz,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,2H),7.86(d,J＝7.8Hz,2H),12.43(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.68,55.77,110.50,119.33,121.83,122.56,124.20(2C),127.77,128.75(2C),130.50,139.62,141.29,148.23,148.38；IR(石蜡糊)
3346,1702,1648,1602,1526,1496,1461cm-1；C17H14N2O2的理论值：C,73.37；H,5.07；N,10.07。实验值：C,73.58；H,5.12；N,10.34。
在一个实施方式中，合成了3-(5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑-2-基)苯酚(MC359)。将3-羟基苯甲醛(0.0427mg；0.35mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0679mg；0.30mmol)在CH3CN(1.2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌28小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。浅绿色固体；得率94％；mp 162-164℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.82(s,3H),4.10(s,2H),6.71(dq,J＝8.2,1.2Hz,1H),6.85(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.92(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),7.00(t,J＝7.6Hz,1H),7.21(t,J＝7.6Hz,2H),7.27-7.30(m,2H),9.55(s,1H),12.33(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.70,55.75,110.47,111.23,114.99,115.07,119.36,121.84,122.54,129.74,131.77,139.76,141.30,148.10,148.37,157.62；IR(石蜡糊)3351,3218,1702,1659,1611,1523,1507,1460cm-1；C17H14N2O3的理论值：C,69.38；H,4.79；N,9.52。实验值：C,69.42；H,4.88；N,9.56。
在一个实施方式中，合成了4-(5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑-2-基)苯酚(MC413)。将4-羟基苯甲醛(0.0388mg；0.32mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0579mg；0.26mmol)在CH3CN(2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌48小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。黄色固体；得率64％；mp 245-246℃；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),4.09(s,2H),6.81(dd,J＝6.8,2.0Hz,2H),6.85(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.92(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),6.99(t,J＝8.0Hz,1H),7.68(dd,J＝6.8,2.0Hz,2H),9.63(s,1H),12.11(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.76,55.75,102.26,110.43,115.48(2C),119.45,121.86(2C),122.45,125.88(2C),140.34,141.36,147.86,148.37,157.44；IR(石蜡糊)3338,3246,1706,1645,1612,1548,1503,1463cm-1；C17H14N2O3的理论值：C,69.38；H,4.79；N,9.52。实验值：C,69.39；H,4.42；N,9.54。
在一个实施方式中，合成了5-甲氧基-2-(2-甲氧基苯基)-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC411)。将2-甲氧苯甲醛(0.0632mg；0.46mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0780mg；0.34mmol)在CH3CN(1mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌47小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。黄色固体；得率85％；mp188-190℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),3.95(s,3H),4.10(s,2H),6.86(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),6.93(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),6.97-7.04(m,2H),7.13(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),7.30(td,J＝7.7,2.0Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),11.63(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)
24.30,55.50,55.78,103.05,110.47,111.72,118.44,119.67,120.78,121.91,122.51,127.39,128.95,137.14,141.34,147.76,148.38,155.59；IR(石蜡糊)
3340,1706,1659,1594,1530,1506,1460cm-1；C18H16N2O3的理论值：C,70.12；H,5.23；N,9.09。实验值：C,70.44；H,5.20；N,9.16。
在一个实施方式中，合成了2,4-二氟-6-(5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑-2-基)苯酚(MC410)。将2,4-二氟-6-羟基苯甲醛(0.0493mg；0.31mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.061mg；0.27mmol)在CH3CN(2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌36小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。黄色固体；得率49％；mp260-262℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.83(s,3H),4.15(s,2H),6.87(dd,J＝7.6,2.4Hz,1H),6.96(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),7.04(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(td,J＝10.0,1.6Hz,1H),7.51(dt,J＝10.0,1.6Hz,1H),11.91(s,1H),12.90(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.28,55.70,104.31(dd,J＝20.6,16.5Hz),104.39,105.38(dd,J＝18.8,4.5Hz),110.59,115.36(dd,J＝7.9,4.5Hz),119.03,121.71,123.14,137.71-137.79(m),140.30(J＝10.2,4.5Hz),140.68,145.62,148.29,150.80(dd,J＝181.9,10.0),153.9(dd,J＝175.9,8.8)；IR(石蜡糊)3348,3225,1698,1651,1601,1542,1461cm-1；C17H12N2O3F20.8H2O的理论值：C,59.23；H,3.72；N,8.13。实验值：C,59.13；H,3.53；N,8.42。
在一个实施方式中，合成了2-(4-乙氧苯基)-5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC415)。将4-乙氧基苯甲醛(0.0403mg；0.30mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0614mg；0.27mmol)在CH3CN(2mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌47小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。黄色固体；得率96％；mp215-217℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)1.20(t,J＝7.6Hz,3H),2.62(q,J＝7.6Hz,2H),3.84(s,3H),4.12(s,2H),6.87(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),6.94(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),7.01(t,J＝7.6Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,2H),7.79(dd,J＝6.6,1.6Hz,2H),12.36(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)
15.43,23.73,27.94,55.80,103.30,110.52,119.41,121.87,122.59,124.33(2C),128.08,128.16(2C),139.87,141.33,143.60,148.40；IR(石蜡糊)
3342,1703,1656,1610,1539,1502,1460cm-1；C19H18N2O3的理论值：C,70.81；H,5.59；N,8.70。实验值：C,70.74；H,5.67；N,8.77。
在一个实施方式中，合成了2-溴-6-甲氧基-3-(5-甲氧基-3,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑-2-基)苯酚(MC416)。将2-溴-3-羟基-4-甲氧基苯甲醛(0.0780mg；0.34mmol)加入至3-氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-2-氯化亚铵(5)(0.0607mg；0.27mmol)在CH3CN(1mL)中的混悬液中，并将所述混悬液在60℃搅拌46小时。过滤固体，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。当在1H NMR光谱中观察到HCl污染时，用NaHCO3(0.05M)的水溶液清洗所述固体，过滤并用水清洗，从而导致产生了纯产物。米色固体；得率71％；mp 160-161℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.82(s,3H),3.86(s,3H),4.08(s,2H),6.85(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.93(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),6.99(t,J＝8.0Hz,1H),7.03-7.08(m,2H),9.55(s,1H),11.97(s,1H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)23.82,55.74,56.23,102.75,109.30,110.43,110.54,119.46,121.38,121.84,122.46,125.26,139.04,141.33,144.05,147.52,148.29,148.37；IR(石蜡糊)3338,3212,1703,1647,1535,1497,1461cm-1；C18H15N2O4Br1.8H2O的理论值：C,49.61；H,3.86；N,6.43。实验值：C,49.68；H,3.91；N,6.43。
在一个实施方式中，合成了5,5'-二甲氧-2,2'-二苯基-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑。将醛(1)(1-1.2当量)加入至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)在CH3CN(1-2mL)中的溶液中，并将所述溶液在80℃搅拌7-24小时。固体产物开始缓慢沉淀，过滤，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物8。
在一个实施方式中，合成了2,2'-双(4-氟苯基)-5,5'-二甲氧-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC406)。将4-氟苯甲醛(0.0629mg；0.51mmol)加入至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)(0.0962mg；0.51mmol)在CH3CN(1mL)中的溶液中，并将所述溶液在80℃搅拌7小时。固体产物开始缓慢沉淀，过滤，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率18％；mp 272-274℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.68(s,6H),4.89(s,2H),5.80(dd,J＝7.8,2.0Hz,2H),6.71(t,J＝7.8Hz,2H),6.80(dd,J＝8.7,1.6Hz,2H),7.32-7.49(m,4H),7.98-8.03(m,4H),12.57(s,2H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)41.21,55.64,105.81,111.00,115.83(2C,J＝21.2),119.62,120.44,122.01,126.80(2C,J＝8.0),127.12,139.98,141.90,147.62,150.12,162.00(J＝243.8)；IR(石蜡糊)3348,1700,1650,1608,1538,1500,1461cm-1；C34H24N4O4F21.2H2O的理论值：C,64.23；H,4.85；N,8.82。实验值：C,64.21；H,4.79；N,8.80。
在一个实施方式中，合成了2,2'-双(4-溴苯基)-5,5'-二甲氧-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC421)。将4-溴苯甲醛(0.069mg；0.37mmol)加入至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)(0.0705mg；0.37mmol)在CH3CN(1.5mL)中的溶液中，并将所述溶液在80℃搅拌8小时。固体产物开始缓慢沉淀，过滤，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率32％；mp 266-268℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.68(s,6H),4.89(s,2H),5.78(dd,J＝7.8,1.6Hz,2H),6.71(t,J＝7.8Hz,2H),6.80(dd,J＝8.2,2.0Hz,2H),7.71(dd,J＝6.6,1.4Hz,2H),7.91(dd,J＝6.9,1.6Hz,2H),12.69(s,2H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)41.24,55.65,106.33,111.06,119.52,120.41,121.14,122.06,126.58,129.65,131.80,139.70,141.86,147.62,150.25；IR(石蜡糊)3352,1703,1654,1610,1543,1508,1461cm-1；C34H24N4O4Br2的理论值：C,57.32；H,3.40；N,7.86。实验值：C,57.78；H,3.37；N,7.88。
在一个实施方式中，合成了2,2'-双(2-氟苯基)-5,5'-二甲氧-1,1',9,9'-四氢-9,9'-二苯并吡喃并[2,3-d]咪唑(MC369)。将2-氟苯甲醛(0.0446mg；0.36mmol)加入至2-亚氨基-8-甲氧基-2H-苯并吡喃-3-胺(4)(0.0590mg；0.31mmol)在CH3CN(2mL)中的溶液中，并将所述溶液在80℃搅拌24小时。固体产物开始缓慢沉淀，过滤，用CH3CN清洗并鉴定为纯产物。米色固体；得率15％；mp 276-278℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)3.69(s,6H),5.00(s,2H),5.91(dd,J＝8.0,1.2Hz,2H),6.75(t,J＝8.0Hz,2H),6.82(dd,J＝8.2,1.6Hz,2H),7.31-7.48(m,6H),7.99(td,J＝5.7,1.6Hz,2H),11.88(s,2H)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)41.08,55.65,106.63,110.99,116.28(J＝21.3),118.24(J＝11.4),120.02,120.45,122.06,124.98,128.60(J＝2.8),129.98(J＝8.2),135.58,141.90,147.62,149.93,158.73(J＝246.6)；IR(石蜡糊)3438,3447,1637,1575,1614,1575,1530,1469cm-1；C34H24N4O4F2.0.8H2O的理论值：C,67.51；H,4.23；N,9.26。实验值：C,67.58；H,4.30；N,9.11。
每当在本文档中使用时，术语“包含”旨在表示所提及的特征、整数、步骤、组件的存在，但是不排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组件或它们的组的存在或添加。
本领域那些技术人员将理解除非本文另外说明，否则所描述的步骤的具体顺序仅是说明性的并且可以在不背离本发明的情况下改变。因此，除非另作说明，否则所描述的步骤是无序的，从而表示当可能时，可以以任何方便或所期望的顺序实施所述步骤。
如果未具体排除，则当在说明书或权利要求中使用元素或特征的单数形式时，还包括复数形式，并且反之亦然。例如，术语“一种化合物”或“所述化合物”还包括复数形式“多种化合物”或“所述多种化合物”，反之亦然。除非有相反的说明或者另外根据上下文显而易见，否则在权利要求中，冠词如“一个”和“所述”可以表示一种或不止一种。除非有相反的说明或者另外根据上下文显而易见，否则如果在给定产品或方法中存在，使用或另外与之相关了一个、大于一个或全部组成员，则认为在组中的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述是满足的。本发明包括其中正好一个组成员存在于、使用于给定产品或方法中或者另外与之相关的实施方式。本发明还包括其中大于一个或者全部组成员存在于、使用于给定产品或方法中或者另外与之相关的实施方式。
此外，应理解本发明涵盖了其中将来自一项或多项权利要求或者来自描述的相关部分的一个或多个限制、元素、条款和描述性术语等引入另一项权利要求的所有改变、组合和排列。例如，可以改变依赖于另一项权利要求的任何权利要求以包括依赖于相同基础权利要求的任何其它权利要求中所存在的一个或多个限制。
此外，当权利要求列举组合物时，应理解除非另外说明或者除非对于本领域的技术人员来说明显将出现矛盾或不一致，否则将包括出于本文所公开的任何目的使用组合物的方法，并且包括根据本文所公开的制备方法或者本领域中已知的其它方法制备组合物的方法。
当给出范围时，包括端点。此外，应理解除非另外说明或另外根据上下文和/或本领域的技术人员的理解显而易见，否则作为范围表示的值可以在本发明的不同实施方式中所述的范围内采取任何具体值，除非上下文另外明确规定，否则至所述范围下限单位的十分之一。还应理解除非另外说明或另外根据上下文和/或本领域的技术人员的理解显而易见，否则作为范围表示的值可以采取给定范围内的任何子范围，其中将子范围的端点表示为与所述范围下限单位的十分之一相同的准确度。
本发明不应以任何方式视为受限于所描述的实施方式，并且本领域技术人员将预见对其修改的多种可能性。
上述实施方式是可组合的。
参考文献
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Claims (25)
1.一种用于医学或兽医的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其包含以下化学式：
其中
R1、R2和R3独立于彼此选择；
R1选自芳基或杂环；
R2选自H、烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基、胺、羰基或杂环；
R3选自H或
条件是不包括
2.根据前述权利要求所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中
R1为芳基；
R2选自H、烷基、烷氧基、卤素、羟基或者胺。
3.根据前述权利要求所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中所述二聚体优选地为同型二聚体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1是取代的芳基，优选地取代的苯基。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1选自以下列表：羟苯基、羟基-甲氧基苯基、羟基-溴苯基、羟基-氯苯基、氟苯基、溴苯基、24-氯苯基、苯基、甲氧基苯基、二氟-羟苯基、乙氧苯基或溴-羟基-甲氧基苯基。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R1为2-羟苯基、2-羟基-3-甲氧基苯基、2-羟基-5-甲氧基苯基、2-羟基-5-溴苯基、2-羟基-5-氯苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氯苯基、苯基、3-羟苯基、2-羟苯基、2-甲氧基苯基、3,5-二氟-2-羟苯基、4-乙氧苯基或者2-溴-3-羟基-4-甲氧基苯基。
7.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R2是取代的或未取代的芳基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R2选自以下列表：H、5-甲氧基、7-甲氧基、7-溴代、7-氯代或7-氟代。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R3是苯并吡喃单元或H。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中R3选自以下列表：H、2-(4-氟苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元、2-(4-溴苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元或者2-(2-氟苯基)-5-甲氧基-1,9-二氢苯并吡喃并[2,3-d]咪唑单元。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物或药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、N-氧化物、立体异构体、非对映异构体、对映异构体、阻转异构体、二聚体或多晶型物，其中所述化合物选自以下列表：
12.用于医学或兽医的根据前述权利要求2-11中任一项所述的化合物。
13.用于以良性或恶性细胞增生或者以新血管形成或过度血管形成区域或者癌症为特征的疾病的治疗、疗法或诊断的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
14.用于过度增殖组织或瘤形成的治疗、疗法或诊断的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
15.用于乳腺癌、肾细胞癌、白血病、神经胶质瘤或成胶质细胞瘤的治疗、疗法或诊断的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
16.用于肾细胞癌、白血病、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌的治疗、疗法或诊断的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
17.用于三阴性乳腺癌、急性肾细胞癌、管腔乳腺癌、基底细胞样乳腺癌、急性白血病的治疗、疗法或诊断的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
18.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物中的至少一种。
19.根据前述权利要求所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
20.根据前述权利要求19-20中任一项所述的药物组合物，还包含抗病毒剂、止痛剂、抗炎剂、化疗剂、放疗剂、抗真菌剂、驱寄生虫剂、抗生素、利尿剂或其混合物。
21.根据前述权利要求19-21中任一项所述的药物组合物，还包含填充剂、粘结剂、崩解剂或润滑剂或其混合物。
22.用于皮内、局部、全身、透皮疗法、静脉内疗法或它们的组合的根据前述权利要求19-22中任一项所述的药物组合物。
23.一种纳米颗粒，其包含如权利要求1-18所述的化合物和/或如权利要求19-23所述的药物组合物。
24.根据前述权利要求所述的纳米颗粒，其中通过所述纳米颗粒包封所述化合物。
25.一种试剂盒，其包含如权利要求1-18所述的化合物和/或如权利要求19-23所述的药物组合物。
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