CN103957923B - 用于抑制包括癌干细胞在内的干细胞的增殖、发育或分化的hs.459642单基因簇产物的拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于抑制所需患者中的干细胞和癌干细胞的增殖、分化或发育的方法和组合物。所述方法包括向患者施用治疗有效量的Hs.459642单基因簇产物的拮抗剂，例如CACNA1H抑制剂。所述组合物包含Hs.459642单基因簇产物的拮抗剂，例如CACNA1H抑制剂。本公开还提供具体的拮抗剂例如抗体和反义寡核苷酸，以及其与一种或多种另外的抗癌剂的组合治疗。此类方法、拮抗剂和组合物可用于例如癌症治疗。

Description

用于抑制包括癌干细胞在内的干细胞的增殖、发育或分化的 HS.459642单基因簇产物的拮抗剂
背景技术
干细胞是具有广泛的增殖潜能的未分化的细胞，可分化成多种细胞系，并在移植时重建(repopulate)为组织。干细胞可产生更多的祖细胞，这些祖细胞具有产生大量母细胞的能力，母细胞可进而产生分化的或可分化的子细胞。典型的干细胞是胚胎干细胞，因其具有无限的自我更新和多能分化潜能(Orkin,Int.J.Dev.Biol.42:927-34,1998；Reubinoff等人,Nat Biotech.18:399404,2000；Shamblott等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:13726-31,1998；Thomson等人,Science282:114-7,1998；Thomson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:7844-8,1995；Williams等人,Nature336:684-7,1988)。
与干细胞类似，癌细胞具有广泛的增殖能力。然而，与以受控方式应答外部因素的干细胞不同的是，癌细胞不是适当地应答外部因素，而且显示不受控的增殖。近期的发现表明，肿瘤形成和生长受到称为癌干细胞(CSC)的癌细胞亚群的驱动，所述癌干细胞具有定殖与产生原发性和继发性肿瘤的能力。微小RNA的研究揭示了CSC和胚胎干细胞之间的多种相似性，包括自我更新和多潜能的遗传调控(Mallick B,等人,RNA Biol8:3,2011)。多种癌症中的证据显示，在普通干细胞功能中居主导地位的通路，例如Wnt、Notch、Shh(音猬因子(sonic hedgehog))和XIAP(细胞凋亡蛋白的伴X染色体的抑制剂)在CSC中变得失调(Reya等人,Nature414:105,2001；Dontu G等人,Breast Cancer Res6:R605,2004；Rosner AK等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:15853；Yang LZ等人,Cancer Res63:6815,2003；LiuS等人,Breast Cancer Res7:86,2005；Mikaelian I等人,Breast Cancer Res6:R668,2004)。
CSC还称为肿瘤起始细胞(tumor initiating cell)、癌干样细胞(cancer stem-like cells)、癌干细胞样细胞、高致瘤性细胞或超级恶性细胞。癌干细胞可为肿瘤的生成细胞(即，其为包含肿瘤块(tumor bulk)的癌细胞的祖先)。CSC与其它肿瘤细胞的区别在于，当少量移植于实验动物中时它们具有成功定殖新肿瘤的能力。相反，非CSC细胞即使在大量移植时也不能起动体内肿瘤生长(Dalerba等人,Annu.Rev.Med.58:267-284,2007)。因此，CSC对致癌、癌转移和癌复发的贡献显著。
癌干细胞包含肿瘤的特有亚群(通常为0.1-10％左右，但多达0.1至20％以上)，该特有亚群相对于其余90％左右的肿瘤(即，肿瘤块)致瘤性更高，生长相对更缓慢或静止，并且通常比肿瘤块相对更耐化学性。如果将常规的治疗和方案通常设计为快速攻击增殖细胞(即，包含肿瘤块的那些癌细胞)，则对于常规治疗和方案，癌干细胞比生长较快的肿瘤细胞更具抗性。癌干细胞可表达同样使其更加抗化学性的其它特性，例如抗多药耐药性、较高的DNA修复能力和提高的抗凋亡活性。这些属性构成了使确保大多数晚期癌症患者长期受益的标准肿瘤治疗方案失败的关键原因，即，无法充分靶向和消灭癌干细胞。
癌症治疗的效力通常由它们消灭的瘤体(tumor mass)量来测量。由于CSC通常形成很少量的肿瘤并具有与其分化的后代显著不同的生物学特性，瘤体的测量可不必选择对干细胞特异性作用的药物。换言之，常规的化学治疗消灭分化的或正在分化的细胞，这些细胞形成不能够产生新细胞的肿瘤块。产生肿瘤的癌干细胞群可保持原样，并引起疾病的复发。此外，利用化学治疗剂的治疗可仅留下化学治疗抗性的癌干细胞，以致于随后产生的肿瘤将很可能还对化学治疗和放射治疗产生抗性。
由于存活的癌干细胞可重建肿瘤并引起再发，通过靶向癌干细胞可以治疗患有侵袭性、非切除性肿瘤和难治或复发癌症的患者，以及防止肿瘤转移和复发。靶向癌干细胞和癌干样细胞的治疗显示出作为癌症治疗的潜力。因此，靶向癌干细胞的特定治疗的开发有望改善癌症患者、特别是转移瘤疾病的患者的存活和生活质量。即使在手术、化学治疗、放射、小分子和抗体治疗(所有这些都使肿瘤缩小，但不消除不死的肿瘤细胞)后，复发和转移瘤的高发凸显了鉴定特异性靶向和消灭癌干细胞以消除复发和转移瘤疾病的新治疗策略的要求。
发明内容
本公开提供用于抑制干细胞和癌干细胞的增殖、分化或发育的方法和药理学组合物。所述组合物包含Hs.459642单基因簇产物的拮抗剂。所述方法涉及向患者施用治疗有效量的Hs.459642单基因簇产物的拮抗剂。在优选的实施方案中，拮抗剂为Hs.459642单基因簇产物CACNA1H的抑制剂。本公开还提供特定的拮抗剂，例如抗体和反义寡核苷酸。此类方法、拮抗剂和组合物可例如在癌症治疗中使用。
本公开还提供与另外的抗癌剂的组合治疗。另外的抗癌治疗可包括，但不限于，手术、放射治疗或施用化学治疗剂。组合治疗可为交错治疗，其中向患者提供本发明的组合物，接下来提供随后的抗癌治疗。可选地，组合治疗可涉及同时或交叠(overlapping)施用本发明的组合物和另外的抗癌治疗。
Hs.459642单基因簇产物的拮抗剂可为Hs.459642单基因簇产物特异性抗体。抗体可为多克隆的或单克隆的，且可完全或部分人源化。在具体实例中，抗体为CACNA1H特异性抗体。拮抗剂还可为抑制Hs.459642单基因簇产物如CACNA1H的反义寡核苷酸。
附图说明
图1.CACNA1H的发育表达。CACNA1H在类胚体、囊胚、胎儿、青少年人和成人组织中表达。最右列显示分子中的CACNA1H EST数，假定池(pool)中的EST总数为分母。中间列为标准化为1,000,000池大小的CACNA1H标签数。
图2.CACNA1G的发育表达。CACNA1G在胎儿和成人组织中表达。最右列显示分子中的CACNA1G EST数，假定池中的EST总数为分母。中间列为标准化为1,000,000池大小的CACNA1G标签数。
图3.CACNA1I的发育表达。CACNA1I在囊胚、胎儿、青少年和成人组织中表达。最右列显示分子中的CACNA1I EST数，假定池中的EST总数为分母。中间列为标准化为1,000,000池大小的CACNA1I标签数。
图4.咪拉地尔(mibefradil,Mi)对于使胶质瘤干细胞(GSC)对替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)敏感的效果。GSC以50,000个细胞/孔接种在24孔板过夜。它们在37℃C下，在5％CO2、95％O2中，在增补有人重组EGF和bFGF(R&DSystems)的无血清neurobasal培养基(Invitrogen)中生长。用T型钙通道阻断剂咪拉地尔(30nM)处理细胞24小时，洗涤，然后用替莫唑胺(5μM)处理24小时。将试剂阿尔玛蓝(Invitrogen)添加到各孔以达到各孔中阿尔玛终浓度为10％，并根据制造商说明书确定荧光强度。将平板温育1-2小时并将100μl的上清液转移至96孔板用于阿尔玛读数。
图5.TTL-1177(TTL)对于使GSC对替莫唑胺(TMZ)敏感的效果。使用与图4相同的方法接种GSC。用T型钙通道阻断剂TTL-1177(30μM)处理细胞24小时，然后用替莫唑胺(5μM)处理24小时。如图4所述使用阿尔玛分析来测试细胞。
具体实施方式
本公开提出了通过抑制Hs.459642单基因簇的产物来靶向癌干细胞(CSC)和癌干样细胞的癌症治疗。本公开进一步提出了治疗癌症的方法，所述方法包括施用组合治疗以靶向肿瘤中的CSC和非CSC细胞，因而治疗多种癌细胞类型并建立更有效的治疗方案。抑制Hs.459642单基因簇的产物对于防止癌细胞和所有类型干细胞(包括，但不限于胚胎干细胞、成体干细胞、癌干细胞和癌干样细胞)的增殖、生长和发育有用。
本发明涉及发现了Hs.459642单基因簇的一种或多种产物存在于CSC中。本发明提供抑制能表达CSC的肿瘤生长的方法。所述方法包括以抑制CSC生长的有效量向个体施用包含Hs.459642单基因簇产物抑制剂的组合物。另外还提供用于抑制个体中癌细胞转移的方法，其中所述癌细胞包含Hs.459642单基因簇的一种或多种产物。所述方法包括向个体施用一定量的包含Hs.459642单基因簇产物抑制剂的试剂以有效抑制转移。
智人(Hs.)459642单基因簇位于人16号染色体。“单基因簇”表示源自相同转录基因座内的一组转录序列，该转录基因座为基因或表达的假基因。Hs.459642至少包括CaV3.2/CACNA1H(钙通道，压敏，T型，α1H亚单位)及其剪接变体和转录变体(transcriptvariants)以及CaV3.2蛋白(Genbank登录号为NP_006921.2和NM_001005407.1)等。本文所述的“Hs.459642单基因簇产物”或简称“产物”是指由Hs.459642单基因簇基因座产生或表达的任何物质，包括完整或部分核苷酸转录本、完整或部分翻译肽、和未成熟和成熟蛋白质、及它们的片段。
优选的Hs.459642单基因簇产物为CACNA1H钙通道。该Hs.459642产物为H同种型T型钙通道。之前已记载了CaV3.2/CACNA1H参与增殖和分化(Lory P等人,Cell Calcium40:135-46,2006)。
T型钙/Ca2+通道为在小型膜去极化后开放的低电压激活的离子通道。存在三种T型α1钙通道亚单位：α1G、α1H和α1I。Hs.459642单基因簇含有典型的α1H序列。α1为通道离子传导蛋白，其包含四个结构域，每个结构域包含6个跨膜片段。T型钙通道的α1亚单位与其它α1钙通道亚单位不同，可行使独立的复合体的功能。T型Ca2+通道起初在神经元和心肌细胞功能背景下研究，并涉及到兴奋过度疾病如癫痫和心功能障碍。电压门控钙通道在非兴奋性细胞中通常不表达，但有证据表明，T型钙通道在非兴奋性谱系的癌细胞中表达(Taylor JT等人,World J Gastroenterol.14:4984-4991,2008)。
T型Ca2+通道由小型膜去极化激活和失活，并显示缓慢的失活率。因此，在低膜电位下这些通道可传输去极化电流并介导细胞“窗口”电流(“window”currents)，“窗口”电流在低或静止膜电位下发生在激活和稳定状态之间的电压交叠内(Tsien RW,等人In:Low-voltage-activated T-type Ca2+channels,Chester:Adis International Ltd,pp.1–394,1998；Crunelli V,等人,J Physiol.562:121–129,2005)。T型Ca2+通道可在非受激(non-stimulated)或静止膜电位下维持窗口电流，从而允许通过未失活通道的一部分传输持续的钙内向电流(Bean BP,McDonough SI,Neuron20:825–828,1998)。在非受激或静止细胞条件下，窗口电流的介导允许T型Ca2+通道调节放电细胞(electrically firing cells)如神经元和非兴奋性组织二者中的细胞内钙水平。
细胞内钙调节为调节细胞周期转换和凋亡的多种信号传导通路的重要环节。癌细胞能够通过细胞周期和旁路正常钙介导的检验点，表明癌细胞已发展替代机制来调节细胞内钙。癌细胞表达T型钙通道的新证据表明，这些通道在检验点非依赖性细胞周期发展和细胞增殖中起作用(Taylor JT等人,World J Gastroenterol.14:4984-4991,2008)。然而，之前的研究将钙信号传导和T型钙通道表达相联系，并未确定这些独特的钙通道在CSC亚群中存在，也没有在发现中暗示某些癌细胞表达T型钙通道这样的假设。事实上，钙与细胞增殖之间的相关性表明，T型钙通道存在于快速分裂、快速增殖的非癌干细胞中，而不是在癌干细胞中。
发明人已发现，CACNA1H T型钙通道由CSC表达，为防止Hs.459642单基因簇产物的表达和/或活性而设计的治疗，特别是防止CACNA1H和CACNA1H基因座产物的表达和/或活性的治疗可用于靶向癌干细胞以及非癌干细胞，由此治疗更完整的癌细胞谱。Hs.459642单基因簇产物的抑制，特别是CACNA1H和CACNA1H产物的抑制，可防止癌细胞增殖，而且还防止CSC活性，因而减少肿瘤大小和生长，并且还防止恶变、转移和肿瘤复发和再发。Hs.459642单基因簇产物的抑制对于防止不期望的非癌干细胞的增殖和/或活性，例如胚胎或成体干细胞增殖和/或活性也是有用的。
CACNA1H的表达序列标签(ESTs)的发育表达和相对丰度示于图1。图1识别出在类胚体、囊胚和胎儿中以及在青少年人和成人组织中有CACNA1H表达，而在新生儿和婴儿中无表达。标准化为1百万EST的池大小，很明显CACNA1H的表达在类胚体中是高度升高的水平(每百万约56个标签，比该基因在任何其它发育阶段表达的两倍还多)。类胚体是胚胎干细胞的聚集体，并且充分的CACNA1H表达表明在这些细胞中Hs.459642单基因簇活性水平高。干细胞中的高表达水平与CSC中相同产物的表达相关，表明CACNA1H在癌干细胞也是活化的。
CACNA1H EST在类胚体中的充分表达并不是所有T型钙通道亚型的非特异性特征，因为CACNA1G或CACNA1I EST都不在类胚体中表达(图2和3)。因此，相对于其它T型钙通道，CACNA1H对于干细胞活性和癌干细胞活性具有独特的重要性。
本文所使用的术语"干细胞"是指能够分化成若干最终分化的细胞类型的细胞。干细胞可为全能、多能或单能细胞。全能干细胞典型地具有发育成任何细胞类型的能力并通常是胚胎来源的。多能细胞为能够分化成几种不同的最终分化的细胞类型的干细胞系中的典型细胞。单能细胞典型地能够分化成单细胞类型。非胚胎干细胞通常为多能或单能的。单能和多能干细胞可起源于各种组织或器官系统，包括，但不限于血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨、肾脏、肝脏、胰腺和胸腺等。
如本文所述，“肿瘤”细胞或“癌”细胞意指显示不受控的增殖并能够侵袭周围组织的异常细胞。
如本文所述，术语“癌干细胞”或“CSC”或“癌干样细胞”或“CSLC”是指可为高增殖性癌细胞的祖先或产生高增殖性癌细胞的祖先的细胞。癌干细胞具有再生长为肿瘤的能力，这被以下所证实：癌干细胞能够在免疫受损的哺乳动物如小鼠中形成肿瘤，并且在免疫受损的哺乳动物如小鼠的随后连续移殖时典型地形成肿瘤。另外，癌干细胞相对于肿瘤块典型地生长缓慢；即，癌干细胞通常是休眠的。癌干细胞可相当于约0.1-20％的肿瘤。癌干样细胞为显示癌干细胞的某些或所有特征的癌细胞。
CSC可显示胚胎干细胞的一种或多种活性特征，例如接触抑制的缺失、锚地非依赖性生长(anchorage independent growth)、碱性磷酸酶的从头合成表达和特异性Oct4启动子的激活。Oct4，Pou结构域第5类转录因子(Pou5fl)的成员(Genbank登录号S68053)，为早期胚胎细胞和生殖细胞表达的哺乳类POU转录因子之一，并且为哺乳动物中多能干细胞的标志。
本文所使用的术语"祖先"是指成为特定细胞系且通过一系列细胞分裂产生该谱系的细胞的细胞。祖细胞可比干细胞更加分化，但本身不完全分化。祖细胞的实例为成肌细胞，其能够分化成仅一种类型的细胞，但本身不完全成熟或完全分化。
本文可互换使用的关于细胞的术语"增殖"和"生长"是指通过细胞分裂、快速重复细胞增殖、细胞复制、细胞周期和细胞生长(特别是不受控的细胞生长)使相同类型细胞的数量增加。“发育”是指从较小的、不太复杂的或良性的形式向较大的、更复杂的或瘤的形式发展。例如，肿瘤可从小块发育成较大块。癌干细胞发育可指从非癌细胞状态向癌细胞状态的发展，或从非瘤组织形成向瘤或肿瘤形成的发展。
本文所使用的术语"分化"是指发育过程，借此细胞变得特化于特定功能，例如，细胞获得不同于起始细胞类型的一种或多种形态特征和/或功能。术语"分化"包括谱系定型(lineage commitment)和终末分化过程。分化可例如使用免疫组织化学或本领域熟练技术人员已知的其它程序，通过监控谱系标记物的存在与否来评价。来源于祖细胞的分化的后代细胞可以，但不必与祖细胞的源组织相同的胚层或组织相关。
本文所使用的术语"终末分化"是指细胞向成熟的、完全分化的细胞的最终分化。通常，终末分化与细胞周期停止和增殖终止相关联。本文可互换使用的术语"谱系定型"和"特化"是指干细胞经历了其中干细胞产生定向形成特定的有限范围的分化细胞类型的祖细胞的过程。定向祖细胞通常能够自我更新或细胞分裂。
本发明提供通过用Hs.459642单基因簇产物的一种或多种抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂，直接或间接接触细胞来抑制增殖、生长和发育，和/或诱导癌干细胞的终末分化的方法。这些方法还用于抑制增殖、生长和发育，和/或诱导非癌干细胞如胚胎或成体干细胞的终末分化。
本文所使用的“抑制”是指活性的减少或阻止。
可通过本发明抑制的Hs.459642单基因簇的一种或多种产物的行为包括，但不限于：细胞钙摄取；细胞内钙水平的调节和/或介导；细胞内窗口电流的调节和/或介导；钙介导的信号传导和/或钙信号传导通路的调节；起动和/或维持细胞生长和增殖，特别是过度的或不需要的增殖；起动和/或维持瘤形成和/或肿瘤生长；和起动和/或维持血管形成和/或转移。
“拮抗剂”抑制活性或功能。例如，一种化合物可通过抑制、减少或消除蛋白质表达，或阻止蛋白质活性，或阻止蛋白质与其它蛋白质相互作用来起拮抗剂作用，导致蛋白质介导的功能或信号传导的抑制。拮抗剂的实例包括抑制Hs.459642单基因簇的一种或多种产物的活性或功能，并且特别是抑制CACNA1H的活性或功能的肽、多肽、蛋白质、抗体、反义寡核苷酸、RNAi/siRNA、小分子、化学治疗剂，和其片段、衍生物和类似物。
本文所使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指通过肽键或修饰的肽键连接到一起的氨基酸残基的序列。典型地，多肽或蛋白质至少六个氨基酸长，肽至少3个氨基酸长。蛋白质、多肽或肽可以是天然存在的、重组、合成、或这些的组合。蛋白质、多肽或肽可为天然存在的蛋白质或多肽的片段。术语多肽和肽还包括肽类似物、肽衍生物和拟肽化合物。此类化合物在本领域是公知的且可比天然存在的肽具有明显的优势，包括，例如，更大的化学稳定性、更强的抗蛋白质降解性、增强的药理性质(如，半衰期、吸收、效价和效力)、改变的特异性(例如，广谱生物活性)和/或减少的抗原性。
“变体”蛋白质、多肽、肽、或其片段是其中删除、增加或取代在野生型蛋白质的氨基酸序列中出现的那些氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基的蛋白质、多肽、肽、或其片段。在本发明的背景下，变体还基本上保留与野生型蛋白质相同的活性。典型地，当变体包含一个或多个氨基酸取代时，它们是“保守性”取代。保守性取代涉及一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链性质的残基代替。如本领域已知的，20种天然存在的氨基酸可根据它们侧链的物理化学性质分组。适当的分组包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水性侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性、不带电荷的侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)和赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。氨基酸的另一分组为苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳族侧链)。保守性取代涉及氨基酸与来自同一组的另一氨基酸的取代。
本发明预期的蛋白质、多肽和肽抑制剂包括天然抑制Hs.459642单基因簇产物的蛋白质，和此类抑制剂的活性片段和变体。抑制剂的其它实例包括抑制Hs.459642单基因簇产物、从而阻止钙活化的信号传导活性的肽衍生物、类似物或拟肽。在具体实例中，抑制剂抑制CACNA1H。
本发明还包括使用生物学失活蛋白质，或干扰野生型蛋白质的作用因而作为蛋白质活性抑制剂而起作用的蛋白质的片段。实例包括显性失活突变体。本发明包括的生物学失活蛋白质或片段为具有比野生型蛋白质显著低的活性的那些。候选抑制片段可选自由野生型蛋白质产生的随机片段。用于产生候选多肽片段的方法对于本领域技术人员是公知的。生物学失活蛋白质还可通过例如编码蛋白质的核酸的定点或随机突变技术，或通过借助化学或物理手段使蛋白质失活来产生。
除了抑制癌干细胞的增殖、分化或发育以外，Hs.459642单基因簇产物的抑制剂还可抑制胚胎干细胞、成体干细胞以及其它多能(pluripotent)、多功能(multipotent)或单能干细胞的增殖、分化或发育。
癌症或肿瘤疾病，包括但不限于，赘生物、肿瘤、转移瘤、白血病或以不受控的细胞生长为特征的任何疾病或病症，可通过向所需受试者施用预防或治疗有效量的Hs.459642单基因簇产物的抑制剂、特别是CACNA1H的抑制剂来防止、治疗和/或控制。
可根据本发明来防止、治疗和/或控制任何类型的癌症。可根据本发明防止、治疗和/或控制的癌症的非限制性实例包括：白血病；淋巴瘤；多发性骨髓瘤；骨和结缔组织肉瘤；脑肿瘤；乳腺癌；肾上腺癌；甲状腺癌；胰腺癌；垂体癌；眼癌；阴道癌；宫颈癌；子宫癌；卵巢癌；食管癌；胃癌；结肠癌；直肠癌；肝癌；胆囊癌；胆管细胞癌；肺癌；睾丸癌；前列腺癌；阴茎癌；口腔癌；基底细胞癌；唾腺癌；咽癌；皮肤癌；肾癌；维尔姆斯瘤；膀胱癌。
如本文所使用的，术语"受试者"和"患者"可互换使用并且是指动物、优选哺乳动物如非灵长类(如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(如猴和人)，最优选人。
如本文所使用的，"治疗"是指尝试改变待治疗的个体或细胞的病程的临床干预，并且可用于预防或在临床病理期间进行。治疗的疗效包括，但不限于，防止疾病的发生或复发、症状的缓和、任何直接或间接的疾病病理结果的缩减、减少疾病进展的速度、疾病状态的改善或减轻、以及缓解或改善的预后。例如，癌症患者的治疗可为减小肿瘤大小、消除恶性细胞、防止转移或防止肿瘤已消退的患者复发。
如本发明所使用的，术语"治疗有效量"和“有效量”可互换使用，指本发明组合物的量足以预防癌干细胞或癌症及其一种或多种症状的发展、复发或发作，增强或改善另一治疗的预防性效果，降低癌症的严重性和持续性，缓和癌症的一种或多种症状，防止癌症的发展，引起癌症的消退和/或增强或改善其他抗癌治疗的治疗效果。
治疗有效量可以以足以减轻、缓和、稳定、逆转或减缓疾病发展，或在其他方面减少疾病的病理结果、或减少疾病症状的一种或多种剂量施用于患者。缓和或减少不必是永久的，但可持续至少1小时、至少1天或至少1周以上的一段时间。有效量通常由医师基于个例并且在本领域技术人员的技术范围内确定。当确定适当剂量以实现有效量时，典型地将多种因素考虑在内。这些因素包括患者的年龄、性别和体重，将要治疗的病况，病况的严重程度，以及施用途径、剂型和方案和所期望的结果。
在本发明的某些实施方案中，治疗有效量为一旦施用便对于实现一个、两个或三个以上的下述结果有效的量：(1)癌干细胞群的减少或消除；(2)总癌细胞群的减少或消除；(3)肿瘤或赘生物的生长或增殖的减少；(4)肿瘤形成的损伤；(5)原发、局部和/或转移癌的根除、除去或控制；(6)死亡率的减少；(7)无病、无复发、无进展和/或总存活率、持续时间或比例的增加；(8)响应率、响应持久性或者响应或处于缓解期的患者数的增加；(9)肿瘤大小维持和不增加或增加小于10％、或小于5％、或小于4％、或小于2％，(10)处于缓解期的患者数增加，(11)缓解期的长度或持续时间增加，(12)癌症的复发率降低，(13)癌症复发的时间延长，(14)癌症相关症状和/或生活质量改善和(15)癌细胞的抗药性减少。
在某些实施方案中，Hs.459642单基因簇产物的抑制剂的量或方案导致肿瘤块大小减小，以及癌干细胞群减少。在某些实施方案中，定期监控肿瘤块大小的减小；肿瘤块大小的减小和包括抗药性癌干细胞的癌干细胞群的减少；或者肿瘤块大小的减小、癌干细胞群的减少和癌细胞群的减少。因此，在一个实例中，本发明提供防止、治疗和/或控制受试者癌症的方法，所述方法包括：(a)向所需受试者施用一个或多个剂量的有效量的Hs.459642单基因簇产物抑制剂。在特定实例中，该抑制剂抑制CACNA1H。
根据本发明，提供拮抗Hs.459642单基因簇产物以抑制干细胞(包括参与癌症的那些干细胞)的增殖、分化或发育的抗体。此类抗体可为多克隆或单克隆的，并且可在任何适合的物种中产生。单克隆抗体可源于产生物种或完全或部分人源化。在具体实例中，一种或多种抗体抑制CACNA1H。
各种抗体的制备方法是本领域已知的(参见，Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press,Eds.,Harlow和Lane(1988)；Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。例如，抗体可通过用从患者分离的完整细胞的样品来免疫适合的哺乳动物宿主制备。简言之，此类在哺乳动物中产生免疫应答的方法(如体液和/或细胞介导的)包括如下步骤：将哺乳动物的免疫系统暴露于一种或多种Hs.459642单基因簇产物如CACNA1H，以使哺乳动物产生对一种或多种Hs.459642单基因簇产物特异的免疫应答(如，产生特异性识别一种或多种Hs.459642单基因簇产物蛋白质表位的抗体)。
抗体可通过包括如本文所述的产生单克隆抗体的细胞培养技术，或者经抗体基因转染至适合的细菌或哺乳动物细胞宿主，从而允许产生重组抗体来生产。在一种技术中，Hs.459642单基因簇产物的样品最初注入多种哺乳动物中的任一种(如，小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)。如果样品随载体蛋白如牛血清白蛋白或钥孔虫戚血兰素注射，则可激发优异的免疫应答。样品优选根据包括一次或多次加强免疫的预定进度注入动物宿主，并且动物被定期采血以便可取得抗体的滴度从而确定抗体形成的充分性。然后可使用来自患者样品的偶联到适合的固体支承体的细胞，通过例如亲和色谱从此类抗血清中纯化对多肽特异的多克隆抗体。
“单克隆抗体”为从基本上同源抗体的群体中获得的抗体，即，包括除了以微小量存在的可能天然产生的突变以外完全相同的群体的抗体。Hs.459642单基因簇产物特异性单克隆抗体可例如使用Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)来制备，并对其改进。简言之，这些方法涉及能够产生具有期望的特异性(即，与Hs.459642单基因簇产物的反应性)的抗体的永生的细胞系的制备。此类细胞系可例如由从如上所述免疫的动物获得的脾细胞来生产。然后将脾细胞通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣，优选与免疫动物同源的骨髓瘤细胞融合伴侣融合来永生化。可采用各种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可与非离子洗涤剂结合几分钟，然后以低密度在支持杂合细胞而不是骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上铺板。优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)筛选。足够长时间之后，通常约1至2周后，观察到杂合子菌落。选择单菌落，并测试其培养上清液对Hs.459642单基因簇产物的结合活性。对Hs.459642单基因簇产物具有高反应性和特异性的杂交瘤对于治疗目的是重要的。当鉴定出适当的永生化细胞时，可扩培该细胞并产生抗体。
另外，可采用各种技术来增加产率，例如将杂交细胞系注入适合的脊椎动物宿主如小鼠的腹膜腔。然后可从腹水液或血液获得单克隆抗体。污染物可通过常规技术如色谱、凝胶过滤、沉淀和提取从抗体中除去。
本发明的抗体还可通过重组手段生产。与Hs.459642单基因簇产物特异性结合的抗体还可在嵌合或补偿决定区嫁接的多物种来源的抗体的环境下生产。还可生产“人源化”或人抗体，并优选用于治疗方面。通过将一条或多条非人抗体序列代替相应的人抗体序列来人源化鼠科和其它非人抗体的方法是公知的[参见例如，Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science239:1534-1536(1988)，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1993)；和Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)]。将这些人源化抗体设计为使对啮齿动物抗人抗体分子的不需要的免疫应答最小化，这种不需要的免疫应答限制了人受体中那些部分的治疗应用的持续性和有效性。因此，用于本发明治疗方法的优选抗体为完全人或人源化的、并且高亲和性地与Hs.459642单基因簇产物特异性结合、但在患者中显示低抗原性或无抗原性的那些抗体。
可使用利用大的人Ig基因组合文库的克隆技术(即，噬菌体展示)产生本发明的完全人单克隆抗体(Griffiths和Hoogenboom,Building an in vitro immune system:humanantibodies from phage display libraries.In:Protein Engineering of AntibodyMolecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man,Clark,M.(Ed.),Nottingham Academic,pp45-64(1993)；Burton和Barbas,Human Antibodies fromcombinatorial libraries.Id.,pp65-82)。本发明的完全人单克隆抗体还可使用工程化为包含人免疫球蛋白基因位点的转基因小鼠来生产(另外参见，Jakobovits,Exp.Opin.Invest.Drugs7(4):607-614(1998)；U.S.Pat.Nos.6,162,963，2000年12月19日发行；6,150,584，2000年11月12日发行；和6,114,598，2000年9月5日发行)。
本发明中还将抗独特型(Anti-idiotypic)抗体考虑在内。本发明的抗独特型抗体可用于诱导对CSC的免疫应答。抗独特型抗体的产生是本领域公知的；该方法学易适合于产生模拟Hs.459642单基因簇产物表位的Hs.459642单基因簇产物抗体的抗独特型抗蛋白(anti-protein)[参见，例如，Wagner等人,Hybridoma16:33-40(1997)；Foon等人,J.Clin.Invest.96:334-342(1995)；Herlyn等人,Cancer Immunol.Immunother.43:65-76(1996)]。抗独特型抗体可用于进一步增强如本文所述的癌症治疗。
治疗癌症的本发明抗体包括引发对肿瘤的潜在免疫应答的那些或为直接细胞毒性的那些。就这一点而言，本发明的抗体可通过补体介导的或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机理(二者要求免疫球蛋白分子的完整的Fc部分以与补体蛋白上的效应细胞Fc受体位点相互作用)引起肿瘤细胞裂解。直接细胞毒性抗体起作用的机理包括：细胞生长的抑制、细胞分化的调节、肿瘤血管生成因子谱的调节和凋亡的诱导。本发明特定抗体发挥抗肿瘤效果的机理可使用本领域通常已知的评价细胞死亡的许多体外试验如ADCC、ADMMC、补体介导的细胞裂解等来评价。
一种或多种抗Hs.459642单基因簇产物抗体的特异性可通过本领域已知的许多技术来测试。例如，特异性可通过ELISA来确定。使用本领域已知的方法将从患者分离的整个细胞用于覆盖多孔板的孔。孔被Hs.459642单基因簇产物所覆盖。添加抗Hs.459642单基因簇产物抗体，与Hs.459642单基因簇产物的反应性通过抗体结合亲和力确定。本领域技术人员公知的确定特异性的其它手段包括FACS分析和免疫化学。
本发明的抗体可导入患者，以使抗体结合至肿瘤内的Hs.459642单基因簇产物并介导CSC和其它肿瘤细胞的破坏和/或抑制其生长。此类抗体发挥治疗效果的机理可包括补体介导的细胞裂解、抗体依赖性细胞毒性、本发明蛋白质生理机能的调节、Ca2+结合或Ca2+摄取的抑制、肿瘤细胞分化的调节、Ca2+细胞内信号传导通路的改变、和/或凋亡。对Hs.459642单基因簇产物产生的免疫应答可导致例如癌细胞死亡或者减少或防止细胞增殖。
在优选的实施方案中，除了本发明的抗Hs.459642单基因簇产物抗体以外，将一种或多种免疫刺激剂施用至患者。免疫刺激剂是指增强或加强对抗原的免疫应答的(抗体和/或细胞介导的)任意物质。免疫刺激剂的一种优选类型包括佐剂。许多佐剂包含设计为保护抗原免受快速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答刺激物，例如脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)衍生蛋白。某些佐剂为商购可得的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；默克佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKlineBeecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐如氢氧化铝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈(polyphosphazenes)；生物降解性微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子如GM-CSF、白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12及其它类似的生长因子也可用作佐剂。
在经注射、喷雾、口服、经皮、经粘膜、胸膜内、囊内或其它适合途径施用根据本发明的抗体组合物时，患者的免疫系统通过产生大量对患者的CSC特异的免疫细胞来应答。结果，患者变得对此类癌细胞免疫敏感，或者患者取得至少某些治疗益处。
本公开进一步预期的是用与细胞毒素剂结合的本发明抗体治疗患者的方法。结合抗体和细胞毒素剂是常规的[参见，Sievers等人,Blood93:113678-3684(1999)]。当将细胞毒素和/或治疗剂直接递送至细胞(例如通过使它们结合至对由该细胞表达的分子特异的抗体)时，细胞毒素剂将对这些细胞发挥其已知的生物效应(即细胞毒性)。例如，抗体可结合至毒素或放射性同位素，例如卡奇霉素或美登木素生物碱(maytansinoid)或Y91或I131与抗体的结合。
初始抗体负荷剂量约4mg/kg患者体重IV，随后每周剂量约2mg/kg IV抗体制剂，这代表可接受的剂量方案。优选地，初始负荷剂量以90分钟以上的输注施用。定期维持剂量以30分钟以上的输注施用，条件是初始剂量耐受良好。如本领域技术人员所理解的，各种因素可影响特定病例的理论剂量方案。此类因素包括，例如所使用的一种或多种抗体的结合亲和力和半衰期、本发明蛋白在患者中的表达程度、Hs.459642单基因簇产物的循环更新程度、所期望的稳态抗体浓度水平、治疗频率和与本发明治疗方法组合使用的化学疗剂或其它试剂的影响，以及特定患者的健康状况。
本发明的抗体制剂经能够将抗体传递至癌细胞的任何途径施用。施用途径包括，但不限于，静脉内、腹膜内、肌内、瘤内和皮内等。治疗通常涉及典型地以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg/kg体重的范围内的剂量，经可接受的施用途径如静脉注射(IV)重复施用本发明的抗体制剂。一般而言，10-1000mg抗体/周范围内的剂量是有效的且耐受良好。
可与本发明疫苗一起使用的载体是本领域公知的，包括例如甲状腺球蛋白，白蛋白如人血清白蛋白，破伤风类毒素，聚氨基酸如聚L-赖氨酸、聚Ｌ-谷氨酸，流感病毒，和乙型肝炎病毒核心蛋白等。疫苗可含有生理耐受(即，可接受的)稀释剂如水或盐水，优选磷酸缓冲盐水。
本公开还提供寡核苷酸抑制剂，包括但不限于反义寡核苷酸、RNAi、dsRNA、siRNA和核糖酶。此类反义寡核苷酸拮抗Hs.459642单基因簇产物来抑制干细胞(包括癌症中涉及的那些)的增殖、分化或发育。在优选实例中，反义寡核苷酸针对CACNA1H。
如本说明书所使用的，"反义寡核苷酸"是指一段单链DNA或RNA，通常经化学修饰，其序列(3'-5')与mRNA分子的正义序列互补。因此反义分子通过形成RNA/DNA双链体来有效抑制基因表达，并且为癌症治疗提供比化学治疗或放射更加靶向的选择。反义被认为是通过各种机理起作用，包括物理阻断核糖体沿信使RNA的移动，并加速mRNA在细胞溶质中降解的速率。
为了避免被DNA酶消化，反义寡核苷酸通常被化学修饰。例如，硫代磷酸寡脱氧核苷酸通过用硫部分来取代DNA非桥接磷酰氧而稳定化，以抵抗核酸酶消化。增加的反义寡核苷酸稳定性还可如美国专利6,451,991号(引入作为参考)和美国公布的专利申请US-2003-0158143-A1一般描述的、使用含2-甲氧乙基(MOE)取代的骨架的分子来实现。因此，在本发明的组合和方法中，修饰反义寡核苷酸，从而增强相对于相同序列的未修饰的寡核苷酸的体内稳定性。所述修饰可为(2'-O-2-甲氧乙基)修饰。寡核苷酸可具有贯穿的硫代膦酸骨架，核苷酸1-4和18-21的糖部分可具有2'-O-甲氧乙基修饰，剩余的核苷酸可为2'-脱氧核苷酸。
反义寡核苷酸对应于Hs.459642单基因簇产物的序列可为5-10-5的gap-mer甲氧乙基修饰的(MOE)寡核苷酸。反义寡核苷酸可为10-25个碱基长度，或15-23个碱基长度，或18-22个碱基长度，或21个碱基长度。在一个实施方案中，该寡核苷酸具有贯穿的硫代磷酸骨架。
本领域理解的是，反义寡核苷酸无需为了有效性而具有与其靶序列的互补序列100％的同一性。因此，根据本发明的反义寡核苷酸具有与靶序列的互补序列至少约70％同一性的序列。在本发明的一个实施方案中，反义寡核苷酸具有与靶序列的互补序列至少约80％同一性的序列。在其它实施方案中，它们具有与靶序列的互补序列至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列，允许几个碱基的间隙或错配。同一性可例如通过使用威斯康星大学计算机组(GCG)软件的BLASTN程序来确定。
根据本发明的反义寡核苷酸长度典型地在7至100个核苷酸之间。在一个实施方案中，反义寡核苷酸包括约7至约50个核苷酸或核苷酸类似物。在另一实施方案中，反义寡核苷酸包括约7至约35个核苷酸或核苷酸类似物。在其它实施方案中，反义寡核苷酸包括约12至约35个核苷酸或核苷酸类似物，约15至约25个核苷酸或核苷酸类似物。
为了本发明的反义寡核苷酸在抑制Hs.459642产物表达方面起作用，必须使它们表现出对靶序列足够的特异性且不与细胞中的其它核酸序列结合。因此，除了拥有适当的与靶序列的互补序列的序列同一性水平，本发明的反义寡核苷酸不应与其它已知序列很类似。因此，本发明的反义寡核苷酸应与任何其它哺乳动物核酸序列小于50％的同一性。
还可使用RNA干扰或"RNAi"实现Hs.459642产物量的减少。RNAi或双链RNA(dsRNA)指导包括脊椎动物的许多生物体中的基因特异性转录后沉默。由siRNA介导的RNA干扰在本领域是已知的，在转录后基因沉默中起到重要作用(Zamore,Nature Struc.Biol.,8:746-750,2001)。在自然界中，siRNA分子典型地为21-22个碱基对长度，且当长双链RNA分子在内源核糖核酸酶作用下切割时产生。RNAi可经由直接引入细胞、或通过将siRNA或siRNA样分子的适当前体(如载体等)引入细胞而在细胞内产生而起作用。然后，siRNA可与其它细胞内组分相结合，从而形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。用具有与一部分靶基因相同的序列的合成的siRNA分子转染哺乳动物细胞导致了靶基因的mRNA水平减少(Elbashir等人,Nature,411:4914498,2001)。
根据本发明的寡核苷酸抑制剂可为靶向感兴趣基因的siRNA分子，从而siRNA的序列对应于所述基因的一部分。用于本发明的RNA分子通常包含RNA部分和某些附加部分，例如脱氧核糖核苷酸部分。RNA分子中核苷酸的总数适宜小于49，以便成为有效的RNAi介质。在优选的RNA分子中，核苷酸数为16-29，更优选18-23，最优选21-23。在本发明的某些实施方案中，siRNA或siRNA样分子小于约30个核苷酸长度。在另外的实施方案中，siRNA或siRNA样分子约21-23个核苷酸长度。在实施方案中，siRNA或siRNA样分子包含19-21bp的双链部分，各链具有2个核苷酸的3'突出端。在本发明的某些实施方案中，siRNA或siRNA样分子基本上与编码Hs.459642单基因簇产物的核酸或其片段或变体相同。
双链siRNA分子可进一步在3'和5'端包含poly-T或poly-U突出端，从而使RNase介导的分子降解最小化。典型地，3'和5'端的突出端包含两个胸苷或两个尿苷残基。siRNA分子的设计和构建是本领域已知的(参见，例如，Elbashir等人，Nature,411:494498,2001；Bitko和Barik,BMC Microbiol.,1:34,2001)。另外，通过体外转录提供快速且有效的构建siRNA分子的手段的试剂盒也是商购可得的(Ambion,Austin,Tex.；New England Biolabs,Beverly,Mass.)，并且可用于构建本发明的siRNA分子。
本发明进一步预期特异性靶向编码感兴趣蛋白的mRNA的核糖酶寡核苷酸调节剂。核糖酶是具有能够使得核糖酶以核苷酸序列特异性方式反复切割其它单独的RNA分子的酶活性的RNA分子。此类酶促RNA分子可几乎靶向任何mRNA转录本，且可在体外实现有效的切割(Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:8788,1987；Haseloff and Gerlach,Nature,334:585,1988；Cech,JAMA,260:3030,1988；Jefferies等人,Nucleic Acids Res.,17:1371,1989)。
典型地，核糖酶包含位于十分靠近区域的两部分：具有与靶mRNA序列互补的序列的mRNA结合部分，和用于切割靶mRNA的催化部分。核糖酶首先通过借助贯穿核糖酶的靶mRNA结合部分的碱基互补配对来识别并结合靶mRNA而起作用。一旦核糖酶特异性结合至其靶标，核糖酶催化靶mRNA的切割。这种策略切割破坏了mRNA指导编码蛋白合成的能力。已结合并切割其mRNA靶标后，核糖酶释放，并且可重复结合和切割新的靶mRNA分子。
本发明还提供Hs.459642单基因簇产物的小分子抑制剂，包括肽、寡核苷酸以及合成和天然存在的有机和无机分子。如本文所使用的，小分子定义为小于1200道尔顿的分子、优选小于1000道尔顿、或优选小于800道尔顿。在具体实例中，小分子抑制剂抑制包括CACNA1H的T型钙通道。已知的T型钙通道抑制性化合物/小分子包括咪拉地尔、地尔硫卓、硝苯地平、尼群地平、尼莫他平、尼鲁地平、尼古地平、尼卡地平、尼索地平、氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、瑞西丁(ryosidine)、加洛帕米、戊脉安、泰尔帕米、哌咪清、硫醚嗪、咪拉地尔、NNC55-0396、TTL-1177、大麻素、苯并吖庚因(benzazepine)衍生物，和其药物学可接受盐。其它T型钙通道特异性拮抗剂包括美国专利7,319,098号中公开的1,3-二氧异吲哚衍生物。
本发明进一步提供拮抗Hs.459642单基因簇产物以抑制干细胞(包括癌症中涉及的那些)的增殖、分化或发育的药理学组合物。该组合物可通过诱导细胞毒性或通过诱导细胞死亡来起作用。该组合物可包含Hs.459642单基因簇产物的任意上述抑制剂或拮抗剂，包括多克隆或单克隆抑制抗体、完全或部分人源化抑制抗体、反义寡核苷酸、小分子抑制剂或本文中公开的任何其它抑制剂或拮抗剂。在具体实例中，抑制剂或拮抗剂，特别是多克隆或单克隆抑制抗体、完全或部分人源化抑制抗体、RNAi或小分子抑制剂抑制或拮抗CACNA1H。
优选的口服剂型，例如片剂或胶囊剂，可以约0.1至约500mg、优选约125至约200mg和更优选约25至约150mg的量包含Hs.459642产物抑制剂。对于肠胃外施用，Hs.459642产物抑制剂可以约0.005mg/kg至约10mg/kg和优选约0.01mg/kg至约1mg/kg范围内的量使用。
进一步提供与其它治疗剂组合的本发明的药理学组合物和治疗方法以抑制干细胞(包括癌症中涉及的那些)的增殖、分化或发育。该组合物可同时或顺次施用。预防和/或治疗有效量或方案的本文中的Hs.459642单基因簇产物抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂可与一种或多种另外的治疗方法组合施用。
例如，Hs.459642单基因簇产物抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂，可与一种或多种另外的癌治疗剂或抗癌剂组合施用。术语"癌治疗剂"和“抗癌剂”是指抑制或防止细胞的功能、表达或活性和/或引起细胞破坏的任何物质。该术语意欲包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。细胞毒素剂的实例包括，但不限于美登木素生物碱、钇、铋、蓖麻毒素、蓖麻毒A链、阿霉素、柔红霉素、紫杉酚、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲素(modeccin)A链、α-帚曲毒蛋白(α-sarcin)、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素(retstrictocin)、酚毒素、伊诺霉素、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，和糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素。在优选的实例中，另外的抗癌剂不是Hs.459642单基因簇产物的抑制剂或拮抗剂，特别地，该另外的抗癌剂不是CACNA1H的抑制剂。
例如，由本发明在此提供的组合治疗包括用本发明的组合物与靶向癌细胞和癌干细胞的另外的治疗组合的治疗。癌细胞和癌干细胞可受到增殖信号传导通路的拮抗剂如JAK/STAT、WNT或p53的抑制；受端粒酶抑制剂的抑制；和受靶点癌干细胞标记物如CD34(白血病CSCs)、CD138(骨髓瘤CSCs)和/或CD44(乳腺癌CSCs)治疗剂的抑制。
在优选的实例中，本发明的组合物提供为与另外的抗癌治疗组合的“交错治疗”。在此类交错治疗中，将包含Hs.459642单基因簇产物抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂的组合物施用至患者一段时间，例如，将该组合物施用1天、3天、5天、7天、14天或21天或更多天，或施用1个月、2个月或更多个月。一旦施用期结束，则根据抗癌治疗用标准治疗方法，用另外的抗癌治疗治疗患者。这样，Hs.459642单基因簇产物的抑制、特别是CACNA1H的抑制先于另外的抗癌治疗，且增加或改善另外的抗癌治疗的有效性。
Hs.459642单基因簇产物抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂，与一种或多种另外的抗癌治疗可单独、同时或顺次施用，或者以最适用于患者耐受的任何方式施用。试剂的组合可通过相同或不同的施用途径施用至患者。在可选的实施方案中，两种或多种预防性或治疗性试剂以单一组合物的形式施用。
可将治疗有效量或方案的本发明组合物施用至将要或已经经受放射治疗、化学治疗、激素治疗和/或包括免疫治疗和/或靶向治疗的生物治疗的患者，以及已进行手术的那些患者。
用于组合治疗的一种或多种另外的抗癌剂的剂量可低于已经用于或目前正用于防止、治疗和/或控制患者癌症的那些剂量。目前用于防止、治疗和/或控制癌症的一种或多种另外的治疗的推荐剂量可从本领域任何参考文献中获得，包括但不限于Hardman等人编辑的，Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis Of Therapeutics,第10版，Mc-Graw-Hill,N.Y.,2001；和Physician's Desk Reference(第60版，2006)，在此将其全部内容引入以作参考。
因此，例如，在Hs.459642产物抑制剂与另外的抗癌治疗剂以同一口服剂型或同时服用的单独口服剂型一起采用的情况下，可采用以约0.01mg/kg至约100mg/kg和优选约0.1mg/kg至约25mg/kg范围内的口服剂量的量的Hs.459642产物抑制剂与约0.01mg/kg至约100mg/kg和优选约0.1mg/kg至约25mg/kg范围内的量的另外的抗癌剂组合来获得满意的结果。
在一种形式的治疗中，将治疗有效量或方案的本发明的组合物施用于正进行或已进行手术以除去肿瘤、癌细胞或赘生物的受试者。在具体应用中，将治疗有效量或方案的本发明组合物施用于目前或随后手术以除去肿瘤、癌细胞或赘生物的受试者。在另一具体应用中，将治疗有效量或方案的本发明组合物施用于除去肿瘤或赘生物的手术之前的受试者，并可另外在手术期间和/或手术后施用。
在某些实施方案中，将治疗有效量或方案的本发明组合物施用于对于一种或多种治疗已失败或难治性受试者。对于治疗手段来说“难治性”癌症意指至少癌细胞的某些主要部分没有杀死，或者它们的细胞分裂不会在治疗应答中被遏止。使用该背景下本领域接受的难治性含义，由本领域已知的用于分析癌细胞治疗效果的任何方法，在体内或体外来确定癌细胞是否是难治性的。
治疗有效量或方案的本发明组合物可施用于细胞因子IL-6的水平增加的患者，IL-6与耐受不同治疗方案如化学治疗和激素治疗的癌细胞的发展相关。
本发明的组合物可以组合形式包含一种或多种Hs.459642产物抑制剂，包括如本文所提供的抗体抑制剂、寡核苷酸抑制剂、小分子抑制剂或钙通道阻断剂的任意组合。本发明进一步提供与如本文所述的任意其它抗癌治疗组合的Hs.459642产物抑制剂的任意组合。
癌干细胞的量可使用本领域技术人员已知的标准技术监测。癌干细胞可通过例如从受试者获得样品如组织/肿瘤样品、血样或骨髓样品并检测样品中的癌干细胞来监测。样品中癌干细胞的量(其可表示为例如总细胞或总癌细胞的百分比)可通过检测癌干细胞中Hs.459642产物的表达来评估。本领域技术人员已知的技术可用于测量这些活性。Hs.459642产物表达可例如通过免疫分析来评价，包括但不限于，蛋白质印迹、免疫组织化学、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫测定)、"夹心"免疫测定("sandwich"immunoassays)、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合试验(complement-fixation assays)、免疫放射测定、荧光免疫测定、免疫荧光、蛋白质A免疫测定、流式细胞术和FACS分析。在这种情况下，来自受试者的试验样品中癌干细胞的量可通过将结果与参考样品(如来自没有检测到癌症的受试者的样品)中干细胞的量，或与预定参考范围，或与较早时间点(如在治疗之前，或在治疗期间)患者中的CSC进行比较来确定。
本公开提供通过将特异性结合至Hs.459642单基因簇产物的试剂或标记物施用至个体或从该个体获得的生物样品来检测干细胞和癌干细胞的方法。
本公开进一步提供通过施用针对Hs.459642单基因簇产物的抗体至个体或从该个体获得的生物样品来检测干细胞和癌干细胞的方法。例如，检测肿瘤中的Hs.459642单基因簇产物特异性抗体来鉴定肿瘤中的CSC。
可使用常规方法如免疫组织化学或细胞分选将前述标记物用于鉴定癌干细胞。癌干细胞本质上可使用由Al-Hajj等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:3984-3983,2003)记载的细胞分选方法鉴定。本发明可调整该方法，以使表达Hs.459642单基因簇产物的癌干细胞可利用抗Hs.459642产物抗体来鉴定。
在一个实施方案中，癌干细胞的鉴定可通过流式细胞术使用标准细胞分选步骤来进行。例如，可通过首先ficoll分离体液(典型地500ml-2L)以除去碎屑和红血细胞污染来处理利用常规技术从患者渗出液或活组织检查获得的细胞。还可进行门控来区分血细胞。用于癌干细胞表型分析的流式细胞染色可鉴定"谱系阴性"细胞。对于FACS分析，FITC标记的抗Hs.459642产物抗体可用于分析来自癌症患者肿瘤组织的细胞。
本发明的抗Hs.459642产物抗体可用于癌症控制中的各种诊断分析、成像方法和治疗方法。例如，可通过从治疗前后的个体获得的样品分析来确定本方法在抑制个体中的癌干细胞生长或消除个体中的癌干细胞方面的效力，例如通过治疗前和治疗后活组织检查的分析、免疫组织化学分析或细胞分选分析，从而确定表达Hs.459642产物的癌干细胞的存在。候选化合物可为分离或未分离的、纯的、部分纯化的或粗制混合物的形式；例如，其可为细胞、源自细胞的溶解产物或提取物、或源自细胞的分子的形式。在候选化合物存在于包含超过一个分子实体的组合物中的情况下，预期可测试该组合物本身，和/或可任选地通过适合的步骤分级，并使用本发明的方法或其它方法测试分级样品，从而鉴定作为Hs.459642单基因簇产物抑制剂、特别是CACNA1H抑制剂起作用的组合物的特定级分或组分。进一步预期可使用本发明的方法来再分级并重复分析测试组合物的亚级分，最终的目标为从鉴定为Hs.459642单基因簇产物抑制剂的亚组合中排除非活性组分。可根据需要或适当地包括化合物分离、纯化和/或表征的插入步骤(intervening steps)。
候选化合物可以大文库的合成或天然化合物的形式获得。目前许多手段被用于以糖、肽和核酸为基础的化合物的随机和直接合成，并且是本领域公知的。合成化合物文库可从一些公司商购获得，这些公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Preton,N.J.)、Brandon Associates(Merrimack,N.H.)、Microsource(NewMilford,Conn.)和Aldrich(Milwaukee,Wis.)。组合文库也是可获得的或可根据标准步骤制备。可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的文库的天然化合物可从例如PanLaboratories(Bothell,Wash.)或MycoSearch(North Carolina)获得，或可容易生产。另外，自然和合成产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理和生物化学手段修饰。
本申请通过下述非限制性实施例进一步描述。
实施例1
为了确定癌干细胞上Hs.459642单基因簇产物的抑制效果，研究两种T型钙通道抑制剂的效果，从而确定CACNA1H抑制是否使癌细胞敏感，以进一步进行抗癌治疗。各抑制剂体外施用于包括多形性成胶质细胞瘤祖细胞的胶质瘤干细胞系，随后用抗癌剂治疗。继组合治疗后，将抗癌剂顺次施用至CACNA1H抑制剂，分析细胞增殖的荧光强度指示，强度越大表明细胞增殖增加。
咪拉地尔(Mi)对于使胶质瘤干细胞(GSC)对替莫唑胺(TMZ)敏感的效果。GSC以50,000个细胞/孔接种在24孔板中过夜。使它们在37℃下、潮湿的5％CO2的环境中，于增补有人重组EGF和bFGF(R&D Systems)的无血清neurobasal培养基(Invitrogen)中生长。用终浓度为30nM的T型钙通道阻断剂咪拉地尔或终浓度为3μM的TTL-1177处理细胞24小时，洗涤，然后用终浓度为5μM的抗癌剂替莫唑胺处理24小时。将试剂阿尔玛(Invitrogen)添加到各孔以获得各孔中终浓度为10％的阿尔玛将平板温育1-2小时并将100μl的上清液转移至96孔板，以用于540nm激发波长和590nm下测量的发射的荧光读数。GBM，多形性成胶质细胞瘤。Mi，咪拉地尔(Mi)。TMZ，替莫唑胺。GSC，胶质瘤干细胞。
如图4所示，在施用包括Mi、随后TMZ的组合治疗的细胞中荧光强度显著降低。
TTL-1177(TTL)对于使GSC对替莫唑胺(TMZ)敏感的效果。使用与图4相同的方法接种GSC。用T型钙通道阻断剂TTL-1177(30μM)处理细胞24小时，然后用替莫唑胺(5μM)处理24小时。如上所述使用阿尔玛分析测试细胞。GBM，多形性成胶质细胞瘤。TTL，TTL-1177。GSC，胶质瘤干细胞。
如图5所示，在施用包括TTL-1177、随后TMZ的组合治疗的细胞中荧光强度显著降低。
实施例2
患者患有肺癌，特征是患者肺中有明显的肿瘤。通过肺肿瘤活组织检查进行从患者取出的癌细胞的免疫组织化学分析。抗Hs.459642产物抗体，特别是结合至CACNA1H的抗体，在适于允许抗体与存在于样品中的CACNA1H抗原结合的条件下施加到患者活组织检查样品。处理后样品的分析揭示了如通过样品中CACNA1H阳性细胞的存在所鉴定的、肿瘤内存在CSC亚群。
用交错治疗方案治疗患者，所述交错治疗方案包括用CACNA1H特异性抗体或与CACNA1H的RNA序列互补的RNA反义寡核苷酸抑制剂治疗，随后用化学治疗抗癌剂治疗。
在应答组合治疗时，患者的肿瘤消退且没有转移形成。
已参考各种具体和优选的实施方案和技术来描述本发明。然而，应理解的是，可在本发明的精神和范围内进行多种变型和改变。对于本领域普通技术人员显而易见的是，除了本文具体记载的那些以外的组合物、方法、装置、装置元件、材料、步骤和技术也可如本文所充分公开的那样，用于实施本发明，而不需要不必要的实验。本文所记载的组合物、方法、装置、装置元件、材料、步骤和技术的所有本领域已知的功能等同物也包括在本发明中。无论范围是否公开，所有子范围和个值都包括在内。本发明不受限于所公开的、包括通过实例或说明给出且没有限定的、说明书中列举的任一种具体实施方案。本发明的范围应仅限于权利要求。

Claims (23)

1.CACNA1H产物的拮抗剂在制备用于抑制患有脑肿瘤的患者中的干细胞或癌干细胞的增殖、分化或发育的药物中的用途，其中所述拮抗剂是选自咪拉地尔和TTL-1177的小分子。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述拮抗剂用于与一种或多种另外的抗癌治疗组合施用。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述另外的抗癌治疗为手术、放射治疗或施用化学治疗剂。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述CACNA1H产物的拮抗剂用于在所述另外的抗癌治疗之前施用。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述拮抗剂和所述另外的抗癌治疗同时施用。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物用于抑制患有脑肿瘤的患者中的癌干细胞的增殖、分化或发育。
7.CACNA1H产物的拮抗剂在制备用于治疗患者脑肿瘤的药物中的用途，其中，所述患者的癌细胞包括癌干细胞，其中所述拮抗剂是选自咪拉地尔和TTL-1177的小分子。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述药物用于治疗其中已确定所述患者的癌干细胞存在的脑肿瘤。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，通过获得所述患者的样品并确定所述样品中癌干细胞的存在来确定所述患者的癌干细胞的存在。
10.根据权利要求7所述的用途，其中，所述药物与放射治疗或癌化学治疗剂组合使用。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述放射治疗或癌化学治疗剂在施用所述拮抗剂之前施用。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于抑制非癌干细胞的增殖、分化或发育。
13.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物用于抑制非癌干细胞的增殖、分化或发育。
14.根据权利要求1所述的用途，所述药物用于抑制癌干细胞的增殖、分化或发育，其中所述脑肿瘤是化学治疗难治性癌。
15.根据权利要求1所述的用途，所述药物用于抑制癌干细胞的增殖、分化或发育，其中所述脑肿瘤是复发癌。
16.根据权利要求1所述的用途，所述药物用于抑制癌干细胞的增殖、分化或发育，其中所述脑肿瘤是转移癌。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述脑肿瘤是胶质瘤。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
19.根据权利要求7所述的用途，其中脑肿瘤癌是化学治疗难治性癌。
20.根据权利要求7所述的用途，其中脑肿瘤癌是复发癌。
21.根据权利要求7所述的用途，其中脑肿瘤癌是转移癌。
22.根据权利要求7所述的用途，其中所述脑肿瘤是胶质瘤。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述胶质瘤是成胶质细胞瘤。
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