CN108265048B - 用于孕妇血浆游离dna非特异复制的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于孕妇血浆游离DNA非特异性复制的试剂盒。本发明的试剂盒包括用于加接头的试剂、用于PCR扩增的试剂、用于切割的试剂。应用本发明的试剂盒进行孕妇血浆游离DNA复制具有以下优点：不引入外来序列，获得大量与孕妇血浆游离DNA基本相同的可利用DNA片段。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于孕妇血浆游离DNA非特异性复制的试剂盒。
背景技术
自然界中存在众多不同种类的微量DNA片段，如体液游离DNA、孕妇血浆游离DNA等，而孕妇血浆游离DNA中胎儿游离DNA的发现无疑为无创伤性产前诊断开辟了新的途径。因此，围绕孕妇血浆游离DNA的研究越来越多，也发展出了许多潜在的临床应用。比如，母体血浆中胎儿DNA的异常与许多妊娠相关的疾病有关，包括先兆子痫、早产、产前出血、侵入性胎盘形成、胎儿唐氏综合症和其他胎儿染色体非整倍性。由于母亲血浆中胎儿游离DNA的含量只占总数的5％-30％，其含量极少，在提取过程中容易丢失，提取难度大，提取量较少，难以满足常规检测或研究的要求，如何获得足量的微量DNA片段，是针对此类DNA进行研究及检测急需解决的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于孕妇血浆游离DNA非特异复制的试剂盒，用于对孕妇血浆中的游离DNA片段进行有效复制，可获得大量与其序列基本相同的DNA片段。
本发明为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：使用具有脱氧尿嘧啶标记的引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶及具有单链特异性切割功能的酶对PCR扩增产物进行酶切，可完全切除接头序列，获得大量与孕妇血浆中的游离DNA片段基本相同的DNA片段。
即，本发明包括：
1.一种用于孕妇血浆游离DNA非特异性复制的试剂盒，其中，包括：
用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'端有脱氧尿嘧啶标记的引物；
用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA的退火产物，
SEQ ID NO：1：5'-GCTCGTTAGATCGTCGTGTAGGCTACCAGTGT-3'，
SEQ ID NO：2：5'-CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCT-3'。
3.根据项1～2任一项所述的试剂盒，其中，所述3'端脱氧尿嘧啶标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的单链DNA，
SEQ ID NO：3：5'-ACACTGGTAGCCTACACGACGATCTAACGAGCU-3'，
SEQ ID NO：4：5'-CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCU-3'。
4.根据项1～3任一项所述的试剂盒，其中，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液。
5.根据项1～4任一项所述的试剂盒，其中，所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。
6.根据项1～5任一项所述的试剂盒，其中，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
7.根据项1～6任一项所述的试剂盒，其中，所述切割的试剂还包括选自下组中的至少一种：EndonucleaseⅧ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液和SI核酸酶缓冲液。
8.根据项1～7任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂，
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段、Klenow缓冲液和T4多聚核苷酸激酶缓冲液；
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段(3'-5'exo-)和Klenow缓冲液。
9.一种孕妇血浆游离DNA的非特异性复制的方法，其使用项1～8任一项所述试剂盒实施，包括：
步骤A：将孕妇血浆游离DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'端有脱氧尿嘧啶标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有脱氧尿嘧啶标记的PCR产物；
步骤C：使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶切除PCR产物中的脱氧尿嘧啶，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与孕妇血浆游离DNA片段基本相同的可利用DNA片段。
10.根据项9所述的方法，其是将步骤A中的孕妇血浆游离DNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：不引入外来序列，使孕妇血浆游离DNA片段有效复制，获得大量与孕妇血浆中游离DNA片段序列基本相同的DNA片段。
附图说明
图1是本发明的安捷伦2100检测1号原始样本DNA片段结果的示意图；
图2是本发明的安捷伦2100检测1号原始样本DNA扩增结果的示意图；
图3是本发明的安捷伦2100检测1号酶切产物的结果的示意图；
图4是5号原始样本及酶切样本在各染色体信号分布结果示意图；
图5是5号原始样本与酶切样本分窗口计算深度值。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本说明书中，非特异性复制是指几乎没有引入外源序列和丢失模板信息的扩增及酶切处理，使其得到的产物与原始模板序列基本一致，总量大幅增加的方法。
一方面，本发明提供一种孕妇血浆游离DNA非特异性复制的试剂盒，包括：用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'端具有脱氧尿嘧啶标记的引物；
用于切割的试剂，所述切割的试剂包括具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶。
所述用于加接头的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA，或者它们的退火产物。核苷酸序列如表1所示。
所述用于PCR扩增的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的单链DNA。核苷酸序列如表1所示。
表1：引物核苷酸序列表
其中，引物A在5'端进行了磷酸化处理。引物a和引物b均在3'端进行了脱氧尿嘧啶(尿嘧啶脱氧核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、deoxy-Uracil、dU)标记。
优选地，所述加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液。
所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。
所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
所述酶切的试剂包括选自下组中的至少一种：EndonucleaseⅧ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液以及SI核酸酶缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂。
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段、Klenow缓冲液以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段(3'-5'exo-)和Klenow缓冲液。
优选地，本发明试剂盒还可以包含用于纯化的试剂，如1.8×Ampure磁珠。
另一方面，本发明还提供一种孕妇血浆游离DNA的非特异性复制的方法，其使用本发明试剂盒实施包括：
步骤A：将孕妇血浆游离DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'端有脱氧尿嘧啶标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有脱氧尿嘧啶标记的PCR产物；
步骤C：使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶切除PCR产物中的脱氧尿嘧啶，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与孕妇血浆游离DNA片段基本相同的DNA片段。
在所述步骤A中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA的退火产物作为接头来进行加接头。该步骤可以使用DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)在相应的反应体系中进行。也可以使用本领域已知的方法及试剂盒来合成接头。
所述步骤B中，使用引物a和引物b作为PCR扩增引物来进行PCR扩增。该步骤可以使用Taq聚合酶、Pfu聚合酶、KAPA HiFi聚合酶、KAPA HiFi Uracil+和/或KAPA 2G robustDNA聚合酶体系，优选KAPA 2G robust DNA聚合酶体系。
所述步骤C中使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。为使酶切反应更加充分，使用反应条件为30～50℃、5-60分钟，优选20～40℃、20～40分钟，更优选30～40℃、30～40分钟。
所述步骤D中使用具有单链特异性切割功能的酶为S1核酸酶，也可以使用绿豆核酸酶，优选为使接头与DNA扩增片段彻底切断，反应条件可以为20～50℃、0.1～2小时，优选20～40℃、20～60分钟，更优选25～35℃、25～35分钟。
优选地，本发明的方法中，步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间还包括产物纯化步骤，纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如进行磁珠纯化。
作为优选，可以将步骤A中的孕妇血浆游离DNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
所述末端修复和/或3'端加A可以通过本技术领域的常规方法来进行。
优选地，本发明的方法中，末端修复和3'端加A的步骤之间还包括产物纯化步骤，纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如进行磁珠纯化。
在本发明的试剂盒中，各试剂或装置优选单独包装，但在不影响本发明的实施的前提下，也可以混合包装。
实施例1
1.样本及引物制备
1)使用的引物A、B序列如下表,其中引物A在5'端进行磷酸化标记处理，引物序列如下：
2)进行扩增使用的引物为a、b，其中引物a、b在3'端均为脱氧尿嘧啶标记，引物序列如下：
3)接头制备(总体系100μL)
使用1×退火缓冲液稀释合成的引物A和引物B干粉至浓度为100μM，然后等体积混合进行退火；
加入引物A(100μM)50μL和引物B(100μM)50μL，85℃反应2分钟，每分钟降温1℃，温度降至15℃，4℃保持，获得接头。
2.DNA模板预处理
使用1份孕妇血浆样本，分离血浆游离DNA，作为原始样本(即孕妇血浆游离DNA)编号1，使用安捷伦2100芯片生物分析仪搭配使用安捷伦2100高灵敏DNA检测芯片(简称安捷伦2100)检测1号样本，结果显示1号样本DNA片段大小主要分布在168bp左右(图1)，并取2ng进行以下处理：
1)末端修复反应
20℃温浴30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于32μL的EB中，得到平末端DNA片段。
2)利用末端加A体系将平末端DNA片段3'末端加A。末端加A反应体系为：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于25μL的EB中，得到3'端加A的DNA片段。
3)使用接头连接体系将接头连接到3'端加A的DNA片段上。接头连接反应体系为：
20℃反应15分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于23μL的EB中，得到加接头的DNA片段。
3.PCR扩增
使用加接头的DNA片段作为模板，使用引物a、b进行扩增。PCR反应体系：
PCR反应条件：
反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于50μL的EB中，获得具有脱氧尿嘧啶标记的PCR产物。安捷伦2100检测片段大小并检测浓度定量，结果显示扩增后片段大小主要分布在235bp左右(图2)。
4.末端接头切割及产物回收
(1)使用User酶(NEB公司)切割脱氧尿嘧啶标记的PCR产物中的脱氧尿嘧啶，体系如下：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于30μL的EB中，获得具有缺刻的DNA片段。
(2)使用S1核酸酶酶切具有缺刻的DNA片段，将接头彻底切断，反应体系及反应条件如下：
30℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，获得酶切产物(大量的、可利用的并且与孕妇血浆中游离DNA片段序列一致的DNA片段)。
5.DNA片段大小检测
使用安捷伦2100检测酶切产物的片段大小，结果显示酶切产物的大小的主要分布在166bp左右(图3)。
6.测序用DNA文库的构建
取编号1的原始样本作为对照，同步骤4获得的酶切产物取2ng按Illumina公司推荐的二代测序用DNA文库构建的常规方法构建了测序用DNA文库，并进行测序，测序类型为单端35bp，每个样本的测3.5G数据量。
图1显示1号样本DNA片段大小主要分布在168bp左右，该片段大小为提出的孕妇血浆游离DNA的片段大小。图2显示扩增后片段大小主要分布在253bp左右，该结果为经过加接头及PCR扩增后在1号样本长度基础上延长66bp，理论上扩增后的扩增产物长度为254bp左右，实际检测的结果片段大小主要分布在253bp左右，但安捷伦2100生物分析仪测定的片段大小结果本身会存在一定的波动，波动在1～5bp范围内，主要为峰值的大小会在1～5bp范围内波动，检测结果在波动范围之内，说明PCR扩增步骤成功的引入了脱氧尿嘧啶标记的引物，获得了具有脱氧尿嘧啶标记的PCR产物。图3显示酶切产物的大小主要分布在166bp，酶切产物的片段大小与原始样本(1号样本)DNA片段大小相差2bp，同样在波动范围内，表明酶切产物为PCR产物成功切割接头，说明酶切产物的片段大小与原始样本的片段大小基本一致。通过该方法可以成功获得与原始样本片段大小一致的酶切产物。
实施例2
在实施例1的基础上，增加9份孕妇血浆游离DNA作为原始样本，依次编号为2-10，对新增的9份原始样本进行实施例1中步骤5-6处理，9份原始样本各取2ng进行实施例1中步骤2-6处理，使用引物及反应条件参照实施例1。
再选择编号为1、2、5、8的测序下机数据分析染色体体非整倍性情况，结果如表3。1号原始样本和酶切样本的检测Z Score-21、Z Score-18和Z Score-13的值介于[-3.000，3.000]之间，检测结果一致，该样本为阴性。2号原始样本和酶切样本的检测Z Score-21、ZScore-18的值介于[-3.000，3.000]之间，Z Score-13原始样本为5.172，酶切样本为9.205，则两个值均大于3.000，检测结果一致，该样本中胎儿具有13三体综合征。5号原始样本和酶切样本的检测Z Score-21、Z Score-13的值介于[-3.000，3.000]之间，Z Score-18原始样本为9.898，酶切样本为8.765，则两个值均大于3.000，检测结果一致，该样本中胎儿具有18三体综合征。8号原始样本和酶切样本的检测Z Score-18、Z Score-13的值介于[-3.000，3.000]之间，Z Score-13原始样本为9.672，酶切样本为7.658，则两个值均大于3.000，检测结果一致，该样本中胎儿具有21三体综合征。通过以上结果可以得出结论，编号为1、2、5、8的原始样本和酶切样本的DNA片段的序列一致。
其中，Unique Reads为测到的唯一比对人类基因组(hg19)的DNA序列数，AlignedReads为测到的比对到人类基因组(hg19)的所有DNA序列数，Z Score-21为该样本21号染色体的Z值，即21号染色体上检测到的碱基占该样本所有检测到的碱基的百分比与参数数据库中正常样本21号染色体的碱基数目与所有碱基数目百分比的偏差；Z Score-18和ZScore-13分别为18号染色体和13号染色体的Z值。Z值介于[-3.000，3.000]为正常样本。
表3编号为1、2、5、8的原始样本和酶切样本的测序结果分析
选择编号为5的原始样本及酶切样本的测序下机数据，分析样本在各染色体上信号分布结果示意图(图4)，图4中横坐标为染色体编号，纵坐标为染色体信号值。所谓染色体信号值为待测样品经过与正常人类基因组进行不容错的比对之后，计算得到每条染色体上唯一比对序列数(Unique Reads)，分别对每条染色体计算其序列数占所有唯一序列数(Unique Reads)总和的比例，将其定义为该染色体的信号值。Group2_A为原始样本，Group2_B为酶切样本。从图4中可以看出原始样本和酶切样本的在每个染色体上信号值基本一致，说明原始样本和酶切样本定位到每条染色体上的Unique Reads数基本一致。将编号为5的原始样本和酶切样本选择3号染色体进行分析，将3号染色体分为4000个窗口，其中每个窗口为100kb的片段大小，结果如图5中显示，原始样本和酶切样本在整个窗口中，深度信号值分布基本一致。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 用于孕妇血浆游离DNA非特异复制的试剂盒
<130> 1601-2RCCN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物A
GCTCGTTAGATCGTCGTGTAGGCTACCAGTGT 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物B
CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCT 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物a
ACACTGGTAGCCTACACGACGATCTAACGAGCU 33
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物b
CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCU 32
Claims (8)
1.一种孕妇血浆游离DNA的非特异性复制的方法，其使用试剂盒实施，所述试剂盒包括：
用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'末端有脱氧尿嘧啶标记的引物和KAPA HiFi Uracil+聚合酶体系；
用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶，
所述方法包括：
步骤A：将孕妇血浆游离DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'末端有脱氧尿嘧啶标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有脱氧尿嘧啶标记的PCR产物；
步骤C：使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶切除PCR产物中的脱氧尿嘧啶，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与孕妇血浆游离DNA片段基本相同的可利用DNA片段，
所述3'末端有脱氧尿嘧啶标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的单链DNA，
SEQ ID NO：3：5'-ACACTGGTAGCCTACACGACGATCTAACGAGCU-3'，
SEQ ID NO：4：5'-CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCU-3'。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤A中的孕妇血浆游离DNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA的退火产物，
SEQ ID NO：1：5'-GCTCGTTAGATCGTCGTGTAGGCTACCAGTGT-3'，
SEQ ID NO：2：5'-CAGTGGACTTCAGACGTGTGATCTAACGAGCT-3'。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切割的试剂还包括选自下组中的至少一种：EndonucleaseⅧ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液和SI核酸酶缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂，
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段、Klenow缓冲液以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液；
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段(3'-5'exo-)和Klenow缓冲液。
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