CN108265046B - 用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒 - Google Patents
用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒。本发明的试剂盒包括用于加接头的试剂、用于PCR扩增的试剂、用于切割的试剂。应用本发明的试剂盒进行血浆ctDNA复制具有以下优点：获得大量与血浆ctDNA基本相同的可利用DNA片段。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒。
背景技术
肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA，这些变异DNA也随之释放到外周血中，被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。研究发现，ctDNA在早期原位癌(primarycancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA半衰期短，因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。另有文献报道，癌变人群血浆中游离100～400bp大小的DNA片段浓度明显高于正常人，可以作为筛查的标志物。
但其含量极少，在提取过程中容易丢失，提取难度大，提取量较少，难以满足常规检测或研究的要求，如何获得足量的ctDNA片段，是针对此类DNA进行研究及检测急需解决的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒，用于可以对血浆中的ctDNA进行有效复制，可获得大量与游离ctDNA序列基本相同DNA片段。
本发明为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：使用具有dU标记的引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，使用具有dU碱基切割功能的酶及具有单链特异性切割功能的酶对PCR扩增产物进行酶切，可完全切除接头序列，获得大量与与进行血浆ctDNA片段基本相同的DNA片段。
即，本发明包括：
1.一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒，其中，包括：
用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'端有dU标记的引物；
用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有dU切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物，
SEQ ID NO：1：5'-GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，
SEQ ID NO：2：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。
3.根据项1～2任一项所述的试剂盒，其中，所述3'端dU标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的单链DNA，
SEQ ID NO：3：5'-GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，
SEQ ID NO：4：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'。
4.根据项1～3任一项所述的试剂盒，其中，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液。
5.根据项1～4任一项所述的试剂盒，其中，所述具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG的混合物。
6.根据项1～5任一项所述的试剂盒，其中，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
7.根据项1～6任一项所述的试剂盒，其中，所述切割的试剂还包括选自下组中的至少一种：EndonucleaseⅧ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液和SI核酸酶缓冲液。
8.根据项1～7任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂，
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段、Klenow缓冲液以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液；
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段(3'-5'exo-)和Klenow缓冲液。
9.一种血浆ctDNA的非特异性复制的方法，其使用项1～8任一项所述试剂盒实施，包括：
步骤A：将血浆ctDNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'端有dU标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有dU标记的PCR产物；
步骤C：使用具有dU切割功能的酶切除PCR产物中的dU，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与血浆ctDNA片段基本相同的可利用DNA片段。
10.根据项9所述的方法，其是将步骤A中的血浆ctDNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：使血浆ctDNA片段有效复制，获得大量与血浆ctDNA片段序列基本相同的DNA片段。
附图说明
图1是本发明的安捷伦2100检测样本DNA片段结果的示意图；
图2是本发明的安捷伦2100检测样本DNA扩增结果的示意图；
图3是本发明的安捷伦2100检测样本DNA扩增后酶切结果的示意图；
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在这里，所述血浆ctDNA是指血浆中的循环肿瘤DNA，获得血浆ctDNA的方法是本领域技术人员已知的，可以是例如，提取包括ctDNA片段在内的血浆游离DNA片段。ctDNA非特异性复制是指以含有ctDNA片段的样本为原始模板，通过复制得到与原始模板在片段大小和序列上都基本相同的产物，产物中的ctDNA片段总量与原始模板相比有大幅的增加。
一方面，本发明提供一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒，包括：用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'端有dU标记的引物；
用于切割的试剂，所述切割的试剂包括具有dU切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶。
所述用于加接头的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物。核苷酸序列如表1所示。
所述用于PCR扩增的试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA。核苷酸序列如表1所示。
表1：引物核苷酸序列表
其中，引物A在5'端进行了磷酸化处理。引物a和引物b均在3'端进行了脱氧尿嘧啶(尿嘧啶脱氧核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、deoxy-Uracil、dU)标记。
优选地，所述加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液。
所述具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。
所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
所述酶切的试剂包括选自下组中的至少一种：EndonucleaseⅧ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液以及SI核酸酶缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂。
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上：T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段、Klenow缓冲液以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段(3'-5'exo-)和Klenow缓冲液。
优选地，本发明试剂盒还可以包含用于纯化的试剂，如1.8×Ampure磁珠。
另一方面，本发明还提供一种血浆ctDNA的非特异性复制的方法，其使用本发明试剂盒实施包括：
步骤A：将血浆ctDNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'端有dU标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有dU标记的PCR产物；
步骤C：使用具有dU切割功能的酶切除PCR产物中的dU，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与血浆ctDNA片段基本相同的可利用DNA片段。
在所述步骤A中，使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为接头来进行加接头。该步骤可以使用DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)在相应的反应体系中进行。也可以使用本领域已知的方法及试剂盒来合成接头。
所述步骤B中，使用引物a和引物b作为PCR扩增引物来进行PCR扩增。该步骤可以使用Taq聚合酶、Pfu聚合酶、KAPA HiFi聚合酶、KAPA HiFi Uracil+体系和/或KAPA 2Grobust DNA聚合酶体系，优选KAPA 2G robust DNA聚合酶体系。
所述步骤C中使用具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ合UDG混合物。为使酶切反应更加充分，使用反应条件为30～50℃、5-60分钟，优选20～40℃、20～40分钟，更优选30～40℃、30～40分钟。
所述步骤D中使用具有单链特异性切割功能的酶为S1核酸酶，也可以使用绿豆核酸酶，优选为使接头与DNA扩增片段彻底切断，反应条件可以为20～50℃、0.1～2小时，优选20～40℃、20～60分钟，更优选25～35℃、25～35分钟。
优选地，本发明的方法中，步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间还包括产物纯化步骤，纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如进行磁珠纯化。
作为优选，可以将步骤A中的血浆ctDNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
所述末端修复和/或3'端加A可以通过本技术领域的常规方法来进行。
优选地，本发明的方法中，末端修复和3'端加A的步骤之间还包括产物纯化步骤，纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如进行磁珠纯化。
在本发明的试剂盒中，各试剂或装置优选单独包装，但在不影响本发明的实施的前提下，也可以混合包装。
实施例1
1.样本及引物制备
1)使用的引物A、B序列如下表,其中引物A在5'端进行磷酸化标记处理，引物序列如下：
2)进行扩增使用的引物为a、b，其中引物a、b在3'端均为dU标记，引物序列如下：
3)接头制备(总体系100μL)
使用1×退火缓冲液稀释合成的引物A和引物B干粉至浓度为100μM，然后等体积混合进行退火；
加入引物A(100μM)50μL和引物B(100μM)50μL，85℃反应2分钟，每分钟降温1℃，温度降至15℃，4℃保持，获得接头。
2.DNA模板预处理
使用结肠癌患者1份血浆样本，分离血浆游离DNA(包括ctDNA)，作为原始样本，使用安捷伦2100芯片生物分析仪搭配使用安捷伦2100高灵敏DNA检测芯片(简称安捷伦2100)检测血浆游离DNA的片段大小，结果显示1号样本DNA片段大小主要分布在165bp左右(图1)，取2ng进行以下处理：
1)末端修复反应
20℃温浴30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于32μL的EB中，得到平末端DNA片段。
2)利用末端加A体系将平末端DNA片段3'末端加A。末端加A反应体系为：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于25μL的EB中，得到3'端加A的DNA片段。
3)使用接头连接体系将接头连接到3'端加A的DNA片段上。接头连接反应体系为：
20℃反应15分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于23μL的EB中，得到加接头的DNA片段。
3.PCR扩增
使用加接头的DNA片段作为模板，使用引物a、b进行扩增。PCR反应体系：
PCR反应条件：
反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于50μL的EB中，获得具有dU标记的PCR产物。安捷伦2100检测片段大小并检测浓度定量，结果显示扩增后片段大小主要分布在234bp左右(图2)。
4.末端接头切割及产物回收
1)使用User酶(NEB公司)切割dU标记的PCR产物中的脱氧尿嘧，体系如下：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，溶于30μl的EB中，获得具有缺刻的DNA片段。
2)使用S1核酸酶酶切具有缺刻的DNA片段，将接头彻底切断，反应体系及反应条件如下：
30℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA，获得酶切产物(大量的、可利用的并且与血浆ctDNA片段序列一致的DNA片段)。
5.DNA片段大小检测
使用安捷伦2100检测酶切产物的片段大小，结果显示酶切产物的大小主要分布在165bp左右(图3)。
图1显示1号样本DNA片段大小主要分布在165bp左右，该片段大小为提出的结肠癌患者血浆游离DNA的片段大小。图2显示扩增后片段大小主要分布在234bp左右，该结果为经过加接头及PCR扩增后在1号样本长度基础上延长66bp，理论上扩增后的扩增产物长度为231bp左右，实际检测的结果片段大小主要分布在234bp左右，但安捷伦2100生物分析仪测定的片段大小结果本身会存在一定的波动，波动在1～5bp范围内，主要为峰值的大小会在1～5bp范围内波动，所以该检测结果在波动范围之内，说明PCR扩增步骤成功的引入了dU标记的引物，获得了具有dU标记的PCR产物。图3显示酶切产物的大小主要分布在165bp，表明酶切产物为PCR产物成功切割接头的产物，其片段大小与原始样本(1号样本)DNA片段大一致。
6.测序用DNA文库的构建
取编号1的原始样本作为对照，同步骤4获得的酶切产物取2ng按Illumina公司推荐的二代测序用DNA文库构建的常规方法构建了测序用DNA文库。
7.芯片复制捕获及测序
使用Illumina公司推出的肿瘤试剂盒
Tumor 15，按照说明书操作流程对步骤6的结果产物进行捕获，并对捕获产物进行PCR扩增，然后上机测序，测序类型为双端125bp，每个样本测9G数据量，测序结果如表2：
在这里，突变频率为确定为支持突变的read数(mutational reads)与该位点的测序总深度(total reads)的比值。
经分析发现在原始样本和酶切样本中均检测出BRAF基因有V600E(c.1799T>A)突变点，说明在原始样本和酶切样本中血浆ctDNA中均有突变，检测结果一致，并且原始样本的BRAF V600E突变频率25.5％，酶切产物的BRAFV600E突变频率为24.8％，说明原始样本和酶切样本在突变结果一致，突变频率基本一致，该方法成功的复制了原始样本。
表2高通量测序突变情况分析表
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒
<130> 1601-3RCCN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
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GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC 29
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物a
GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物b
CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU 29
Claims (8)
1.一种用于血浆ctDNA非特异性复制的方法，其使用试剂盒实施，
所述试剂盒包括：
用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；
用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'末端有dU标记的引物和KAPAHiFi Uracil+聚合酶体系；
用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有dU切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶，
所述3'末端有dU标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示的单链DNA，
SEQ ID NO：3：5'- GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，
SEQ ID NO：4：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'，
所述方法包括：
步骤A：将血浆ctDNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；
步骤B：使用在3'末端有dU标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有dU标记的PCR产物；
步骤C：使用具有dU切割功能的酶切除PCR产物中的dU，得到具有缺刻的DNA片段；以及
步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与血浆ctDNA片段基本相同的可利用DNA片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA的退火产物，
SEQ ID NO：1：5'- GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，
SEQ ID NO：2：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的试剂还包括选自下组中的至少一种： Endonuclease Ⅷ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液以及SI核酸酶缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂，
所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上： T4 DNA 聚合酶、T4 多聚核苷酸激酶、Klenow 片段、Klenow缓冲液以及T4 多聚核苷酸激酶缓冲液；
所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段（3'-5'exo-）和Klenow缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤A中的血浆ctDNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。
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| CN106148513A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-23 | 杭州杰毅麦特医疗器械有限公司 | 一种游离dna文库构建方法及试剂盒 |
-
2016
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| Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method;DUHAIME, M.B.等;《Environmental Microbiology》;20121231;第14卷(第9期);2526–2537 * |
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